Summary
هنا نصف منهجية فحص سريعة ومباشرة في vivo CRISPR/Cas9 باستخدام الحقن العدسية الجنينية الموجهة بالموجات فوق الصوتية لتقييم وظائف العديد من الجينات في الجلد وتجويف الفم للفئران ذات القدرة المناعية في وقت واحد.
Abstract
وقد لعبت نماذج الماوس المعدلة وراثيا دورا أساسيا في تقييم وظيفة الجينات، ونمذجة الأمراض البشرية، والعمل كنموذج قبل السريرية لتقييم السبل العلاجية. ومع ذلك ، فإن طبيعتها كثيفة الوقت والعمالة والتكلفة تحد من فائدتها للتحليل المنهجي لوظيفة الجينات. وتتغلب التطورات الأخيرة في تكنولوجيات تحرير الجينوم على هذه القيود وتسمح بالجيل السريع من الاضطرابات الجينية المحددة مباشرة داخل أجهزة فأرة محددة بطريقة متعددة السرعة. هنا ، نصف طريقة CRISPR / Cas9 المستندة إلى (تكرارات Palindromic القصيرة المتشابكة بانتظام) لتوليد الآلاف من استنساخ الجينات خارج داخل ظهارة الجلد وتجويف الفئران عن طريق الفم ، وتقديم بروتوكول يفصل الخطوات اللازمة لإجراء فحص مباشر في vivo CRISPR لجينات مثبط الورم. يمكن تطبيق هذا النهج على أجهزة أخرى أو تقنيات CRISPR/Cas9 الأخرى مثل تنشيط CRISPR أو تعطيل CRISPR لدراسة الوظيفة البيولوجية للجينات أثناء التوازن النسيجي أو في بيئات المرض المختلفة.
Introduction
أحد التحديات التي تواجه أبحاث السرطان في حقبة ما بعد الجينوم هو استخراج الكمية الهائلة من بيانات الجينوم للطفرات الجينية السببية وتحديد العقد في شبكة الجينات التي يمكن استهدافها علاجيا. وفي حين ساعدت التحليلات المعلوماتية الحيوية كثيرا على تحقيق هذه الأهداف، فإن إنشاء نماذج فعالة في المختبر وفي الجسم الحي شرط أساسي لفك شفرة تعقيد النظم البيولوجية وحالات الأمراض وتمكين تطوير الأدوية. في حين تم استخدام نماذج الماوس المعدلة وراثيا التقليدية على نطاق واسع في دراسات علم الوراثة سرطان الجسم الحي، وطبيعتها التكلفة والوقت والعمالة الكثيفة حظرت إلى حد كبير التحليل المنهجي لمئات من جينات السرطان المفترضة التي كشفها الجينوم الحديث. للتغلب على هذا الاختناق، قمنا بالجمع بين منهجية حقن الموجات فوق الصوتية1،2 مع CRISPR/Cas9 (متفاوتة بانتظام قصيرة Palindromic يكرر) تكنولوجيا تحرير الجينات3 للحث في وقت واحد ودراسة فقدان وظيفة الطفرات من مئات الجينات في الجلد وتجويف الفم من فأر واحد.
تستخدم المنهجية الموصوفة هنا الحقن الموجهة بالموجات فوق الصوتية للفيروسات العدسية المهندسة في تجويف السلى من أجنة الفئران الحية في اليوم الجنيني E9.5. تنقل الشحنة العدسية التي تحتوي على مكونات CRISPR/Cas9 ectoderm السطحي أحادي الطبقات ، والذي يؤدي لاحقا إلى ظهارة الجلد وتجويف الفم. يتكون الجلد من البشرة الخارجية، يليه غشاء الطابق السفلي والأدمة. البشرة هي ظهارة طبقية تتكون من طبقة داخلية وباسية ، تحافظ على ملامسة غشاء الطابق السفلي ولها قدرة على التكاثر والخلايا الجذعية. الطبقة القاعدية يؤدي إلى طبقات متمايزة أعلاه مثل طبقات القرنية الشوكية والحبيبية وطبقات الطبقة2،4. تظهر دراسات تتبع النسب أن هذه الطريقة المباشرة في vivo CRISPR/Cas9 تتلاعب وراثيا بالخلايا الجذعية المقيمة في الأنسجة داخل الطبقة القاعدية التي تستمر طوال مرحلة البلوغ. كما يمكن titrated lentivirus إلى تحويل ectoderm سطح E9.5 في كثافة كلونال، ويمكن استخدام هذه الطريقة لتوليد الفئران الفسيفساء التي تؤوي الآلاف من الجينات المنفصلة خروج المغلوب استنساخ. ويمكن بعد ذلك الجيل التالي من التسلسل يمكن استخدامها لتحليل تأثير CRISPR / Cas9 بوساطة الاستئصال الجيني داخل تلك المستنسخات بطريقة متعددة5.
استخدمنا مؤخرا هذه الطريقة لتقييم وظيفة 484 الجينات التي تظهر الطفرات المتكررة في سرطان الخلايا الحرشفية الرأس والرقبة البشرية (HNSCC)5. HNSCC هو سرطان مدمر مع ارتفاع معدل الوفيات من 40-50٪ وهو السرطان6 الأكثر شيوعا في جميع أنحاء العالم6. ينشأ HNSCC في بطانات المخاطية في مجرى الهواء العلوي أو تجويف الفم وترتبط باستهلاك التبغ والكحول أو عدوى فيروس الورم الحليمي البشري (HPV). سرطان الخلايا الحرشفية الجلدية (SCC) هي أورام الجلد وتمثل ثاني أكثر أنواع السرطان شيوعا في البشر7. SCC الجلدية وHNSCC هي هي هي نفسها من الناحية النسيجية والجزيئية جدا، مع نسبة عالية من الحالات التي تظهر التغيير في TP53، PIK3CA، NOTCH1، وHRAS8. في حين لا يوجد سوى عدد قليل من الجينات تحور على تردد عال، وهناك مئات الجينات وجدت تحور في التردد المنخفض (< 5٪)، وهي ظاهرة يشار إليها عادة باسم التوزيع ذيل طويل. وبما أن غالبية الجينات ذات الذيل الطويل تفتقر إلى التحقق البيولوجي أو السريري ، استخدمنا هذا في تقنية فحص VIVO CRISPR لنمذجة فقدان وظيفة هذه الجينات في الفئران المعرضة للورم مع طفرات حساسة في p53 أو Pik3ca أو Hras وحددنا العديد من جينات مثبط الورم الجديدة التي تتعاون مع p53 أو Pik3ca أو Hras لتحريك تطور الورم5.
هنا، ونحن نصف بروتوكول مفصل لتوليد متعددة الأضلاع sgRNA lentiviral CRISPR مكتبات SgRNA وأداء CRISPR / Cas9 الجينات خروج المغلوب شاشات في ectoderm سطح الماوس. وتجدر الإشارة إلى أنه يمكن تكييف هذه المنهجية لدمج تقنيات التلاعب الجيني الأخرى مثل تنشيط CRISPR (CRISPRa) و CRISPR تعطيل (CRISPRi) أو تعديلها لاستهداف أنظمة الأعضاء الأخرى في الماوس لدراسة الوظائف الجينية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على هذا البروتوكول وتنفيذه وفقا لIACUC من جامعة تورنتو.
1. تصميم واستنساخ مكتبات CRISPR المجمعة
- حدد 4-5 sgRNAs استهداف جينات الماوس ذات الفائدة من الموارد مثل مصمم SgRNA معهد واسع (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) أو خادم CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no). حدد عددا متساويا من الرنانات غير المستهدفة من مثل سانجانا وآخرون9 لإنشاء مكتبة مراقبة غير مستهدفة بنفس الحجم.
