Summary
Ici nous décrivons une méthodologie rapide et directe de criblage d’in vivo CRISPR/Cas9 utilisant des injections lentiviral embryonnaires ultrason-guidées dans utero pour évaluer simultanément des fonctions de plusieurs gènes dans la peau et la cavité buccale des souris immunocompétentes.
Abstract
Les modèles de souris génétiquement modifiés (GEMM) ont joué un rôle déterminant dans l’évaluation de la fonction génétique, la modélisation des maladies humaines et le modèle préclinique d’évaluation des avenues thérapeutiques. Cependant, leur nature de temps, de travail et de coût-intensive limite leur utilité pour l’analyse systématique de la fonction de gène. Les progrès récents des technologies d’édition du génome surmontent ces limitations et permettent la génération rapide de perturbations génétiques spécifiques directement dans des organes de souris spécifiques d’une manière multiplexée et rapide. Ici, nous décrivons une méthode basée sur CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) pour générer des milliers de clones knock-out génétiques dans l’épithélium de la peau et de la cavité buccale des souris, et fournir un protocole détaillant les étapes nécessaires pour effectuer un écran CRISPR in vivo direct pour les gènes suppresseurs de tumeurs. Cette approche peut être appliquée à d’autres organes ou à d’autres technologies CRISPR/Cas9 telles que CRISPR-activation ou CRISPR-inactivation pour étudier la fonction biologique des gènes pendant l’homéostasie tissulaire ou dans divers contextes de maladies.
Introduction
L’un des défis de la recherche sur le cancer à l’ère postgénomique est d’extraire la grande quantité de données génomiques pour les mutations génétiques causales et d’identifier les nœuds du réseau génétique qui peuvent être ciblés thérapeutiquement. Alors que les analyses bioinformatiques ont énormément contribué à atteindre ces objectifs, l’établissement de modèles in vitro et in vivo efficaces est une condition préalable pour déchiffrer la complexité des systèmes biologiques et des états de la maladie et pour permettre le développement de médicaments. Alors que les modèles conventionnels de souris transgéniques ont été largement utilisés pour les études génétiques in vivo sur le cancer, leur nature à forte intensité de coût, de temps et de main-d’œuvre a largement interdit l’analyse systématique des centaines de gènes du cancer putatifs démêlés par la génomique moderne. Pour surmonter ce goulot d’étranglement, nous avons combiné une méthodologie d’injection in utero guidée par ultrasonsprécédemment établie 1,2 avec une technologie d’édition de gènes CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)3 pour induire et étudier simultanément des mutations de perte de fonction de centaines de gènes dans la peau et la cavité buccale d’une seule souris.
La méthodologie décrite ici utilise des injections guidées par ultrasons de lentivirus modifiés dans la cavité amniotique des embryons vivants de souris au jour embryonnaire E9.5. La cargaison lentivirale contenant des composants CRISPR/Cas9 transduisent l’ectoderm de surface à une seule couche, ce qui donne plus tard naissance à l’épithélium de la peau et de la cavité buccale. La peau est composée d’un épiderme externe, suivi d’une membrane et d’un derme du sous-sol. Epidermis est un épithélium stratifié composé d’une couche interne basale, qui maintient le contact avec la membrane du sous-sol et a une capacité proliférative et de cellules souches. La couche basale donne lieu aux couches différenciées ci-dessus telles que les couches de cornée épineuses, granulaires et stratiques2,4. Les études de traçage de lignée ment montrent que cette méthode directe in vivo CRISPR/Cas9 manipule génétiquement les cellules souches résidentes des tissus dans la couche basale qui persistent tout au long de l’âge adulte. Comme le lentivirus peut être titré pour transduire l’ectoderme de surface E9.5 à la densité clonale, cette méthode peut être utilisée pour générer des souris mosaïques hébergeant des milliers de clones discrets knock-out gène. Le séquençage de prochaine génération peut ensuite être utilisé pour analyser l’effet de l’ablation des gènes crispr/cas9 dans ces clones d’une manière multiplexée5.
