4차원(x, y, z 및 λ) 하이퍼스펙트럼 FRET 이미징 및 분석을 사용하여 살아있는 세포에서 3차원 cAMP 분포 측정
Summary
Fónster 공명 에너지 전송 (FRET) 기반 센서의 내재 된 낮은 신호 대 잡음 비율 (SNR)으로 인해, 특히 세 공간 차원에서 cAMP 신호의 측정이 도전하고있다. 여기서는 3개의 공간 차원에서 cAMP 분포를 측정할 수 있는 하이퍼스펙트럼 FRET 이미징 및 분석 방법론을 설명합니다.
Abstract
순환 AMP는 세포 및 생리 활동의 넓은 범위에 관여하는 두 번째 메신저입니다. 몇몇 연구 결과는 cAMP 신호가 구획화되고, 그 구획화가 cAMP 신호 통로 내의 신호 특이성에 기여한다는 것을 건의합니다. F렌스터 공명 에너지 전달(FRET) 기반 바이오 센서의 개발은 세포내 cAMP 신호를 측정하고 시각화하는 능력을 발전시켰습니다. 그러나 이러한 측정은 종종 두 개의 공간 차원으로 제한되어 데이터를 잘못 해석할 수 있습니다. 현재까지, 본질적으로 낮은 신호 대 잡음 비(SNR)를 나타내는 FRET 센서를 사용하는 기술적 한계로 인해 3개의 공간 차원(x, y 및 z)으로 cAMP 신호의 측정이 매우 제한적이었습니다. 또한, 전통적인 필터 기반 이미징 접근법은 스펙트럼 크로스토크, 제한된 신호 강도 및 자동 형광을 포함한 다양한 요인으로 인해 국소화 된 세포 이형 지역에서 cAMP 신호를 정확하게 측정하는 데 효과가 없습니다. 이러한 한계를 극복하고 FRET 기반 바이오 센서를 여러 형광과 함께 사용할 수 있도록 FRET 기반 의 바이오 센서를 여러 형광과 함께 사용할 수 있도록 FRET 효율을 계산하기 위한 스펙트럼 특이성 및 추가 형광 라벨에서 접건 성 자동 형광 및/또는 신호를 반사적으로 분리하는 기능을 제공하는 하이퍼 스펙트럼 FRET 이미징 및 분석 접근 방식을 개발했습니다. 여기서는 하이퍼스펙트럼 FRET 이미징을 구현하기 위한 방법론과 스펙트럼 미혼을 수행하기 위해 샘플링되거나 과샘플링되지 않은 적절한 스펙트럼 라이브러리를 구성할 필요성을 제시합니다. 우리는 폐 미세 혈관 내피 세포 (PMVEC)에서 3 차원 cAMP 분포의 측정을위한이 방법론을 제시하는 동안,이 방법론은 세포 유형의 범위에서 cAMP의 공간 분포를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
순환 아데노신 모노인산염(cAMP)은 세포 분열, 칼슘 유입, 유전자 전사 및 신호 변환을 포함한 주요 세포 및 생리적 과정에 관여하는 두 번째 메신저입니다. 증거의 성장 몸은 신호 특이성을 달성하는 세포를 통해 cAMP 구획의 존재를 제안1,2,3,4,5,6,7. 최근까지, cAMP 구획화는 다른 G-결합 수용체작용제에의해 유도된 뚜렷한 생리적 또는 세포 효과에 기초하여 유추되었다8,9,10,11. 최근에는 FRET 기반 형광 이미징 프로브가 세포12,13,14에서cAMP 신호를 직접 측정 및 관찰하기 위한 새로운접근법을제공하고 있다.
Förster 공명 에너지 전달(FRET)은 분자가15,16에근접할 때 비방사적 방식으로 기증자와 수용자 분자 간에 에너지 전달이 발생하는 물리적 현상이다. FRET 기반 형광 지표의 발달과 함께, 이러한 물리적 현상은 단백질-단백질 상호 작용17,단백질 공동 국소화18,Ca+2 신호19,유전자 발현20,세포 부문21 및 순환 뉴클레오티드 신호화를 연구하기 위해 생물학적 응용 분야에서 사용되었습니다. FRET 기반 cAMP 지표는 일반적으로 cAMP 결합 도메인, 기증자 불소 호및 수용자불소호레(22)로구성됩니다. 예를 들어, 이 방법론에 사용되는 H188 cAMP센서(12)22는 에팍으로부터 얻은 cAMP 결합 도메인으로 구성되며, 청록색(기증자)과 금성(수용자) 형광 사이에 끼어 있다. 기저 조건(언바운드)에서 청록색과 금성은 형광류 사이에 FRET가 발생하는 방향으로 있습니다. 바인딩 도메인에 대한 cAMP의 바인딩시, 청록색과 금성이 떨어져 이동하도록 형성 변화가 발생하여 FRET가 감소합니다.
