Summary
Aqui descrevemos uma metodologia rápida e direta de triagem in vivo CRISPR/Cas9 utilizando ultrassom guiado em injeções lentiviras embrionárias uterobrionárias para avaliar simultaneamente funções de vários genes na pele e cavidade oral de camundongos imunocompetrente.
Abstract
Modelos de camundongos geneticamente modificados (GEMM) têm sido fundamentais na avaliação da função genética, modelagem de doenças humanas e servindo como modelo pré-clínico para avaliar caminhos terapêuticos. No entanto, sua natureza de tempo, trabalho e custo-intensivo limita sua utilidade para análise sistemática da função genética. Os recentes avanços nas tecnologias de edição de genomas superam essas limitações e permitem a rápida geração de perturbações genéticas específicas diretamente dentro de órgãos específicos do mouse de forma multiplexada e rápida. Aqui, descrevemos um método baseado em CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) para gerar milhares de clones de knock-out genéticos dentro do epitélio da pele e cavidade oral dos camundongos, e fornecer um protocolo detalhando os passos necessários para realizar uma tela CRISPR direta para genes supressores tumorais. Essa abordagem pode ser aplicada a outros órgãos ou outras tecnologias CRISPR/Cas9, como a ativação crispr ou a inativação crispr para estudar a função biológica dos genes durante a homeostase tecidual ou em vários ambientes de doenças.
Introduction
Um dos desafios para a pesquisa do câncer na era pós-genômica é minerar a vasta quantidade de dados de genoma para mutações genéticas causais e identificar nós na rede genética que podem ser direcionados terapeuticamente. Embora as análises bioinformáticas tenham ajudado imensamente nesse sentido, estabelecer modelos in vitro e in vivo eficientes é um pré-requisito para decifrar a complexidade dos sistemas biológicos e estados de doenças e para permitir o desenvolvimento de medicamentos. Embora os modelos convencionais de camundongos transgênicos tenham sido usados extensivamente para estudos de genética do câncer in vivo, sua natureza de custo, tempo e trabalho intensivo proibiu em grande parte a análise sistemática das centenas de genes putativos de câncer desvendados pela genômica moderna. Para superar esse gargalo, combinamos uma tecnologia de edição de genes previamente estabelecida no ultrassom na metodologia de injeção do útero1,2 com uma tecnologia de edição de genes CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)para induzir e estudar simultaneamente mutações de perda de função de centenas de genes na pele e cavidade oral de um único rato.
A metodologia descrita aqui utiliza injeções guiadas por ultrassom de lentivírus projetados na cavidade amniótica de embriões de camundongos vivos no dia embrionário E9.5. A carga lentiviral contendo componentes CRISPR/Cas9 transduzir o ectoderme de superfície em camada única, que mais tarde dá origem ao epitélio da pele e da cavidade oral. A pele é composta de uma epiderme externa, seguida por membrana do porão e derme. Epiderme é um epitélio estratificado composto por uma camada interna basal, que mantém contato com a membrana do porão e tem capacidade proliferativa e de células-tronco. A camada basal dá origem às camadas diferenciadas acima, como camadas de córneas espinhosas, granulares eestratosas 2,4. Estudos de rastreamento de linhagem mostram que este método in vivo CRISPR/Cas9 manipula geneticamente células-tronco residentes em tecidos dentro da camada basal que persistem durante toda a idade adulta. Como o lentivírus pode ser titulado para transduturar o ectoderm superficial E9.5 na densidade clonal, este método pode ser usado para gerar ratos de mosaico abrigando milhares de clones de knock-out genéticos discretos. O sequenciamento da próxima geração pode então ser usado para analisar o efeito da ablação genética mediada pelo CRISPR/Cas9 dentro desses clones de forma multiplexada5.
