Summary
Hier beschreiben wir eine schnelle und direkte in vivo CRISPR/Cas9 Screening-Methodik mit Ultraschall-geführten in utero embryonalen lentiviralen Injektionen, um gleichzeitig die Funktionen mehrerer Gene in der Haut und Mundhöhle von immunkompetenten Mäusen zu bewerten.
Abstract
Genetisch veränderte Mausmodelle (GEMM) waren maßgeblich an der Beurteilung der Genfunktion, der Modellierung menschlicher Krankheiten und als präklinisches Modell zur Bewertung therapeutischer Wege beteiligt. Ihre zeit-, arbeits- und kostenintensive Natur schränkt jedoch ihren Nutzen für die systematische Analyse der Genfunktion ein. Jüngste Fortschritte in den Genom-Editing-Technologien überwinden diese Einschränkungen und ermöglichen die schnelle Generierung spezifischer Genstörungen direkt in bestimmten Mausorganen in multiplexierter und schneller Weise. Hier beschreiben wir eine CRISPR/Cas9-basierte Methode (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), um Tausende von Gen-Knock-out-Klonen innerhalb des Epithels der Haut und der Mundhöhle von Mäusen zu erzeugen, und liefern ein Protokoll, das die Schritte beschreibt, die notwendig sind, um einen direkten in vivo CRISPR-Bildschirm für Tumorsuppressorgene durchzuführen. Dieser Ansatz kann auf andere Organe oder andere CRISPR/Cas9-Technologien wie CRISPR-Aktivierung oder CRISPR-Inaktivierung angewendet werden, um die biologische Funktion von Genen während der Gewebehomöostase oder in verschiedenen Krankheitssituationen zu untersuchen.
Introduction
Eine der Herausforderungen für die Krebsforschung in der postgenomischen Ära besteht darin, die riesige Menge an Genomdaten für kausale Genmutationen zu abbauen und Knoten im Gennetzwerk zu identifizieren, die therapeutisch anvisiert werden können. Während bioinformatische Analysen enorm dazu beigetragen haben, diese Ziele zu erreichen, ist die Etablierung effizienter In-vitro- und In-vivo-Modelle eine Voraussetzung, um die Komplexität biologischer Systeme und Krankheitszustände zu entschlüsseln und die Entwicklung von Arzneimitteln zu ermöglichen. Während herkömmliche transgene Mausmodelle ausgiebig für in vivo Krebsgenetik-Studien verwendet wurden, hat ihre kosten-, zeit- und arbeitsintensive Natur die systematische Analyse der Hunderte von vermeintlichen Krebsgenen, die durch die moderne Genomik entwirrt wurden, weitgehend verboten. Um diesen Engpass zu überwinden, kombinierten wir eine zuvor etablierte Ultraschall-geführte in der Utero-Injektionsmethodik1,2 mit einer CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) Gen-Editing-Technologie3, um gleichzeitig Funktionsverlustmutationen von Hunderten von Genen in Haut und Mundhöhle einer einzelnen Maus zu induzieren und zu untersuchen.
Die hier beschriebene Methodik nutzt Ultraschall-geführte Injektionen von technisch hergestellten Lentiviren in die Fruchtwasserhöhle lebender Mausembryonen am Embryonaltag E9.5. Die lentivirale Ladung, die CRISPR/Cas9-Komponenten enthält, transduciert das einschichtige Oberflächenektoderm, das später das Epithel der Haut und der Mundhöhle hervorruft. Die Haut besteht aus einer äußeren Epidermis, gefolgt von Kellermembran und Dermis. Epidermis ist ein geschichtetes Epithel, das aus einer inneren Basalschicht besteht, die den Kontakt mit der Kellermembran aufrechterhält und eine proliferative und Stammzellkapazität hat. Die Basalschicht führt zu den differenzierten Schichten oben wie z.B. stachelförmigen, körnigen und stratum corneum Schichten2,4. Lineage-Tracing-Studien zeigen, dass diese direkte in vivo CRISPR/Cas9-Methode geweberesidente Stammzellen innerhalb der Basalschicht genetisch manipuliert, die während des gesamten Erwachsenenalters fortbestehen. Da lentivirus titriert werden kann, um das E9.5-Oberflächenektoderm bei klonaler Dichte zu transduzieren, kann diese Methode verwendet werden, um Mosaikmäuse zu erzeugen, die Tausende von diskreten Gen-Knock-out-Klonen beherbergen. Die Sequenzierung der nächsten Generation kann dann verwendet werden, um die Wirkung der CRISPR/Cas9-vermittelten Genablation innerhalb dieser Klone in multiplexisierter Weise zu analysieren5.
