Triagem In Vivo CRISPR/Cas9 para avaliar simultaneamente a função genética na pele do rato e na cavidade oral

Sampath  Kumar Loganathan; Ahmad Malik; Ellen Langille; Chen Luxenburg; Daniel Schramek

doi:10.3791/61693

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Artigo de método

Triagem In Vivo CRISPR/Cas9 para avaliar simultaneamente a função genética na pele do rato e na cavidade oral

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DOI:

10.3791/61693

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2 de novembro de 2020

Sampath Kumar Loganathan¹ , Ahmad Malik¹^,² , Ellen Langille¹^,² , Chen Luxenburg³ , Daniel Schramek¹^,²

¹Centre for Molecular and Systems Biology, Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, ²Department of Molecular Genetics, University of Toronto, ³Department of Cell and Developmental Biology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University

Neste artigo

Resumo

Aqui descrevemos uma metodologia rápida e direta de triagem in vivo CRISPR/Cas9 utilizando ultrassom guiado em injeções lentiviras embrionárias uterobrionárias para avaliar simultaneamente funções de vários genes na pele e cavidade oral de camundongos imunocompetrente.

Resumo

Modelos de camundongos geneticamente modificados (GEMM) têm sido fundamentais na avaliação da função genética, modelagem de doenças humanas e servindo como modelo pré-clínico para avaliar caminhos terapêuticos. No entanto, sua natureza de tempo, trabalho e custo-intensivo limita sua utilidade para análise sistemática da função genética. Os recentes avanços nas tecnologias de edição de genomas superam essas limitações e permitem a rápida geração de perturbações genéticas específicas diretamente dentro de órgãos específicos do mouse de forma multiplexada e rápida. Aqui, descrevemos um método baseado em CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) para gerar milhares de clones de knock-out genéticos dentro do epitélio da pele e cavidade oral dos camundongos, e fornecer um protocolo detalhando os passos necessários para realizar uma tela CRISPR direta para genes supressores tumorais. Essa abordagem pode ser aplicada a outros órgãos ou outras tecnologias CRISPR/Cas9, como a ativação crispr ou a inativação crispr para estudar a função biológica dos genes durante a homeostase tecidual ou em vários ambientes de doenças.

Introdução

Um dos desafios para a pesquisa do câncer na era pós-genômica é minerar a vasta quantidade de dados de genoma para mutações genéticas causais e identificar nós na rede genética que podem ser direcionados terapeuticamente. Embora as análises bioinformáticas tenham ajudado imensamente nesse sentido, estabelecer modelos in vitro e in vivo eficientes é um pré-requisito para decifrar a complexidade dos sistemas biológicos e estados de doenças e para permitir o desenvolvimento de medicamentos. Embora os modelos convencionais de camundongos transgênicos tenham sido usados extensivamente para estudos de genética do câncer in vivo, sua natureza de custo, tempo e trabalho inten....