Recentemente, utilizamos este método para avaliar a função de 484 genes que mostram mutações recorrentes no Carcinoma de Células Escamosas de Cabeça e Pescoço Humano (HNSCC)5. O HNSCC é um câncer devastador com uma alta taxa de mortalidade de 40 a 50% e é o6º câncer mais comum em todo o mundo6. O HNSCC surge em forros mucosas das vias aéreas superiores ou da cavidade oral e está associado ao consumo de tabaco e álcool ou infecção por papilomavírus humano (HPV). Carcinoma de Células Escamosas Cutâneas (CCS) são tumores de pele e representam o segundo câncer mais comum em humanos7. O CCS cutâneo e o HNSCC são histologicamente e molecularmente muito semelhantes, com um alto percentual de casos apresentando alteração em TP53, PIK3CA, NOTCH1 e HRAS8. Embora haja apenas um punhado de genes mutados em alta frequência, há centenas de genes encontrados mutados em baixa frequência (< 5%), um fenômeno comumente referido como a distribuição de cauda longa. Como a maioria dos genes de cauda longa não tem validação biológica ou clínica, usamos esta tecnologia de triagem in vivo CRISPR para modelar a perda de função desses genes em camundongos propensos a tumores com mutações sensibilizantes em p53, Pik3ca ou Hras e identificamos vários novos genes supressores de tumores que cooperam com p53, Pikca ou Hras para desencadear o desenvolvimento do tumor5.
Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para gerar bibliotecas sgRNA lentiviral sgRNA multiplexed sgRNA e executar telas de knock-out de genes CRISPR/Cas9 no ectoderme da superfície do mouse. Note-se que essa metodologia pode ser adaptada para incorporar outras tecnologias de manipulação genética, como a ativação crispr (CRISPRa) e a inativação CRISPR (CRISPRi) ou modificada para atingir outros sistemas de órgãos no mouse para estudar funções genéticas.
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Protocol
Este protocolo foi aprovado e realizado de acordo com o IACUC da Universidade de Toronto.
1. Design e clonagem de bibliotecas CRISPR agrupadas
- Selecione 4-5 sgRNAs visando genes de interesse do mouse de recursos como o designer sgRNA (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) do Broad Institute ou o servidor CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no). Selecione um número igual de sgRNAs não direcionados de por exemplo, Sanjana et al.9 para gerar uma biblioteca de controles de gRNA de controles não direcionados igualmente dimensionados.
- Ao construir as bibliotecas sgRNA, certifique-se de que há cobertura suficiente para cada sgRNA no sistema de órgãos direcionado. Para a pele do camundongo, a epiderme em E9.5 é uma única camada que contém ~150.000 células, a maioria das quais têm capacidade de células-tronco4. Se a transdução lenti-viral resultar em 15-20% de infectividade, apenas 18.000-24.000 células serão transduzidas em E9.5. Dimensione o experimento de acordo.
- Para clonagem e amplificação dessas bibliotecas sgRNA, adicione os locais de restrição de enzimas BsmBI, bem como as sequências de DNA de ligação de primer a 5' e 3' finais do sgRNA e solicite os oligos de comprimento total resultantes como chip de oligonucleotídeo agrupado(Figura 1A).
- Para multiplex diferentes bibliotecas em um chip, adicione sequências específicas de primer da biblioteca.
- Usando os pares de primer apropriados, amplie cada biblioteca separadamente do chip oligo agrupado. Em um tubo PCR, misture 25 μL de 2x mistura mestre de polimerase, 20 μL de água livre DNase/RNase, 5 ng de DNA de chip oligo, 2,5 μL de primer dianteiro apropriado e 2,5 μL de primer reverso apropriado. Use 12-15 ciclos e amplie com desnaturação de 98 °C, 63-67 °C de ressarificação, parâmetros de extensão de 72 °C para cada ciclo na máquina PCR.
- Execute o produto PCR em um gel de 2,5% de agarose e purifique ~100 bp de produto PCR usando um kit de limpeza de DNA de gel.
- Prepare a espinha dorsal plasmid.
- Digerir 5 μg do Cre-recombinase contendo pLKO-Cre stuffer v3 plasmid com 2 μL de BsmBI em 50 μL mistura de reação por 1 h a 55 °C, seguido por 1 μL de incubação de fosfatas alcalinas para 45 min a 37 °C de acordo com as instruções do fabricante.
