Summary
ここでは、子宮胚性レンチウイルス注射で超音波誘導を使用した迅速かつ直接的なin vivo CRISPR/Cas9スクリーニング方法論を説明し、免疫担当マウスの皮膚および口腔内のいくつかの遺伝子の機能を同時に評価する。
Abstract
遺伝子組み換えマウスモデル(GEMM)は、遺伝子機能の評価、ヒト疾患のモデル化、治療手段の評価のための前臨床モデルとしての役割を果たしてきました。しかし、時間、労力、コストを要する性質は、遺伝子機能の体系的な分析のための有用性を制限します。ゲノム編集技術の最近の進歩は、これらの限界を克服し、多重化された迅速な方法で特定のマウス器官内で直接特異的な遺伝子摂動の迅速な生成を可能にする。ここでは、CRISPR/Cas9ベースの方法(クラスター化された定期的に間隔を置いた短いパリンドローム反復)を用いて、マウスの皮膚および口腔の上皮内に何千もの遺伝子ノックアウトクローンを生成し、腫瘍抑制遺伝子に対して直接in vivo CRISPRスクリーンを実行するために必要な手順を詳述するプロトコルを提供する 。このアプローチは、他の臓器またはCRISPR活性化やCRISPR不活性化などの他のCRISPR/Cas9技術に適用して、組織ホメオスタシス中または様々な疾患の設定における遺伝子の生物学的機能を研究することができます。
Introduction
ゲノム後のがん研究における課題の1つは、因果遺伝子変異のゲノムデータを大量に取り出し、治療的に標的とできる遺伝子ネットワーク内のノードを特定することです。バイオインフォマティクス分析はこれらの目標に非常に役立っていますが、効率的なインビトロおよびインビボモデルを確立することは、生物学的システムと疾患状態の複雑さを解読し、医薬品開発を可能にするための前提条件です。従来のトランスジェニックマウスモデルは、生体内がん遺伝学の研究に広く使用されてきましたが、そのコスト、時間、労働集約的な性質は、現代のゲノミクスによって解明された何百もの推定癌遺伝子の体系的な分析をほとんど禁止してきました。このボトルネックを克服するために、以前に確立された超音波誘導性子宮注射方法論1,2をCRISPR/Cas9(クラスター化された定期的に間隔をあけられた短いパリンドローム反復)遺伝子編集技術3と組み合わせて、単一マウスの皮膚および口腔内の何百もの遺伝子の機能喪失変異を同時に誘導および研究した。
ここで説明する方法論は、胚性の日E9.5で生きているマウス胚の羊膜腔に工学的レンチウイルスの超音波誘導注射を利用する。CRISPR/Cas9成分を含むレンチウイルス貨物は、単層表面外膜をトランスデューシングし、後に皮膚の上皮および口腔を生じさせる。皮膚は外側の表皮で構成され、続いて膜と真皮が続く。表皮は、基底膜との接触を維持し、増殖および幹細胞能力を有する内層、基底層から構成される階層化された上皮である。基底層は、上記の分化層(例えば、棘、粒状および角層2、4)を生み出す。系統トレース研究は、この直接in vivo CRISPR/Cas9法が成人期を通じて持続する基底層内の組織に居住する幹細胞を遺伝的に操作することを示している。レンチウイルスは、クローン密度でE9.5表面外膜をトランスデューシングするために滴定することができるので、この方法は、何千もの離散遺伝子ノックアウトクローンを収容するモザイクマウスを生成するために使用することができる。次世代シーケンシングを使用して、それらのクローン内のCRISPR/Cas9媒介遺伝子アブレーションの効果を多重化した方法で分析することができます5.
