In Vivo CRISPR/Cas9 Screening para evaluar simultáneamente la función génica en la piel del ratón y la cavidad oral
Summary
Aquí describimos una metodología de detección CRISPR/Cas9 rápida y directa in vivo utilizando inyecciones lentivirales embrionarias de tero guiadas por ultrasonido para evaluar simultáneamente las funciones de varios genes en la piel y la cavidad oral de ratones inmunocompetentntes.
Abstract
Los modelos de ratón modificados genéticamente (GEMM) han sido fundamentales para evaluar la función génica, modelar enfermedades humanas y servir como modelo preclínico para evaluar las vías terapéuticas. Sin embargo, su naturaleza de tiempo, mano de obra y costo intensivo limita su utilidad para el análisis sistemático de la función génica. Los recientes avances en las tecnologías de edición del genoma superan esas limitaciones y permiten la rápida generación de perturbaciones genéticas específicas directamente dentro de órganos específicos del ratón de una manera multiplexada y rápida. Aquí, describimos un método basado en CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) para generar miles de clones genéticos knock-out dentro del epitelio de la piel y la cavidad oral de ratones, y proporcionar un protocolo que detalle los pasos necesarios para realizar una pantalla CRISPR directa in vivo para los genes supresores tumorales. Este enfoque se puede aplicar a otros órganos u otras tecnologías CRISPR/Cas9 como la activación CRISPR o la inactivación CRISPR para estudiar la función biológica de los genes durante la homeostasis tisular o en diversos entornos de la enfermedad.
Introduction
Uno de los desafíos para la investigación del cáncer en la era post-genómica es extraer la gran cantidad de datos del genoma para mutaciones genéticas causales e identificar nodos en la red genética que pueden ser dirigidos terapéuticamente. Si bien los análisis bioinformáticas han ayudado enormemente hacia estos objetivos, establecer modelos eficientes in vitro e in vivo es un requisito previo para descifrar la complejidad de los sistemas biológicos y los estados de enfermedades y para permitir el desarrollo de fármacos. Si bien los modelos convencionales de ratón transgénico se han utilizado ampliamente para estudios genéticos in vivo sobre el cáncer, su naturaleza intensiva en costos, tiempo y mano de obra ha prohibido en gran medida el análisis sistemático de los cientos de genes cancerosos putativos desentrañados por la genómica moderna. Para superar este cuello de botella, combinamos una tecnología de edición genética1,2 con una tecnología de edición de genes CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)3 para inducir y estudiar simultáneamente mutaciones de pérdida de función de cientos de genes en la piel y cavidad oral de un solo ratón.
La metodología descrita aquí utiliza inyecciones guiadas por ultrasonido de lentivirus de ingeniería en la cavidad amniótica de embriones de ratón vivos en el día embrionario E9.5. La carga lentiviral que contiene componentes CRISPR/Cas9 transduce el ectodermo superficial de una sola capa, que más tarde da lugar al epitelio de la piel y la cavidad oral. La piel se compone de una epidermis externa, seguida de membrana y dermis del sótano. Epidermis es un epitelio estratificado compuesto por una capa interior basal, que mantiene contacto con la membrana del sótano y tiene capacidad proliferativa y de células madre. La capa basal da lugar a las capas diferenciadas anteriores, como las capas de córneo espinosas, granulares y estrato2,4. Estudios de rastreo de linaje muestran que este método crispr/cas9 in vivo directo manipula genéticamente las células madre residentes en tejidos dentro de la capa basal que persisten a lo largo de la edad adulta. Como el lentivirus se puede valorar para transducir el ectodermo superficial E9.5 a densidad clonal, este método se puede utilizar para generar ratones mosaico que albergan miles de clones noqueantes genéticos discretos. A continuación, la secuenciación de próxima generación se puede utilizar para analizar el efecto de la ablación genética mediada por CRISPR/Cas9 dentro de esos clones de forma multiplexada5.