NOTA: Cre-recombinase contendo pLKO-Cre stuffer v3 plasmid é um plasmídeo à base de lenti viral que contém enzima Cre-recombinase para remover Lox-Stop-Lox em células de mouse e também tem um promotor U6 para conduzir a expressão de sgRNA e tracrRNA. Uma versão com Cas9 e sem Cas9 pode ser usada e disponível na Addgene #158030 e #158031. - Execute o DNA digerido em um gel de 1% de agarose e purifique a faixa vetorial linearizada de 7 kb usando um kit de limpeza de DNA de gel. Note-se que uma banda de enchatar 2 kb também deve ser visível indicando um digestor bem sucedido.
- Digerir 5 μg do Cre-recombinase contendo pLKO-Cre stuffer v3 plasmid com 2 μL de BsmBI em 50 μL mistura de reação por 1 h a 55 °C, seguido por 1 μL de incubação de fosfatas alcalinas para 45 min a 37 °C de acordo com as instruções do fabricante.
- Configure a reação de ligadura para gerar uma biblioteca de plasmídeos sgRNA.
- Misture 1 μg de vetor purificado e 30 ng de inserção PCR purificada com 2 μL de BsmBI, 5 μL de ligase de DNA T4, 10 μM ATP e 1x tampão específico para BsmBI. Incubar a mistura de ligadura durante a noite a 37 °C. Use um tubo adicional contendo todos os materiais acima, exceto a inserção PCR como um controle negativo.
- Na manhã seguinte, purifique a mistura de ligadura usando o kit de limpeza oligo e elute em 7 μL de água livre RNase/DNase.
- Eletroporar a biblioteca em células competentes.
- Adicione 2 μL de biblioteca de sgRNA eluted ou mistura de ligadura de controle negativo a 25 μL de células eletrocompetente descongeladas em cuvetas pré-refrigeradas (1,0 mm) no gelo. Eletroporato seguindo o protocolo do fabricante (10 μF, 600 Ohms, 1800 Volts). Ao cuvette adicione 975 μL de meio de recuperação (ou meio SOC) dentro de 10 s do pulso.
- Transfira células eletroporadas para um tubo de cultura e incubar por uma hora a 37 °C em uma incubadora de agitação bacteriana a 300 rpm.
- Estimar a eficiência da transformação e a cobertura da biblioteca por sgRNA.
- Prepare uma diluição de 100 vezes transferindo 10 μL da reação de transformação contendo células eletroporadas com biblioteca sgRNA ou ligadura de controle negativo para 990 μL de Recovery Medium e misture bem.
- Placa 10 μL da mistura de transformação diluída em uma placa de ágar pré-aquecida de 10 cm LB + ampicillina (100 μg/L). Isso resulta em uma diluição de 10.000 vezes dos transformadores e usar esta placa para calcular a eficiência da transformação. Realizar incubação das placas a 30 °C para 14-16 h.
- Plaque o resto da reação de transformação espalhando 100 μL de células recuperadas em cada placa de um total de 10 placas de ágar pré-aquecidas de 15 cm LB + ampicillin. Incubar as placas por 14-16 h a 30 °C. Note-se que o crescimento a 30 °C minimiza a recombinação entre as duas repetições de terminal longo dentro do plasmídeo viral.
- Para avaliar o sucesso da clonagem, calcule a eficiência da transformação. Conte o número de colônias na placa de diluição contendo transformadores da biblioteca sgRNA ou ligadura de controle negativo (placas de 10 cm, passo 1.8.2). A mistura de controle negativo não deve ter nenhuma ou poucas colônias. Para obter o número total de colônias, multiplique o número de colônias em 10.000.
NOTA: O número total contado de colônias representa uma cobertura de biblioteca que deve ser mínima de 200x colônias por sgRNA.- Certifique-se de que uma biblioteca com 2000 sgRNAs terá pelo menos 400.000 colônias. Caso não haja colônias suficientes, repita e configure mais eletroporação.