我々は最近、この方法を用いて、ヒト頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)5における再発性突然変異を示す484遺伝子の機能を評価した。HNSCCは40-50%の高い死亡率を持つ壊滅的な癌であり、それは6番目に世界で最も一般的な癌である6番目に一般的な癌である6 .HNSCCは、上部気道または口腔の粘膜内層で生じ、タバコおよびアルコール消費量またはヒトパピローマウイルス(HPV)感染に関連している。皮膚扁平上皮癌(SCC)は皮膚腫瘍であり、ヒトにおける2番目に多い癌である7。皮SCCとHNSCCは、組織学的および分子的に非常に類似しており、TP53、PIK3CA、NOTCH1、およびHRAS8において変化を示す症例の割合が高い。高頻度で変異する遺伝子はほんの一握りですが、低周波(<5%)で変異した遺伝子は何百種類もあります。長い尾の遺伝子の大半は生物学的または臨床的検証を欠いているため、この生体内CRISPRスクリーニング技術を使用して、p53、Pik3caまたはHrasの感作突然変異を有する腫瘍発生しやすいマウスにおけるこれらの遺伝子の機能喪失をモデル化し、p53、Pik3caまたはHrasと協力するいくつかの新しい腫瘍抑制遺伝子を同定して腫瘍開発を開始した。
ここでは、多重化sgRNAレンチウイルスCRISPR sgRNAライブラリを生成し、CRISPR/Cas9遺伝子ノックアウトスクリーンをマウス表面エクストダームで行う詳細なプロトコルについて説明する。なお、この方法論は、CRISPR活性化(CRISPRa)やCRISPR不活性化(CRISPRi)などの他の遺伝子操作技術を組み込むために適応することができ、または遺伝子機能を研究するためにマウスの他の器官系を標的にするように改変することができる。
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Protocol
このプロトコルは承認され、トロント大学のIACUCに従って実行されました.
1. プールされたCRISPRライブラリの設計とクローン作成
- ブロード・インスティテュートのsgRNAデザイナー(https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design)やCHOPCHOPサーバー(https://chopchop.cbu.uib.no)などのリソースから、関心のあるマウス遺伝子を標的とする4-5 sgRNAを選択します。例えば、Sanjana et al.9 から同数の非標的 sgRNA を選択して、同等のサイズの非標的制御 gRNA ライブラリーを生成する。
- sgRNAライブラリーを構築する際には、標的臓器系の各sgRNAに十分なカバレッジがあることを確認してください。マウスの皮膚の場合、E9.5の表皮は、150,000個の細胞を含む単層であり、そのほとんどは幹細胞容量4を有する。レンチウイルス伝達が15〜20%の感染率をもたらす場合、E9.5でトランスミケーションされるのは18,000-24,000個の細胞だけです。それに応じて実験をスケーリングします。
- これらのsgRNAライブラリーのクローニングおよび増幅のために、SgRNAの5'および3'末端にBsmBI酵素制限部位ならびにプライマー結合DNA配列を加え、得られた全長オリゴをプールされたオリゴヌクレオチドチップとして注文する(図1A)。
- 1 つのチップ上の異なるライブラリを多重化するには、ライブラリ固有のプライマー シーケンスを追加します。
- 適切なプライマーペアを使用して、プールされたオリゴチップとは別に各ライブラリを増幅します。PCRチューブには、2xポリメラーゼマスターミックス25 μL、DNase/RNaseフリーウォーター20 μL、オリゴチップDNA5 ng、適切なフォワードプライマー2.5 μL、適切なリバースプライマー2.5 μLを混合します。12-15 サイクルを使用し、PCR マシンの各サイクルに対して 98 °C 変性、63-67 °C アニール、72 °C 拡張パラメータを使用して増幅します。
- PCR製品を2.5%アガロースゲルで実行し、ゲルDNAクリーンアップキットを使用して約100 bpのPCR産物を精製します。
- 骨格プラスミドを準備します。
- 55°Cで1時間の間にBsmBIの2 μLのpL-Cre stuffer v3プラスミドを含むクレリコンビナーゼの5μgを消化し、その後、メーカーの指示に従って37°Cで45分間のアルカリホスファターゼインキュベーションを1 μLとします。