Wir haben diese Methode vor kurzem verwendet, um die Funktion von 484 Genen zu bewerten, die wiederkehrende Mutationen im menschlichen Kopf- und Hals-Squamous-Zell-Karzinom (HNSCC)5zeigen. HNSCC ist eine verheerende Krebserkrankung mit einer hohen Sterblichkeitsrate von 40–50% und sie ist die6. häufigste Krebsart weltweit6. HNSCC entstehen in Schleimhautauskleidungen der oberen Atemwege oder Mundhöhle und sind mit Tabak- und Alkoholkonsum oder einer Infektion mit dem humanen Papillomavirus (HPV) in Verbindung gebracht. Kutanes Plattenepithelkarzinom (SCC) sind Hauttumoren und stellen die zweithäufigste Krebsart beim Menschendar 7. Kutane SCC und HNSCC sind histologisch und molekular sehr ähnlich, mit einem hohen Prozentsatz von Fällen, die Veränderungen in TP53, PIK3CA, NOTCH1 und HRAS8aufweisen. Während es nur eine Handvoll Gene gibt, die mit hoher Frequenz mutiert sind, gibt es Hunderte von Genen, die mit niedriger Frequenz mutiert sind (< 5%), ein Phänomen, das gemeinhin als Long-tail-Verteilung bezeichnet wird. Da die Mehrheit der Longtail-Gene keine biologische oder klinische Validierung haben, haben wir diese in vivo CRISPR-Screening-Technologie verwendet, um Funktionsverlust dieser Gene bei tumorgefährdeten Mäusen mit sensibilisierenden Mutationen in p53, Pik3ca oder Hras zu modellieren und identifizierten mehrere neuartige Tumorsuppressorgene, die mit p53, Pik3ca oder Hras zusammenarbeiten, um die Tumorentwicklung auszulösen5.
Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Generierung von multiplexed sgRNA lentiviral CRISPR sgRNA Bibliotheken und führen CRISPR/Cas9 Gen Knock-out-Screens in der MausOberfläche Ektoderm. Bemerkenswert ist, dass diese Methode angepasst werden kann, um andere Genmanipulationstechnologien wie CRISPR-Aktivierung (CRISPRa) und CRISPR-Inaktivierung (CRISPRi) zu integrieren oder modifiziert werden, um andere Organsysteme in der Maus zu zielen, um Genfunktionen zu untersuchen.
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Protocol
Dieses Protokoll wurde in Übereinstimmung mit der IACUC der University of Toronto genehmigt und durchgeführt.
1. Entwerfen und Klonen von gepoolten CRISPR-Bibliotheken
- Wählen Sie 4-5 sgRNAs aus, die auf Mausgene von Interesse aus Ressourcen wie dem Broad Institute sgRNA Designer (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) oder dem CHOPCHOP-Server (https://chopchop.cbu.uib.no) abzielen. Wählen Sie eine gleiche Anzahl von nicht-zielgerichteten sgRNAs aus z.B. Sanjana et al.9 aus, um eine gleich große gRNA-Bibliothek für nicht-zielgerichtete Steuerelemente zu generieren.
- Stellen Sie beim Aufbau der sgRNA-Bibliotheken sicher, dass für jede sgRNA im Zielorgansystem genügend Abdeckung vorhanden ist. Für die Maushaut ist die Epidermis bei E9.5 eine einzelne Schicht, die 150.000 Zellen enthält, von denen die meisten eine Stammzellkapazität haben4. Wenn die lenti-virale Transduktion zu einer Infektiosität von 15-20% führt, werden nur 18.000-24.000 Zellen bei E9.5 transduziert. Skalieren Sie das Experiment entsprechend.
- Zum Klonen und Verstärken dieser sgRNA-Bibliotheken fügen Sie BsmBI-Enzymrestriktionsstellen sowie Grundbindungs-DNA-Sequenzen an 5' und 3' Ende der sgRNA hinzu und ordnen die resultierenden Oligos in voller Länge als gepoolten Oligonukleotidchip an (Abbildung 1A).
- Um verschiedene Bibliotheken auf einem Chip zu multiplexen, fügen Sie bibliotheksspezifische Primersequenzen hinzu.
- Mit den entsprechenden Primer-Paaren, verstärken Sie jede Bibliothek separat vom gepoolten Oligo-Chip. Mischen Sie in einem PCR-Rohr 25 l 2x Polymerase-Master-Mix, 20 l DNase/RNase-freies Wasser, 5 ng Oligo-Chip-DNA, 2,5 l geeignete Vorwärtsgrundierung und 2,5 l geeignete Reverse-Primer. Verwenden Sie 12-15 Zyklen und verstärken Sie mit 98 °C Denaturierung, 63-67 °C Glühen, 72 °C Erweiterungsparameter für jeden Zyklus in der PCR-Maschine.
- Führen Sie PCR-Produkt auf einem 2,5% Agarose-Gel aus und reinigen Sie das PCR-Produkt mit einem Gel-DNA-Reinigungskit.
- Bereiten Sie das Backbone-Plasmid vor.
- Verdauen Sie 5 g der Cre-recombinase mit pLKO-Cre Stuffer v3-Plasmid mit 2 l BsmBI in 50 l Reaktionsmischung für 1 h bei 55 °C, gefolgt von 1 l alkalischer Phosphatase-Inkubation für 45 min bei 37 °C gemäß Herstelleranleitung.
HINWEIS: Cre-recombinase enthält pLKO-Cre Stuffer v3 Plasmid ist ein lenti-virales Plasmid, das Cre-Recombinase-Enzym enthält, um Lox-Stop-Lox-Kassette in Mauszellen zu entfernen und hat auch einen U6-Promotor, um die Expression von sgRNA und tracrRNA zu fördern. Eine Version mit Cas9 und ohne Cas9 kann verwendet werden und ist auf Addgene #158030 und #158031 verfügbar. - Führen Sie die verdaute DNA auf einem 1% Agarose-Gel aus und reinigen Sie das 7 kb linearisierte Vektorband mit einem Gel-DNA-Reinigungskit. Bemerkenswert ist, dass auch ein 2 kb Stuffer-Band sichtbar sein sollte, was auf einen erfolgreichen Digest hinweist.