- Controle de qualidade: A partir da placa de diluição, escolha 20 colônias e adicione cada colônia a um tubo de cultura individual contendo 3 mL de mídia LB + ampicillina. Incubar todos os 20 tubos durante a noite a 30 °C tremendo a 250 rpm. Purifique o DNA plasmídeo usando o kit mini-prep de acordo com as instruções do fabricante e sanger sequencia todas as 20 amostras de DNA plasmida para verificar que cada amostra tem uma sequência sgRNA diferente usando o primer U6 (5'GAG GGC CTA TTT CCC ATT ATT CC-3').
- Colher as colônias de cada placa de 15 cm.
- Adicione 7 mL de meio LB, em seguida, raspe as colônias da placa lb agar com um espalhador de células. Use uma pipeta de 10 mL para transferir as células para um frasco cônico estéril de 2 L. Repita para todas as placas e bactérias da piscina no frasco de 2 L. Incubar o frasco por 2-3 h tremendo a 30 °C. Centrifugar a cultura e coletar a pelota.
- Purificar DNA plasmídeo usando um kit de purificação maxi-plasmida.
- Controle de qualidade adicional: Use 1ng de DNA plasmídeo da biblioteca maxi-prep e execute uma reação pcr usando primers de sequenciamento de próxima geração de acordo com as instruções do fabricante. A representação de todas as sgRNAs na biblioteca pode ser verificada por uma plataforma de sequenciamento profundo.
2. Produção de lentivírus de alta titer adequado para transdução in vivo
NOTA: Execute todas as etapas nesta seção do protocolo em uma instalação BSL2+ em um gabinete de biossegurança classe II, Tipo A2. 293FT e especialmente as células de embalagem 293NT permitem maior produção de vírus. Use células de baixa passagem ( 3. Cirurgia guiada ultrassom e injeção NOTA: Esta tecnologia foi adaptada a partir de4,11. A microinjeção voltada para a transdução do epitélio superficial deve ser realizada no dia embrionário E9.5, quando o ectoderme superficial consiste em uma única camada e antes da formação do periderm a partir do E10, o que impediria a transdução desta camada basal. Preferencialmente configurar ratos na sexta-feira, para que o primeiro dia possível com embriões E9.5 seja na segunda-feira seguinte. Use ratos Rosa26-Lox-STOP-LOX-Cas9-GFP (Jackson Laboratory #024857) para obter uma eficiência ótima de CRISPR/Cas912. 4. Procedimento de sequenciamento profundo
NOTA: Use sempre uma garrafa de DMEM aberta ou muito recentemente aberta para a transfecção, pois o pH nesta etapa é crítico, e o DMEM torna-se mais básico ao longo do tempo uma vez aberto.
NOTA: A suspensão viral resultante deve produzir uma concentração aproximada de 2.000 vezes e a solução resultante do vírus e deve ter um título viral de 107-109, o que é bom o suficiente para mais de 100 cirurgias E9.5 descritas abaixo.
NOTA: A comparação entre a suspensão viral concentrada com seu supernanato viral não cocentrado permitirá estimar o sucesso da (1) produção viral, bem como (2) da concentração viral. Alternativamente, o título viral pode ser estimado usando o método qRT-PCR10. A produção em larga escala e a concentração de lentivírus também podem ser realizadas usando uma concentração de duas etapas com concentração de cartuchos seguidos de ultracentrifugação como descrito anteriormente2.
NOTA: Não exceda 30 minutos de anestesia, pois as barragens grávidas são muito mais propensas a abortar seus embriões além desse tempo. Um cirurgião experiente pode injetar até 12 embriões dentro de 30 minutos de cirurgia.
NOTA: Ao realizar o ultrassom guiado em cirurgias do útero, deve-se tomar o máximo cuidado para manter um ambiente limpo, manter a esterilidade o máximo possível e evitar possíveis contaminantes. Se mais de uma cirurgia deve ser feita no mesmo dia, é importante esterilizar os instrumentos de dissecção usando um esterilizador de contas e limpar outros aparelhos que encontram tecido de rato limpo com etanol. Isso aumenta muito a maior sobrevida dos embriões pós-cirurgia. A taxa de sobrevivência do método cirúrgico descrito aqui é consistentemente entre 80-100%.
NOTA: Os camundongos são melhor identificados usando microscópio fluorescente até o dia 3 pós-natal antes que o cabelo comece a crescer.