注:pLKO-Cre stuffer v3プラスミドを含むクレインコンビナーゼは、マウス細胞中のLox-Stop-Loxカセットを除去するクレリコンビナーゼ酵素を含むレンチウイルスベースのプラスミドであり、また、sgRNAおよびtracrRNAの発現を駆動するU6プロモーターを有する。Cas9 と Cas9 を含まないバージョンは、Addgene #158030および#158031で使用でき、利用できます。 - 消化したDNAを1%アガロースゲルで実行し、ゲルDNAクリーンアップキットを使用して7kbの線形化ベクターバンドを精製します。注意すべきは、2 kb の詰め物バンドも、ダイジェストが成功したことを示す可視である必要があります。
- 55°Cで1時間の間にBsmBIの2 μLのpL-Cre stuffer v3プラスミドを含むクレリコンビナーゼの5μgを消化し、その後、メーカーの指示に従って37°Cで45分間のアルカリホスファターゼインキュベーションを1 μLとします。
- sgRNAプラスミドライブラリーを生成するライゲーション反応を設定します。
- 精製されたベクターの1 μgと精製PCRインサートの30 ngを2 μLのBsmBI、T4 DNAリガーゼの5 μL、10 μM ATP、およびBsmBIに特異的な1xバッファを混合します。ライゲーションミックスを一晩37°Cでインキュベートする。 PCRインサートを除く上記の材料をすべて含む追加のチューブをネガティブコントロールとして使用してください。
- 翌日の朝、オリゴのクリーンアップキットを使用してライゲーションミックスを精製し、RNase/ DNaseフリーウォーターの7 μLで溶出します。
- ライブラリを有能な細胞にエレクトロポレートします。
- 溶出したsgRNAライブラリまたは陰性対照ライゲーションミックスを氷上の冷蔵キュベット(1.0mm)の融解された電気コンピテントセルの25 μLに加えます。メーカーのプロトコル(10 μF、600オーム、1800ボルト)に従ってエレクトロポレート。キュベットに、パルスの10秒以内に975 μLの回収媒体(またはSOC培地)を加えます。
- 電気ポレートされた細胞を培養管に移し、300rpmで細菌振盪インキュベーターで37°Cで1時間インキュベートする。
- sgRNAあたりの変換効率とライブラリカバレッジを推定します。
- sgRNAライブラリまたは陰性対照ライゲーションで電気ポポレートされた細胞を含む10μLの変換反応を990μLの回収媒体に移して100倍希釈を調製し、よく混合します。
- 希釈変換のプレート10 μLを、あらかじめ温めた10 cm LB +アンピシリン(100 μg/L)寒天板に混ぜます。これにより、変換体の 10,000 倍の希釈が生じ、このプレートを使用して変換効率を計算します。30°Cで14~16時間のプレートインキュベーションを行います。
- 残りの変換反応をプレートに入れ、合計10個の予熱した15cm LB+アンピシリン寒天プレートの各プレートに回収した細胞を100μL広げます。30°Cで14~16時間のプレートをインキュベートします。 注意すべきは、30°Cでの成長は、ウイルスプラスミド内の2つの長末端反復間の再結合を最小限に抑える。
- クローンの成功を評価するには、変換効率を計算します。sgRNAライブラリまたは陰性対照結紮(10cmプレート、ステップ1.8.2)からの形質転換体を含む希釈プレート上のコロニー数を数える。負の対照ミックスは、任意または唯一の非常に少数のコロニーを持つべきではありません。コロニーの総数を求めるには、コロニーの数に10,000を掛けます。
注: コロニーの総数は、sgRNA あたり最低 200x のコロニーである必要があるライブラリカバレッジを表します。- 2000 sgRNA を持つライブラリに少なくとも 400,000 のコロニーがあることを確認します。十分なコロニーがない場合は、繰り返し、より多くのエレクトロポレーションを設定します。
- 品質管理:希釈プレートから20コロニーを選び、LB培地+アンピシリンの3mLを含む個々の培養管に各コロニーを追加します。250rpmで30°Cの揺れで20本のチューブすべてを一晩インキュベートします。メーカーの指示に従ってミニプレップキットを使用してプラスミドDNAを精製し、サンガー配列すべての20個のプラスミドDNAサンプルを使用して、各サンプルがU6プライマー(5'-GAG GGC CTA TTT CCC ATG ATT CC-3')を使用して異なるsgRNA配列を有することを確認します。
