قياس توزيعات cAMP ثلاثية الأبعاد في الخلايا الحية باستخدام التصوير والتحليل عالي الطيفي (x وy وz و λ)
Summary
نظرا لانخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR) المتأصلة في أجهزة الاستشعار المستندة إلى نقل الطاقة بالرنين Fӧrster (FRET) ، كان قياس إشارات cAMP صعبا ، خاصة في ثلاثة أبعاد مكانية. هنا، نقوم بوصف منهجية التصوير والتحليل فائقة الطيفية FRET التي تسمح بقياس توزيع cAMP في ثلاثة أبعاد مكانية.
Abstract
Cyclic AMP هو رسول الثاني الذي يشارك في مجموعة واسعة من الأنشطة الخلوية والفسيولوجية. تشير العديد من الدراسات إلى أن إشارات cAMP مجزأة ، وأن التقسيم يساهم في خصوصية الإشارات داخل مسار إشارات cAMP. وقد عزز تطوير أجهزة الاستشعار البيولوجية القائمة على نقل الطاقة بالرنين Fӧrster (FRET) القدرة على قياس وتصور إشارات cAMP في الخلايا. غير أن هذه القياسات كثيرا ما تقتصر على بعدين مكانيين، مما قد يؤدي إلى سوء تفسير للبيانات. وحتى الآن، لم تكن هناك سوى قياسات محدودة جدا لإشارات CAMP في ثلاثة أبعاد مكانية (س، ص، وz)، وذلك بسبب القيود التقنية في استخدام أجهزة استشعار FRET التي تظهر بطبيعتها نسبة إشارة منخفضة إلى ضوضاء (SNR). بالإضافة إلى ذلك، غالبا ما تكون أساليب التصوير التقليدية القائمة على الفلتر غير فعالة للقياس الدقيق لإشارات cAMP في المناطق شبه الخلوية المترجمة بسبب مجموعة من العوامل، بما في ذلك الكلام الطيفي المتقاطع، وقوة الإشارة المحدودة، والفلوروريشن التلقائي. للتغلب على هذه القيود والسماح باستخدام أجهزة الاستشعار الحيوية القائمة على FRET مع فلوروفورس متعددة ، قمنا بتطوير نهج التصوير والتحليل FRET الطيفية الفائقة التي توفر خصوصية طيفية لحساب كفاءات FRET والقدرة على فصل إشارات FRET الطيفية عن الفلورة التلقائية المحيرة و / أو الإشارات من تسميات فلورية إضافية. هنا، نقدم منهجية لتنفيذ التصوير FRET مفرط الطيفية، فضلا عن الحاجة إلى بناء مكتبة الطيفية المناسبة التي ليست أقل من المخ أو الإفراط في الاختزال لأداء التجهم الطيفي. بينما نقدم هذه المنهجية لقياس توزيعات CAMP ثلاثية الأبعاد في الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة الرئوية (PMVECs) ، يمكن استخدام هذه المنهجية لدراسة التوزيعات المكانية لل CAMP في مجموعة من أنواع الخلايا.
Introduction
الأدينوسين الدوري أحادي الفوسفات (cAMP) هو رسول الثاني المشاركة في العمليات الخلوية والفسيولوجية الرئيسية بما في ذلك انقسام الخلايا، وتدفق الكالسيوم، ونسخ الجينات، ونقل الإشارات. وهناك مجموعة متزايدة من الأدلة تشير إلى وجود مقصورات cAMP في الخلية التي من خلالها يتم تحقيقخصوصيةالإشارات 1 ،2،3،4،5،6،7. حتى وقت قريب، تم الاستدلال على تجزئة cAMP على أساس تأثيرات فسيولوجية أو خلوية متميزة ناجمة عن ناهضات مستقبلات G-coupled المختلفة8و9و10و11. وفي الآونة الأخيرة، قدمت مسابير التصوير الفلوري المستندة إلى FRET مقاربات جديدة للقياس المباشر وإشارات CAMP ومراقبتها فيالخلية 12و13و14.