NOTA: É importante gerar uma amostra de referência para permitir o cálculo das alterações do fold sgRNA ao longo do tempo. Embriões transduzidos 3 dias após infecção ou células transduzidas (ver passo 2. 6) podem servir como amostra de referência para determinar a representação do sgRNA na biblioteca original.
NOTA: Configure a reação pcr de codificação de barras em uma área dedicada separada do laboratório ou em uma capa de cultura de tecido que é completamente limpa por apagar DNA para evitar qualquer contaminação. Execute o controle negativo para cada placa PCR com água como modelo para ter certeza de que não há contaminação.
NOTA: A etapa de pré-amplificação só é necessária para a amplificação de um tecido transduzido complexo. Se amplificar um único tumor que presumivelmente desenvolveu formar uma célula clonal e, portanto, contém apenas um único sgRNA, pode-se pular o PCR1 pré-amplificação e prosseguir imediatamente com PCR2.
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Representative Results
A Figura 1A mostra o design dos oligonucleotídeos para multiplexar várias bibliotecas CRISPR personalizadas de forma econômica em um único chip oligo de 12k ou 92k. Uma vez selecionados os sgRNAs (código de cor azul), os oligonucleotídeos são projetados com locais de restrição (BsmBI cor laranja) e pares de primer PCR específicos da biblioteca (código de cor verde). Várias bibliotecas podem ser projetadas usando uma combinação única de pares de primer para multiplexing em um único chip oligo. Quando o PCR amplificar as bibliotecas usando um par específico de primer PCR, inclua sempre um controle negativo de água e execute todas as reações em um gel de agarose. A faixa de controle negativa não deve ter bandas a 100 bp, enquanto a pista ampliada da biblioteca deve ter uma única banda de 100 bp. Se não houver banda, certifique-se de que o par de primer PCR esteja selecionado adequadamente. A Figura 1B mostra a etapa de controle de qualidade da biblioteca clonada e o procedimento de produção e concentração viral. Deve-se tomar cuidado para preservar a representação igualitária das sgRNAs da clonagem até a transdução. Leituras de sequenciamento de última geração de DNA amplificado pcr de células transduzidas plasmídeos e lenti-virais devem mostrar uma alta correlação. Qualquer desvio deve ser analisado cuidadosamente para examinar se a representação é perdida antes ou depois da preparação do vírus lenti. Se o sgRNA lê do DNA plasmídeo não mostrar representação igual dos sgRNAs, então o procedimento de preparação e concentração viral deve ser repetido com cuidado. Se a perda de representação sgRNA igual ocorreu no DNA plasmídeo, então todo o procedimento de clonagem deve ser repetido incluindo a amplificação pcr de bibliotecas de chip oligo com ciclos de amplificação reduzidos. O sucesso da triagem da biblioteca CRISPR depende criticamente da representação igualitária das sgRNAs presentes na biblioteca.
A Figura 2 mostra a micro-injeção guiada por ultrassom para manipular os embriões E9.5 em camundongos grávidas. Toda a configuração é colocada sob um gabinete de nível de biossegurança classe II para manter a condição estéril de todo o procedimento e evitar qualquer infecção do camundongo gestante devido aos procedimentos cirúrgicos. Deve-se tomar cuidado para evitar pressionar os chifres uterinos durante a injeção. A agulha deve ser muito afiada, de modo que a ferida na parede uterina e na membrana amniótica é mínima.
A Figura 3 mostra os resultados da injeção guiada ultrassonora do vírus lenti carregando Cre-recombinase em E9.5 Lox-stop-Lox (LSL) filhotes de rato confete no dia pós-natal (P)0. O título viral pode ser ajustado para obter uma cobertura de transdução adequada da epiderme. Embora o alto título de vírus resulte em uma maior cobertura da pele do camundongo, também resultaria na transdução de múltiplos sgRNAs para a mesma célula potencialmente confundindo os resultados. Para reduzir múltiplas transduções de uma única célula, a taxa de infecção deve ser mantida <20%.