- أثناء بناء مكتبات SGRNA ، تأكد من وجود تغطية كافية لكل sgRNA في نظام الأعضاء المستهدف. لجلد الفأر، البشرة في E9.5 هي طبقة واحدة تحتوي على ~ 150،000 الخلايا، ومعظمها لديه قدرة الخلايا الجذعية4. إذا أدى التحول الفيروسي العدسي إلى إصابة 15-20٪، سيتم نقل 18000-24000 خلية فقط في E9.5. قم بتحجيم التجربة وفقا لذلك.
- لاستنساخ وتضخيم هذه المكتبات SgRNA، إضافة مواقع تقييد إنزيم BsmBI وكذلك تسلسل الحمض النووي ملزم التمهيدي إلى 5 'و 3' نهاية SgRNA والنظام oligos طول كامل الناتجة كما تجمع oligonucleotide رقاقة (الشكل 1A).
- إلى تعدد مكتبات مختلفة على شريحة واحدة، إضافة تسلسل التمهيدي مكتبة معينة.
- باستخدام أزواج التمهيدي المناسبة، تضخيم كل مكتبة بشكل منفصل عن رقاقة أوليغو المجمعة. في أنبوب PCR، مزيج 25 ميكرولتر من 2x بوليمراز مزيج رئيسي، 20 ميكرولتر من المياه الحرة DNase / RNase، 5 نانوغرام من الحمض النووي رقاقة أوليغو، 2.5 ميكرولتر من التمهيدي الأمامي المناسب و 2.5 ميكروغرام من التمهيدي العكسي المناسب. استخدام 12-15 دورات وتضخيم مع 98 درجة مئوية التشبع، 63-67 درجة مئوية التلين، 72 درجة مئوية معلمات التمديد لكل دورة في الجهاز PCR.
- تشغيل المنتج PCR على هلام agarose 2.5٪ وتنقية ~ 100 BP PCR المنتج باستخدام هلام الحمض النووي تنظيف عدة.
- إعداد البلازميد العمود الفقري.
- خلاصة 5 ميكروغرام من كريم-recombinase تحتوي على pLKO-Cre حشو v3 البلازميد مع 2 ميكرولتر من BsmBI في 50 مزيج رد فعل ميكرولتر ل 1 ساعة في 55 درجة مئوية، تليها 1 ميكرولتر من الحضانة الفوسفاتاز القلوية لمدة 45 دقيقة في 37 درجة مئوية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
ملاحظة: Cre-recombinase التي تحتوي على pLKO-Cre حشو v3 plasmid هو بلازميد أساسه العدسي الفيروسي يحتوي على إنزيم Cre-recombinase لإزالة كاسيت Lox-Stop-Lox في خلايا الماوس ولديه أيضا مروج U6 لدفع التعبير عن sgRNA وtracrRNA. يمكن استخدام نسخة مع Cas9 وبدون Cas9 ومتاحة على addgene #158030 #158031. - تشغيل الحمض النووي هضمها على هلام agarose 1٪ وتنقية الفرقة ناقلات خطي 7 كيلو بايت باستخدام مجموعة تنظيف الحمض النووي هلام. من الجدير بالذكر ، ينبغي أن يكون شريط حشو 2 كيلوبايت مرئيا أيضا مما يشير إلى نجاح عملية الهضم.
- خلاصة 5 ميكروغرام من كريم-recombinase تحتوي على pLKO-Cre حشو v3 البلازميد مع 2 ميكرولتر من BsmBI في 50 مزيج رد فعل ميكرولتر ل 1 ساعة في 55 درجة مئوية، تليها 1 ميكرولتر من الحضانة الفوسفاتاز القلوية لمدة 45 دقيقة في 37 درجة مئوية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- إعداد رد فعل الربط لتوليد مكتبة سجرنا بلازميد.
- مزيج 1 ميكروغرام من ناقلات منقى و 30 نانوغرام من إدراج PCR المنقى مع 2 ميكرولتر من BsmBI، 5 ميكرولتر من T4 الحمض النووي ليغانيس، 10 ميكرومتر ATP و1x العازلة محددة لBsmBI. احتضان مزيج الربط بين عشية وضحاها في 37 °C. استخدام أنبوب إضافية تحتوي على جميع المواد المذكورة أعلاه باستثناء إدراج PCR كعنصر تحكم سلبي.
- صباح اليوم التالي، تنقية مزيج الربط باستخدام طقم تنظيف أوليغو وeblute في 7 ميكرولتر من المياه الحرة RNase / DNase.
- كهربية المكتبة في الخلايا المختصة.
- أضف 2 ميكرولتر من مكتبة sgRNA أو مزيج ربط التحكم السلبي إلى 25 ميكرولتر من الخلايا الكهرو تنافسية إذابة في cuvettes المبردة مسبقا (1.0 مم) على الجليد. الكتروبورات بعد بروتوكول الشركة المصنعة (10 ميكروفولت، 600 أوم، 1800 فولت). إلى cuvette إضافة 975 ميكرولتر من الانتعاش المتوسطة (أو SOC المتوسطة) في غضون 10 ثانية من النبض.
- نقل الخلايا الكهربائية إلى أنبوب الثقافة واحتضان لمدة ساعة في 37 درجة مئوية في حاضنة اهتزاز البكتيرية في 300 دورة في الدقيقة.
- تقدير كفاءة التحويل وتغطية المكتبة لكل sgRNA.
- إعداد تخفيف 100 أضعاف عن طريق نقل 10 ميكرولتر من التفاعل التحول التي تحتوي على خلايا كهربائية مع مكتبة SgRNA أو ربط السيطرة السلبية إلى 990 ميكرولتر من الاسترداد المتوسطة وتخلط جيدا.
- لوحة 10 ميكرولتر من مزيج التحول المخفف على لوحة أجار 10 سم LB + ampicillin (100 ميكروغرام / لتر) مسبقا. وهذا يؤدي إلى تخفيف 10000 مرة من المحولات واستخدام هذه اللوحة لحساب كفاءة التحويل. إجراء حضانة اللوحات عند 30 درجة مئوية لمدة 14-16 ساعة.
- لوحة بقية التفاعل التحول عن طريق نشر 100 ميكرولتر من الخلايا المستردة على كل لوحة من ما مجموعه 10 قبل تسخينها 15 سم LB + أمبيسلين أجار لوحات. احتضان لوحات لمدة 14-16 ساعة في 30 درجة مئوية. وتجدر الإشارة إلى أن النمو عند 30 درجة مئوية يقلل من إعادة التركيب بين المحطتين الطرفيتين الطويلتين داخل البلازميد الفيروسي.
- لتقييم نجاح الاستنساخ، احسب كفاءة التحويل. عد عدد المستعمرات على لوحة التخفيف التي تحتوي على المحولات من مكتبة sgRNA أو ربط التحكم السلبي (لوحات 10 سم ، الخطوة 1.8.2). يجب أن لا يكون مزيج التحكم السلبي أي أو عدد قليل جدا من المستعمرات. للحصول على العدد الإجمالي للمستعمرات، قم بضرب عدد المستعمرات ب 10,000.
ملاحظة: يمثل العدد الإجمالي counted من المستعمرات تغطية مكتبة التي يجب أن يكون الحد الأدنى من مستعمرات 200x لكل sgRNA.- تأكد من أن مكتبة مع 2000 sgRNAs سيكون لها ما لا يقل عن 400،000 المستعمرات. في حالة عدم وجود ما يكفي من المستعمرات، كرر واقامة المزيد من electroporation.
- مراقبة الجودة: من لوحة التخفيف، اختر 20 مستعمرة وأضف كل مستعمرة إلى أنبوب ثقافة فردي يحتوي على 3 مل من وسائط LB + أمبيسلين. احتضان جميع الأنابيب 20 بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية تهتز في 250 دورة في الدقيقة. تنقية الحمض النووي البلازميد باستخدام مجموعة الإعدادية المصغرة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وتسلسل سانجر جميع عينات الحمض النووي plasmid 20 للتحقق من كل عينة لديها تسلسل مختلف sgRNA باستخدام التمهيدي U6 (5'GAG GGC CTA TTT CCC ATG ATT CC-3').