Nous avons récemment utilisé cette méthode pour évaluer la fonction de 484 gènes qui montrent des mutations récurrentes dans le carcinome épilemous de tête et de cou humain (HNSCC)5. HNSCC est un cancer dévastateur avec un taux de mortalité élevé de 40-50% et il estle 6ème cancer le plus commun dansle monde entier 6. Le HNSCC se présente dans les muqueux des voies respiratoires supérieures ou de la cavité buccale et est associé à la consommation de tabac et d’alcool ou à l’infection par le virus du papillome humain (VPH). Le carcinome cutané de cellules squamous (CSC) sont des tumeurs de peau et représentent le deuxième cancer le plus commun chez l’homme7. Le CSC cutané et le HNSCC sont histologiquement et moléculairement très semblables, avec un pourcentage élevé de cas présentant l’altération dans TP53, PIK3CA, NOTCH1, et HRAS8. Bien qu’il n’y ait qu’une poignée de gènes mutés à haute fréquence, il existe des centaines de gènes trouvés mutés à basse fréquence (et 5 %), un phénomène communément appelé la distribution à longue queue. Comme la majorité des gènes à longue queue n’ont pas de validation biologique ou clinique, nous avons utilisé cette technologie de dépistage IN vivo CRISPR pour modéliser la perte de fonction de ces gènes chez les souris sujettes aux tumeurs avec des mutations sensibilisantes dans p53, Pik3ca ou Hras et identifié plusieurs nouveaux gènes suppresseurs de tumeur qui coopèrent avec p53, Pik3ca ou Hras pour déclencher le développementtumoral 5.
Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour générer des bibliothèques de sgRNA lentiviral CRISPR sgRNA multiplexed et effectuer crispr/cas9 gène knock-out écrans dans l’ectoderm surface de la souris. Il convient de noter que cette méthodologie peut être adaptée pour intégrer d’autres technologies de manipulation génétique telles que l’activation CRISPR (CRISPRa) et l’inactivation CRISPR (CRISPRi) ou modifiée pour cibler d’autres systèmes organiques chez la souris pour étudier les fonctions génétiques.
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Protocol
Ce protocole a été approuvé et exécuté conformément à l’IACUC de l’Université de Toronto.
1. Conception et clonage de bibliothèques CRISPR en commun
- Sélectionnez 4-5 sgARN ciblant les gènes de souris d’intérêt à partir de ressources telles que le concepteur sgRNA broad institute (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) ou chopchop serveur (https://chopchop.cbu.uib.no). Sélectionnez un nombre égal d’ARN sgRNA non ciblés à partir de Sanjana et coll.9, par exemple, afin de générer une bibliothèque de gRNA de contrôle s’œnant de taille égale.
- Lors de la construction des bibliothèques sgRNA, assurez-vous qu’il y a suffisamment de couverture pour chaque sgRNA dans le système d’organes ciblé. Pour la peau de souris, l’épiderme à E9.5 est une seule couche qui contient ~150.000 cellules, dont la plupart ont la capacité de cellules souches4. Si la transduction lenti-virale entraîne une infectiosité de 15 à 20 %, seulement 18 000 à 24 000 cellules seront transduites à l’E9,5. Échelle de l’expérience en conséquence.
- Pour le clonage et l’amplification de ces bibliothèques sgRNA, ajouter des sites de restriction enzymatique BsmBI ainsi que des séquences d’ADN liant l’amorce à 5' et 3' fin de la sgRNA et commander les oligos de pleine longueur résultant comme puce oligonucléotide mis en commun (Figure 1A).
- Pour multiplexer différentes bibliothèques sur une seule puce, ajoutez des séquences d’amorce spécifiques à la bibliothèque.
- À l’aide des paires d’amorce appropriées, amplifiez chaque bibliothèque séparément de la puce oligo mise en commun. Dans un tube PCR, mélanger 25 μL de mélange principal de polymélas 2 x, 20 μL d’eau libre DNase/RNase, 5 ng d’ADN de puce oligo, 2,5 μL d’amorce avant appropriée et 2,5 μL d’amorce inversée appropriée. Utilisez 12-15 cycles et amplifiez avec 98 °C denaturation, 63-67 °C annealing, 72 °C paramètres d’extension pour chaque cycle dans la machine PCR.
- Exécutez le produit PCR sur un gel d’agarose de 2,5 % et purifiez ~100 bp PCR produit à l’aide d’un kit de nettoyage de l’ADN gel.
- Préparer le plasmide épine dorsale.
- Digérer 5 μg de la Cre-recombinase contenant du pLKO-Cre stuffer v3 plasmide avec 2 μL de BsmBI dans un mélange de réaction de 50 μL pendant 1 h à 55 °C, suivi de 1 μL d’incubation de phosphatase alcaline pendant 45 min à 37 °C selon les instructions du fabricant.