- Verdauen Sie 5 g der Cre-recombinase mit pLKO-Cre Stuffer v3-Plasmid mit 2 l BsmBI in 50 l Reaktionsmischung für 1 h bei 55 °C, gefolgt von 1 l alkalischer Phosphatase-Inkubation für 45 min bei 37 °C gemäß Herstelleranleitung.
- Richten Sie die Ligationsreaktion ein, um eine sgRNA-Plasmidbibliothek zu erzeugen.
- Mischen Sie 1 g gereinigten Vektor und 30 ng gereinigten PCR-Einsatz mit 2 l BsmBI, 5 l T4-DNA-Ligase, 10 -M ATP und 1x Puffer spezifisch für BsmBI. Inkubieren Sie den Ligationsmix über Nacht bei 37 °C. Verwenden Sie ein zusätzliches Rohr, das alle oben genannten Materialien außer dem PCR-Einsatz als Negativkontrolle enthält.
- Am nächsten Tag morgen, reinigen Sie die Ligationsmischung mit dem Oligo-Reinigungskit und elute in 7 l RNase/DNase freies Wasser.
- Elektroporate die Bibliothek in kompetente Zellen.
- Fügen Sie 2 l eluierte sgRNA-Bibliothek oder negative Kontrollligationsmischung zu 25 l aufgetauten elektrokompetenten Zellen in vorgekühlten Küvetten (1,0 mm) auf Eis hinzu. Elektroporate nach dem Herstellerprotokoll (10 F, 600 Ohm, 1800 Volt). Zur Küvette 975 l Erholungsmedium (oder SOC-Medium) innerhalb von 10 s des Pulses hinzufügen.
- Elektroporated Zellen in ein Kulturrohr übertragen und eine Stunde bei 37 °C in einem bakteriellen Schüttelinkubator bei 300 U/min brüten.
- Schätzen Sie die Transformationseffizienz und die Bibliotheksabdeckung pro sgRNA.
- Bereiten Sie eine 100-fache Verdünnung vor, indem Sie 10 l der Transformationsreaktion, die Zellen enthält, die mit der sgRNA-Bibliothek oder negativer Kontrollligation elektropoiert sind, auf 990 l Erholungsmedium übertragen und gut mischen.
- Platte 10 l der verdünnten Transformationsmischung auf eine vorgewärmte 10 cm LB + Ampicillin (100 g/l) Agarplatte. Dies führt zu einer 10.000-fachen Verdünnung der Transformationsmittel und verwendet diese Platte, um die Transformationseffizienz zu berechnen. Inkubation der Platten bei 30 °C für 14–16 h durchführen.
- Den Rest der Transformationsreaktion durch Dies pro Platte von insgesamt 10 vorgewärmten 15 cm LB + Ampicillin-Agarplatten 100 l der wiedergewonnenen Zellen zu verfestigen. Inkubieren Sie die Platten für 14–16 h bei 30 °C. Bemerkenswert ist, dass das Wachstum bei 30 °C die Rekombination zwischen den beiden langterminalen Wiederholungen innerhalb des viralen Plasmids minimiert.
- Um den Klonerfolg zu bewerten, berechnen Sie die Transformationseffizienz. Zählen Sie die Anzahl der Kolonien auf der Verdünnungsplatte, die Transformanten aus der sgRNA-Bibliothek oder Negativkontrollligation (10 cm Platten, Schritt 1.8.2) enthält. Negative Kontrollmischung sollte keine oder nur sehr wenige Kolonien haben. Um die Gesamtzahl der Kolonien zu erhalten, multiplizieren Sie die Anzahl der Kolonien mit 10.000.
HINWEIS: Die gezählte Gesamtzahl der Kolonien stellt eine Bibliotheksabdeckung dar, die mindestens 200x Kolonien pro sgRNA betragen sollte.- Stellen Sie sicher, dass eine Bibliothek mit 2000 sgRNAs mindestens 400.000 Kolonien hat. Falls es nicht genügend Kolonien gibt, wiederholen und mehr Elektroporation einrichten.
- Qualitätskontrolle: Von der Verdünnungsplatte 20 Kolonien pflücken und jede Kolonie zu einem individuellen Kulturrohr hinzufügen, das 3 ml LB-Medien + Ampicillin enthält. Alle 20 Röhren über Nacht bei 30 °C schütteln bei 250 U/min inkubieren. Reinigen Sie die Plasmid-DNA mit Mini-Prep-Kit nach Herstelleranweisungen und Sanger Sequenz alle 20 Plasmid-DNA-Proben, um zu überprüfen, dass jede Probe eine andere sgRNA-Sequenz mit dem U6-Primer (5'-GAG GGC CTA TTT CCC ATG ATT CC-3') hat.
- Ernten Sie die Kolonien von jedem 15 cm Teller.
- Fügen Sie 7 ml LB Medium, dann kratzen Sie die Kolonien von der LB Agar Platte mit einem Zellstreuer. Verwenden Sie eine 10 ml Pipette, um die Zellen in einen 2 L sterilen konischen Kolben zu übertragen. Wiederholen Sie dies für alle Platten und Poolbakterien im 2 L-Kolben. Den Kolben für 2-3 h Schütteln bei 30 °C inkubieren. Zentrifugieren Sie die Kultur und sammeln Sie das Pellet.