- 各15cmプレートからコロニーを収穫する。
- LB培地7 mLを加え、細胞スプレッダーでLB寒天プレートからコロニーを削り取ります。10 mL ピペットを使用して、細胞を 2 L 滅菌の円錐形フラスコに移します。2 Lフラスコのすべてのプレートとプール細菌について繰り返します。フラスコを30°Cで2~3時間揺れにインキュベートする。 培養物を遠心分離し、ペレットを集める。
- マキシプラスミド精製キットを使用してプラスミドDNAを精製します。
- 追加の品質管理:マキシプレップsgRNAライブラリープラスミドDNAの1 ngを使用し、メーカーの指示に従って次世代シーケンシングプライマーを使用してPCR反応を実行します。ライブラリー内のすべての sgRNA の表現は、深いシーケンス・プラットフォームによって検証できます。
2. 生体内導入に適した高いチターレンチウイルスの製造
注: クラス II、タイプ A2 バイオセーフティキャビネットの BSL2+ 施設で、プロトコルのこのセクションのすべての手順を実行します。293FT、特に293NT包装セルは、より高いウイルス産生を可能にする。トランスフェクションには低通路( 3. 超音導手術と注射 注:この技術は4、11から適応しました。表面上皮の導入に向けたマイクロインジェクションは、表面外胚の日E9.5で行われなければならない、表面外胚が単層で構成されている場合、そしてこの基底層の導入を妨げるE10から始まるペライダームの形成前に行う。好ましくは金曜日にマウスを設定し、E9.5胚で最初に可能な日が次の月曜日になるようにする。最適なCRISPR/Cas9効率12のためにRosa26-LOX-STOP-LOX-Cas9-GFPマウス(ジャクソン研究所#024857)を使用してください。 4. 深いシーケンシング手順
注:このステップのpHは重要であり、DMEMは一度開かれると時間の経過とともにより基本的なものになるので、トランスフェクションには必ず未開封または非常に最近開いたDMEMのボトルを使用してください。
注:結果として生じるウイルス懸濁液は、およそ2,000倍の濃度と結果として生じるウイルス溶液を生み出す必要があり、107-109のウイルスのチターを持っている必要があり、これは以下に記載される100以上のE9.5手術に十分です。
注:濃縮ウイルス懸濁液と濃縮されていないウイルス上清との比較は、(1)ウイルス産生ならびに(2)ウイルス濃度の成功を推定することを可能にする。あるいは、ウイルスの用合剤は、qRT-PCR法10を用いて推定することができる。レンチウイルスの大規模な生産および濃度は、前述のように、カートリッジ濃度を有する2段階濃度を用いて超遠心分離を行うこともできる。
注:妊娠中のダムは、その時間を超えて胚を中止する可能性がはるかに高いので、麻酔の30分を超えないでください。経験豊富な外科医は、30分の手術内に最大12個の胚を注入することができます。
注意:子宮外科で導かれる超音を行っている間、きれいな環境を維持し、可能な限り無菌性を維持し、可能な限り汚染物質を避けるために細心の注意を払うべきです。同じ日に複数の手術を行う必要がある場合は、ビーズ滅菌器を使用して解剖器具を殺菌し、エタノールで洗浄されたマウス組織に遭遇する他の装置をきれいにすることが重要です。これは、手術後の胚のより高い生存率を大幅に増加させる。ここで説明する手術方法の生存率は、一貫して80〜100%の間である。
注:マウスは、毛髪が成長し始める前に、出生後3日目まで蛍光顕微鏡を使用して最もよく識別されます。
注: 時間の経過に伴う sgRNA 折り返しの変化を計算するために、参照サンプルを生成することが重要です。トランスデュースされた胚は、感染後3日後またはトランスデューセ細胞(ステップ2.6を参照)を、元のライブラリーにおけるsgRNA表現を決定するための参照サンプルとして機能することができる。
注: バーコード PCR 反応は、ラボの別の専用領域または DNA 消去によって完全にクリーニングされる組織培養フードに設定して、汚染を防ぎます。汚れがないことを確認するために、水をテンプレートとして各PCRプレートに対して負のコントロールを実行します。
注:事前増幅ステップは、複雑なトランスデューセド組織の増幅にのみ必要です。おそらく開発された単一の腫瘍を腫瘍細胞を形成し、したがって単一のsgRNAを含む場合、1つは、プリ増幅PCR1をスキップし、PCR2ですぐに進むことができます。