REMARQUE : Cre-recombinase contenant pLKO-Cre stuffer v3 plasmide est un plasmide à base de lenti-viral qui contient l’enzyme Cre-recombinase pour enlever la cassette Lox-Stop-Lox dans les cellules de souris et a également un promoteur U6 pour conduire l’expression de sgRNA et tracrRNA. Une version avec Cas9 et sans Cas9 peut être utilisée et disponible sur Addgene #158030 et #158031. - Exécutez l’ADN digéré sur un gel d’agarose de 1 % et purifiez la bande vectorielle linéarisée de 7 kb à l’aide d’un kit de nettoyage de l’ADN du gel. Il convient de noter qu’une bande de farce de 2 kb doit également être visible indiquant un digest réussi.
- Digérer 5 μg de la Cre-recombinase contenant du pLKO-Cre stuffer v3 plasmide avec 2 μL de BsmBI dans un mélange de réaction de 50 μL pendant 1 h à 55 °C, suivi de 1 μL d’incubation de phosphatase alcaline pendant 45 min à 37 °C selon les instructions du fabricant.
- Configurer la réaction de ligature pour générer une bibliothèque plasmide sgRNA.
- Mélanger 1 μg de vecteur purifié et 30 ng d’insert PCR purifié avec 2 μL de BsmBI, 5 μL de ligase d’ADN T4, 10 μM ATP et 1x tampon spécifique à BsmBI. Incuber le mélange de ligature toute la nuit à 37 °C. Utilisez un tube supplémentaire contenant tous les matériaux ci-dessus, sauf l’insert PCR comme un contrôle négatif.
- Le lendemain matin, purifier le mélange de ligature à l’aide du kit de nettoyage oligo et elute dans 7 μL d’eau libre RNase/DNase.
- Électroporer la bibliothèque en cellules compétentes.
- Ajouter 2 μL de bibliothèque sgRNA élitée ou de mélange de ligature de contrôle négatif à 25 μL de cellules électrocompétentes décongelées dans des cuvettes pré-réfrigérées (1,0 mm) sur la glace. Électroporate suivant le protocole du fabricant (10 μF, 600 Ohms, 1800 Volts). À la cuvette ajouter 975 μL de milieu de récupération (ou milieu SOC) dans les 10 s de l’impulsion.
- Transférer les cellules électroporées dans un tube de culture et incuber pendant une heure à 37 °C dans un incubateur de secousses bactériennes à 300 rpm.
- Estimer l’efficacité de la transformation et la couverture de la bibliothèque par sgRNA.
- Préparer une dilution 100 fois en transférant 10 μL de la réaction de transformation contenant des cellules électroporées avec la bibliothèque sgRNA ou la ligature de contrôle négatif à 990 μL de Recovery Medium et bien mélanger.
- Plaque 10 μL du mélange de transformation dilué sur une plaque d’agar préchauffée de 10 cm LB + ampicilline (100 μg/L). Il en résulte une dilution 10 000 fois des transformateurs et l’utilisation de cette plaque pour calculer l’efficacité de la transformation. Effectuer l’incubation des plaques à 30 °C pendant 14-16 h.
- Plaquez le reste de la réaction de transformation en étalant 100 μL de cellules récupérées sur chaque plaque d’un total de 10 plaques d’agar préchauffées de 15 cm LB + ampicilline. Incuber les plaques de 14 à 16 h à 30 °C. Il convient de noter que la croissance à 30 °C minimise la recombinaison entre les deux répétitions terminales à long terme dans le plasmide viral.
- Pour évaluer le succès du clonage, calculer l’efficacité de la transformation. Comptez le nombre de colonies sur la plaque de dilution contenant des transformateurs de la bibliothèque sgRNA ou la ligature de contrôle négatif (plaques de 10 cm, étape 1.8.2). Le mélange de contrôle négatif ne devrait pas avoir ou seulement très peu de colonies. Pour obtenir le nombre total de colonies, multipliez le nombre de colonies par 10 000.
REMARQUE : Le nombre total de colonies comptées représente une couverture de bibliothèque qui devrait être d’au moins 200 x colonies par SGRNA.- Assurez-vous qu’une bibliothèque de 2000 sgARN comptera au moins 400 000 colonies. Dans le cas où il n’y aurait pas assez de colonies, répéter et mettre en place plus d’électroporation.