A Figura 4 mostra leituras de sequenciamento de última geração de DNA amplificado pcr de células transduzidas plasmídeos e lenti-virais e também lê de 4 tumores representativos. guias sgRNA direcionados a Adam10 e Ripk4 são enriquecidos nas amostras de tumor (triângulos e diamantes) em comparação com a apresentação de sgRNA em piscina plasmida ou células infectadas. Adam10 e Ripk4 funcionam como supressores de tumor5. Várias centenas de tumores podem ser multiplexados atribuindo códigos de barras únicos a cada amostra e sequenciados profundamente conforme descrito no protocolo.
Figura 1: Clonagem da biblioteca CRISPR direcionada. (A) Esquema representando o design de oligonucleotídeos para o chip oligo personalizado de 12 k ou 92 k. Foram adicionados em cada lado do sgRNA os locais de restrição (cor laranja codificada e sublinhada) em cada lado do sgRNA. As cabeças de seta indicam o local de corte do BsmBI. Para cada biblioteca, um par único de primers PCR (código de cor verde, marrom e roxo) foram adicionados, de modo que ele possa ser especificamente amplificado usando PCR do chip pooled. Várias bibliotecas personalizadas podem ser multiplexadas até 12k ou 92k oligos. (B) Gráfico mostrando representação sgRNA de uma biblioteca CRISPR em DNA plasmídeo versus DNA de células transduzidas com a mesma biblioteca lentiviral. Cada ponto representa um guia. A representação total foi mantida após a transdução com alguma correlação em abundância. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagem da configuração de microinjeção guiada por ultrassom. (A) O mouse que transportava embriões E9.5 foi anestesiado e colocado em uma plataforma aquecida com o útero exposto em uma câmara de placa de Petri modificada da PBS (estabilizada por quatro argilas modeladoras). A borracha semi-redonda azul apoiou o útero contendo embriões e a agulha de injeção do microinjetor está posicionada no lado direito. A cabeça de ultrassom foi montada na parte superior retransmitindo imagem ao vivo para o monitor atrás com a cabeça da agulha visível. (B) Imagem ultrassonora de perto de um embrião E9.5. A biblioteca lentiviral foi injetada com a agulha (vista no lado direito) na cavidade amniótica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Transdução bem sucedida do epitélio superficial no camundongo. Imagens fluorescentes de corpo inteiro, cavidade oral, língua e paladar de camundongos cre-repórter recém-nascidos LSL-Confetti transduzidos com lentivírus Cre (Inlet: imagens de luz branca correspondentes). Barras de escala = 500 μm Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Sequenciamento profundo de amostras de tumores. Gráfico mostrando a representação do SGRNA de uma biblioteca CRISPR em DNA plasmídeo versus DNA de células transduzidas com a mesma biblioteca lentiviral e além de leituras de 4 tumores representativos. Os círculos vermelho e verde denotam o número de leituras de SGRNA de Adam10 e Ripk4 em bibliotecas e células transduzidas, enquanto o triângulo vermelho representa as leituras de Adam10 sgRNAs e o diamante verde representa leituras de Ripk4 sgRNAs identificadas em tumores de ratos HNSCC separados mostrando um enriquecimento de 1000x. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Primer para frente pcr1 | GAGGGCCTATTTCCCATGATTC |
| Primer reverso PCR1 | CAAACCCAGGGCTGCCTTGGAA |
Tabela 1: Primers para reação PCR1. Os primers dianteiros e invertidos usados para amplificação da região circundante do sgRNA a partir do DNA genômico das células transduzidas com o vírus lenti.
| passo | temperatura | Hora | |
| 1 | 98 °C | 30 segundos | |
| 2 | 98 °C | 10 segundos | |
| 3 | 66 °C | 30 segundos | |
| 4 | 72 °C | 15 seg | 15 ciclos (passo 2-4) |
| 5 | 72 °C | 2 min. | |
| 6 | 4 °C | segurar |
Tabela 2: Parâmetros do ciclo PCR1. Condições de PCR utilizadas para a amplificação da região circundante do sgRNA a partir do DNA genômico das células transduzidas com o vírus lenti.