Förster نقل الطاقة الرنين (FRET) هي ظاهرة المادية التي نقل الطاقة يحدث بين جزيئات المانحة والمقبل بطريقة غير إشعاعية عندما تكون الجزيئات على مقربة15،16. مع تطوير مؤشرات الفلورسنت FRET المستندة ، تم استخدام هذه الظاهرة الفيزيائية في التطبيقات البيولوجيةلدراسة التفاعلاتالبروتين البروتين 17 ، البروتين المشارك توطين18، كا+2 مما يشير إلى19، التعبير الجيني20، انقسام الخلية21 والإشارات النيوكليوتيدات الدورية. وتتكون مؤشرات CAMP المستندة إلى FRET عادة من مجال ربط CAMP ، وفلوروفوري مانح ، وفلوروفوري مقبول22. على سبيل المثال، يتكون مستشعر H188 cAMP12،22 المستخدم في هذه المنهجية من نطاق ربط cAMP تم الحصول عليه من Epac ، يقع بين الفلوروفوريس الفيروزي (المانح) والزهرة (المقبول). في الظروف القاعدية (غير منضم)، الفيروز والزهرة في اتجاه مثل هذا FRET يحدث بين الفلوروفوريس. عند ربط cAMP بمجال الربط ، يحدث تغيير تشكيلي بحيث ينفصل الفيروز والزهرة مما يؤدي إلى انخفاض في FRET.
تقدم أساليب التصوير المستندة إلى FRET أداة واعدة للتحقيق في إشارات cAMP وتصورها داخل الخلية. ومع ذلك ، فإن تقنيات التصوير المجهري الحالية القائمة على FRET غالبا ما تكون ناجحة جزئيا فقط في تحقيق قوة إشارة كافية لقياس FRET مع الوضوح المكاني دون الخلوي. ويرجع ذلك إلى عدة عوامل، بما في ذلك قوة الإشارة المحدودة للعديد من مراسلي FRET، والمستوى العالي من الدقة المطلوبة لتحديد التغيرات بدقة في كفاءة FRET، ووجود عوامل محيرة، مثل الفلورة الذاتية الخلوية23،24. والنتيجة هي في كثير من الأحيان صورة FRET التي تعاني من ضعف SNR ، مما يجعل تصور التغيرات دون الخلوية في FRET صعبا للغاية. وبالإضافة إلى ذلك، تم إجراء التحقيق في إشارات cAMP المترجمة مكانيا بشكل حصري تقريبا في بعدين مكانيين فقط ونادرا ما اعتبر توزيع cAMP المحوري25. وهذا على الأرجح لأن انخفاض SNR أعاق القدرة على قياس وتصور تدرجات cAMP في ثلاثة أبعاد مكانية. للتغلب على القيود المفروضة على استخدام أجهزة استشعار FRET مع انخفاض SNR، قمنا بتنفيذ التصوير والتحليل hyperspectral النهج لقياس FRET في خلايا واحدة25،26،27.
تم تطوير نهج التصوير الطيفي الفائق من قبل وكالة ناسا للتمييز بين الأجسام الأرضية الموجودة في صور الأقمار الصناعية28،29. وقد ترجمت هذه التقنيات منذ ذلك الحين إلى مجال المجهر الفلوري30، مع العديد من أنظمة المجهر confocal التجارية التي تقدم كاشفات الطيفية. في التصوير الفلوري التقليدي (غير الطيفي)، تكون العينة متحمسة باستخدام فلتر تمرير النطاق أو خط ليزر، ويتم جمع الانبعاثات باستخدام فلتر تمرير النطاق الثاني، الذي يتم اختياره غالبا لتتناسب مع الطول الموجي لذروة الانبعاثات للفلوروفور (الفلوروفور). وعلى النقيض من ذلك، تسعى نهج التصوير الطيفي الفائق إلى أخذ عينات من ملف طيفي كامل إما لانبعاثات الفلورية26أو31أو32 أو الإثارة33و34 على فترات طول موجية محددة. في دراساتنا السابقة، أظهرنا أن التصوير والتحليل الطيفي المفرط يمكن أن يقدم كمية محسنة لإشارات FRET في الخلايا بالمقارنة مع تقنيات التصوير FRET التقليدية القائمة على التصفية26. هنا، نقدم منهجية لأداء التصوير والتحليل عالي الطيفية (x و y و z و λ) ثلاثي الأبعاد لقياس وتصور توزيعات cAMP في ثلاثة أبعاد مكانية. وقد سمحت هذه النهج التصور من التدرجات المكانية cAMP الناجمة عن ناهض في خلايا واحدة25. ومن المثير للاهتمام، اعتمادا على ناهض، قد تكون التدرجات cAMP واضحة في الخلايا. وتستخدم المنهجية المعروضة هنا الطيس الطيفي للخلفية غير الموحدة والفلورة الذاتية الخلوية لتحسين دقة قياسات FRET. في حين يتم إثبات هذه المنهجية في الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة الرئوية (PMVECs) باستخدام جهاز استشعار حيوي CAMP FRET ، يمكن بسهولة تعديل المنهجية لاستخدامها مع مراسلي FRET البديلين أو خطوط الخلايا البديلة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد سمح تطوير أجهزة الاستشعار الحيوية FRET قياس وتصور إشارات النيوكليوتيدات الدورية في خلايا واحدة، وهناك وعد كبير لتصور الأحداث الإشارات دون الخلوية13،22،37،38. ومع ذلك ، فإن استخدام أجهزة الاستشعار الحيوية FRET يمثل العدي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب يود أن نعترف الدكتور كيس Jalink (معهد السرطان الهولندي ومركز فان ليوينهوك للمجهر المتقدم ، أمستردام ، هولندا) لتزويدنا H188 cAMP FRET الاستشعار البيولوجي وكيني ترينه (كلية الهندسة ، جامعة جنوب ألاباما) للمساعدة التقنية في الحد من الوقت الذي استغرقه لتشغيل العرف لدينا وضعت البرامج النصية.
ويود المؤلفون أن يعترفوا بمصادر التمويل: رابطة القلب الأمريكية (16PRE27130004)، المؤسسة الوطنية للعلوم؛ مؤسسة العلوم الوطنية (16PRE27130004)، المؤسسة الوطنية للعلوم؛ مؤسسة القلب الأمريكية (16PRE27130004)، المؤسسة الوطنية للعلوم( 160004). (1725937) المعاهد القومية للصحة، S100D020149، S10RR027535، R01HL058506، P01HL066299).
