由于基于 Fürster 共振能量转移 (FRET) 传感器的固有的低信号与噪声比 (SNR),CAMP 信号的测量一直具有挑战性,尤其是在三个空间维度方面。在这里,我们描述了一个高光谱FRET成像和分析方法,允许测量三个空间尺寸的CAMP分布。
循环AMP是第二个信使,参与广泛的细胞和生理活动。一些研究表明,cAMP 信号是分隔的,隔间化有助于 cAMP 信号通路中的信号特异性。基于Fürster共振能量转移(FRET)的生物传感器的发展,进一步增强了测量和可视化细胞中CAMP信号的能力。但是,这些测量通常局限于两个空间维度,这可能导致对数据的误解。迄今为止,由于使用本身信号与噪声比 (SNR) 较低的 FRET 传感器的技术限制,在三个空间维度(x、y 和 z)中对 CAMP 信号的测量非常有限。此外,由于光谱相声、信号强度有限和自发光等一系列因素,传统的基于滤波器的成像方法通常对精确测量局部子细胞区域的 CAMP 信号无效。为了克服这些限制,并允许基于FRET的生物传感器与多个荧光素一起使用,我们开发了高光谱FRET成像和分析方法,为计算FRET效率提供光谱特异性,并能够将FRET信号与混淆的自发光和/或来自其他荧光标签的信号隔离开来。在这里,我们介绍了实施高光谱FRET成像的方法,以及需要构建一个适当的光谱库,既不采样不足,也不采样过采,以执行光谱未混合。虽然我们提出了测量肺微血管内皮细胞(PMVECs)中三维CAMP分布的方法,但这种方法可用于研究CAMP在一系列细胞类型的空间分布。
环腺苷单磷酸盐(cAMP)是参与关键细胞和生理过程的第二个信使,包括细胞分裂、钙的涌入、基因转录和信号转导。越来越多的证据表明,细胞中存在cAMP隔间,通过这些隔间可以达到1、2、3、4、5、6、7的信号特异性。直到最近,CAMP分隔断是根据不同的G耦合受体激动剂8,9,10,11诱导的独特的生理或细胞效应推断的。最近,基于FRET的荧光成像探测器为直接测量和观察12、13、14细胞中的CAMP信号提供了新的方法。
Fürster共振能量转移(FRET)是一种物理现象,当分子接近15、16时,能量转移以非辐射的方式发生在供体和接受分子之间。随着基于FRET的荧光指标的发展,这种物理现象已用于生物应用,研究蛋白质-蛋白质相互作用17,蛋白质共定位18,Ca+2信号19,基因表达20,细胞分裂21和环核苷酸信号。基于FRET的cAMP指标通常包括一个CAMP结合域,一个捐赠者氟和一个接受荧光22。例如,H188 cAMP 传感器12,22用于此方法包括从 Epac 获得的 cAMP 结合域,夹在绿松石(捐赠者)和金星(接受者)荧光之间。在基础条件下(未绑定),绿松石和金星处于一个方向,因此FRET发生在萤管之间。将 cAMP 与绑定域结合后,会发生构象变化,使绿松石和金星分开,导致 FRET 减少。
基于 FRET 的成像方法为研究细胞内的 cAMP 信号提供了一个很有前途的工具。然而,目前的基于FRET的微观成像技术往往只部分成功达到足够的信号强度,以测量具有亚细胞空间清晰度的FRET。这是由于几个因素,包括许多FRET记者的信号强度有限,准确量化FRET效率变化所需的高精度,以及存在混淆因素,如细胞自发光23,24。结果往往是受弱 SNR 困扰的 FRET 图像,使得 FRET 的子细胞变化的可视化变得非常困难。此外,空间定位 CAMP 信号的调查几乎只在两个空间维度中执行,轴向 CAMP 分布很少被视为25。这可能是因为低 SNR 妨碍了在三个空间维度中测量和可视化 cAMP 梯度的能力。为了克服使用低SNR的FRET传感器的限制,我们采用了高光谱成像和分析方法,在单个细胞25、26、27中测量FRET。
美国宇航局开发了超光谱成像方法,以区分卫星图像28、29中存在的地球物体。此后,这些技术被翻译成荧光显微镜场30,几个商业共聚焦显微镜系统提供光谱探测器。在传统的(非光谱)荧光成像中,样品使用带通滤镜或激光线激发,并且使用第二个带通滤波器收集发射,通常选择以匹配荧光的峰值发射波长。相比之下,高光谱成像方法寻求以特定波长间隔对荧光发射26、31、32或激发33、34的完整光谱剖面进行采样。在我们之前的研究中,我们发现,与传统的基于过滤器的FRET成像技术相比,高光谱成像和分析方法可以改善细胞中FRET信号的量化。在这里,我们提出了一种执行 4 维(x、y、z 和 +)高光谱 FRET 成像和分析的方法,以测量和可视化三个空间维度的 cAMP 分布。这些方法使单细胞25中激动剂诱导的CAMP空间梯度可视化。有趣的是,根据激动剂的不同,CAMP梯度在细胞中可能很明显。此处提供的方法利用不均匀背景和细胞自发光的光谱解密,以提高 FRET 测量的准确性。虽然这种方法在使用 cAMP FRET 生物传感器的肺微血管内皮细胞 (PMVECs) 中得到了证明,但该方法可以很容易地修改,用于替代 FRET 记者或替代细胞系。
FRET生物传感器的研制使单细胞环核苷酸信号的测量和可视化,对13、22、37、38等亚细胞信号事件的可视化大有可为。然而,使用FRET生物传感器存在一些局限性,包括许多荧光蛋白基FRET记者的低信号到噪声特性,以及FRET记者的弱透射或表达效率(这在某些细胞系中可能特别具有挑战性,如PMVECs)23、24…
The authors have nothing to disclose.