- Contrôle de la qualité : À partir de la plaque de dilution, choisissez 20 colonies et ajoutez chaque colonie à un tube de culture individuel contenant 3 mL de lb de médias + ampicilline. Incuber les 20 tubes toute la nuit à 30 °C secouant à 250 rpm. Purifier l’ADN plasmide à l’aide d’un kit de mini-préparation selon les instructions du fabricant et la séquence Sanger tous les 20 échantillons d’ADN plasmide pour vérifier chaque échantillon a une séquence sgRNA différente en utilisant l’amorce U6 (5'-GAG GGC CTA TTT CCC ATG ATT CC-3').
- Récolter les colonies à partir de chaque plaque de 15 cm.
- Ajouter 7 mL de LB moyen, puis gratter les colonies de la plaque LB Agar à l’avec un épéiste cellulaire. Utilisez une pipette de 10 mL pour transférer les cellules dans un flacon conique stérile de 2 L. Répéter l’répétition pour toutes les plaques et les bactéries de la piscine dans le flacon de 2 L. Incuber le flacon pendant 2-3 h en secouant à 30 °C. Centrifugez la culture et recueillez la pastille.
- Purifier l’ADN plasmide à l’aide d’un kit de purification maxi-plasmide.
- Contrôle de qualité supplémentaire : Utilisez 1 ng d’ADN plasmide de bibliothèque sgRNA maxi-prep et exécutez une réaction PCR à l’aide d’amorce séquençage de nouvelle génération selon les instructions du fabricant. La représentation de tous les sgARN dans la bibliothèque peut être vérifiée par plate-forme de séquençage profond.
2. Production de lentivirus à haut litre adapté à la transduction in vivo
REMARQUE : Effectuez toutes les étapes de cette section du protocole dans une installation BSL2+ dans une armoire de biosécurité de type II de type A2. 293FT et surtout les cellules d’emballage 293NT permettent une production de virus plus élevée. Utilisez des cellules à faible passage ( 3. Chirurgie guidée ultra-sonore et injection NOTE: Cette technologie a été adaptée de4,11. La microinjection orientée vers la transduction de l’épithélium de surface doit être effectuée au jour embryonnaire E9.5, lorsque l’ectoderm de surface se compose d’une seule couche et avant la formation du periderme à partir de E10, ce qui empêcherait la transduction de cette couche basale. De préférence mettre en place des souris le vendredi, de sorte que le premier jour possible avec e9,5 embryons est le lundi suivant. Utilisez des souris Rosa26-Lox-STOP-LOX-Cas9-GFP (Jackson Laboratory #024857) pour une efficacité optimale CRISPR/Cas912. 4. Procédure de séquençage en profondeur
REMARQUE : Utilisez toujours une bouteille de DMEM non ouverte ou très récemment ouverte pour la transfection, car le pH à cette étape est critique, et le DMEM devient plus basique au fil du temps une fois ouvert.
REMARQUE : La suspension virale qui en résulte devrait donner une concentration d’environ 2 000 fois et la solution virale qui en résulte et devrait avoir un viral de 107à 109, ce qui est suffisant pour plus de 100 chirurgies E9.5 décrites ci-dessous.
REMARQUE : La comparaison entre la suspension virale concentrée et son supernatant viral non concentré permettra d’estimer le succès de (1) la production virale ainsi que (2) la concentration virale. Alternativement, le titer viral peut être estimé en utilisant la méthode qRT-PCR10. La production et la concentration à grande échelle de lentivirus peuvent également être effectuées à l’aide d’une concentration en deux étapes avec une concentration de cartouche suivie d’une ultracentrifugation commedécrit précédemment 2.
REMARQUE : Ne dépassez pas 30 minutes d’anesthésie, car les mères enceintes sont beaucoup plus susceptibles d’avorter leurs embryons au-delà de ce délai. Un chirurgien expérimenté peut injecter jusqu’à 12 embryons dans un délai de 30 min de chirurgie.
REMARQUE : Tout en effectuant des chirurgies in utero guidées ultra-sonores, il faut prendre le plus grand soin de maintenir un environnement propre, de maintenir la stérilité autant que possible et d’éviter tout contaminant possible. Si plus d’une chirurgie doit être effectuée le même jour, il est important de stériliser les instruments de dissection à l’aide d’un stérilisateur de perles et de nettoyer d’autres appareils qui rencontre des tissus de souris nettoyés avec de l’éthanol. Cela augmente considérablement la survie plus élevée des embryons après la chirurgie. Le taux de survie pour la méthode de chirurgie décrite ici est constamment entre 80-100%.
REMARQUE : Les souris sont mieux identifiées à l’aide d’un microscope fluorescent jusqu’au jour postnatal 3 avant que les cheveux ne commencent à pousser.
