Summary

Измерение 3-мерных распределений цАМФ в живых клетках с использованием 4-мерной (x, y, z и λ) гиперспектральной визуализации и анализа FRET

Published: October 27, 2020
doi:

Summary

Из-за низкого отношения сигнал/шум (SNR) датчиков на основе резонансной передачи энергии (FRET) измерения сигналов цАМФ были сложными, особенно в трех пространственных измерениях. Здесь мы описываем гиперспектральную методологию визуализации и анализа FRET, которая позволяет измерять распределение цАМФ в трех пространственных измерениях.

Abstract

Циклический АМП является вторым мессенджером, который участвует в широком спектре клеточной и физиологической деятельности. Несколько исследований показывают, что сигналы цАМФ разделены и что компартментализация способствует специфичности сигналов в рамках сигнального пути цАМФ. Разработка биосенсоров на основе резонансного переноса энергии (FRET) на основе Fӧrster способствовала способности измерять и визуализировать сигналы цАМФ в клетках. Однако эти измерения часто ограничиваются двумя пространственными измерениями, что может привести к неправильному толкованию данных. На сегодняшний день были проведены лишь очень ограниченные измерения сигналов цАМФ в трех пространственных измерениях (x, y и z) из-за технических ограничений в использовании датчиков FRET, которые по своей природе демонстрируют низкое отношение сигнал/шум (SNR). Кроме того, традиционные подходы к визуализации на основе фильтров часто неэффективны для точного измерения сигналов цАМФ в локализованных субклеточных областях из-за ряда факторов, включая спектральные перекрестные помехи, ограниченную силу сигнала и автофлуоресценцию. Чтобы преодолеть эти ограничения и позволить использовать биосенсоры на основе FRET с несколькими флуорофорами, мы разработали гиперспектральные подходы к визуализации и анализу FRET, которые обеспечивают спектральную специфичность для расчета эффективности FRET и возможность спектрально отделять сигналы FRET от смешивающей автофлуоресценции и / или сигналов от дополнительных флуоресцентных меток. Здесь мы представляем методологию реализации гиперспектральной визуализации FRET, а также необходимость построения соответствующей спектральной библиотеки, которая не является ни недовыборочной, ни передискретированной для выполнения спектрального размешивания. Хотя мы представляем эту методологию для измерения трехмерных распределений цАМФ в легочных микрососудистых эндотелиальных клетках (PMVECs), эта методология может быть использована для изучения пространственных распределений цАМФ в ряде типов клеток.

Introduction

Циклический аденозинмонофосфат (цАМФ) является вторым мессенджером, участвующим в ключевых клеточных и физиологических процессах, включая деление клеток, приток кальция, транскрипцию генов и трансдукцию сигналов. Растущее количество доказательств свидетельствует о существовании цАМФ-компартментов в клетке, благодаря которым достигается сигнальнаяспецифичность 1,2,3,4,5,6,7. До недавнего времени компартментализация цАМФ выводилась на основе различных физиологических или клеточных эффектов, индуцированных различными агонистами G-связанных рецепторов8,9,10,11. Совсем недавно флуоресцентные зонды на основе FRET предоставили новые подходы для прямого измерения и наблюдения сигналов цАМФ в ячейке12,13,14.

Резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET) — это физическое явление, при котором передача энергии происходит между донорскими и акцепторными молекулами нерадиационным образом, когда молекулы находятся в непосредственнойблизости 15,16. С развитием флуоресцентных индикаторов на основе FRET это физическое явление было использовано в биологических приложениях для изучения белково-белковых взаимодействий17,колокализации белка18,передачи сигналов Ca+2 19,экспрессии генов20,деления клеток21 и циклической нуклеотидной сигнализации. Индикаторы цАМФ на основе FRET обычно состоят из цАМФ-связывающего домена, донорского флуорофора и акцепторного флуорофора22. Например, датчик цАМФ H18812,22, используемый в данной методологии, состоит из цАМФ-связующего домена, полученного из Epac, зажатого между бирюзовыми (донорскими) и венериными (акцепторными) флуорофорами. В базальных условиях (несвязанные) бирюза и Венера находятся в такой ориентации, что между флуорофорами возникает FRET. При связывании цАМФ с связующим доменом происходит конформационное изменение, в результате чего Бирюза и Венера раздвигаются, что приводит к снижению FRET.