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Representative Results
図1Aは 、1つの12kまたは92kオリゴチップで費用対効果の高い方法で複数のカスタムCRISPRライブラリを多重化するためのオリゴヌクレオチドの設計を示す。sgRNA(青色の色がコード化された)を選択すると、オリゴヌクレオチドは制限部位(オレンジ色のBsmBI)およびライブラリ固有のPCRプライマーペア(緑色コード化)で設計されます。いくつかのライブラリは、単一のオリゴチップで多重化するためのプライマーペアのユニークな組み合わせを使用して設計することができます。PCRが特定のPCRプライマーペアを使用してライブラリを増幅する場合、常に水のみ陰性制御を含め、アガロースゲル上のすべての反応を実行します。負の制御レーンは100 bpでバンドを持つべきではありませんが、図書館増幅レーンは単一の100 bpバンドを持つべきです。バンドがない場合は、PCR プライマー ペアが適切に選択されていることを確認します。 図1B は、クローン化されたライブラリーの品質管理ステップおよびウイルス産生および濃度手順を示す。sgRNAの等しい表現をクローニングから伝達まで維持するために注意する必要があります。プラスミドおよびレンチウイルスライブラリー導入細胞からのPCR増幅DNAの次世代シーケンシング読み取りは、高い相関を示すべきである。レンチウイルスの調製前または後に表現が失われるかどうかを調べるために、偏差を慎重に分析する必要があります。プラスミドDNAからsgRNAが読み取る場合は、sgRNAの等しい表現を示さない場合、ウイルス調製および濃縮手順は注意して繰り返さなければならない。プラスミドDNAで等しいsgRNA表現の喪失が起こった場合、クローニング手順全体を繰り返し、増幅サイクルを低減したオリゴチップからのライブラリーのPCR増幅を含む。CRISPRライブラリースクリーニングの成功は、ライブラリ内に存在するsgRNAの等しい表現に大きく依存する。
図2 は、妊娠マウスでE9.5胚を操作するための超音波誘導マイクロ注入設定を示す。全体のセットアップは全体のプロシージャの無菌状態を維持し、外科的処置による妊娠中のマウスの伝染を避けるためにバイオセーフティレベルIIキャビネットの下に置かれる。注入中に子宮の角を圧迫しないように注意する必要があります。針は非常に鋭くなければならないので、子宮壁と羊膜の傷は最小限に抑えられます。
図3 は、E9.5 Lox-stop-Lox(LSL)のマウスの親類を出生後(P)0で行うレンチウイルスの超健全誘導注入の結果を示す。ウイルス性の刺激剤は、表皮の適切な伝達カバレッジを得るために調整することができる。ウイルスの高い潮量はマウスの皮膚のより大きなカバレッジをもたらすが、それはまた、結果を混乱させる可能性のある同じ細胞への複数のsgRNAの伝達をもたらすであろう。単一の細胞の複数の伝達を減らすために、感染率は<20%維持されるべきである。
図4 は、プラスミドおよびレンチウイルスライブラリートランスデューシング細胞からのPCR増幅DNAの次世代シーケンシング読み取りと、4つの代表的な腫瘍からの読み取りも示しています。 Adam10 および Ripk4 を標的とするsgRNAガイドは、プラスミドプールまたは感染細胞におけるsgRNAの提示と比較して、腫瘍サンプル(三角形およびダイヤモンド)で濃縮される。 Adam10 および Ripk4 は腫瘍抑制剤5として機能する。数百個の腫瘍は、各サンプルに固有のバーコードを割り当て、プロトコルで概説されているように深い順序で多重化することができます。
図1:対象となるCRISPRライブラリのクローン作成(A)12kまたは92kカスタムオリゴチップ用オリゴヌクレオチドの設計を表す回路図。BsmBI(または他の互換性のある)制限部位(オレンジ色の色分けおよび下線部)は、sgRNAの各側に添加した。矢印ヘッドは、BsmBIカット部位を示します。各ライブラリに対して、ユニークなPCRプライマー(緑、茶色、紫の色がコード化された)を追加し、プールされたチップからのPCRを使用して特異的に増幅することができます。いくつかのカスタムライブラリは、12kまたは92kオリゴまで多重化することができます。(B)同じレンチウイルスライブラリーを用いて導入した細胞由来のプラスミドDNAとDNAのCRISPRライブラリーからのsgRNA表現を示すグラフ。各ドットはガイドを表します。完全な表現は、豊富ないくつかの相関関係を持つ伝達後に維持された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:超音波誘導マイクロインジェクションセットアップの画像。