- حصاد المستعمرات من كل لوحة 15 سم.
- إضافة 7 مل من LB المتوسطة، ثم كشط المستعمرات قبالة لوحة أغار LB مع انتشار الخلية. استخدام ماصة 10 مل لنقل الخلايا إلى قارورة مخروطية معقمة 2 لتر. كرر لجميع لوحات وبركة البكتيريا في قارورة 2 L. احتضان قارورة لمدة 2-3 ساعة تهتز في 30 درجة مئوية. الطرد المركزي الثقافة وجمع بيليه.
- تنقية الحمض النووي البلازميد باستخدام مجموعة تنقية ماكسي بلازميد.
- مراقبة الجودة الإضافية: استخدام 1 نانوغرام من الحمض النووي مكتبة ماكسي الإعدادية سجرنا plasmid وتشغيل رد فعل PCR باستخدام الجيل القادم تسلسل التمهيديات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. يمكن التحقق من تمثيل جميع SgRNAs في المكتبة من خلال منصة التسلسل العميق.
2. إنتاج عالية تيتر lentivirus مناسبة ل في نقل الجسم الحي
ملاحظة: تنفيذ كافة الخطوات في هذا المقطع من البروتوكول في مرفق BSL2 + في خزانة السلامة الحيوية من الفئة II, نوع A2. 293FT وخاصة خلايا التعبئة والتغليف 293NT تسمح لإنتاج فيروس أعلى. استخدام ممر منخفض (< p20) HEK293T, 293FT أو 293NT خلايا لtransfections. قبل الحرب كل وسائل الإعلام إلى 37 °C. لا تسمح أبدا للخلايا HEK293T أو 293FT أو 293NT بأن تصبح التقاء أثناء التصنيع الفرعي. تنمو 293FT في وجود G418 للحفاظ على التعبير عن SV40 كبير تي مستضد.
- إعداد خلايا التعبئة والتغليف الفيروسية.
- في اليوم الأول، كانت خلايا اللوحة HEK293T على 6 لوحات بولي-إل-ليسين مغلفة 15 سم بنسبة التقاء 35٪ في وسائل الإعلام النمو (DMEM + 10٪ FBS + 1٪ محلول مضاد حيوي للبنسلين-ستربتوميسين (ث/v)). احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
- مرة واحدة في الخلايا المطلية هي 70-80٪ التقاء وانتشار بالتساوي، واستبدال وسائل الإعلام النمو مع 25 مل من المصل والمضادات الحيوية خالية من وسائل الإعلام DMEM.
- إضافة وسائل الإعلام ببطء إلى الجانبين من القوارير عند التغذية، كما HEK293T و 293NT الخلايا يمكن فصل بسهولة من البلاستيك ثقافة الأنسجة
- إعداد مزيج العدوى.
- إضافة 65 ميكروغرام من التغليف العدسي plasmids psPAX2، 43 ميكروغرام من VSV-G التعبير عن المغلف بلازميد pMD2.G، 65 ميكروغرام من سجرنا مكتبة البلازميد و 240 ميكروغرام من 1 ملغ / مل البولي ايثيلينيمين (PEI) إلى 6 مل من DMEM ودوامة.
ملاحظة: استخدم دائما زجاجة مفتوحة أو فتح مؤخرا جدا من DMEM ل transfection، كما هو أمر بالغ الأهمية في رقم الحموضة في هذه الخطوة، ويصبح DMEM أكثر أساسية مع مرور الوقت بمجرد فتح. - حضانة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. هذا المزيج transfection يكفي للخلايا مطلي على لوحات 6 × 15 سم مع 870 سم2 مساحة السطح. قم بتحجيم مزيج العدوى وفقا لمتطلبات التجربة.
- إضافة 65 ميكروغرام من التغليف العدسي plasmids psPAX2، 43 ميكروغرام من VSV-G التعبير عن المغلف بلازميد pMD2.G، 65 ميكروغرام من سجرنا مكتبة البلازميد و 240 ميكروغرام من 1 ملغ / مل البولي ايثيلينيمين (PEI) إلى 6 مل من DMEM ودوامة.
- إعادة إصابة خلايا التعبئة والتغليف الفيروسية.
- بعد 15 دقيقة من الحضانة، تتسرب كل صفيحة من لوحات 15 سم بإضافة 1 مل من خليط العدوى المنسدلة في جميع أنحاء اللوحة. حضانة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 لمدة 8 ساعة.
- بعد الحضانة، قم بإزالة الوسائط الخالية من المصل التي تحتوي على مزيج العدوى وإضافة 30 مل من الوسائط الثقافية العادية إلى لوحات وثقافات 15 سم لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية، و5٪ CO2.
- بعد 48 ساعة، وجمع supernatant الفيروسية ومرشح من خلال مرشح PVDF 0.45 ميكرومتر. الحفاظ على 1 مل من supernatant الفيروسية وتخزينها في -80 درجة مئوية لمراقبة الجودة والتأليه الفيروسية.
- ركز الناتورات الفيروسية عن طريق الطرد المركزي المتدرجة السكروز في أجهزة الطرد المركزي عالية السرعة باستخدام رأس الدوار SW28.
- أنابيب الطرد المركزي فائقة رئيس الوزراء عن طريق غسلها مع الإيثانول 70٪، تليها 3 شطف مع برنامج تلفزيوني. توزيع ما يقرب من 30 مل بالتساوي من الناسخ الفيروسي في كل من أنبوب 6-ultracentrife.
- ماصة بلطف إلى الجزء السفلي من كل أنبوب 4 مل من محلول السكروز 20٪ (20 غرام من السكروز في 100 مل من برنامج تلفزيوني). ضع أنابيب الطرد الستة فائقة المركزية في دلاء التأرجح SW28 الستة ووازن بدقة كل زوج متعارض من الدلاء عن طريق إضافة أو إزالة الناسخ الفيروسي.
- طارد مركزي فائق الفيروسية في 4 درجة مئوية لمدة 2 ساعة على الأقل وحتى 4 ساعة في 80،000 س ز و 4 درجة مئوية. بمجرد الانتهاء من الطرد المركزي ، تجاهل بعناية supernatant.
- استنزاف supernatant المتبقية عن طريق وضع أنابيب الطرد المركزي جدا رأسا على عقب على منشفة ورقية ناعمة معقمة لمدة 2 دقيقة على الأقل ومسح أي قطرات من supernatant داخل الأنبوب باستخدام منشفة ورقية ناعمة للتخلص من أي وسيلة المتبقية. قد تكون الكريات البيضاء الرمادية الصغيرة مرئية في الجزء السفلي من الأنبوب.
- إضافة 20-25 ميكرولتر الباردة، برنامج تلفزيوني جديد إلى كل أنبوب. أنابيب الختم مع فيلم البارافين وأنابيب الحضانة تستقيم على الجليد مع اهتزاز لطيف على شاكر منصة المدارية ل ~ 2 ساعة.
- باستخدام ماصة 20 ميكرولتر، قم بإزاحة بيليه الأنبوب الأول بعناية وإعادة إنفاقه، مع الحرص على عدم تشكيل فقاعات. نقل المتوسطة إلى الأنبوب التالي وتكرار العملية حتى تم طرد جميع الكريات الفيروس ودمجها في أنبوب واحد من حجم 120-150 μL تقريبا. احتضان هذا التعليق الفيروسي عالية التيتر لآخر ~ 2 ساعة على الجليد مع اهتزاز لطيف.
- نقل التعليق الفيروسي إلى أنبوب 1.5 مل من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة وتدور الأنبوب في 4 درجة مئوية في المبردة وقبل تبريد الجدول أعلى جهاز الطرد المركزي في 12,000 x ز لمدة 2 دقيقة. Aliquot فائقة الفيروسية واضحة بعناية كما 10 ميكرولتر aliquots في أنابيب منفصلة 0.2 مل وتخزينها في -80 درجة مئوية. تجاهل بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب لأن هذا سوف تسد الإبرة أثناء الحقن الجنينية.
