Method Article

4차원(x, y, z 및 λ) 하이퍼스펙트럼 FRET 이미징 및 분석을 사용하여 살아있는 세포에서 3차원 cAMP 분포 측정

DOI:

10.3791/61720

⸱

October 27th, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, University of South Alabama, 2Center for Lung Biology, University of South Alabama, 3Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of South Alabama

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fónster 공명 에너지 전송 (FRET) 기반 센서의 내재 된 낮은 신호 대 잡음 비율 (SNR)으로 인해, 특히 세 공간 차원에서 cAMP 신호의 측정이 도전하고있다. 여기서는 3개의 공간 차원에서 cAMP 분포를 측정할 수 있는 하이퍼스펙트럼 FRET 이미징 및 분석 방법론을 설명합니다.

Abstract

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순환 AMP는 세포 및 생리 활동의 넓은 범위에 관여하는 두 번째 메신저입니다. 몇몇 연구 결과는 cAMP 신호가 구획화되고, 그 구획화가 cAMP 신호 통로 내의 신호 특이성에 기여한다는 것을 건의합니다. F렌스터 공명 에너지 전달(FRET) 기반 바이오 센서의 개발은 세포내 cAMP 신호를 측정하고 시각화하는 능력을 발전시켰습니다. 그러나 이러한 측정은 종종 두 개의 공간 차원으로 제한되어 데이터를 잘못 해석할 수 있습니다. 현재까지, 본질적으로 낮은 신호 대 잡음 비(SNR)를 나타내는 FRET 센서를 사용하는 기술적 한계로 인해 3개의 공간 차원(x, y 및 z)으로 cAMP 신호의 측정이 매우 제한적이었습니다. 또한, 전통적인 필터 기반 이미징 접근법은 스펙트럼 크로스토크, 제한된 신호 강도 및 자동 형광을 포함한 다양한 요인으로 인해 국소화 된 세포 이형 지역에서 cAMP 신호를 정확하게 측정하는 데 효과가 없습니다. 이러한 한계를 극복하고 FRET 기반 바이오 센서를 여러 형광과 함께 사용할 수 있도록 FRET 기반 의 바이오 센서를 여러 형광과 함께 사용할 수 있도록 FRET 효율을 계산하기 위한 스펙트럼 특이성 및 추가 형광 라벨에서 접건 성 자동 형광 및/또는 신호를 반사적으로 분리하는 기능을 제공하는 하이퍼 스펙트럼 FRET 이미징 및 분석 접근 방식을 개발했습니다. 여기서는 하이퍼스펙트럼 FRET 이미징을 구현하기 위한 방법론과 스펙트럼 미혼을 수행하기 위해 샘플링되거나 과샘플링되지 않은 적절한 스펙트럼 라이브러리를 구성할 필요성을 제시합니다. 우리는 폐 미세 혈관 내피 세포 (PMVEC)에서 3 차원 cAMP 분포의 측정을위한이 방법론을 제시하는 동안,이 방법론은 세포 유형의 범위에서 cAMP의 공간 분포를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

Introduction

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순환 아데노신 모노인산염(cAMP)은 세포 분열, 칼슘 유입, 유전자 전사 및 신호 변환을 포함한 주요 세포 및 생리적 과정에 관여하는 두 번째 메신저입니다. 증거의 성장 몸은 신호 특이성을 달성하는 세포를 통해 cAMP 구획의 존재를 제안1,2,3,4,5,6,7. 최근까지, cAMP 구획화는 다른 G-결합 수용체작용제에의해 유도된 뚜렷한 생리적 또는 세포 효과에 기초하여 유추되었다8,9,10,11. 최근에는 FRET 기반 형광 이미징 프로브가 세포12,13,<....

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Protocol

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이 프로토콜은 사우스 앨라배마 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회가 승인 한 절차를 따릅니다.