- Reinigen Sie Plasmid-DNA mit einem Maxi-Plasmid-Reinigungskit.
- Zusätzliche Qualitätskontrolle: Verwenden Sie 1 ng maxi-prep sgRNA Bibliothek Plasmid-DNA und führen Sie eine PCR-Reaktion mit Next-Generation-Sequenzierungsprimer nach Herstelleranweisungen aus. Die Darstellung aller sgRNAs in der Bibliothek kann durch eine tiefe Sequenzierungsplattform überprüft werden.
2. Herstellung von High Titer lentivirus geeignet für In-vivo-Transduktion
HINWEIS: Führen Sie alle Schritte in diesem Abschnitt des Protokolls in einer BSL2+-Anlage in einem Biosicherheitsschrank der Klasse II, Typ A2, aus. 293FT und vor allem die 293NT Verpackungszellen ermöglichen eine höhere Virusproduktion. Verwenden Sie niedrige Durchgangszellen ( 3. Ultra-Sound geführte Chirurgie und Injektion HINWEIS: Diese Technologie wurde von4,11angepasst. Mikroinjektionen, die auf die Transduktion des Oberflächenepithels ausgerichtet sind, müssen am Embryonaltag E9.5 durchgeführt werden, wenn das Oberflächenektoderm aus einer einzigen Schicht besteht, und vor der Bildung des Periderms ab E10, was eine Transduktion dieser Basalschicht verhindern würde. Vorzugsweise am Freitag Mäuse aufstellen, so dass der erste mögliche Tag mit E9.5-Embryonen der folgende Montag ist. Verwenden Sie Rosa26-Lox-STOP-LOX-Cas9-GFP-Mäuse (Jackson Laboratory #024857) für optimale CRISPR/Cas9-Effizienz12. 4. Tiefe Sequenzierung
HINWEIS: Verwenden Sie immer eine ungeöffnete oder erst kürzlich geöffnete Flasche DMEM für die Transfektion, da der pH-Wert in diesem Schritt entscheidend ist und DMEM mit der Zeit nach dem Öffnen einfacher wird.
HINWEIS: Die resultierende virusische Suspension sollte eine ca. 2.000-fache Konzentration und die resultierende Viruslösung ergeben und einen viralen Titer von 107-109aufweisen, was gut genug für mehr als 100 e9,5 operationen ist, die unten beschrieben werden.
HINWEIS: Der Vergleich zwischen der konzentrierten viralen Suspension mit ihrem unkonzentrierten viralen Überstand ermöglicht es, den Erfolg von (1) viraler Produktion sowie (2) virale Konzentration zu schätzen. Alternativ kann der virale Titer mit der qRT-PCR-Methode10geschätzt werden. Die großflächige Produktion und Konzentration des Lentivirus kann auch mit einer zweistufigen Konzentration mit einer Patronenkonzentration gefolgt von einer Ultrazentrifugation durchgeführt werden, wie zuvor beschrieben2.
HINWEIS: Überschreiten Sie nicht 30 min Anästhesie, da schwangere Muttern ihre Embryonen über diese Zeit hinaus abtreiben. Ein erfahrener Chirurg kann innerhalb von 30 min eine Operation von bis zu 12 Embryonen injizieren.
HINWEIS: Bei der Durchführung von Ultraschall, der in Gebärmutteroperationen geführt wird, sollte äußerste Sorgfalt darauf geachtet werden, eine saubere Umgebung zu erhalten, die Sterilität so weit wie möglich zu erhalten und mögliche Verunreinigungen zu vermeiden. Wenn mehr als eine Operation am selben Tag durchgeführt werden muss, ist es wichtig, die Sezierinstrumente mit einem Perlensterilisator zu sterilisieren und andere Geräte zu reinigen, die auf mit Ethanol gereinigtes Mausgewebe treffen. Dies erhöht das höhere Überleben der Embryonen nach der Operation erheblich. Die Überlebensrate für die hier beschriebene Operationsmethode liegt konstant zwischen 80-100%.
HINWEIS: Mäuse werden am besten mit dem Fluoreszenzmikroskop bis zum postnatalen Tag 3 identifiziert, bevor das Haar zu wachsen beginnt.
HINWEIS: Es ist wichtig, eine Referenzstichprobe zu generieren, um sgRNA-Faltenänderungen im Laufe der Zeit zu berechnen. Transduced embryos 3 Tage nach der Infektion oder transduced cells (siehe Schritt 2. 6) kann als Referenzprobe dienen, um die sgRNA-Darstellung in der ursprünglichen Bibliothek zu bestimmen.
HINWEIS: Richten Sie die Barkodierung pcR-Reaktion in einem separaten dedizierten Bereich des Labors oder in einer Gewebekulturhaube ein, die gründlich durch DNA-Löschen gereinigt wird, um eine Kontamination zu vermeiden. Führen Sie eine negative Kontrolle für jede PCR-Platte mit Wasser als Vorlage aus, um sicherzustellen, dass keine Kontamination vorliegt.
HINWEIS: Der Vorverstärkungsschritt ist nur für die Verstärkung eines komplexen Transduced Gewebes erforderlich. Wenn man einen einzelnen Tumor verstärkt, der vermutlich eine Klonzelle bildet und somit nur eine einzige sgRNA enthält, kann man die Vorverstärkung PCR1 überspringen und sofort mit PCR2 fortfahren.