Materials
| Attofluor Cell Chamber | Invitrogen | A7816 | Attofluor contains steel cell chambers and a rubber O-ring. Cell chamber holds the coverslip and O-ring provides a lock in mechanism to hold the buffer in cell chamber with out leakage |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | Solvent used to prepare stock solution forskolin. |
| DRAQ5 Fluoroscent Probe Solution | Thermo Scientific | 62252 | Nuclear label |
| Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | Contains nutrients and growth factors for the cells to grow and divide in the culture dishes. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F6178 | Growth factor suppliment that is added to culture medium, DMEM |
| Forskolin | Sigma | F3917 | Adenyly cyclase activator. |
| H188 Cyclic AMP FRET biosensor | Netherland Cancer Institute, Dr. K. Jalink | Gift | Plasmid encoding Turquoise (donor fluorophore), Venus (acceptor fluorophore), and binding domain obtained from Epac. |
| Image J | image.net | Free download | Another image processing platform used to extact spectral information and image processing. |
| Integrating Sphere | Ocean Optics | FOIS-1 | Used to measure illumination intensity of the laser line at different laser intensities (?). |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Invitrogen | 23017-015 | Coverslips are coated with laminin and this helps in cell attachment, growth and motility of the cell. |
| Lipofectamine 3000 Transfection Kit | Invitrogen | L3000-015 | Transfection reagent used to transfect cells with H188 FRET biosensor |
| MATLAB | Mathworks | R2019a | Image processing operations (linear unmixing and FRET efficiency calculations) are performed by writing custom programs in MATLAB programming environment |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon Instruments | Nikon A1R | Spectral image acquisition is performed using confocal microscope. |
| Nikon Elements Software | Nikon Instruments | Software dongle | used to export and handle nd2 image files (multidimensional image files) that are aquired using Nikon A1R |
| NIST-Traceable Calibration Lamp | Ocean Optics | LS-1-CAL-INT | A lamp with a known spectrum for use as a standard |
| PBS pH 7.4 (1X) | Gibco | 10010-023 | coomonly used buffer suring cell culture |
| Pulmonary Microvascular Endothelial Cells (PMVECs) | In house – Cell culture core, Univeristy of South Alabama | Isolated from Rat pulmonary microvasculature | PMVECs form inner lining of a blood vessel. |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco | 15140-122 | antibiotics are added to culture medum to prevent contamination of the cells. |
| Pre-Cleaned Gold Seal Micro Slides | Clay Adams | 3010 | Microscope slides used for cell fixation |
| ProLong Diamond Antifade Mounting Media | Invitrogen | P36961 | If samples are fixed using antifade mountant, then the later protects fluoroscent dyes and chromophores from fading. |
| Spectrometer | Ocean Optics | QE65000 | Used to measure spectral response of the light source (?) |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 | Digests the protein-protein bond between the cell and cell matrix and helps to disscociate and lift the cells during cell plating. |
| Tyrodes Buffer | Made in-house | Made in-house | Tyrodes buffer is used to make working solutions and to maintain cells in aqueous solution during image acquisition. |
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3506 | Laminin coated coverslips are placed in 6-well culture dish (one coverlisps/well). Cells along with medium is added into each well. |
| 25 mm Round Microscope Cover Slips | Fisher Scientific | 12545102 | Cells were grown on round glass coverslips |
| 60X Ojective | Nikon Instruments | Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 | water immersion and commonly used objective for cells |
References
- Corbin, J. D., Sugden, P. H., Lincoln, T. M., Keely, S. L. Compartmentalization of adenosine 3′:5′-monophosphate and adenosine 3′:5′-monophosphate-dependent protein kinase in heart tissue. The Journal of Biological Chemistry. 252, 3854-3861 (1977).