Подходы к визуализации на основе FRET предлагают многообещающий инструмент для исследования и визуализации сигналов цАМФ в клетке. Однако современные методы микроскопической визуализации на основе FRET часто лишь частично успешны в достижении достаточной силы сигнала для измерения FRET с субклеточной пространственной четкостью. Это связано с несколькими факторами, включая ограниченную силу сигнала многих репортеров FRET, высокий уровень точности, необходимый для точной количественной оценки изменений эффективности FRET, и наличие смешанных факторов, таких как клеточная автофлуоресценция23,24. Результатом часто является изображение FRET, которое страдает от слабого SNR, что делает визуализацию субклеточных изменений в FRET очень сложной. Кроме того, исследование пространственно локализованных сигналов цАМФ почти исключительно проводилось только в двух пространственных измерениях, а осевое распределение цАМФ редко считалось25. Вероятно, это связано с тем, что низкий SNR препятствует возможности измерения и визуализации градиентов цАМФ в трех пространственных измерениях. Чтобы преодолеть ограничения использования датчиков FRET с низким SNR, мы внедрили гиперспектральные подходы к визуализации и анализу для измерения FRET в отдельных клетках25,26,27.

Подходы к гиперспектральной визуализации были разработаны НАСА для дифференциации наземных объектов, присутствующих на спутниковых снимках28,29. С тех пор эти методы были переведены в поле флуоресцентной микроскопии30,с несколькими коммерческими системами конфокальных микроскопов, предлагающими спектральные детекторы. В традиционной (неспектральной) флуоресцентной визуализации образец возбуждается с помощью полосового фильтра или лазерной линии, а излучение собирается с помощью второго полосового фильтра, часто выбираемого в соответствии с пиковой длиной волны излучения флуорофора (флуорофоров). Напротив, подходы к гиперспектральной визуализации направлены на выборку полного спектрального профиля либо флуоресцентного излучения26,31,32, либо возбуждения33,34 на определенных интервалах длин волн. В наших предыдущих исследованиях мы показали, что гиперспектральные подходы к визуализации и анализу могут предложить улучшенную количественную оценку сигналов FRET в клетках по сравнению с традиционными методами визуализации FRET на основе фильтров26. Здесь мы представляем методологию выполнения 4-мерной (x, y, z и λ) гиперспектральной визуализации и анализа FRET для измерения и визуализации распределений цАМФ в трех пространственных измерениях. Эти подходы позволили визуализировать агонист-индуцированные цАМФ пространственные градиенты в одиночных ячейках25. Интересно, что в зависимости от агониста градиенты цАМФ могут быть очевидны в клетках. Представленная здесь методология использует спектральное размешивание неоднородного фона и клеточной автофлуоресценции для повышения точности измерений FRET. Хотя эта методология демонстрируется в легочных микрососудистых эндотелиальных клетках (PMVEC) с использованием биосенсора цАМФ FRET, методология может быть легко модифицирована для использования с альтернативными репортерами FRET или альтернативными клеточными линиями.