- المعايرة من مكتبة فيروسات كريسبر العدسية المجمعة
ملاحظة: يجب أن ينتج عن التعليق الفيروسي الناتج تركيز 2000 أضعاف تقريبا ومحلول الفيروس الناتج ، ويجب أن يكون له تتر فيروسي من 107-109، وهو جيد بما يكفي لأكثر من 100 عملية جراحية E9.5 موضحة أدناه.- البذور R26-Lox-STOP-Lox-tdTomato الماوس الخلايا الليفية الجنينية (MEFs) أو R26-Lox-STOP-Lox-tdTomato الخلايا القرنية الأولية أو أي خط الخلية Cre-مراسل أخرى في لوحة بئر 2 × 6.
- بمجرد أن تصل الخلية إلى ~ 40٪ التقاء، والخلايا جاهزة لاتجاه. في ذلك الوقت، تحديد عدد الخلايا داخل بئر واحد لتمكين حساب التيتر الفيروسية في وقت لاحق. تغيير وسائل الإعلام من الخلايا Cre-مراسل إلى وسائل الإعلام النمو تستكمل مع 10 ميكروغرام / مل البوليبريني (=سداسي الديميثرين بروميد).
- تمييع 1 ميكرولتر من الفيروس المركز مع 2 مل من وسائل الإعلام النمو. إضافة 0, 10, 50, 200 ميكرولتر من تعليق الفيروسية المخفف و 50, 200 ميكرولتر من الفيروس غير المركزة من الخطوة 2.4 ومزيج لوحات واحتضان خلال الليل في 37 °C, 5٪ CO2.
- إزالة وسائل الإعلام التي تحتوي على فيروس النمو في اليوم التالي، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني واستبدال وسائل الإعلام النمو الطبيعي. ولا يزال الناسخ الفائق في هذه المرحلة يعتبر نفايات فيروسية ويجب التخلص منه وفقا للوائح المؤسسية المتعلقة ب BSL2.
- حوالي 36-48 ساعة بعد النقل، وتقييم إعادة تركيب كري بوساطة من كاسيت Lox-STOP-Lox والتعبير عن tdTomato من قبل FACS. حساب التيتر الفيروسية. حساب وحدات تشكيل مستعمرة (cfu) / مل باستخدام الصيغة التالية:
ملاحظة: مقارنة بين تعليق الفيروسية المركزة مع supernatant الفيروسية غير المركزة سوف تسمح لتقدير نجاح (1) الإنتاج الفيروسي، فضلا عن (2) تركيز الفيروسية. بدلا من ذلك، يمكن تقدير التيتر الفيروسي باستخدام طريقة qRT-PCR10. ويمكن أيضا إنتاج وتركيز واسع النطاق من الفيروس العدسي يمكن أن يتم استخدام تركيز خطوتين مع تركيز خرطوشة تليها الطرد المركزي الفائق كما هو موضح سابقا2.
3. الجراحة الموجهة فائقة الصوت والحقن
ملاحظة: تم تكييف هذه التكنولوجيا من4،11. يجب إجراء التشنج الدقيق الموجه نحو نقل ظهارة السطح في اليوم الجنيني E9.5 ، عندما يتكون ectoderm السطح من طبقة واحدة وقبل تشكيل periderm بدءا من E10 ، مما يمنع نقل هذه الطبقة القاعدية. يفضل إعداد الفئران يوم الجمعة ، بحيث يكون أول يوم ممكن مع الأجنة E9.5 هو يوم الاثنين التالي. استخدام Rosa26-Lox-STOP-LOX-Cas9-GFP الفئران (مختبر جاكسون #024857) لتحقيق الكفاءة المثلى CRISPR/Cas912.
- إعداد الفئران المناسبة من الذكور والإناث للحمل في الوقت المحدد قبل 10 أيام من تاريخ الجراحة المطلوب.
- قم بفحص الفئران خلال الأيام التالية لتحديد الفئران الحامل المحتملة. تأكدي من الحمل قبل يوم من الجراحة المخطط لها (أي E8.5) باستخدام الموجات فوق الصوتية.
- إعداد طبق بيتري المعدلة.
- باستخدام الشريط اللاصق على الوجهين ، قم بلصق غشاء السيليكون على الجزء السفلي من طبق بيتري الذي يغطي الفتحة الدائرية. باستخدام مقص حاد، وقطع 2 × 10 مم فتحة بيضاوية في غشاء السيليكون.
- إعداد نظام الميكرويكشن
- إعداد إبر الحقن من الشعرية الزجاجية سميكة الجدران باستخدام سحب micropipette مع الإعدادات التالية: الضغط = 200; الحرارة = 769؛ سحب = 0; السرعة = 140؛ الوقت = 100.
- باستخدام مقص غرامة لقطع طرف إبرة في المستوى حيث قطرها هو ~ 30 ميكرومتر. شطب الإبرة باستخدام إبرة المبراة إلى 20 درجة على لوحة جلخ من الدرجة الدقيقة مع التبول العادية لمدة 20 دقيقة.
- تعقيم إبرة microinjection عن طريق دفع الإيثانول 70٪ باستخدام حقنة 10 مل مع إبرة 26 G1/2. باستخدام حقنة 10 مل و 26 إبرة G1/2 محملة بالزيت المعدني، ردم إبرة الحقن المجهري. تأكد من عدم وجود فقاعات في إبرة الحقن المجهري.
- جبل إبرة microinjector على micromanipulator وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- تحميل الإبرة مع مكتبة SgRNA الفيروسية.
- ماصة 10 ميكرولتر من التعليق الفيروسي على بارا فيلم ثابت على سطح مستو.
- باستخدام ميكرومانيبوتور، طرد النفط المعدني. وجود كمية صغيرة من النفط في الإبرة سيمنع الفيروس العدسي من الاتصال المكبس. تحميل حوالي 4-5 ميكرولتر تعليق الفيروسية عن طريق الطموح البطيء دون أي فقاعات الهواء.
- تخدير الماوس الحوامل باستخدام غرفة التعريفي isoflurane. تعيين منظم الأكسجين إلى 1 لتر / دقيقة ومبخر isoflurane إلى 2٪. لتحديد ما إذا كان الحيوان مخدرا، تحقق من قرصة إصبع القدم بعد ~ 3-5 دقيقة في غرفة التعريفي isoflurane.
- ضع الجانب البطني الحيواني المخدر على مرحلة الجراحة الساخنة (40 درجة مئوية) وتطبيق أشرطة الجراحة لعقد الكفوف في مكانها مع أنبوب التخدير الأنف مخروط لتوريد مستمر من الأيزوفلوران والأوكسجين حتى يتم الانتهاء من الجراحة.
- تأكدي من الحمل E9.5 إذا لم يتم في E8.5.
- تطبيق كمية صغيرة (~ 1/2 ملعقة صغيرة) من كريم إزالة الشعر إلى البطن ونشرها على مساحة 3 × 3 سم باستخدام قضيب القطن يميل.
- بعد 2-3 دقائق، قم بإزالة الكريم بلطف بالشاش أو الأنسجة ومسح المنطقة نظيفة باستخدام PBS والإيثانول بنسبة 70٪.
- باستخدام مسبار الموجات فوق الصوتية وهلام، تحقق من الماوس الحامل لليوم الجنيني E9.5. وتجدر الإشارة إلى أن هذا يمكن أن يتم أيضا في اليوم السابق في E8.5 لتوفير الوقت في يوم الجراحة الفعلية.
- إزالة هلام الموجات فوق الصوتية ومسح المنطقة نظيفة باستخدام BPS ثم الإيثانول 70٪ لتطهير.
- حقن 0.02 سم مكعب من مسكن البوبرينورفين تحت الجلد في سد الماوس.