REMARQUE : Il est important de générer un échantillon de référence pour permettre le calcul des changements de pli sgRNA au fil du temps. Les embryons transduced 3 jours après l’infection ou les cellules transduced (voir l’étape 2. 6) peuvent servir d’échantillon de référence pour déterminer la représentation de sgRNA dans la bibliothèque originale.
REMARQUE : Configurer la réaction pcr de codage à barres dans une zone dédiée distincte du laboratoire ou dans une hotte de culture tissulaire qui est nettoyée à fond par effacement d’ADN pour éviter toute contamination. Exécutez un contrôle négatif pour chaque plaque PCR avec de l’eau comme modèle pour vous assurer qu’il n’y a pas de contamination.
REMARQUE : L’étape de pré-amplification n’est requise que pour l’amplification d’un tissu transduced complexe. Si l’amplification d’une seule tumeur qui a vraisemblablement développé former une cellule clonale et contient donc juste un sgRNA unique, on peut sauter le PCR1 de pré-amplification et procéder tout de suite avec PCR2.
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Representative Results
La figure 1A montre la conception des oligonucléotides pour le multiplexage de plusieurs bibliothèques CRISPR personnalisées d’une manière rentable d’une seule puce oligo de 12 ou 92 k. Une fois que les sgARN (code couleur bleue) sont sélectionnés, les oligonucléotides sont conçus avec des sites de restriction (BsmBI de couleur orange) et des paires d’amorce PCR spécifiques à la bibliothèque (couleur verte codée). Plusieurs bibliothèques peuvent être conçues en utilisant une combinaison unique de paires d’amorce pour le multiplexage dans une seule puce oligo. Lorsque PCR amplifier les bibliothèques à l’aide d’une paire d’amorce PCR spécifique, toujours inclure un contrôle négatif de l’eau seulement et exécuter toutes les réactions sur un gel agarose. La voie de contrôle négative ne devrait pas avoir de bandes à 100 bp, tandis que la bibliothèque a amplifié la voie devrait avoir une seule bande de 100 bp. S’il n’y a pas de bande, assurez-vous que la paire d’amorce PCR est sélectionnée de manière appropriée. La figure 1B montre l’étape de contrôle de la qualité de la bibliothèque clonée et la procédure de production et de concentration virale. Il convient de prendre soin de préserver la représentation égale des SGARN du clonage jusqu’à la transduction. Les lectures de séquençage de prochaine génération de l’ADN amplifié par PCR à partir de cellules transduced de bibliothèque plasmide et lenti-virale devraient montrer une corrélation élevée. Toute déviation doit être analysée attentivement pour examiner si la représentation est perdue avant ou après la préparation du virus lenti. Si les lues sgRNA à partir de l’ADN plasmide ne montrent pas une représentation égale des SGARN, alors la procédure de préparation virale et de concentration doit être répétée avec soin. Si la perte de représentation égale de sgRNA s’est produite dans l’ADN plasmide, alors la procédure entière de clonage doit être répétée comprenant l’amplification de PCR des bibliothèques de la puce d’oligo avec les cycles réduits d’amplification. Le succès de la projection de la bibliothèque CRISPR dépend de façon critique de l’égalité de représentation des SGARN présents dans la bibliothèque.
La figure 2 montre la micro-injection guidée par ultrasons mise en place pour manipuler les embryons E9.5 chez la souris enceinte. L’ensemble de la mise en place est placé sous un cabinet de niveau biosécurité de classe II pour maintenir l’état stérile de l’ensemble de la procédure et pour éviter toute infection de la souris enceinte due aux procédures chirurgicales. Il faut prendre soin d’éviter de presser les cornes utériines lors de l’injection. L’aiguille doit être très forte, de sorte que la plaie sur la paroi utérine et la membrane amniotique est minime.
La figure 3 montre les résultats de l’injection guidée ultra-sonore de lenti-virus transportant cre-recombinase dans E9.5 Lox-stop-Lox (LSL) Chiots de souris confettis au jour postnatal (P)0. Le titer viral peut être ajusté pour obtenir une couverture de transduction appropriée de l’épiderme. Tandis que le titer élevé du virus aurait comme conséquence une plus grande couverture de la peau de souris, il aurait également comme conséquence la transduction des sgRNAs multiples dans la même cellule confondant potentiellement les résultats. Pour réduire les transductions multiples d’une seule cellule, le taux d’infection doit être maintenu et lt;20%.