(A)E9.5胚を運ぶマウスを麻酔し、PBS充填された改変ペトリ皿チャンバーに子宮を露出させた加熱されたプラットホームに置いた(4つのモデリング粘土によって安定化)。青色の半円形ゴムは、胚を含む子宮を支え、マイクロインジェクターからの注射針を右側に配置した。超音波スキャンヘッドは、針の頭部が見える後ろのモニターにライブ画像を中継する上部に取り付けられました。(B) E9.5胚のクローズアップ超音像。レンチウイルスライブラリーを羊膜腔に注射した(右側に見られる)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:マウスにおける表面上皮の転写に成功。クレレンチウイルスを導入した新生児クレレポーターLSL-Confettiマウスの全身、口腔、舌、口蓋の蛍光像(入口:対応する白色光画像)。スケールバー= 500 μm この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:腫瘍サンプルの深いシーケンシング。同じレンチウイルスライブラリーを導入した細胞からのプラスミドDNAとDNAのCRISPRライブラリーからのsgRNA表現を示すグラフ、および4つの代表的な腫瘍からの読み取りに加えて。赤と緑の円は 、Adam10 および Ripk4 sgRNAがライブラリおよびトランスデューセ細胞で読み取る数を示し、赤色三角形は Adam10 sgRNAの読み取りを表し、緑色のダイヤモンドは腫瘍で同定された Ripk4 sgRNAの読み取りを表し、1000倍の倍数の濃縮を示す。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| PCR1フォワードプライマー | ガグックタットタガット |
| PCR1 リバースプライマー | カアコンカガグGCTCTGgAA |
表1:PCR1反応用プライマー レンチウイルスを導入した細胞のゲノムDNAからsgRNAカセットを取り囲む領域の増幅に用いられるフォワードおよびリバースプライマー。
| 歩 | 温度 | 時間 | |
| 1 | 98°C | 30秒 | |
| 2 | 98°C | 10秒 | |
| 3 | 66°C | 30秒 | |
| 4 | 72°C | 15秒 | 15サイクル(ステップ2-4) |
| 5 | 72°C | 2分 | |
| 6 | 4°C | 持つ |
表2:PCR1サイクルパラメータ レンチウイルスを導入した細胞のゲノムDNAからsgRNAカセットを取り囲む領域の増幅に用いられるPCR条件。
| 501 FW | アトガタッケグッカッカッカッハッタクトタッカータタグクトクトタッハクトタッハクタチャガッカCG ACGCTCtCcGATTTgtggaaggacg |
||
| 701 RV | カグカガガアッチャッガッカガチャガツガガクトガガクトクトガクトガクトカガックGTGTGTGTTT CTTCCGATCTATTTTATGCTTTTCTAGCTCTAAAC |
||
| *下線付きのベースは、多重化に使用されたバーコード位置(フォワード用D501-510、逆方向のD701-712)を示します。 | |||
| *赤色の塩基はレンチウイルスCRISPRプラスミド上の標的部位に結合する配列を示す。この領域は、使用するレンチウイルスベクターに応じて修飾することができる。 | |||
表3:PCR2反応用のプライマーをバーコード化する。 バーコードに使用されるプライマーは、各腫瘍サンプルを増幅します(ゲノムDNAから直接、またはPCR1の産物を鋳型として使用)。下線領域は、深いシーケンス処理で多重化するために各サンプルに割り当てることができる固有のバーコード領域を示します。赤色の塩基対は、これらのプライマーが結合するレンチウイルス構造中の標的領域を示す。この標的領域は、使用するレンチウイルス構造の種類に応じて変更することができる。
| 歩 | 温度 | 時間 | |
| 1 | 98°C | 30秒 | |
| 2 | 98°C | 10秒 | |
| 3 | 68°C | 30秒 | |
| 4 | 72°C | 15秒 | 10サイクル(ステップ2-4) |
| 5 | 72°C | 2分 | |
| 6 | 4°C | 持つ |
表 4: PCR2 サイクル パラメータ バーコードに使用される PCR 条件は、各腫瘍サンプルを増幅します (ゲノム DNA から直接、または PCR1 の産物をテンプレートとして使用)。