| 501 FW | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACTATAGCCTCTTTCCCTACACGG ACGCTCTTCCGATCTtgtggaaaaggacgaaacaCCG |
||
| 701 RV | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAGAGAGTAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGCT CTTCCGATCTATTTTAACTTGCTATTTCTAAAACACACACACACAC |
||
| * As bases sublinhadas indicam o local de código de barras Illumina (D501-510 para a frente e D701-712 para o inverso) que foram usados para multiplexagem. | |||
| * Bases de cor vermelha indicam a sequência que se liga ao local alvo no plasmídeo lentiviral CRISPR. Esta região pode ser modificada de acordo com o vetor lentiviral utilizado. | |||
Tabela 3: Primers de codificação de barras para reação PCR2. Os primers usados para amplificar cada amostra de tumor (diretamente do DNA genômico ou usando os produtos do PCR1 como modelo). A região sublinhada indica a região de código de barras única que pode ser atribuída para cada amostra para multiplexing em uma reação de sequenciamento profundo. Os pares de base de cor vermelha indicam a região alvo na construção lentiviral que esses primers ligam. Esta região alvo pode ser modificada de acordo com o tipo de construção lentiviral utilizada.
| passo | temperatura | Hora | |
| 1 | 98 °C | 30 segundos | |
| 2 | 98 °C | 10 segundos | |
| 3 | 68 °C | 30 segundos | |
| 4 | 72 °C | 15 seg | 10 ciclos (passo 2-4) |
| 5 | 72 °C | 2 min. | |
| 6 | 4 °C | segurar |
Tabela 4: Parâmetros do ciclo PCR2. Condições de PCR usadas para amplificar cada amostra de tumor (diretamente do DNA genômico ou usando os produtos do PCR1 como modelo).
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Discussion
A edição do genoma CRISPR/Cas9 tem sido amplamente utilizada em estudos in vitro e in vivo para investigar funções genéticas e processos celulares. A maioria dos estudos in vivo utiliza células editadas por genes CRISPR/Cas9 enxertadas em um modelo animal (aoenxerto ou xenoenxerto). Embora esta seja uma ferramenta poderosa para estudar a genética do câncer e funções celulares, ela ainda carece do microambiente do tecido nativo e pode provocar ferimentos e/ou respostas imunológicas.
Para superar esses desafios, diversos grupos foram pioneiros em abordagens in vivo CRISPR gerando vários modelos de mouse autóctones multiplexados nos últimos anos15,16,17,18. Esses projetos geralmente dependem do vírus associado ao Adeno (AAV) para fornecer sgRNAs para órgãos-alvo. O AAV permite a geração de titer muito maior, facilitando assim a produção de vírus de alta titer necessário para manipulações in vivo. No entanto, o uso de AAVs limita severamente o número de genes que podem ser analisados para cerca de 40-50 genes, já que os AAVs, ao contrário do lentivírus, não se integram ao DNA genômico, tornando a leitura das bibliotecas sgRNA impraticável. A triagem baseada em AAV requer leitura direta de mutações em locais de destino usando, por exemplo, sequenciamento de captura direcionado. No entanto, o sequenciamento de captura baseado em PCR multiplexed restringe o número de alvos capturáveis em uma biblioteca 'screenable' geralmente para a ordem das dezenas15,16,17,18.
Em comparação com as telas AAV in vivo CRISPR, a metodologia descrita aqui utiliza sgRNAs lentiviral. Dado que as construções lentiviras se integram ao DNA da célula alvo, a representação do sgRNA pode ser analisada em DNA genômico semelhante a qualquer tela crispr convencional19,20. Assim, essa metodologia permite a análise simultânea de centenas de genes e pode ser perfeitamente dimensionada até mesmo para telas in vivo em todo o genoma. Por exemplo, uma tela de genoma com 78.000 sgRNAs e uma cobertura de 30x exigiria ~90 embriões como descrito anteriormente para uma tela shRNA semelhante4. Como o tamanho da ninhada das cepas de camundongos de raça mais comuns é em torno de 8-12 filhotes/lixo e um cirurgião experiente pode facilmente injetar todos os ratos dentro de um menor, apenas cerca de ~10-12 barragens e cirurgias seriam necessárias para tal tela de genoma.