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Representative Results
Abbildung 1A zeigt das Design der Oligonukleotide zum Multiplexieren mehrerer benutzerdefinierter CRISPR-Bibliotheken auf kostengünstige Weise in einem einzigen 12k- oder 92k-Oligochip. Sobald die sgRNAs (blaue Farbe kodiert) ausgewählt sind, werden die Oligonukleotide mit Restriktionsstellen (orange farbene BsmBI) und bibliotheksspezifischen PCR-Primer-Paaren (grüne Farbe codiert) entworfen. Mehrere Bibliotheken können mit einer einzigartigen Kombination von Primerpaaren für Multiplexing in einem einzigen Oligo-Chip entworfen werden. Wenn PCR die Bibliotheken mit einem bestimmten PCR-Primer-Paar verstärkt, schließen Sie immer eine Wasser nur negative Kontrolle und führen Sie alle Reaktionen auf einem Agarose-Gel. Die negative Kontrollspur sollte keine Bänder bei 100 bp haben, während die Bibliothek verstärkte Spur ein einzelnes 100 bp-Band haben sollte. Wenn kein Band vorhanden ist, stellen Sie sicher, dass das PCR-Primer-Paar entsprechend ausgewählt ist. Abbildung 1B zeigt den Qualitätskontrollschritt der geklonten Bibliothek und das virale Produktions- und Konzentrationsverfahren. Es sollte darauf geachtet werden, dass die gleiche Vertretung von sgRNAs vom Klonen bis zur Transduktion erhalten bleibt. Sequenzierungslesungen der PCR-verstärkten DNA aus plasmid- und lenti-viralen Bibliothekstransduzierten Zellen der nächsten Generation sollten eine hohe Korrelation aufweisen. Jede Abweichung muss sorgfältig analysiert werden, um zu prüfen, ob die Darstellung vor oder nach der Lenti-Virus-Vorbereitung verloren geht. Wenn die sgRNA-Lesevorgänge aus der Plasmid-DNA nicht die gleiche Darstellung von sgRNAs aufweisen, muss das virale Präparat und Konzentrationsverfahren mit Vorsicht wiederholt werden. Wenn der Verlust der gleichen sgRNA-Darstellung in der Plasmid-DNA eingetreten ist, dann muss das gesamte Klonverfahren einschließlich PCR-Verstärkung von Bibliotheken aus Oligo-Chip mit reduzierten Amplifikationszyklen wiederholt werden. Der Erfolg des CRISPR-Bibliotheksscreenings hängt entscheidend von der gleichberechtigten Darstellung der in der Bibliothek vorhandenen sgRNAs ab.
Abbildung 2 zeigt die Ultraschall-geführte Mikroinjektion, die für die Manipulation der E9.5-Embryonen bei schwangeren Mäusen eingerichtet wurde. Die gesamte Einrichtung wird unter ein Biosicherheits-Level-II-Schrank gestellt, um den sterilen Zustand des gesamten Eingriffs aufrechtzuerhalten und eine Infektion der trächtigen Maus aufgrund der chirurgischen Eingriffe zu vermeiden. Es sollte darauf geachtet werden, dass die Uterushörner während der Injektion nicht unter Druck gesetzt werden. Die Nadel muss sehr scharf sein, so dass die Wunde an der Gebärmutterwand und der Fruchtwassermembran minimal ist.
Abbildung 3 zeigt die Ergebnisse der ultra-soliden geführten Injektion von Lenti-Virus, das Cre-Recombinase in E9.5 Lox-stop-Lox (LSL) Konfetti-Mauswelpen am postnatalen Tag (P)0 trägt. Viraler Titer kann angepasst werden, um eine angemessene Transduktionsabdeckung der Epidermis zu erhalten. Während hohe Titer des Virus würde zu einer größeren Abdeckung der Maus-Haut führen, Es würde auch in transduktion von mehreren sgRNAs in die gleiche Zelle potenziell verwirren die Ergebnisse führen. Um mehrere Transduktionen einer einzelnen Zelle zu reduzieren, sollte die Infektionsrate <20% beibehalten werden.
Abbildung 4 zeigt Sequenzierungs-Lesevorgänge der nächsten Generation von PCR-verstärkter DNA aus plasmid- und lenti-viralen Bibliothekstransduzierten Zellen und liest auch aus 4 repräsentativen Tumoren. sgRNA-Leitfäden für Adam10 und Ripk4 sind in den Tumorproben (Dreiecke und Diamanten) im Vergleich zur sgRNA-Präsentation im Plasmidpool oder infizierten Zellen angereichert. Adam10 und Ripk4 fungieren als Tumorsuppressoren5. Mehrere hundert Tumoren können durch Zuweisen einzigartiger Barcodes zu jeder Probe und tief sequenziert werden, wie im Protokoll beschrieben.