FRET 기반 이미징 접근 방식은 셀 내에서 cAMP 신호를 조사하고 시각화하기 위한 유망한 도구를 제공합니다. 그러나, 현재 FRET 기반 현미경 이미징 기술은 종종 세포 전 세포 공간 선명도로 FRET를 측정하기에 충분한 신호 강도를 달성하는 데 부분적으로만 성공적입니다. 이는 많은 FRET 기자의 제한된 신호 강도, FRET 효율의 변화를 정확하게 정량화하는 데 필요한 높은 수준의 정밀도, 세포 자동불화(23)및24와같은 혼란스러운 요인의 존재를 포함한 여러 가지 요인에 기인한다. 결과는 종종 약한 SNR에 의해 괴롭히는 FRET 이미지, FRET에 있는 세포 극변경의 시각화를 아주 어렵게 만듭니다. 또한, 공간적으로 국소화된 cAMP 신호에 대한 조사는 거의 2개의 공간 차원에서만 거의 독점적으로 수행되었으며 축 cAMP 분포는거의 25로간주되지 않습니다. 이는 SNR이 cAMP 그라데이션을 세 가지 공간 차원으로 측정하고 시각화하는 기능을 방해했기 때문일 수 있습니다. 낮은 SNR을 가진 FRET 센서를 사용하는 한계를 극복하기 위하여는, 우리는 단하나세포25,26,27에서FRET를 측정하기 위하여 하이퍼 스펙트럼 화상 진찰 및 분석 접근법을 구현했습니다.
하이퍼스펙트럼 이미징 접근법은 NASA가 위성 이미지28,29에존재하는 지상파 물체를 차별화하기 위해 개발되었다. 이러한 기술은 이후 형광 현미경 필드(30)로번역되었으며, 스펙트럼 검출기를 제공하는 여러 상용 공초점 현미경 시스템이 있습니다. 기존의 (비 스펙트럼) 형광 이미징에서, 샘플은 밴드 패스 필터 또는 레이저 라인을 사용하여 흥분하고, 방출은 종종 형광의 피크 방출 파장에 맞게 선택된 제2 밴드 패스 필터를 사용하여 수집된다. 대조적으로, hyperspectral 화상 진찰 접근은 특정 파장 간격에 형광 방출26,31,32 또는 여기33,34의 완전한 스펙트럼 단면도를 샘플링하는 것을 추구합니다. 우리의 이전 연구에서, 우리는 Hyperspectral 화상 진찰 및 분석 접근이 전통적인 필터 기지를 둔 FRET 화상 진찰 기술(26)에비교될 때 세포에 있는 FRET 신호의 향상한 정량화를 제공할 수 있다는 것을 보여주었습니다. 여기서는 4차원(x, y, z 및 λ) 하이퍼스펙트럼 FRET 이미징 및 분석을 수행하여 3개의 공간 차원에서 cAMP 분포를 측정하고 시각화하는 방법론을 제시합니다. 이러한 접근법은 단일세포(25)에서작용제 유도 된 cAMP 공간 그라데이션의 시각화를 허용하였다. 흥미롭게도, 고뇌에 따라, cAMP 그라데이션은 세포에서 명백할 수 있습니다. 여기에 제시된 방법론은 FRET 측정의 정확도를 향상시키기 위해 비 균일한 배경 및 세포 자동 형광의 스펙트럼 미혼을 사용합니다. 이 방법론은 cAMP FRET 바이오 센서를 사용하여 폐 미세 혈관 내피 세포 (PMVEC)에서 입증되지만, 방법론은 대체 FRET 기자 또는 대체 세포주와 함께 사용하기 위해 쉽게 수정 될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
FRET 바이오센서의 개발은 단일 세포에서 순환 뉴클레오티드 신호의 측정 및 시각화를 허용하고, 세포 외 신호 이벤트13,22,37,38을시각화하기위한 큰 약속이있다. 그러나 FRET 바이오 센서의 사용은 많은 형광 단백질 계 FRET 리포터의 낮은 신호-잡음 특성 및 FRET 기자의 약한 트랜스퍼션 또는 발현 효율을 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 H188 cAMP FRET 바이오 센서와 케니 트린 (사우스 앨라배마 대학)을 제공하는 데 도움이 우리의 사용자 정의 개발 프로그래밍 스크립트를 실행하는 데 걸린 시간을 줄이기 위해 우리에게 제공하는 박사 Kees Jalink (네덜란드 암 연구소 및 고급 현미경 검사법을위한 반 Leeuwenhoek 센터) 인정하고 싶습니다.