1. 이미징을 위한 세포, 샘플 및 시약 준비

  1. 이전에설명된 바와 같이 쥐 폐 내피 세포(PMVEC)를 분리한다.
    참고: 세포는 100mm 세포 배양 접시에 사우스 앨라배마 대학, 모바일, AL에서 세포 배양 코어에 의해 분리되고 배양되었습니다.
  2. 25mm 원형 유리 커버립에 시드 절연 PMVECs는 세포가 적어도 80 %의 합류 (적어도 24 시간)에 도달 할 때까지 37 ° C에서 인큐베이터에서 성장하게한다.
    참고: 세포 와 세포 유형 연구에서 다양 한 수 있습니다 및 따라서 세포 특정 세포 배양 절차는 씨앗과 성장 세포에 따라야 한다. 이러한 연구에 사용되는 세포 시드 및 배양 프로토콜은 "보충 File_Cell 문화 및 트랜스페션"이라는 파일의 보충 정보로 사용할 수 있습니다.
  3. FRET 바이오 센서를 장착하고 37°C에서 48시간 동안 배양할 수 있는 Transfect PMVECs.
    참고: PMVEC를 횡단하는 프로토콜은 "보충 File_Cell 문화 및 트랜스페션"이라는 보충 정보 파일에도 설명되어 있습니다.
  4. 이미징....

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Results

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이 프로토콜은 살아있는 세포에 있는 3개의 공간 차원에서 cAMP 그라데이션을 측정하기 위하여 hyperspectral FRET 화상 진찰 및 분석 접근의 사용을 기술합니다. 이러한 결과를 생성하는 데 관련된 몇 가지 주요 단계가 있으며, 데이터를 분석하고 정량화하는 동안 주의 깊게 주의를 기울여야 합니다. 이러한 주요 단계에는 적절한 스펙트럼 라이브러리 구성, 백그라운드 스펙트럼 해제, 셀 테두리 식별을 위한 임계값 지정 및 FRET 효율성 계산이 포함됩니다. 도 1은 살아있는 세포의 FRET 효율 및 cAMP 수준을 측정하는 데 관련된 모든 단계의 회로도 흐름을 보여줍니다. 이러한 이미징 및 분석 단계를 사용하면 FRET 효율을 측정하고 셀의 3차원의 cAMP 공간 그라데이션을 측정하는 동시에 균일하지 않은 배경 신호를 고려할 수 있습니다.

도 2는 기준조건(그림 2A).......

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Discussion

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FRET 바이오센서의 개발은 단일 세포에서 순환 뉴클레오티드 신호의 측정 및 시각화를 허용하고, 세포 외 신호 이벤트13,22,37,38을시각화하기위한 큰 약속이있다. 그러나 FRET 바이오 센서의 사용은 많은 형광 단백질 계 FRET 리포터의 낮은 신호-잡음 특성 및 FRET 기자의 약한 트랜스퍼션 또는 발현 효율을 포함하여 몇 가지한계를제시한다(이는 PMVEC와 같은 특정 세포주에서 특히 어려울 수 있음)23,24. 약하게 발현된 형광 단백질의 이미징은 비메트릭 FRET 계산과 결합되어 종종 계산된 FRET 효율에서 높은 수준의 불확실성 또는 변동을 초래합니다. FRET 측정의 신뢰성을 향상시키.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

리프슬리 박사와 리치 박사는 스펙트럼 이미징 기술을 상용화하기 위해 설립된 스타트업 회사인 SpectraCyte, LLC에 대한 재정적 관심을 공개합니다. 그러나 이 프로토콜에 설명된 모든 절차는 SPECtraCyte, LLC와 관련이 없는 상업적으로 이용 가능한 제품을 사용하여 수행되었습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 H188 cAMP FRET 바이오 센서와 케니 트린 (사우스 앨라배마 대학)을 제공하는 데 도움이 우리의 사용자 정의 개발 프로그래밍 스크립트를 실행하는 데 걸린 시간을 줄이기 위해 우리에게 제공하는 박사 Kees Jalink (네덜란드 암 연구소 및 고급 현미경 검사법을위한 반 Leeuwenhoek 센터) 인정하고 싶습니다.

저자는 자금 출처를 인정하고 싶습니다: 미국 심장 협회 (16PRE2713004), 국립 과학 재단; (1725937) NIH, S100D020149, S10RR027535, R01HL058506, P01HL0666299).