- كشف الرحم جراحيا
- باستخدام ملقط معقم ومقص، وجعل عمودي ~ 2 سم شق في الجلد من الماوس.
- استخدام ملقط حاد فصل الجلد حول شق من الصفاق.
- باستخدام ملقط معقم ومقص، وقطع من خلال الصفاق.
- باستخدام ملقط حاد، سحب بلطف من قرن الرحم الأيسر والأييم وإحصاء الأجنة.
- إعادة إدراج معظم قرون الرحم ولكن ترك نهاية البعيدة من قرن الرحم واحد يحتوي على 3 أجنة يتعرض.
- باستخدام ملقط حاد، ودفع بلطف وسحب الرحم مع الأجنة 3 من خلال فتح في غشاء السيليكون من طبق بيتري المعدلة.
- استقرار طبق بيتري باستخدام مكعبات من الطين النمذجة.
- استقرار الرحم مع الأجنة الثلاثة داخل طبق بيتري باستخدام قالب السيليكون. تسطيح المكونات السيليكون على جانب الأجنة باستخدام سكين حادة.
- ملء طبق بيتري مع برنامج تلفزيوني عقيم. قم بغسل غشاء السيليكون في الجزء السفلي من طبق بيتري ببطن السد الحامل وبالتالي منع أي تسرب.
- تحريك رئيس الموجات فوق الصوتية في طبق بيتري ~ 0.5 سم فوق الجنين العلوي وضبط المرحلة بحيث يصبح تجويف السلى مرئية بوضوح في عرض الموجات فوق الصوتية.
- محاذاة إبرة حاقن بعناية في طبق بيتري المعدلة. باستخدام micromanipulator، ضع طرف الإبرة داخل ~ 5 مم من الجنين العلوي. ثم تبديل الإبرة ذهابا وإيابا والانتقال إلى الطائرة حيث يظهر طرفه ألمع في صورة الموجات فوق الصوتية.
- باستخدام micromanipulator دفع الإبرة من خلال جدار الرحم في تجويف السلى.
- حقن الفيروس العدسي التي تحتوي على مكتبة SgRNA.
- قبل البرنامج حاقن إلى 62 nL وسرعة الحقن بطيئة. يمكن برمجة الميكروبيكتور لحقن كميات محددة بسرعة بطيئة أو سريعة.
- اضغط على زر الحقن 8 مرات ليصل المجموع إلى 496 nL لكل جنين. ضبط مستوى الصوت للاحتياجات المطلوبة وتيتر الفيروسية. وتيتر الفيروسية من 1 × 108 pfu / مل و 496 nL حجم الحقن سيؤدي إلى ما يقرب من 30 ٪ infectivity.
- كرر نفس الإجراء للأجنة الأخرى.
- ارفع رأس الموجات فوق الصوتية وأزل قابس السيليكون.
- ادفع بلطف الأجنة ال 3 إلى بطن الفأر باستخدام مبادلة قطنية معقمة.
- سحب بلطف الأجنة 3 المقبلة وتكرار إجراء الحقن حتى يتم حقن العدد المطلوب من الأجنة.
ملاحظة: لا تتجاوز 30 دقيقة من التخدير حيث أن السدود الحامل أكثر عرضة لإجهاض أجنتها بعد ذلك الوقت. يمكن للجراح ذو الخبرة حقن ما يصل إلى 12 جنينا في غضون 30 دقيقة من الجراحة.
- رفع رئيس الموجات فوق الصوتية، وإزالة micromanipulator مع الإبرة، يستنشق برنامج تلفزيوني وإزالة طبق بتري. باستخدام مناديل معقمة، استوعب أي برنامج تلفزيوني قد يكون تراكم في تجويف البطن.
- أغلق الشق البريتوني باستخدام الغرز القابلة للامتصاص. استخدم اثنين من المواد الغذائية لإغلاق الشق في جلد البطن.
ملاحظة: أثناء إجراء عمليات جراحية فائقة الصوت موجهة في الرحم، ينبغي توخي أقصى درجات الحذر للحفاظ على بيئة نظيفة، والحفاظ على العقم قدر الإمكان وتجنب أي ملوثات محتملة. إذا كان يجب إجراء أكثر من عملية جراحية واحدة في نفس اليوم ، فمن المهم تعقيم أدوات التشريح باستخدام معقم حبة وتنظيف جهاز آخر يواجه أنسجة الماوس تنظيفها بالإيثانول. وهذا يزيد بشكل كبير من البقاء على قيد الحياة أعلى من الأجنة بعد الجراحة. معدل البقاء على قيد الحياة لطريقة الجراحة الموصوفة هنا هو باستمرار بين 80-100٪. - الرعاية بعد الجراحة.
- السماح للأنثى الحامل لاسترداد في قفص ساخن ومراقبة لمدة 15-30 دقيقة.
- تحقق من قناة المهبل بحثا عن الدم، وهي علامة مبكرة على الإجهاض والمضاعفات. لتخفيف الألم بعد العملية الجراحية، تقديم إعطاء مسكن مرتين في اليوم لمدة يومين بعد الجراحة.
- تحديد الأجنة المنقولة / حديثي الولادة Rosa26-Lox-STOP-Lox-Cas9-GFP الفئران باستخدام المجهر تشريح الفلورسنت، مصباح يدوي البروتين الفلورية والنظارات مرشح أو عن طريق genotyping للجسيمات الفيروسية المتكاملة في مقاطع الأذن أو الذيل.
ملاحظة: يتم تحديد الفئران بشكل أفضل باستخدام المجهر الفلوري حتى يوم ما بعد الولادة 3 قبل أن يبدأ الشعر في النمو. - لضمان تغطية كافية لمكتبة CRISPR، احسب التغطية استنادا إلى المعلمات التالية: تتكون ectoderm سطح الماوس E9.5 من ~ 150,000 خلية؛ و 9.5 خلية؛ و 9.5 خلية؛ و 150,000 خلية؛ و 9.5 خلية؛ و 9.5 خلية. نقل ~ 20٪ النتائج في الحد الأدنى من معدل العدوى المزدوجة (~ 1/10 الخلايا المصابة المزدوجة)4،5،11؛ في 20٪ العدوى، كل جنين لديه 30،000 الخلايا المصابة. تأكد من أن ما لا يقل عن 100 خلية فردية يتم تحويلها مع sgRNA معين. على سبيل المثال، يتطلب تجمع من 2000 sgRNAs 2 × 105 خلايا أو 6-7.
4. إجراء تسلسل عميق
- عند نقطة النهاية التجريبية مثل تكوين الورم أو أي نمط الظاهري الأخرى، التضحية الماوس وحصاد الأنسجة ذات الأهمية. استخدم مجموعة استخراج الحمض النووي للدم والأنسجة لتنقية الحمض النووي الجينومي باتباع بروتوكول الشركة المصنعة. قبل البدء في استخراج الحمض النووي من الأورام، قم بتنظيف مقعد العمل باستخدام DNA Erase واعمل بعيدا عن منطقة المختبر حيث يتم التعامل مع البلازميدات.
ملاحظة: من المهم إنشاء عينة مرجعية للسماح بحساب تغييرات طية sgRNA بمرور الوقت. يمكن للأجنة المنقولة بعد 3 أيام من العدوى أو الخلايا المنقولة (انظر الخطوة 2. 6) أن تكون بمثابة عينة مرجعية لتحديد تمثيل الزنا في المكتبة الأصلية. - استخدام 100 نانوغرام – 1.5 ميكروغرام الحمض النووي الجينومي كقالب في 50 ميكرولتر قبل تضخيم PCR 1 رد فعل باستخدام التمهيديات الخارجية المدرجة في الجدول 1 وبرنامج PCR المبينة في الجدول 2. إعداد رد فعل كاف لتحقيق التغطية المطلوبة.