저자는 자금 출처를 인정하고 싶습니다: 미국 심장 협회 (16PRE2713004), 국립 과학 재단; (1725937) NIH, S100D020149, S10RR027535, R01HL058506, P01HL0666299).
Materials
| Attofluor Cell Chamber | Invitrogen | A7816 | Attofluor contains steel cell chambers and a rubber O-ring. Cell chamber holds the coverslip and O-ring provides a lock in mechanism to hold the buffer in cell chamber with out leakage |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | Solvent used to prepare stock solution forskolin. |
| DRAQ5 Fluoroscent Probe Solution | Thermo Scientific | 62252 | Nuclear label |
| Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | Contains nutrients and growth factors for the cells to grow and divide in the culture dishes. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F6178 | Growth factor suppliment that is added to culture medium, DMEM |
| Forskolin | Sigma | F3917 | Adenyly cyclase activator. |
| H188 Cyclic AMP FRET biosensor | Netherland Cancer Institute, Dr. K. Jalink | Gift | Plasmid encoding Turquoise (donor fluorophore), Venus (acceptor fluorophore), and binding domain obtained from Epac. |
| Image J | image.net | Free download | Another image processing platform used to extact spectral information and image processing. |
| Integrating Sphere | Ocean Optics | FOIS-1 | Used to measure illumination intensity of the laser line at different laser intensities (?). |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Invitrogen | 23017-015 | Coverslips are coated with laminin and this helps in cell attachment, growth and motility of the cell. |
| Lipofectamine 3000 Transfection Kit | Invitrogen | L3000-015 | Transfection reagent used to transfect cells with H188 FRET biosensor |
| MATLAB | Mathworks | R2019a | Image processing operations (linear unmixing and FRET efficiency calculations) are performed by writing custom programs in MATLAB programming environment |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon Instruments | Nikon A1R | Spectral image acquisition is performed using confocal microscope. |
| Nikon Elements Software | Nikon Instruments | Software dongle | used to export and handle nd2 image files (multidimensional image files) that are aquired using Nikon A1R |
| NIST-Traceable Calibration Lamp | Ocean Optics | LS-1-CAL-INT | A lamp with a known spectrum for use as a standard |
| PBS pH 7.4 (1X) | Gibco | 10010-023 | coomonly used buffer suring cell culture |
| Pulmonary Microvascular Endothelial Cells (PMVECs) | In house – Cell culture core, Univeristy of South Alabama | Isolated from Rat pulmonary microvasculature | PMVECs form inner lining of a blood vessel. |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco | 15140-122 | antibiotics are added to culture medum to prevent contamination of the cells. |
| Pre-Cleaned Gold Seal Micro Slides | Clay Adams | 3010 | Microscope slides used for cell fixation |
| ProLong Diamond Antifade Mounting Media | Invitrogen | P36961 | If samples are fixed using antifade mountant, then the later protects fluoroscent dyes and chromophores from fading. |
| Spectrometer | Ocean Optics | QE65000 | Used to measure spectral response of the light source (?) |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 | Digests the protein-protein bond between the cell and cell matrix and helps to disscociate and lift the cells during cell plating. |
| Tyrodes Buffer | Made in-house | Made in-house | Tyrodes buffer is used to make working solutions and to maintain cells in aqueous solution during image acquisition. |
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3506 | Laminin coated coverslips are placed in 6-well culture dish (one coverlisps/well). Cells along with medium is added into each well. |
| 25 mm Round Microscope Cover Slips | Fisher Scientific | 12545102 | Cells were grown on round glass coverslips |
| 60X Ojective | Nikon Instruments | Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 | water immersion and commonly used objective for cells |
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