La figure 4 montre des lectures de séquençage de prochaine génération de l’ADN amplifié par PCR à partir de cellules transduced de bibliothèque plasmide et lenti-virale et se lit également à partir de 4 tumeurs représentatives. Les guides sgRNA ciblant Adam10 et Ripk4 sont enrichis dans les échantillons tumoraux (triangles et diamants) par rapport à la présentation de sgRNA dans la piscine plasmide ou les cellules infectées. Adam10 et Ripk4 fonctionnent comme suppresseurs detumeurs 5. Plusieurs centaines de tumeurs peuvent être multiplexées en attribuant des codes à barres uniques à chaque échantillon et séquencées en profondeur comme indiqué dans le protocole.
Figure 1 : Clonage de la bibliothèque CRISPR ciblée. (A) Schéma représentant la conception d’oligonucléotides pour la puce oligo personnalisée de 12 k ou 92 k. Des sites de restriction BsmBI (ou autres compatibles) (couleur orange codée et soulignée) ont été ajoutés de chaque côté de la sgRNA. Les têtes de flèche indiquent le site de coupe BsmBI. Pour chaque bibliothèque, une paire unique d’amorces PCR (couleur verte, brune et violette codée) a été ajoutée, de sorte qu’elle peut être spécifiquement amplifiée à l’aide de PCR à partir de la puce mise en commun. Plusieurs bibliothèques personnalisées peuvent être multiplexées jusqu’à 12k ou oligos 92k. (B) Graphique montrant la représentation de sgRNA à partir d’une bibliothèque CRISPR dans l’ADN plasmide par rapport à l’ADN des cellules transduites avec la même bibliothèque lentiviral. Chaque point représente un guide. La représentation complète a été maintenue après transduction avec une certaine corrélation dans l’abondance. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Image de la microinjection guidée par ultrasons. (A) La souris portant des embryons E9.5 a été anesthésiée et placée sur une plate-forme chauffée avec l’utérus exposé dans une chambre de boîte de Petri remplie de PBS (stabilisée par quatre argiles de modélisation). Le caoutchouc semi-rond bleu supportait l’utérus contenant des embryons et l’aiguille d’injection du microinjecteur est positionnée sur le côté droit. La tête de balayage d’ultrason a été montée sur le dessus relayant l’image vivante au moniteur derrière avec la tête d’aiguille visible. (B) Image ultra-sonore en gros plan d’un embryon E9.5. La bibliothèque lentivirale a été injectée avec l’aiguille (vue sur le côté droit) dans la cavité amniotique. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Transduction réussie de l’épithélium de surface chez la souris. Images fluorescentes de souris de corps entier, de cavité buccale, de langue et de palais de souris nouveau-nées de Cre-reporter LSL-Confetti transduites avec le lentivirus de Cre (Inlet : images de lumière blanche correspondantes). Barres d’échelle = 500 μm Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Séquençage profond des échantillons de tumeurs. Graphique montrant la représentation de sgRNA d’une bibliothèque CRISPR dans l’ADN plasmide par rapport à l’ADN des cellules transduites avec la même bibliothèque lentiviral et en plus des reads de 4 tumeurs représentatives. Les cercles rouges et verts indiquent le nombre d’Adam10 et ripk4 sgRNA lit dans la bibliothèque et les cellules transduced tandis que le triangle rouge représente les lignes d’Adam10 sgRNAs et le diamant vert représente des lectures de Ripk4 sgARN identifiés dans les tumeurs de souris HNSCC séparées montrant un enrichissement 1000x fois. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Amorce avant PCR1 | GAGGGCCTATTTCCCATGATTC GAGGGCCTATTTCCCATGATTC GAGGGCCTATTTCCCATGATTC GAGGG |
| Amorce inversée PCR1 | CAAACCCAGGGCTCCTTGGAA |
Tableau 1 : Amorce pour la réaction PCR1. Les amorces avant et arrière utilisées pour l’amplification de la zone entourant la cassette sgRNA à partir de l’ADN génomique des cellules transduites avec le virus lenti.
| pas | température | Heure | |
| 1 | 98 °C | 30 sec | |
| 2 | 98 °C | 10 sec | |
| 3 | 66 °C | 30 sec | |
| 4 | 72 °C | 15 sec | 15 cycles (étape 2-4) |
| 5 | 72 °C | 2 min | |
| 6 | 4 °C | tenir |
Tableau 2 : Paramètres du cycle PCR1. Conditions PCR utilisées pour l’amplification de la zone entourant la cassette sgRNA à partir de l’ADN génomique des cellules transduites avec le virus lenti.