- Terrin, A., et al. PGE1 stimulation of HEK293 cells generates multiple contiguous domains with different [cAMP]: role of compartmentalized phosphodiesterases. The Journal of Cell Biology. 175, 441-451 (2006).
- Bacskai, B. J., et al. Spatially resolved dynamics of cAMP and protein kinase A subunits in Aplysia sensory neurons. Science. 260, 222-226 (1993).
- Iancu, R. V., Ramamurthy, G., Harvey, R. D. Spatial and temporal aspects of cAMP signalling in cardiac myocytes. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 35, 1343-1348 (2008).
- Brunton, L. L., Hayes, J. S., Mayer, S. E. Functional compartmentation of cyclic AMP and protein kinase in heart. Advances in Cyclic Nucleotide Research. 14, 391-397 (1981).
- Hohl, C. M., Li, Q. Compartmentation of cAMP in adult canine ventricular myocytes. Relation to single-cell free Ca2+ transients. Circulation Research. 69, 1369-1379 (1991).
- Rich, T. C., et al. A uniform extracellular stimulus triggers distinct cAMP signals in different compartments of a simple cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 13049-13054 (2001).
- Sayner, S. L., Alexeyev, M., Dessauer, C. W., Stevens, T. Soluble adenylyl cyclase reveals the significance of cAMP compartmentation on pulmonary microvascular endothelial cell barrier. Circulation Research. 98, 675-681 (2006).
- Rich, T. C., Tse, T. E., Rohan, J. G., Schaack, J., Karpen, J. W. In vivo assessment of local phosphodiesterase activity using tailored cyclic nucleotide-gated channels as cAMP sensors. The Journal of General Physiology. 118, 63-78 (2001).
- Blackman, B. E., et al. PDE4D and PDE4B function in distinct subcellular compartments in mouse embryonic fibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 286, 12590-12601 (2011).
- Sayner, S. L., et al. Paradoxical cAMP-induced lung endothelial hyperpermeability revealed by Pseudomonas aeruginosa ExoY. Circulation Research. 95, 196-203 (2004).
- Klarenbeek, J., Jalink, K. Detecting cAMP with an EPAC-based FRET sensor in single living cells. Methods in Molecular Biology. 1071, 49-58 (2014).
- Surdo, N. C., et al. FRET biosensor uncovers cAMP nano-domains at β-adrenergic targets that dictate precise tuning of cardiac contractility. Nature Communications. 8, 15031 (2017).
- Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. EMBO Reports. 5, 1176-1180 (2004).
- Vogel, S. S., Thaler, C., Koushik, S. V. Fanciful FRET. Science’s STKE. 2006, (2006).
- Clegg, R. M. The History of FRET: From conception through the labors of birth. Reviews in Fluorescence. 3, (2006).
- Giepmans, B. N. G., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312, 217-224 (2006).
- Manzella-Lapeira, J., Brzostowski, J. A. Imaging protein-protein interactions by Förster resonance energy transfer (FRET) microscopy in live cells. Current Protocols in Protein Science. 93, 58 (2018).