Protocol

Этот протокол следует процедурам, утвержденным Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию Университетом Южной Алабамы. 1. Подготовка клеток, образцов и реагентов к визуализации Выделяют легочные микрососудистые эндотелиальные клетки к?…

Representative Results

Этот протокол описывает использование гиперспектральных подходов к визуализации и анализу FRET для измерения градиентов цАМФ в трех пространственных измерениях в живых клетках. Существует несколько ключевых шагов, связанных с получением этих результатов, для которых требуется тщател?…

Discussion

Разработка биосенсоров FRET позволила измерять и визуализировать циклические нуклеотидные сигналы в отдельных клетках, и существует большая перспектива для визуализации субклеточных сигнальных событий13,22,37,38. Однак…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы поблагодарить доктора Кейса Джалинка (Нидерландский институт рака и Центр передовой микроскопии ван Левенгука, Амстердам, Нидерланды) за предоставление нам биосенсора H188 cAMP FRET и Кенни Тринха (Инженерный колледж Университета Южной Алабамы) за техническую помощь в сокращении времени, занимаемого для запуска наших специально разработанных программных сценариев.

Авторы хотели бы отметить источники финансирования: Американская кардиологическая ассоциация (16PRE27130004), Национальный научный фонд; (1725937) NIH, S100D020149, S10RR027535, R01HL058506, P01HL066299).

Materials

Attofluor Cell Chamber Invitrogen A7816 Attofluor contains steel cell chambers and a rubber O-ring. Cell chamber holds the coverslip and O-ring provides a lock in mechanism to hold the buffer in cell chamber with out leakage
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific BP231-100 Solvent used to prepare stock solution forskolin.
DRAQ5 Fluoroscent Probe Solution Thermo Scientific 62252 Nuclear label
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11965-092 Contains nutrients and growth factors for the cells to grow and divide in the culture dishes.
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F6178 Growth factor suppliment that is added to culture medium, DMEM
Forskolin Sigma F3917 Adenyly cyclase activator.
H188 Cyclic AMP FRET biosensor Netherland Cancer Institute, Dr. K. Jalink Gift Plasmid encoding Turquoise (donor fluorophore), Venus (acceptor fluorophore), and binding domain obtained from Epac.
Image J image.net Free download Another image processing platform used to extact spectral information and image processing.
Integrating Sphere Ocean Optics FOIS-1 Used to measure illumination intensity of the laser line at different laser intensities (?).
Laminin Mouse Protein, Natural Invitrogen 23017-015 Coverslips are coated with laminin and this helps in cell attachment, growth and motility of the cell.
Lipofectamine 3000 Transfection Kit Invitrogen L3000-015 Transfection reagent used to transfect cells with H188 FRET biosensor
MATLAB Mathworks R2019a Image processing operations (linear unmixing and FRET efficiency calculations) are performed by writing custom programs in MATLAB programming environment
Nikon A1R confocal microscope Nikon Instruments Nikon A1R Spectral image acquisition is performed using confocal microscope.
Nikon Elements Software Nikon Instruments Software dongle used to export and handle nd2 image files (multidimensional image files) that are aquired using Nikon A1R
NIST-Traceable Calibration Lamp Ocean Optics LS-1-CAL-INT A lamp with a known spectrum for use as a standard
PBS pH 7.4 (1X) Gibco 10010-023 coomonly used buffer suring cell culture
Pulmonary Microvascular Endothelial Cells (PMVECs) In house – Cell culture core, Univeristy of South Alabama Isolated from Rat pulmonary microvasculature PMVECs form inner lining of a blood vessel.
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Gibco 15140-122 antibiotics are added to culture medum to prevent contamination of the cells.
Pre-Cleaned Gold Seal Micro Slides Clay Adams 3010 Microscope slides used for cell fixation
ProLong Diamond Antifade Mounting Media Invitrogen P36961 If samples are fixed using antifade mountant, then the later protects fluoroscent dyes and chromophores from fading.
Spectrometer Ocean Optics QE65000 Used to measure spectral response of the light source (?)
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200-056 Digests the protein-protein bond between the cell and cell matrix and helps to disscociate and lift the cells during cell plating.
Tyrodes Buffer Made in-house Made in-house Tyrodes buffer is used to make working solutions and to maintain cells in aqueous solution during image acquisition.
6 Well Cell Culture Plate Corning 3506 Laminin coated coverslips are placed in 6-well culture dish (one coverlisps/well). Cells along with medium is added into each well.
25 mm Round Microscope Cover Slips Fisher Scientific 12545102 Cells were grown on round glass coverslips
60X Ojective Nikon Instruments Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 water immersion and commonly used objective for cells