| 501 FW (FW) | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATAGCCTACACTCTCTCCCTACACG ACGCTCTTCCGATCTtgtggaaaggacgaaaCACCG |
||
| 701 RV | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAGTAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCT CTTCCGATCTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC |
||
| * Les bases soulignées indiquent l’emplacement du code à barres Illumina (D501-510 pour l’avant et D701-712 pour l’inverse) qui ont été utilisés pour le multiplexage. | |||
| * Les bases de couleur rouge indiquent la séquence qui se lie au site cible sur le plasmide CRISPR lentiviral. Cette région peut être modifiée en fonction du vecteur lentiviral utilisé. | |||
Tableau 3 : Amorce de codage à barres pour la réaction PCR2. Les amorces utilisées pour coder à barres amplifient chaque échantillon de tumeur (soit directement à partir de l’ADN génomique, soit en utilisant les produits de PCR1 comme modèle). La région soulignée indique la région unique de code à barres qui peut être assignée pour chaque échantillon pour le multiplexage dans une réaction de séquençage profonde. Les paires de base de couleur rouge indiquent la région cible dans la construction lentivirale que ces amorces lient. Cette région cible peut être modifiée en fonction du type de construction lentiviral utilisée.
| pas | température | Heure | |
| 1 | 98 °C | 30 sec | |
| 2 | 98 °C | 10 sec | |
| 3 | 68 °C | 30 sec | |
| 4 | 72 °C | 15 sec | 10 cycles (étape 2-4) |
| 5 | 72 °C | 2 min | |
| 6 | 4 °C | tenir |
Tableau 4 : Paramètres du cycle PCR2. Les conditions pcr utilisées pour coder à barres amplifient chaque échantillon de tumeur (soit directement à partir de l’ADN génomique ou en utilisant les produits de PCR1 comme modèle).
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Discussion
L’édition du génome CRISPR/Cas9 a été largement utilisée dans des études in vitro et in vivo pour étudier les fonctions génétiques et les processus cellulaires. La plupart des études in vivo utilisent des cellules éditées par le gène CRISPR/Cas9 greffées dans un modèle animal (allogreffe ou xénogreffe). Bien qu’il s’agit d’un outil puissant pour étudier la génétique du cancer et les fonctions cellulaires, il manque encore le microenvironnement des tissus indigènes et pourrait provoquer des blessures et / ou des réponses immunitaires.
Pour relever ces défis, plusieurs groupes ont été les pionniers des approches directes in vivo CRISPR générant plusieurs modèles de souris autochthonous multiplexées au cours desdernières années 15,16,17,18. Ces projets reposent généralement sur le virus associé à l’adénos (AAV) pour délivrer des SGARN aux organes cibles. AAV permet la génération de litres très élevés facilitant ainsi la production de virus à haut litre nécessaires pour les manipulations in vivo. Cependant, l’utilisation des AAV limite sévèrement le nombre de gènes qui peuvent être analysés à environ 40-50 gènes, car les AAV, contrairement au lentivirus, ne s’intègrent pas de façon stably dans l’ADN génomique, rendant la lecture des bibliothèques sgRNA impraticable. Le dépistage basé sur l’AAV nécessite une lecture directe des mutations dans les sites cibles à l’aide, par exemple, du séquençage ciblé des captures. Toutefois, le séquençage multiplexé de capture basé sur pcr limite le nombre de cibles capturables dans une bibliothèque « screenable » généralement de l’ordrede dizaines 15,16,17,18.
Par rapport aux écrans CRISPR aav in vivo, la méthodologie décrite ici utilise des sgARN lentiviral. Étant donné que les constructions lentivirales s’intègrent dans l’ADN de la cellule cible, la représentation sgRNA peut être analysée dans l’ADN génomique similaire à tous les écrans CRISPRconventionnels 19,20. Ainsi, cette méthodologie permet l’analyse simultanée de centaines de gènes et peut être progressivement mise à l’échelle, même à l’échelle du génome écrans in vivo. Par exemple, un écran à l’échelle du génome avec 78 000 sgARN et une couverture de 30x nécessiterait ~90 embryons comme décrit précédemment pour un écran shRNAsimilaire 4. Comme la taille des portées des souches de souris consanguine les plus courantes est d’environ 8-12 chiots / portée et un chirurgien expérimenté peut facilement injecter toutes les souris dans un peu plus, seulement environ ~ 10-12 barrages et chirurgies seraient nécessaires pour un tel écran à l’échelle du génome.