ملاحظة: إعداد تفاعل PCR الباركودينج في منطقة مخصصة منفصلة من المختبر أو في غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة التي يتم تنظيفها بدقة عن طريق محو الحمض النووي لتجنب أي تلوث. تشغيل التحكم السلبي لكل لوحة PCR مع الماء كقالب للتأكد من عدم وجود تلوث. - تجمع جميع تفاعل PCR 1 وتشغيل 20 ميكرولتر على هلام agarose التحكم 1.5٪ للتحقق من تضخيم ناجحة من الفرقة 600 نقطة أساس.
- استخدام 5 ميكرولتر من تفاعل PCR1 المجمعة كقالب في 50 ميكرولتر من تفاعل PCR 2 باستخدام تركيبة التمهيدي الباركود فريدة المدرجة في الجدول 3 وبرنامج PCR المبينة في الجدول 4. تشغيل 50 ميكرولتر من تفاعل PCR 2 على هلام agarose 2٪ وتنقية الفرقة 200bp باستخدام عدة استخراج هلام وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
ملاحظة: خطوة ما قبل التضخيم مطلوبة فقط لتضخيم الأنسجة المعقدة المنقولة. إذا تضخيم ورم واحد التي يفترض أن وضعت تشكل خلية الاستنساخ وبالتالي يحتوي على sgRNA واحد فقط، يمكن للمرء أن تخطي PCR1 ما قبل التضخيم والمضي قدما على الفور مع PCR2. - تحديد تركيز الحمض النووي باستخدام القياس الكمي الفلوري وإرساله للتسلسل العميق إلى مرفق التسلسل (على سبيل المثال، 1 مليون قراءة لكل ورم).
- استخدام Bowtie v1.2.3، والذي يسمح فقط التحالفات ungapped، محاذاة قراءات تسلسلية لمكتبة SgRNA13. إنشاء فهرس bowtie باستخدام bowtie بناء الأمر إدخال تسلسل sgRNA في شكل fasta. تعيين القراءات باستخدام الأمر bowtie مع خيارات -m 2 -v 1، والذي يسمح بحد أقصى اثنين من عدم التطابق أثناء محاذاة القراءة ويتجاهل القراءات التي محاذاة أكثر من تسلسل sgRNA مكتبة واحدة. بشكل عام، أكثر من 80٪ من القراءات محاذاة ضمن هذه المعلمات.
- استخدم الأمر عدد MAGeCK للحصول على جدول عدد القراءة باستخدام الملف المتوائم كمدخلات14. يمكن استخدام جدول العد sgRNA لتحليل المصب مثل, تحديد الفرق في sgRNA (MAGeCK) وإيجاد الجينات الأساسية (BAGEL).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الشكل 1A يظهر تصميم oligonucleotides لتعدد عدة مكتبات CRISPR مخصصة بطريقة فعالة من حيث التكلفة في رقاقة أوليغو 12k أو 92k واحد. بمجرد اختيار sgRNAs (اللون الأزرق المرمز) ، تم تصميم oligonucleotides مع مواقع تقييد (BsmBI اللون البرتقالي) وأزواج التمهيدي PCR محددة للمكتبة (مرمزة باللون الأخضر). يمكن تصميم العديد من المكتبات باستخدام مزيج فريد من أزواج التمهيدي لتعدد في رقاقة أوليغو واحدة. عندما PCR تضخيم المكتبات باستخدام زوج محدد PCR التمهيدي، وتشمل دائما السيطرة السلبية المياه فقط وتشغيل جميع ردود الفعل على هلام agarose. يجب ألا يكون لمسار التحكم السلبي أي نطاقات عند 100 نقطة أساس ، في حين يجب أن يكون لممر المكتبة المضخم نطاق واحد 100 bp. إذا لم يكن هناك نطاق، تأكد من تحديد زوج التمهيدي PCR بشكل مناسب. ويبين الشكل 1ب خطوة مراقبة الجودة للمكتبة المستنسخة وإجراءات الإنتاج والتركيز الفيروسية. وينبغي الحرص على الحفاظ على التمثيل المتساوي للزغازات الرنانة من الاستنساخ حتى النقل. الجيل القادم من تسلسل يقرأ PCR تضخيم الحمض النووي من الخلايا المنقولة مكتبة البلازميد والفيروسية العدسية ينبغي أن تظهر علاقة عالية. يجب تحليل أي انحراف بعناية لفحص ما إذا كان يتم فقدان التمثيل قبل أو بعد إعداد الفيروسات العدسية. إذا كان يقرأ SGRNA من الحمض النووي البلازميد لا تظهر التمثيل المتساوي من SgRNAs، ثم يجب أن يتكرر إعداد الفيروسية وإجراء التركيز بعناية. إذا كان فقدان تمثيل sgRNA متساوية وقعت في الحمض النووي البلازميد، ثم يجب أن يتكرر إجراء الاستنساخ بأكمله بما في ذلك تضخيم PCR من المكتبات من رقاقة أوليغو مع انخفاض دورات التضخيم. يعتمد نجاح فحص مكتبة CRISPR بشكل حاسم على التمثيل المتساوي لل SgRNAs الموجودة في المكتبة.
يظهر الشكل 2 الحقن الدقيق الموجه بالموجات فوق الصوتية الذي تم إعداده للتلاعب بالأجنة E9.5 في الماوس الحامل. يتم وضع الإعداد بأكمله تحت خزانة مستوى السلامة الحيوية من الدرجة الثانية للحفاظ على الحالة العقيمة للإجراء بأكمله وتجنب أي عدوى في الماوس الحامل بسبب العمليات الجراحية. يجب توخي الحذر لتجنب الضغط على قرون الرحم أثناء الحقن. يجب أن تكون الإبرة حادة جدا ، بحيث يكون الجرح على جدار الرحم والغشاء السلوي ضئيلا.
ويبين الشكل 3 نتائج الحقن الموجه فائق الصوت لفيروس لينتي الحامل لفيروس كري - إعادة الكومبيناسي في E9.5 Lox-stop-Lox (LSL) جراء فأرة Confetti في يوم ما بعد الولادة (P)0. يمكن تعديل التيتر الفيروسي للحصول على تغطية نقل مناسبة للبشرة. في حين أن ارتفاع titer من الفيروس من شأنه أن يؤدي إلى تغطية أكبر من جلد الماوس، فإنه سيؤدي أيضا إلى نقل sgRNAs متعددة في نفس الخلية يحتمل أن تخلط بين النتائج. للحد من عمليات نقل متعددة لخلية واحدة، ينبغي الحفاظ على معدل العدوى < 20٪.
ويبين الشكل 4 قراءات الجيل التالي من تسلسل PCR تضخيم الحمض النووي من الخلايا المنقولة مكتبة بلازميد و lenti الفيروسية ويقرأ أيضا من 4 أورام تمثيلية. يتم إثراء أدلة sgRNA التي تستهدف Adam10 و Ripk4 في عينات الورم (المثلثات والماس) مقارنة بعرض SgRNA في بركة البلازميد أو الخلايا المصابة. Adam10 وRipk4 وظيفة كمثبطات الورم5. يمكن مضاعفة عدة مئات من الأورام عن طريق تعيين الباركود الفريد لكل عينة وتسلسل عميق كما هو موضح في البروتوكول.