- Cooper, D. M. F., Mons, N., Karpen, J. W. Adenylyl cyclases and the interaction between calcium and cAMP signalling. Nature. 374, 421-424 (1995).
- Sassone-Corsi, P. Coupling gene expression to cAMP signalling: role of CREB and CREM. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 30, 27-38 (1998).
- Rebhun, L. I. Cyclic nucleotides, calcium, and cell division. International Review of Cytology. 49, 1-54 (1977).
- Klarenbeek, J., Goedhart, J., Van Batenburg, A., Groenewald, D., Jalink, K. Fourth-generation Epac-based FRET sensors for cAMP feature exceptional brightness, photostability and dynamic range: characterization of dedicated sensors for FLIM, for ratiometry and with high affinity. PLOS ONE. 10, 0122513 (2015).
- Leavesley, S. J., Rich, T. C. FRET: signals hidden within the noise. Cytometry Part A. 85, 918-920 (2014).
- Rich, T. C., Webb, K. J., Leavesley, S. J. Can we decipher the information content contained within cyclic nucleotide signals. The Journal of General Physiology. 143, 17-27 (2014).
- Annamdevula, N. S., et al. Spectral imaging of FRET-based sensors reveals sustained cAMP gradients in three spatial dimensions. Cytometry Part A. 93 (10), 1029-1038 (2018).
- Leavesley, S. J., Britain, A. L., Cichon, L. K., Nikolaev, V. O., Rich, T. C. Assessing FRET using spectral techniques. Cytometry Part A. 83, 898-912 (2013).
- Leavesley, S. J., Rich, T. C. Overcoming limitations of FRET measurements. Cytometry Part A. 89, 325-327 (2016).
- Fink, D. J. Monitoring Earcths Resources from Space. Technology Review. 75, 32-41 (1973).
- Goetz, A. F. H., Vane, G., Solomon, J. E., Rock, B. N. Imaging Spectrometry for Earth Remote Sensing. Science. 228, 1147-1153 (1985).
- Bücherl, C. A., Bader, A., Westphal, A. H., Laptenok, S. P., Borst, J. W. FRET-FLIM applications in plant systems. Protoplasma. 251, 383-394 (2014).
- Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions. Journal of Microscopy. 228, 139-152 (2007).
- Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair. FEBS Letters. 531, 245-249 (2002).
- Griswold, J. R., Annamdevula, N., Deal, J., Rich, T., Leavesley, S. Estimating FRET Efficiency using Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging. Biophysical Journal. 112, 586 (2017).
- Favreau, P. F., et al. Excitation-scanning hyperspectral imaging microscope. Journal of Biomedical Optics. 19, 046010 (2014).
- King, J., et al. Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes. Microvascular Research. 67, 139-151 (2004).
- Thaler, C., Koushik, S. V., Blank, P. S., Vogel, S. S. Quantitative multiphoton spectral imaging and its use for measuring resonance energy transfer. Biophysical Journal. 89, 2736-2749 (2005).
- Agarwal, S. R., et al. Compartmentalized cAMP signaling associated with lipid raft and non-raft membrane domains in adult ventricular myocytes. Frontiers in Pharmacology. 9, 332 (2018).
- Johnstone, T. B., Agarwal, S. R., Harvey, R. D., Ostrom, R. S. cAMP signaling compartmentation: Adenylyl cyclases as anchors of dynamic signaling complexes. Mol Pharmacol. , (2017).
- Zhang, J., Li, H., Chai, L., Zhang, L., Qu, J., Chen, T. Quantitative FRET measurement using emission-spectral unmixing with independent excitation crosstalk correction. Journal of Microscopy. 257, 104-116 (2015).
- Zhang, J., Lin, F., Chai, L., Wei, L., Chen, T. IIem-spFRET: improved Iem-spFRET method for robust FRET measurement. Journal of Biomedical Optics. 21, 105003 (2016).
- Levy, S., et al. SpRET: highly sensitive and reliable spectral measurement of absolute FRET efficiency. Microscopy and Microanalysis. 17, 176-190 (2011).
- West, S. J., et al. Hyperspectral Measurements Allow Separation of FRET Signals from Non-Uniform Background Fluorescence. Biophysical Journal. 112, 453 (2017).
- Annamdevula, N. S., et al. An approach for characterizing and comparing hyperspectral microscopy systems. Sensors. 13, 9267-9293 (2013).