Recientemente utilizamos este método para evaluar la función de 484 genes que muestran mutaciones recurrentes en carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello humano (HNSCC)5. El HNSCC es un cáncer devastador con una alta tasa de mortalidad del 40-50% y es el6º cáncer más común en todo el mundo6. El HNSCC surge en revestimientos mucosos de las vías respiratorias superiores o cavidad oral y se asocian con el consumo de tabaco y alcohol o la infección por el virus del papiloma humano (VPH). Carcinoma de células escamosas cutáneas (SCC) son tumores de piel y representan el segundo cáncer más común en los seres humanos7. Cutánea SCC y HNSCC son histológica y molecularmente muy similares, con un alto porcentaje de casos que exhiben alteración en TP53, PIK3CA, NOTCH1 y HRAS8. Si bien sólo hay un puñado de genes mutados a alta frecuencia, hay cientos de genes que se encuentran mutados a baja frecuencia (< 5%), un fenómeno comúnmente conocido como la distribución de cola larga. Como la mayoría de los genes de cola larga carecen de validación biológica o clínica, utilizamos esta tecnología de detección CRISPR in vivo para modelar la pérdida de la función de estos genes en ratones propensos a tumores con mutaciones sensibilizantes en p53, Pik3ca o Hras e identificamos varios genes supresores tumorales novedosos que cooperan con p53, Pik3ca o Hras para desencadenar el desarrollo tumoral5.
Aquí, describimos un protocolo detallado para generar bibliotecas de sgRNA lentiviral CRISPR lentiviral multiplexed y realizar pantallas noqueadas del gen CRISPR/Cas9 en el ectodermo de la superficie del ratón. Cabe destacar que esta metodología se puede adaptar para incorporar otras tecnologías de manipulación genética como la activación CRISPR (CRISPRa) y la inactivación CRISPR (CRISPRi) o modificarse para dirigirse a otros sistemas de órganos del ratón para estudiar las funciones genéticas.
Protocol
Representative Results
Discussion
La edición del genoma CRISPR/Cas9 ha sido ampliamente utilizada en estudios in vitro e in vivo para investigar las funciones genéticas y los procesos celulares. La mayoría de los estudios in vivo utilizan células editadas por genes CRISPR/Cas9 injertadas en un modelo animal (aloinjerto o xenoinjerto). Si bien esta es una poderosa herramienta para estudiar la genética del cáncer y las funciones celulares, todavía carece del microambiente de tejido nativo y podría provocar heridas y/o respuestas inmunes.
<p cla…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una subvención de proyectos del Instituto Canadiense de Investigación de la Salud (CIHR 365252), la Fundación Krembil y la Ronda 8 de Excelencia en Investigación del Fondo de Investigación de Ontario (RE08-065). Sampath Kumar Loganathan es el receptor de una beca de la Sociedad Canadiense del Cáncer (BC-F-16#31919).
Materials
| 0.45 micron filter | Sigma | S2HVU02RE | |
| 12k or 92k oligo chip | Customarray Inc. (Genscript) | ||
| 15 cm cell culture plates | Corning | ||
| 293FT | Invitrogen | R70007 | |
| 293NT | Systems Biosciences | LV900A-1 | |
| Alkaline phosphatase | NEB | M0290L | |
| Amplicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | |
| ATP | NEB | 9804S | |
| BsmBI | NEB | R0580L | |
| Chromic gut suture | Covidien | ||
| Deep sequencing (Next-Seq or Hi-Seq) | Illumina | ||
| DNA-cleanup kit | Zymo Research | D4008 | |
| DNAesy Blood and Tissue DNA extraction kit | Qiagen | 69506 | |
| Endura electrocompetent cells | Lucigen | 60242-1 | |
| Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| High-Speed Centrifuge | Beckman Coulter | MLS-50 | |
| LB Agar | Wisent Technologies | 800-011-LG | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Mini-prep plasmid Kit | Frogga Bio | PDH300 | |
| Mouse oxygen anaesthesia system | Visual Sonics | ||
| Nanoject II micromanipulator | Drummond | ||
| NEBuffer 3.1 (Buffer for BsmBI) | NEB | R0580L | |
| Needle sharpener | Sutter Instrument | BV-10 | |
| Oligo cleanup kit | Zymo research | D4060 | |
| PAGE purified illumina sequencing primer | IDT DNA | ||
| PEI (polyethyleneimine) | Sigma | 408727-100ML | |
| Permoplast modeling clay | |||
| Petridish with central opening | Visual Sonics | ||
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| Q5 Polymerase 2x Master mix | NEB | M0494L | |
| Qubit Fluorometric Quantification | Invitrogen | Q33327 | |
| Semicircular Silicone plug | Corning | ||
| Silicone membrane | Visual Sonics | ||
| T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
| Ultra-centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
| Vevo2000 ultrasound system | Visual Sonics |
References
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