الشكل 1: استنساخ مكتبة كريسبر المستهدفة. (أ) التخطيطي تمثل تصميم oligonucleotides ل12 ك أو 92 ك مخصصة رقاقة أوليغو. تمت إضافة مواقع تقييد BsmBI (أو غيرها من المواقع المتوافقة) (اللون البرتقالي المرمز والمتسطر) على كل جانب من SgRNA. تشير رؤوس الأسهم إلى موقع قطع BsmBI. لكل مكتبة، تمت إضافة زوج فريد من التمهيديات PCR (الأخضر والبني والأرجواني مرمزة)، بحيث يمكن تضخيمها على وجه التحديد باستخدام PCR من رقاقة مجمعة. يمكن تعدد عدة مكتبات مخصصة تصل إلى 12k أو 92k oligos. (ب)رسم بياني يظهر تمثيل SgRNA من مكتبة CRISPR في الحمض النووي البلازميد مقابل الحمض النووي من الخلايا المنقولة مع نفس المكتبة العدسية. تمثل كل نقطة دليلا. تم الحفاظ على التمثيل الكامل بعد النقل مع بعض الارتباط في وفرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: صورة لإعداد الموجات فوق الصوتية الموجهة بالموجات الدقيقة. (أ)تم تخدير الماوس الذي يحمل أجنة E9.5 ووضعها على منصة ساخنة مع الرحم المكشوف في غرفة طبق بيتري المعدلة (استقرت بأربعة طين نمذجة). دعم المطاط الأزرق شبه المستدير الرحم الذي يحتوي على أجنة ويتم وضع إبرة الحقن من الحقن الدقيق على الجانب الأيمن. تم تركيب رأس الفحص بالموجات فوق الصوتية على الجزء العلوي من ترحيل الصورة الحية إلى الشاشة خلفها مع رؤية رأس الإبرة. (ب) صورة فائقة الصوت عن قرب لجنين E9.5. تم حقن مكتبة لينتيفيرال بالإبرة (ينظر على الجانب الأيمن) في تجويف السلى. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: نجاح نقل ظهارة السطح في الماوس. صور الفلورسنت من الجسم كله، تجويف الفم، اللسان، والحنك من حديثي الولادة كريم مراسل LSL-Confetti الفئران المنقولة مع فيروس ليندي كريم (مدخل: صور الضوء الأبيض المقابلة). أشرطة المقياس = 500 ميكرومتر يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التسلسل العميق لعينات الورم. الرسم البياني الذي يظهر تمثيل SgRNA من مكتبة CRISPR في الحمض النووي البلازميد مقابل الحمض النووي من الخلايا المنقولة مع نفس المكتبة العدسية بالإضافة إلى قراءات من 4 أورام تمثيلية. تشير الدوائر الحمراء والخضراء إلى عدد قراءات Adam10 و Ripk4 sgRNA في المكتبة والخلايا المنقولة في حين يمثل المثلث الأحمر قراءات Adam10 sgRNAs ويمثل الماس الأخضر قراءات من RIPK4 sgRNAs المحددة في الأورام من فئران HNSCC المنفصلة التي تظهر إثراء أضعاف 1000x. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| PCR1 التمهيدي الأمامي | غاغكاتاتكاتكاتكاتك |
| PCR1 التمهيدي العكسي | كااكاججككتغكاتغا |
الجدول 1: التهيئة لرد فعل PCR1. التمهيديات الأمامية والعكسية المستخدمة لتضخيم المنطقة المحيطة كاسيت SgRNA من الحمض النووي الجينومي للخلايا المنقولة مع فيروس ليندي.
| درج | درجة الحرارة | الوقت | |
| 1 | 98 درجة مئوية | 30 ثانية | |
| 2 | 98 درجة مئوية | 10 ثانية | |
| 3 | 66 درجة مئوية | 30 ثانية | |
| 4 | 72 درجة مئوية | 15 ثانية | 15 دورة (الخطوة 2-4) |
| 5 | 72 درجة مئوية | دقيقتان | |
| 6 | 4 درجة مئوية | مسك |
الجدول 2: بارامترات دورة PCR1. شروط PCR المستخدمة لتضخيم المنطقة المحيطة كاسيت SgRNA من الحمض النووي الجينومي للخلايا المنقولة مع فيروس ليندي.
| 501 FW | أاتغاتاكجاكاكاسغاغاتكاتاكاتاغاتاكتكتكتاكاتاكاتش ACGCTCTTCCGATCTtgtggagaaaCACCG |
||
| 701 RV | كاغاغاغاغاتسغاتاغتغاتاغاتغاغاكتغاكت CTTCCغاتكاتاتاتاكتاتاكتكتاتكتاتاك |
||
| * تشير القواعد المسطرة إلى موقع الباركود Illumina (D501-510 للأمام و D701-712 للعكس) الذي تم استخدامه للتعدد. | |||
| * قواعد ملونة حمراء تشير إلى التسلسل الذي يربط إلى الموقع المستهدف على plasmid كريسبر lentiviral. ويمكن تعديل هذه المنطقة وفقا لنقل العدسية المستخدمة. | |||
الجدول 3: تهيئة الجداول لرد فعل PCR2. تستخدم التمهيديات لتضخيم كل عينة ورم (إما مباشرة من الحمض النووي الجينومي أو باستخدام المنتجات من PCR1 كقالب). تشير المنطقة المسطرة إلى منطقة الباركود الفريدة التي يمكن تعيينها لكل عينة للتعدد في رد فعل تسلسل عميق. تشير أزواج القاعدة الملونة الحمراء إلى المنطقة المستهدفة في البنية العدسية التي تربطها هذه المبرمجين. ويمكن تعديل هذه المنطقة المستهدفة وفقا لنوع البناء العدسي المستخدم.
| درج | درجة الحرارة | الوقت | |
| 1 | 98 درجة مئوية | 30 ثانية | |
| 2 | 98 درجة مئوية | 10 ثانية | |
| 3 | 68 درجة مئوية | 30 ثانية | |
| 4 | 72 درجة مئوية | 15 ثانية | 10 دورات (الخطوة 2-4) |
| 5 | 72 درجة مئوية | دقيقتان | |
| 6 | 4 درجة مئوية | مسك |
الجدول 4: معلمات دورة PCR2. شروط PCR المستخدمة لتضخيم الباركود كل عينة الورم (إما مباشرة من الحمض النووي الجينومي أو باستخدام المنتجات من PCR1 كقالب).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد تم استخدام تحرير الجينوم CRISPR/Cas9 على نطاق واسع في المختبر وفي الدراسات الحية للتحقيق في وظائف الجينات والعمليات الخلوية. معظم الدراسات في الجسم الحي الاستفادة كريسبر / Cas9 الجينات تحرير الخلايا المطعمة في نموذج حيواني (allograft أو xenograft). في حين أن هذا هو أداة قوية لدراسة علم الوراثة السرطان والوظائف الخلوية، فإنه لا يزال يفتقر إلى البيئة الدقيقة الأنسجة الأصلية، وربما تثير الجروح و / أو الاستجابات المناعية.
للتغلب على هذه التحديات، وقد رائدة عدة مجموعات مباشرة في نهج فيفو CRISPR توليد عدة، نماذج الماوس autochthonous متعددة على مدى السنوات القليلة الماضية15،16،17،18. وتعتمد هذه المشاريع عادة على الفيروس المرتبط بال أدينو (AAV) لإيصال الزغازات الرنانة إلى الأعضاء المستهدفة. AAV يسمح لتوليد من titer أعلى جدا مما يسهل إنتاج عالية تيتر الفيروس المطلوبة للتلاعب في الجسم الحي. ومع ذلك ، فإن استخدام AAVs يحد بشدة من عدد الجينات التي يمكن تحليلها إلى حوالي 40-50 جينا ، حيث أن AAVs ، على عكس الفيروس العدسي ، لا تندمج بشكل ثابت في الحمض النووي الجينومي ، مما يجعل قراءة مكتبات sgRNA غير عملية. يتطلب الفحص القائم على AAV قراءة مباشرة للطفرات في المواقع المستهدفة باستخدام تسلسل الالتقاط المستهدف على سبيل المثال. ومع ذلك ، متعددة PCR القائمة على تسلسل التقاط يحد من عدد الأهداف التي يمكن التقاطها في مكتبة "للفحص" عادة إلى ترتيب عشرات15،16،17،18.