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Discussion
CRISPR/Cas9ゲノム編集は、遺伝子機能や細胞プロセスを調べるインビトロおよびインビボ研究で広く使用されています。ほとんどの生体内研究では、動物モデル(同種移植片または異種移植片)に移植されたCRISPR/Cas9遺伝子編集細胞を利用しています。これは癌遺伝学と細胞機能を研究するための強力なツールですが、それはまだネイティブの組織微小環境を欠いているし、傷や免疫応答を引き出す可能性があります。
これらの課題を克服するために、いくつかのグループは、過去数年間で複数の多重化オートチソナスマウスモデルを生成する直接in vivo CRISPRアプローチを開拓しました15,16,17,18.これらのプロジェクトは、通常、標的臓器にsgRNAを送達するためにアデノ関連ウイルス(AAV)に依存しています。AAVは非常に高い用剤の生成を可能にし、それによってインビボ操作に必要な高いっきりしたウイルスを生産促進する。しかし、AAVの使用は、レンチウイルスとは異なり、AAVがゲノムDNAに安定的に統合せず、sgRNAライブラリの読み出しを非現実的にするので、分析できる遺伝子の数を約40〜50遺伝子に厳しく制限します。AAVベースのスクリーニングは、例えば標的捕捉シーケンシングを用いて標的部位における突然変異の直接読み出しを必要とする。ただし、多重 PCR ベースのキャプチャ シーケンスでは、通常、"screenable" ライブラリ内のキャプチャ可能なターゲットの数は、通常、15、16、17、18の順序に制限されます。
In vivo CRISPR スクリーンの AAV と比較して、ここで説明する方法論はレンチウイルス sgRNA を使用します。レンチウイルス構築物が標的細胞のDNAに統合されることを考えると、sgRNAの表現は、任意の従来のCRISPRスクリーン19,20と同様のゲノムDNAで分析することができる。このように、この方法論は、数百の遺伝子の同時解析を可能にし、インビボスクリーンのゲノム全体にまでシームレスにスケールアップすることができます。例えば、78,000 sgRNAと30xのカバレッジを有するゲノムワイドスクリーンは、同様のshRNAスクリーン4について前述したように〜90個の胚を必要とするであろう。最も一般的な近交系マウス株のごみの大きさは約8-12匹の子犬/ごみであり、経験豊富な外科医は簡単に小さな中にすべてのマウスを注入することができるので、そのようなゲノム全体のスクリーンには約10〜12のダムと手術のみが必要です。
インビボスクリーンの成功は、高い潮のウイルス産生にヒンジします。関心のあるsgRNAを発現するレンチウイルス構造は、Cas9およびCre(例えば、pSECC)は便利で実現可能なオールインワン溶液であるが、レンチウイルスキャプシド(総サイズで約10kb)の包装限界があり、全体的に低いウイルス力価につながる。この課題を克服するために、R26-LSL-Cas9-GFPマウスとクレリコンビナーゼのみを含むレンチウイルス構築物をsgRNAと共に使用します。結果として得られるレンチウイルス構造は、わずか7 kbの長さであり、108 PFU/mL以上のウイルス力を生み出す。
標的型および特定のライブラリは、わずか数日で迅速に生成することができ、遺伝的相互作用の複雑なネットワークは、数週間以内に生体内で研究することができます。Cas9媒介性変異誘発は、野生型マウスで臓器の発達、ホメオスタシスまたは疾患表現型(癌、炎症性皮膚疾患など)を研究するために行うことができるか、または任意の発癌性突然変異または突然変異の組み合わせを有するマウスと容易に組み合わせてヒト患者に見られる遺伝的状態をモデル化することができる。さらに、クローニング方法は、互換性のある制限部位とsgRNA配列をオールインワンプラスミドに追加することで、CRISPRaまたはCRISPRiライブラリをクローン化するように改良することができます。注目に、遺伝子機能を操作するライブラリは、マウスモデルだけでなく、他の動物モデルやオルガノイド培養でも使用できます。この方法論は、このユーティリティを強調し、身体遺伝子編集とマウスモデリングを統合して生体内で遺伝子機能を迅速に評価するために直接in vivo CRISPRを使用する定型文を提供します。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、カナダ保健研究所(CIHR 365252)、クレンビル財団、オンタリオ研究基金リサーチエクセレンスラウンド8(RE08-065)からのプロジェクト助成金によって支えられました。サンパス・クマール・ロガナタンは、カナダ癌学会フェローシップ(BC-F-16#31919)の受賞者です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 micron filter | Sigma | S2HVU02RE | |