Abbildung 1: Klonen der gezielten CRISPR-Bibliothek. (A) Schemat, das die Konstruktion von Oligonukleotiden für den 12 k oder 92 k benutzerdefinierten Oligochip darstellt. Auf jeder Seite der sgRNA wurden BsmBI (oder andere kompatible) Restriktionsstellen (orange kodiert und unterstrichen) hinzugefügt. Pfeilspitzen zeigen die BsmBI-Schnittstelle an. Für jede Bibliothek wurde ein einzigartiges Paar PCR-Primer (grün, braun und lila kodiert) hinzugefügt, so dass es speziell mit PCR vom gepoolten Chip verstärkt werden kann. Mehrere benutzerdefinierte Bibliotheken können bis zu 12k oder 92k Oligos multiplexiert werden. (B) Grafik, die die sgRNA-Darstellung aus einer CRISPR-Bibliothek in Plasmid-DNA im Vergleich zu DNA von Zellen zeigt, die mit derselben lentiviralen Bibliothek transduziert wurden. Jeder Punkt stellt eine Führung dar. Die vollständige Repräsentation wurde nach der Transduktion mit einer gewissen Korrelation in Hülle und Fülle aufrechterhalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Bild des ultraschallgeführten Mikroinjektionsaufbaus. (A) Maus, die E9.5-Embryonen trägt, wurde betäubetisiert und auf eine beheizte Plattform gestellt, wobei die Gebärmutter in einer PBS-gefüllten modifizierten Petrischalenkammer (stabilisiert durch vier Modellierton) ausgesetzt wurde. Der blaue Halbrundkautschuk unterstützte die Gebärmutter, die Embryonen enthielt, und die Injektionsnadel des Mikroinjektors ist auf der rechten Seite positioniert. Der Ultraschall-Scankopf wurde auf dem oberen Relais-Live-Bild auf den Monitor hinter mit Nadelkopf sichtbar montiert. (B) Nahaufnahme Ultra-Sound-Bild eines E9.5 Embryo. Die Lentivirale Bibliothek wurde mit der Nadel (auf der rechten Seite gesehen) in die Fruchtwasserhöhle injiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Erfolgreiche Transduktion des Oberflächenepithels in der Maus. Fluoreszierende Bilder von Ganzkörper-, Mundhöhle, Zunge und Gaumen neugeborener Cre-Reporter-LSL-Konfetti-Mäuse, die mit Demcre lentivirus transduziert wurden (Einlass: entsprechende Weißlichtbilder). Skalenbalken = 500 m Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Tiefe Sequenzierung von Tumorproben. Grafik, die die sgRNA-Darstellung aus einer CRISPR-Bibliothek in Plasmid-DNA-Daten im Vergleich zu DNA von Zellen zeigt, die mit derselben lentiviralen Bibliothek transduziert wurden, sowie Lesevorgänge aus 4 repräsentativen Tumoren. Die roten und grünen Kreise bezeichnen die Anzahl der Adam10- und Ripk4-sgRNA-Lesevorgänge in Bibliotheks- und Transduced-Zellen, während das rote Dreieck die Lesevorgänge von Adam10 sgRNAs darstellt und der grüne Diamant die Lesevorgänge von Ripk4 sgRNAs darstellt, die in Tumoren von separaten HNSCC-Mäusen identifiziert wurden und eine 1000-fache Faltenanreicherung zeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| PCR1 Vorwärts-Primer | GAGGGCCTATTTCCCATGATTC |
| PCR1 Reverse Primer | CAAACCCAGGGCTGCCTTGGAA |
Tabelle 1: Primer für PCR1-Reaktion. Die Vorwärts- und Reverse-Primer, die zur Verstärkung der Region um die sgRNA-Kassette aus der genomischen DNA von Zellen verwendet werden, die mit dem Lenti-Virus transduziert werden.
| Schritt | Temperatur | Zeit | |
| 1 | 98 °C | 30 Sek. | |
| 2 | 98 °C | 10 Sek. | |
| 3 | 66 °C | 30 Sek. | |
| 4 | 72 °C | 15 Sek. | 15 Zyklen (Schritt 2-4) |
| 5 | 72 °C | 2 Min. | |
| 6 | 4 °C | Halten |
Tabelle 2: PCR1-Zyklusparameter. PCR-Bedingungen, die zur Amplifikation der Region um die sgRNA-Kassette aus der genomischen DNA von Zellen verwendet werden, die mit dem Lenti-Virus transduziert wurden.
| 501 FW | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACATAGCCTACCTCTCTCCTACACG ACGCTCTTCCGATCTtgtggaaggacgaaaCACCG |
||
| 701 RV | CAAGGAGAAGACGGCATACGAGATCGAGTAGTGACTGGAGGAGAGACACGTGTGCT CTTCCGATCTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTAAAAC |
||
| * Die unterstrichenen Basen zeigen den Illumina -Barcode-Standort Illumina (D501-510 für Vorwärts und D701-712 für Reverse) an, die für Multiplexing verwendet wurden. | |||
| * Rote Basen zeigen die Sequenz an, die an die Zielstelle auf dem lentiviralen CRISPR-Plasmid bindet. Diese Region kann entsprechend dem verwendeten lentiviralen Vektor modifiziert werden. | |||
Tabelle 3: Barcoding Primer für PCR2-Reaktion. Primer, die verwendet werden, um Barcode zu verstärken jede Tumorprobe (entweder direkt aus genomischer DNA oder mit den Produkten von PCR1 als Vorlage). Der unterstrichene Bereich gibt den eindeutigen Barcodebereich an, der für jede Probe für das Multiplexen in einer tiefen Sequenzierungsreaktion zugewiesen werden kann. Die rot gefärbten Basispaare geben den Zielbereich im lentiviralen Konstrukt an, den diese Primer binden. Diese Zielregion kann entsprechend der Art des verwendeten lentiviralen Konstrukts geändert werden.
| Schritt | Temperatur | Zeit | |
| 1 | 98 °C | 30 Sek. | |
| 2 | 98 °C | 10 Sek. | |
| 3 | 68 °C | 30 Sek. | |
| 4 | 72 °C | 15 Sek. | 10 Zyklen (Schritt 2-4) |
| 5 | 72 °C | 2 Min. | |
| 6 | 4 °C | Halten |
Tabelle 4: PCR2-Zyklusparameter. PCR-Bedingungen, die verwendet werden, um Barcode zu verwenden, verstärken jede Tumorprobe (entweder direkt aus der genomischen DNA oder unter Verwendung der Produkte von PCR1 als Vorlage).