O sucesso de uma tela in vivo depende da alta produção de vírus titer. Enquanto construções lentiviral que expressam um sgRNA de interesse, Cas9 e Cre (por exemplo, pSECC) são uma solução totalmente conveniente e viável, eles têm o limite de embalagem para o capsídeo lentiviral (~10 kb em tamanho total), levando a um título viral mais baixo. Para superar este desafio, usamos ratos R26-LSL-Cas9-GFP e uma construção lenti-viral contendo apenas Cre-recombinase juntamente com um sgRNA. A construção lentiviral resultante tem apenas 7 kb de comprimento e produz um título viral de mais de 108 PFU/mL.
Bibliotecas específicas e direcionadas podem ser rapidamente geradas em poucos dias e a complexa rede de interações genéticas pode ser estudada in vivo dentro de algumas semanas. A mutagênese mediada pelo Cas9 pode ser realizada em camundongos do tipo selvagem para estudar o desenvolvimento de órgãos, homeostase ou fenótipos de doenças (câncer, doenças inflamatórias da pele, etc.) ou pode ser facilmente combinada com camundongos que abrigam qualquer mutação oncogênica ou combinação de mutações para modelar o estado genético encontrado em pacientes humanos. Além disso, a metodologia de clonagem pode ser refinada para clonar bibliotecas CRISPRa ou CRISPRi adicionando sites de restrição compatíveis e sequências de sgRNA em plasmídeos all-in-one. Note-se que todas as bibliotecas que manipulam funções genéticas podem ser usadas não apenas em modelos de camundongos, mas também em outros modelos animais e em culturas organoides. Em conjunto, essa metodologia destaca o utilitário e fornece uma caldeira para usar unicamente CRISPR para integrar a edição de genes somatic e modelagem do mouse para avaliar rapidamente a função genética in vivo.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por uma subvenção do Instituto Canadense de Pesquisa em Saúde (CIHR 365252), da Fundação Krembil e do Ontario Research Excellence Round 8 (RE08-065). Sampath Kumar Loganathan é o beneficiário de uma bolsa da Canadian Cancer Society (BC-F-16#31919).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 micron filter | Sigma | S2HVU02RE | |
| 12k or 92k oligo chip | Customarray Inc. (Genscript) | ||
| 15 cm cell culture plates | Corning | ||
| 293FT | Invitrogen | R70007 | |
| 293NT | Systems Biosciences | LV900A-1 | |
| Alkaline phosphatase | NEB | M0290L | |
| Amplicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | |
| ATP | NEB | 9804S | |
| BsmBI | NEB | R0580L | |
| Chromic gut suture | Covidien | ||
| Deep sequencing (Next-Seq or Hi-Seq) | Illumina | ||
| DNA-cleanup kit | Zymo Research | D4008 | |
| DNAesy Blood and Tissue DNA extraction kit | Qiagen | 69506 | |
| Endura electrocompetent cells | Lucigen | 60242-1 | |
| Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| High-Speed Centrifuge | Beckman Coulter | MLS-50 | |
| LB Agar | Wisent Technologies | 800-011-LG | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Mini-prep plasmid Kit | Frogga Bio | PDH300 | |
| Mouse oxygen anaesthesia system | Visual Sonics | ||
| Nanoject II micromanipulator | Drummond | ||
| NEBuffer 3.1 (Buffer for BsmBI) | NEB | R0580L | |
| Needle sharpener | Sutter Instrument | BV-10 | |
| Oligo cleanup kit | Zymo research | D4060 | |
| PAGE purified illumina sequencing primer | IDT DNA | ||
| PEI (polyethyleneimine) | Sigma | 408727-100ML | |
| Permoplast modeling clay | |||
| Petridish with central opening | Visual Sonics | ||
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| Q5 Polymerase 2x Master mix | NEB | M0494L | |
| Qubit Fluorometric Quantification | Invitrogen | Q33327 | |
| Semicircular Silicone plug | Corning | ||
| Silicone membrane | Visual Sonics | ||
| T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
| Ultra-centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
| Vevo2000 ultrasound system | Visual Sonics |
References
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