作者感谢Kees Jalink博士(荷兰癌症研究所和荷兰阿姆斯特丹范利乌文霍克高级显微镜中心)为我们提供了H188 cAMP FRET生物传感器和肯尼·特里恩(南阿拉巴马大学工程学院)的技术帮助,以减少运行我们自定义开发的编程脚本所花的时间。
作者要感谢资金来源:美国心脏协会(16PRE27130004),国家科学基金会:(1725937) NIH, S100D020149, S10RR027535, R01HL058506, P01HL066299).)
Attofluor Cell Chamber | Invitrogen | A7816 | Attofluor contains steel cell chambers and a rubber O-ring. Cell chamber holds the coverslip and O-ring provides a lock in mechanism to hold the buffer in cell chamber with out leakage |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | Solvent used to prepare stock solution forskolin. |
DRAQ5 Fluoroscent Probe Solution | Thermo Scientific | 62252 | Nuclear label |
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | Contains nutrients and growth factors for the cells to grow and divide in the culture dishes. |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F6178 | Growth factor suppliment that is added to culture medium, DMEM |
Forskolin | Sigma | F3917 | Adenyly cyclase activator. |
H188 Cyclic AMP FRET biosensor | Netherland Cancer Institute, Dr. K. Jalink | Gift | Plasmid encoding Turquoise (donor fluorophore), Venus (acceptor fluorophore), and binding domain obtained from Epac. |
Image J | image.net | Free download | Another image processing platform used to extact spectral information and image processing. |
Integrating Sphere | Ocean Optics | FOIS-1 | Used to measure illumination intensity of the laser line at different laser intensities (?). |
Laminin Mouse Protein, Natural | Invitrogen | 23017-015 | Coverslips are coated with laminin and this helps in cell attachment, growth and motility of the cell. |
Lipofectamine 3000 Transfection Kit | Invitrogen | L3000-015 | Transfection reagent used to transfect cells with H188 FRET biosensor |
MATLAB | Mathworks | R2019a | Image processing operations (linear unmixing and FRET efficiency calculations) are performed by writing custom programs in MATLAB programming environment |
Nikon A1R confocal microscope | Nikon Instruments | Nikon A1R | Spectral image acquisition is performed using confocal microscope. |
Nikon Elements Software | Nikon Instruments | Software dongle | used to export and handle nd2 image files (multidimensional image files) that are aquired using Nikon A1R |
NIST-Traceable Calibration Lamp | Ocean Optics | LS-1-CAL-INT | A lamp with a known spectrum for use as a standard |
PBS pH 7.4 (1X) | Gibco | 10010-023 | coomonly used buffer suring cell culture |
Pulmonary Microvascular Endothelial Cells (PMVECs) | In house – Cell culture core, Univeristy of South Alabama | Isolated from Rat pulmonary microvasculature | PMVECs form inner lining of a blood vessel. |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco | 15140-122 | antibiotics are added to culture medum to prevent contamination of the cells. |
Pre-Cleaned Gold Seal Micro Slides | Clay Adams | 3010 | Microscope slides used for cell fixation |
ProLong Diamond Antifade Mounting Media | Invitrogen | P36961 | If samples are fixed using antifade mountant, then the later protects fluoroscent dyes and chromophores from fading. |
Spectrometer | Ocean Optics | QE65000 | Used to measure spectral response of the light source (?) |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 | Digests the protein-protein bond between the cell and cell matrix and helps to disscociate and lift the cells during cell plating. |
Tyrodes Buffer | Made in-house | Made in-house | Tyrodes buffer is used to make working solutions and to maintain cells in aqueous solution during image acquisition. |
6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3506 | Laminin coated coverslips are placed in 6-well culture dish (one coverlisps/well). Cells along with medium is added into each well. |
25 mm Round Microscope Cover Slips | Fisher Scientific | 12545102 | Cells were grown on round glass coverslips |
60X Ojective | Nikon Instruments | Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 | water immersion and commonly used objective for cells |