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Discussion
Die CRISPR/Cas9-Genombearbeitung wurde in In-vitro- und In-vivo-Studien häufig zur Untersuchung von Genfunktionen und zellulären Prozessen eingesetzt. Die meisten In-vivo-Studien verwenden CRISPR/Cas9-Gen-editierte Zellen, die in ein Tiermodell (Allograft oder Xenograft) eingepfropft wurden. Während dies ein leistungsfähiges Werkzeug ist, um Krebsgenetik und zelluläre Funktionen zu studieren, fehlt es immer noch an der einheimischen Gewebemikroumgebung und könnte Wund- und/oder Immunreaktionen hervorrufen.
Um diese Herausforderungen zu meistern, haben mehrere Gruppen in den letzten Jahren mehrere, multiplexige autochthone Mausmodelle entwickelt,15,16,17,18. Diese Projekte sind in der Regel auf adeno-assoziierte Viren (AAV) angewiesen, um sgRNAs an Zielorgane zu liefern. AAV ermöglicht die Erzeugung von sehr höheren Titer nen und erleichtert so das Produktions-High-Titer-Virus, das für In-vivo-Manipulationen erforderlich ist. Die Verwendung von AAVs begrenzt jedoch stark die Anzahl der Gene, die analysiert werden können, auf etwa 40-50 Gene, da AAVs sich im Gegensatz zum Lentivirus nicht stabil in die genomische DNA integrieren, was das Auslesen von sgRNA-Bibliotheken unpraktisch macht. Das AAV-basierte Screening erfordert das direkte Auslesen von Mutationen an Zielstandorten, z. B. durch gezielte Erfassungssequenzierung. Die multiplexe PCR-basierte Erfassungssequenzierung beschränkt jedoch die Anzahl der entkapselbaren Ziele in einer "bildschirmfähigen" Bibliothek in der Regel auf die Größenordnung von Dutzenden15,16,17,18.
Im Vergleich zu AAV in vivo CRISPR-Bildschirmen verwendet die hier beschriebene Methodik lentivirale sgRNAs. Da lentivirale Konstrukte in die DNA der Zielzelle integriert sind, kann die sgRNA-Darstellung in genomischer DNA ähnlich wie bei herkömmlichen CRISPR-Bildschirmen19,20analysiert werden. Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Analyse von Hunderten von Genen und kann auch auf genomweite In-vivo-Bildschirme nahtlos skaliert werden. Zum Beispiel würde ein genomweiter Bildschirm mit 78.000 sgRNAs und einer Abdeckung von 30x 90 Embryonen erfordern, wie zuvor für einen ähnlichen shRNA-Bildschirm4beschrieben. Da die Wurfgrößen der häufigsten inzuchtbasierten Mausstämme bei 8-12 Welpen/Wurf liegen und ein erfahrener Chirurg leicht alle Mäuse in ein wenig injizieren kann, wären für einen solchen genomweiten Bildschirm nur etwa 10-12 Dämme und Operationen erforderlich.
Der Erfolg eines In-vivo-Bildschirms hängt von der Produktion von High Titer-Viren ab. Während lentivirale Konstrukte, die eine sgRNA von Interesse ausdrücken, Cas9 und Cre (z. B. pSECC) eine bequeme und praktikable All-in-One-Lösung sind, haben sie die Verpackungsgrenze für das lentivirale Capsid (ca. 10 kb gesamtgröße), was zu einem insgesamt niedrigeren viralen Titer führt. Um diese Herausforderung zu meistern, verwenden wir R26-LSL-Cas9-GFP-Mäuse und ein lenti-virales Konstrukt, das nur Cre-Recombinase zusammen mit einer sgRNA enthält. Das resultierende lentivirale Konstrukt ist nur 7 kb lang und ergibt einen viralen Titer von mehr als 108 PFU/ml.