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Attofluor Cell ChamberInvitrogenA7816Attofluor에는 강철 셀 챔버와 고무 O-링이 포함되어 있습니다. 세포 챔버는 커버 슬립을 잡고 O- 링은 누출없이 세포실에 완충액을 보유하는 잠금 메커니즘을 제공합니다
디메틸 설폭 사이드 (DMSO)Fisher ScientificBP231-100용매는 원액 포스콜린을 제조하는 데 사용됩니다.
DRAQ5 형광 프로브 용액Thermo Scientific62252핵 라벨
Dulbecco Modified Eagle Medium(DMEM)Gibco11965-092배양 접시에서 세포가 성장하고 분열하는 데 필요한 영양소와 성장 인자가 포함되어 있습니다.
소 태아 혈청 (FBS)배F6178성장 인자 공급, DMEM
ForskolinSigmaF3917Adenyly cyclase 활성제.
H188 Cyclic AMP FRET 바이오센서Netherland Cancer Institute, Dr. K. JalinkGiftPlasmid 인코딩 청록색(공여체 형광단), 금성(수용체 형광단) 및 Epac에서 얻은 결합 도메인.
Image Jimage.net무료 다운로드스펙트럼 정보 및 이미지 처리를 제거하는 데 사용되는 또 다른 이미지 처리 플랫폼입니다.
Integrating SphereOcean OpticsFOIS-1다양한 레이저 강도(?)에서 레이저 라인의 조명 강도를 측정하는 데 사용됩니다.
Laminin Mouse Protein, NaturalInvitrogen23017-015커버슬립은 라미닌으로 코팅되어 있어 세포 부착, 성장 및 세포의 운동성에 도움을 줍니다.
Lipofectamine 3000 Transfection KitInvitrogenL3000-015H188 FRET 바이오센서로 세포를 transfection하는 데 사용되는 Transfection 시약
MATLABMathworksR2019a이미지 처리 작업(선형 불혼합 및 FRET 효율 계산)은 MATLAB 프로그래밍 환경에서 사용자 지정 프로그램을 작성하여 수행됩니다
. Nikon A1R 컨포칼 현미경Nikon InstrumentsNikon A1R스펙트럼 이미지 획득은 컨포칼 현미경을 사용하여 수행됩니다.
Nikon Elements SoftwareNikon InstrumentsSoftware 동글Nikon A1R
NIST-Traceable Calibration LampOcean OpticsLS-1-CAL-INT표준
PBS pH 7.4 (1X)Gibco10010-023coomonly 사용 버퍼 suring 세포 배양
폐 미세혈관 내피 세포(PMVEC)사내 - 세포 배양 코어, 사우스 앨라배마 대학교쥐 폐 미세혈관 구조에서 분리PMVEC는 혈관의 내벽을 형성합니다.
페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/ml)Gibco15140-122항생제를 배양 메덤에 첨가하여 세포의 오염을 방지합니다.
사전 세척된 골드 씰 마이크로 슬라이드Clay Adams3010세포 고정에 사용되는 현미경 슬라이드
ProLong Diamond Antifade Mounting MediaInvitrogenP36961샘플이 퇴색 방지 마운트를 사용하여 고정되면 나중에 형광 염료와 발색단이 퇴색되지 않도록 보호합니다.
SpectrometerOcean OpticsQE65000광원의 스펙트럼 응답을 측정하는 데 사용됩니다(?)
트립신-EDTA (0.25%)Gibco25200-056세포와 세포 매트릭스 사이의 단백질-단백질 결합을 소화하고 세포 도금 중에 세포를 분리하고 들어 올리는 데 도움을 줍니다.
Tyrodes BufferMade in-houseMadeTyrodes buffer는 작업 용액을 만들고 이미지 획득 중에 수용액의 세포를 유지하는 데 사용됩니다.
6웰 세포 배양 플레이트Corning3506라미닌 코팅 커버슬립을 6웰 배양 접시(1개의 커버리스프/웰)에 넣습니다. 배지와 함께 세포가 각 웰에 추가됩니다.
25mm 원형 현미경 커버 슬립Fisher Scientific12545102세포는 원형 유리 커버 슬립,
60X OjectiveNikon InstrumentsPlan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27수침 및 일반적으로 사용되는 세포 대물렌즈
양 배지에 첨가되는 Sigma , 된 은 에서 성장했습니다.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Corbin, J. D., Sugden, P. H., Lincoln, T. M., Keely, S. L. Compartmentalization of adenosine 3':5'-monophosphate and adenosine 3':5'-monophosphate-dependent protein kinase in heart tissue. The Journal of Biological Chemistry. 252, 3854-3861 (1977).
  2. Terrin, A., et al.

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cAMP DistributionFRET ImagingHyperspectral FRETSpectral UnmixingConfocal Microscopy3D ImagingCyclic AMPFRET EfficiencySpectral LibraryLinear Unmixing

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