Le succès d’un écran in vivo dépend de la production de virus de haut niveau. Bien que les constructions lentivirales qui expriment un sgRNA d’intérêt, Cas9 et Cre (p.ex., pSECC) sont une solution tout-en-un pratique et réalisable, elles ont la limite d’emballage pour la capside lentiviral (~10 kb de taille totale), conduisant à une baisse globale du litre viral. Pour relever ce défi, nous utilisons des souris R26-LSL-Cas9-GFP et une construction lenti-virale contenant uniquement du Cre-recombinase avec un sgRNA. La construction lentivirale qui en résulte n’a que 7 kb de longueur et donne un litre viral de plus de 108 PFU/mL.
Des bibliothèques ciblées et spécifiques peuvent être rapidement générées en aussi peu que quelques jours et le réseau complexe d’interactions génétiques peut être étudié in vivo en quelques semaines. La mutagenèse à 9 œmentses peut être pratiquée soit chez des souris de type sauvage pour étudier le développement d’organes, l’homéostasie ou les phénotypes de maladies (cancer, maladies inflammatoires de la peau, etc.) soit peut être facilement combinée avec des souris hébergeant des mutations oncogènes ou une combinaison de mutations pour modéliser le statut génétique trouvé chez les patients humains. En outre, la méthodologie de clonage peut être affinée pour cloner les bibliothèques CRISPRa ou CRISPRi en ajoutant des sites de restriction compatibles et des séquences sgRNA dans le plasmide tout-en-un. Il convient de noter que toutes les bibliothèques qui manipulent les fonctions génétiques peuvent être utilisées non seulement dans les modèles muraux, mais aussi dans d’autres modèles animaux et dans les cultures organoïdes. Ensemble, cette méthodologie met en évidence l’utilité et fournit une plaque tournante pour utiliser directement in vivo CRISPR pour intégrer l’édition de gènes somatiques et la modélisation de souris pour évaluer rapidement la fonction génétique in vivo.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ces travaux ont été appuyés par une subvention de projet de l’Institut canadien de recherche en santé (IRSC 365252), de la Fondation Krembil et de la ronde d’excellence en recherche du Fonds de recherche de l’Ontario 8e ronde (RE08-065). Sampath Kumar Loganathan est récipiendaire d’une bourse de la Société canadienne du cancer (BC-F-16#31919).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 micron filter | Sigma | S2HVU02RE | |
| 12k or 92k oligo chip | Customarray Inc. (Genscript) | ||
| 15 cm cell culture plates | Corning | ||
| 293FT | Invitrogen | R70007 | |
| 293NT | Systems Biosciences | LV900A-1 | |
| Alkaline phosphatase | NEB | M0290L | |
| Amplicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | |
| ATP | NEB | 9804S | |
| BsmBI | NEB | R0580L | |
| Chromic gut suture | Covidien | ||
| Deep sequencing (Next-Seq or Hi-Seq) | Illumina | ||
| DNA-cleanup kit | Zymo Research | D4008 | |
| DNAesy Blood and Tissue DNA extraction kit | Qiagen | 69506 | |
| Endura electrocompetent cells | Lucigen | 60242-1 | |
| Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| High-Speed Centrifuge | Beckman Coulter | MLS-50 | |
| LB Agar | Wisent Technologies | 800-011-LG | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Mini-prep plasmid Kit | Frogga Bio | PDH300 | |
| Mouse oxygen anaesthesia system | Visual Sonics | ||
| Nanoject II micromanipulator | Drummond | ||
| NEBuffer 3.1 (Buffer for BsmBI) | NEB | R0580L | |
| Needle sharpener | Sutter Instrument | BV-10 | |
| Oligo cleanup kit | Zymo research | D4060 | |
| PAGE purified illumina sequencing primer | IDT DNA | ||
| PEI (polyethyleneimine) | Sigma | 408727-100ML | |
| Permoplast modeling clay | |||
| Petridish with central opening | Visual Sonics | ||
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| Q5 Polymerase 2x Master mix | NEB | M0494L | |
| Qubit Fluorometric Quantification | Invitrogen | Q33327 | |
| Semicircular Silicone plug | Corning | ||
| Silicone membrane | Visual Sonics | ||
| T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
| Ultra-centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
| Vevo2000 ultrasound system | Visual Sonics |
References
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