| 12k or 92k oligo chip | Customarray Inc. (Genscript) | ||
| 15 cm cell culture plates | Corning | ||
| 293FT | Invitrogen | R70007 | |
| 293NT | Systems Biosciences | LV900A-1 | |
| Alkaline phosphatase | NEB | M0290L | |
| Amplicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | |
| ATP | NEB | 9804S | |
| BsmBI | NEB | R0580L | |
| Chromic gut suture | Covidien | ||
| Deep sequencing (Next-Seq or Hi-Seq) | Illumina | ||
| DNA-cleanup kit | Zymo Research | D4008 | |
| DNAesy Blood and Tissue DNA extraction kit | Qiagen | 69506 | |
| Endura electrocompetent cells | Lucigen | 60242-1 | |
| Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| High-Speed Centrifuge | Beckman Coulter | MLS-50 | |
| LB Agar | Wisent Technologies | 800-011-LG | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Mini-prep plasmid Kit | Frogga Bio | PDH300 | |
| Mouse oxygen anaesthesia system | Visual Sonics | ||
| Nanoject II micromanipulator | Drummond | ||
| NEBuffer 3.1 (Buffer for BsmBI) | NEB | R0580L | |
| Needle sharpener | Sutter Instrument | BV-10 | |
| Oligo cleanup kit | Zymo research | D4060 | |
| PAGE purified illumina sequencing primer | IDT DNA | ||
| PEI (polyethyleneimine) | Sigma | 408727-100ML | |
| Permoplast modeling clay | |||
| Petridish with central opening | Visual Sonics | ||
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| Q5 Polymerase 2x Master mix | NEB | M0494L | |
| Qubit Fluorometric Quantification | Invitrogen | Q33327 | |
| Semicircular Silicone plug | Corning | ||
| Silicone membrane | Visual Sonics | ||
| T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
| Ultra-centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
| Vevo2000 ultrasound system | Visual Sonics |
References
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