Gezielte und spezifische Bibliotheken können in wenigen Tagen schnell generiert werden und das komplexe Netzwerk genetischer Wechselwirkungen kann innerhalb weniger Wochen in vivo untersucht werden. Die Cas9-vermittelte Mutagenese kann entweder bei Wildtyp-Mäusen durchgeführt werden, um organentwicklung, Homöostase oder Krankheitsphänotypen (Krebs, entzündliche Hauterkrankungen usw.) zu untersuchen, oder sie können leicht mit Mäusen kombiniert werden, die onkogene Mutationen oder Kombinationen von Mutationen beherbergen, um den genetischen Status bei menschlichen Patienten zu modellieren. Darüber hinaus kann die Klonmethodik verfeinert werden, um CRISPRa- oder CRISPRi-Bibliotheken zu klonen, indem kompatible Einschränkungssites und sgRNA-Sequenzen in All-in-One-Plasmid hinzugefügt werden. Bemerkenswert ist, dass alle Bibliotheken, die Genfunktionen manipulieren, nicht nur in Mausmodellen, sondern auch in anderen Tiermodellen und in organoiden Kulturen verwendet werden können. Zusammen hebt diese Methode den Nutzen hervor und bietet eine Boilerplate, um direkte in vivo CRISPR zu verwenden, um somatische Genbearbeitung und Mausmodellierung zu integrieren, um die Genfunktion in vivo schnell zu bewerten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch ein Projektstipendium des Canadian Institute of Health Research (CIHR 365252), der Krembil Foundation und des Ontario Research Fund Research Excellence Round 8 (RE08-065) unterstützt. Sampath Kumar Loganathan ist Träger eines Stipendiums der Canadian Cancer Society (BC-F-16-31919).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 micron filter | Sigma | S2HVU02RE | |
| 12k or 92k oligo chip | Customarray Inc. (Genscript) | ||
| 15 cm cell culture plates | Corning | ||
| 293FT | Invitrogen | R70007 | |
| 293NT | Systems Biosciences | LV900A-1 | |
| Alkaline phosphatase | NEB | M0290L | |
| Amplicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | |
| ATP | NEB | 9804S | |
| BsmBI | NEB | R0580L | |
| Chromic gut suture | Covidien | ||
| Deep sequencing (Next-Seq or Hi-Seq) | Illumina | ||
| DNA-cleanup kit | Zymo Research | D4008 | |
| DNAesy Blood and Tissue DNA extraction kit | Qiagen | 69506 | |
| Endura electrocompetent cells | Lucigen | 60242-1 | |
| Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| High-Speed Centrifuge | Beckman Coulter | MLS-50 | |
| LB Agar | Wisent Technologies | 800-011-LG | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Mini-prep plasmid Kit | Frogga Bio | PDH300 | |
| Mouse oxygen anaesthesia system | Visual Sonics | ||
| Nanoject II micromanipulator | Drummond | ||
| NEBuffer 3.1 (Buffer for BsmBI) | NEB | R0580L | |
| Needle sharpener | Sutter Instrument | BV-10 | |
| Oligo cleanup kit | Zymo research | D4060 | |
| PAGE purified illumina sequencing primer | IDT DNA | ||
| PEI (polyethyleneimine) | Sigma | 408727-100ML | |
| Permoplast modeling clay | |||
| Petridish with central opening | Visual Sonics | ||
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| Q5 Polymerase 2x Master mix | NEB | M0494L | |
| Qubit Fluorometric Quantification | Invitrogen | Q33327 | |
| Semicircular Silicone plug | Corning | ||
| Silicone membrane | Visual Sonics | ||
| T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
| Ultra-centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
| Vevo2000 ultrasound system | Visual Sonics |
References
- Beronja, S., Fuchs, E. RNAi-mediated gene function analysis in skin. Methods in Molecular Biology. 961, 351-361 (2013).
- Beronja, S., Livshits, G., Williams, S., Fuchs, E. Rapid functional dissection of genetic networks via tissue-specific transduction and RNAi in mouse embryos. Nature Medicine. 16, 821-827 (2010).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343, 84-87 (2014).
- Beronja, S., et al. RNAi screens in mice identify physiological regulators of oncogenic growth. Nature. 501, 185-190 (2013).
- Loganathan, S. K., et al. Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling. Science. 367, 1264-1269 (2020).
- Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. The molecular landscape of head and neck cancer. Nature Reviews Cancer. 18, 269-282 (2018).
- Green, A. C., Olsen, C. M. Cutaneous squamous cell carcinoma: an epidemiological review. British Journal of Dermatology. 177, 373-381 (2017).
- Campbell, J. D., et al. pathway network, and immunologic features distinguishing squamous carcinomas. Cell Reports. 23, 194-212 (2018).
- Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11, 783-784 (2014).
- Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnology. 6, 34 (2006).
- Schramek, D., et al. Direct in vivo RNAi screen unveils myosin IIa as a tumor suppressor of squamous cell carcinomas. Science. 343, 309-313 (2014).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159, 440-455 (2014).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10, 25 (2009).
- Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens. Genome Biology. 15, 554 (2014).
- Winters, I. P., Murray, C. W., Winslow, M. M. Towards quantitative and multiplexed in vivo functional cancer genomics. Nature Reviews Genetics. 19, 741-755 (2018).
- Rogers, Z. N., et al. Mapping the in vivo fitness landscape of lung adenocarcinoma tumor suppression in mice. Nature Genetics. 50, 483-486 (2018).
- Chow, R. D., et al. AAV-mediated direct in vivo CRISPR screen identifies functional suppressors in glioblastoma. Nature Neuroscience. 20, 1329-1341 (2017).
- Wang, G., et al. Mapping a functional cancer genome atlas of tumor suppressors in mouse liver using AAV-CRISPR–mediated direct in vivo screening. Science Advances. 4, 5508 (2018).
- Chan, K., Tong, A. H. Y., Brown, K. R., Mero, P., Moffat, J. Pooled CRISPR-based genetic screens in mammalian cells. Journal of Visualized Experiments. (151), e59780 (2019).
- Hart, T., et al. High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities. Cell. 163, 1515-1526 (2015).