بالمقارنة مع AAV في شاشات VIVO CRISPR ، تستخدم المنهجية الموصوفة هنا SgRNAs العدسية. وبالنظر إلى أن يبني lentiviral دمج في الحمض النووي للخلية المستهدفة، يمكن تحليل تمثيل SgRNA في الحمض النووي الجينوم مماثلة لأي شاشات CRISPR التقليدية19،20. وهكذا، تسمح هذه المنهجية بإجراء تحليل متزامن لمئات الجينات ويمكن توسيع نطاقها بسلاسة حتى على نطاق الجينوم في شاشات الجسم الحي. على سبيل المثال، تتطلب شاشة على نطاق الجينوم مع 78،000 sgRNAs وتغطية 30x ~ 90 الأجنة كما هو موضح سابقا لشاشة SHRNA مماثلة4. كما أحجام القمامة من سلالات الماوس الأصيل الأكثر شيوعا حوالي 8-12 الجراء / القمامة وجراح من ذوي الخبرة يمكن بسهولة حقن جميع الفئران داخل أصغر قليلا، فقط حوالي ~ 10-12 السدود والعمليات الجراحية ستكون هناك حاجة لمثل هذه الشاشة الجينوم واسعة.
نجاح شاشة في الجسم الحي يتوقف على إنتاج فيروس التيتر عالية. في حين أن البنى العدسية التي تعبر عن SgRNA من الفائدة ، Cas9 و Cre (على سبيل المثال ، pSECC) هي حل شامل ومريح وممكن ، إلا أن لديهم حد التعبئة والتغليف ل lentiviral capsid (~ 10 kb في الحجم الإجمالي) ، مما يؤدي إلى انخفاض إجمالي في titer الفيروسي. للتغلب على هذا التحدي، ونحن نستخدم R26-LSL-Cas9-GFP الفئران وبناء lenti الفيروسية التي تحتوي فقط على كري-recombinase جنبا إلى جنب مع sgRNA. بناء lentiviral الناتجة ليست سوى 7 كيلوبايت في الطول وتسفر عن titer الفيروسية من أكثر من 108 PFU / مل.
يمكن إنشاء مكتبات مستهدفة ومحددة بسرعة في أقل من بضعة أيام ويمكن دراسة الشبكة المعقدة من التفاعلات الجينية في الجسم الحي في غضون أسابيع قليلة. يمكن إجراء تكوين الطفرات بوساطة Cas9 إما في الفئران البرية لدراسة تطور الأعضاء أو التوازن أو الأنماط الظاهرية للمرض (السرطان أو الأمراض الجلدية الالتهابية ، وما إلى ذلك) أو يمكن دمجها بسهولة مع الفئران التي تؤوي أي طفرات أو مزيج من الطفرات لنمذجة الحالة الوراثية الموجودة في المرضى البشريين. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تنقيح منهجية الاستنساخ لاستنساخ مكتبات CRISPRa أو CRISPRi عن طريق إضافة مواقع تقييد متوافقة وتسلسل SGRNA في البلازميد الكل في واحد. وتجدر الإشارة إلى أن جميع المكتبات التي تعالج وظائف الجينات يمكن استخدامها ليس فقط في نماذج الماوس ولكن أيضا في نماذج حيوانية أخرى وفي الثقافات العضوية. معا، تسلط هذه المنهجية الضوء على الأداة المساعدة وتوفر لوحة تستخدم مباشرة في vivo CRISPR لدمج تحرير الجينات الجسدية ونمذجة الماوس لتقييم وظيفة الجينات بسرعة في الجسم الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل منحة مشروع من المعهد الكندي للبحوث الصحية (CIHR 365252) ومؤسسة كريمبيل وجولة التميز البحثي لصندوق أونتاريو للبحوث الجولة 8 (RE08-065). سامباث كومار لوغاناثان هو الحاصل على زمالة الجمعية الكندية للسرطان (BC-F-16#31919).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 micron filter | Sigma | S2HVU02RE | |
| 12k or 92k oligo chip | Customarray Inc. (Genscript) | ||
| 15 cm cell culture plates | Corning | ||
| 293FT | Invitrogen | R70007 | |
| 293NT | Systems Biosciences | LV900A-1 | |
| Alkaline phosphatase | NEB | M0290L | |
| Amplicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | |
| ATP | NEB | 9804S | |
| BsmBI | NEB | R0580L | |
| Chromic gut suture | Covidien | ||
| Deep sequencing (Next-Seq or Hi-Seq) | Illumina | ||
| DNA-cleanup kit | Zymo Research | D4008 | |
| DNAesy Blood and Tissue DNA extraction kit | Qiagen | 69506 | |
| Endura electrocompetent cells | Lucigen | 60242-1 | |
| Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| High-Speed Centrifuge | Beckman Coulter | MLS-50 | |
| LB Agar | Wisent Technologies | 800-011-LG | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Mini-prep plasmid Kit | Frogga Bio | PDH300 | |
| Mouse oxygen anaesthesia system | Visual Sonics | ||
| Nanoject II micromanipulator | Drummond | ||
| NEBuffer 3.1 (Buffer for BsmBI) | NEB | R0580L | |
| Needle sharpener | Sutter Instrument | BV-10 | |
| Oligo cleanup kit | Zymo research | D4060 | |
| PAGE purified illumina sequencing primer | IDT DNA | ||
| PEI (polyethyleneimine) | Sigma | 408727-100ML | |
| Permoplast modeling clay | |||
| Petridish with central opening | Visual Sonics | ||
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| Q5 Polymerase 2x Master mix | NEB | M0494L | |
| Qubit Fluorometric Quantification | Invitrogen | Q33327 | |
| Semicircular Silicone plug | Corning | ||
| Silicone membrane | Visual Sonics | ||
| T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
| Ultra-centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
| Vevo2000 ultrasound system | Visual Sonics |
References
- Beronja, S., Fuchs, E. RNAi-mediated gene function analysis in skin. Methods in Molecular Biology. 961, 351-361 (2013).
- Beronja, S., Livshits, G., Williams, S., Fuchs, E. Rapid functional dissection of genetic networks via tissue-specific transduction and RNAi in mouse embryos. Nature Medicine. 16, 821-827 (2010).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343, 84-87 (2014).
- Beronja, S., et al. RNAi screens in mice identify physiological regulators of oncogenic growth. Nature. 501, 185-190 (2013).
- Loganathan, S. K., et al. Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling. Science. 367, 1264-1269 (2020).
- Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. The molecular landscape of head and neck cancer. Nature Reviews Cancer. 18, 269-282 (2018).
- Green, A. C., Olsen, C. M. Cutaneous squamous cell carcinoma: an epidemiological review. British Journal of Dermatology. 177, 373-381 (2017).
- Campbell, J. D., et al. pathway network, and immunologic features distinguishing squamous carcinomas. Cell Reports. 23, 194-212 (2018).
- Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11, 783-784 (2014).
- Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnology. 6, 34 (2006).
- Schramek, D., et al. Direct in vivo RNAi screen unveils myosin IIa as a tumor suppressor of squamous cell carcinomas. Science. 343, 309-313 (2014).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159, 440-455 (2014).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10, 25 (2009).
- Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens. Genome Biology. 15, 554 (2014).
- Winters, I. P., Murray, C. W., Winslow, M. M. Towards quantitative and multiplexed in vivo functional cancer genomics. Nature Reviews Genetics. 19, 741-755 (2018).
- Rogers, Z. N., et al. Mapping the in vivo fitness landscape of lung adenocarcinoma tumor suppression in mice. Nature Genetics. 50, 483-486 (2018).
- Chow, R. D., et al. AAV-mediated direct in vivo CRISPR screen identifies functional suppressors in glioblastoma. Nature Neuroscience. 20, 1329-1341 (2017).
- Wang, G., et al. Mapping a functional cancer genome atlas of tumor suppressors in mouse liver using AAV-CRISPR–mediated direct in vivo screening. Science Advances. 4, 5508 (2018).
- Chan, K., Tong, A. H. Y., Brown, K. R., Mero, P., Moffat, J. Pooled CRISPR-based genetic screens in mammalian cells. Journal of Visualized Experiments. (151), e59780 (2019).
- Hart, T., et al. High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities. Cell. 163, 1515-1526 (2015).