References

  1. Corbin, J. D., Sugden, P. H., Lincoln, T. M., Keely, S. L. Compartmentalization of adenosine 3′:5′-monophosphate and adenosine 3′:5′-monophosphate-dependent protein kinase in heart tissue. The Journal of Biological Chemistry. 252, 3854-3861 (1977).
  2. Terrin, A., et al. PGE1 stimulation of HEK293 cells generates multiple contiguous domains with different [cAMP]: role of compartmentalized phosphodiesterases. The Journal of Cell Biology. 175, 441-451 (2006).
  3. Bacskai, B. J., et al. Spatially resolved dynamics of cAMP and protein kinase A subunits in Aplysia sensory neurons. Science. 260, 222-226 (1993).
  4. Iancu, R. V., Ramamurthy, G., Harvey, R. D. Spatial and temporal aspects of cAMP signalling in cardiac myocytes. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 35, 1343-1348 (2008).
  5. Brunton, L. L., Hayes, J. S., Mayer, S. E. Functional compartmentation of cyclic AMP and protein kinase in heart. Advances in Cyclic Nucleotide Research. 14, 391-397 (1981).
  6. Hohl, C. M., Li, Q. Compartmentation of cAMP in adult canine ventricular myocytes. Relation to single-cell free Ca2+ transients. Circulation Research. 69, 1369-1379 (1991).
  7. Rich, T. C., et al. A uniform extracellular stimulus triggers distinct cAMP signals in different compartments of a simple cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 13049-13054 (2001).
  8. Sayner, S. L., Alexeyev, M., Dessauer, C. W., Stevens, T. Soluble adenylyl cyclase reveals the significance of cAMP compartmentation on pulmonary microvascular endothelial cell barrier. Circulation Research. 98, 675-681 (2006).
  9. Rich, T. C., Tse, T. E., Rohan, J. G., Schaack, J., Karpen, J. W. In vivo assessment of local phosphodiesterase activity using tailored cyclic nucleotide-gated channels as cAMP sensors. The Journal of General Physiology. 118, 63-78 (2001).
  10. Blackman, B. E., et al. PDE4D and PDE4B function in distinct subcellular compartments in mouse embryonic fibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 286, 12590-12601 (2011).
  11. Sayner, S. L., et al. Paradoxical cAMP-induced lung endothelial hyperpermeability revealed by Pseudomonas aeruginosa ExoY. Circulation Research. 95, 196-203 (2004).
  12. Klarenbeek, J., Jalink, K. Detecting cAMP with an EPAC-based FRET sensor in single living cells. Methods in Molecular Biology. 1071, 49-58 (2014).
  13. Surdo, N. C., et al. FRET biosensor uncovers cAMP nano-domains at β-adrenergic targets that dictate precise tuning of cardiac contractility. Nature Communications. 8, 15031 (2017).
  14. Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. EMBO Reports. 5, 1176-1180 (2004).
  15. Vogel, S. S., Thaler, C., Koushik, S. V. Fanciful FRET. Science’s STKE. 2006, (2006).
  16. Clegg, R. M. The History of FRET: From conception through the labors of birth. Reviews in Fluorescence. 3, (2006).
  17. Giepmans, B. N. G., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312, 217-224 (2006).
  18. Manzella-Lapeira, J., Brzostowski, J. A. Imaging protein-protein interactions by Förster resonance energy transfer (FRET) microscopy in live cells. Current Protocols in Protein Science. 93, 58 (2018).
  19. Cooper, D. M. F., Mons, N., Karpen, J. W. Adenylyl cyclases and the interaction between calcium and cAMP signalling. Nature. 374, 421-424 (1995).
  20. Sassone-Corsi, P. Coupling gene expression to cAMP signalling: role of CREB and CREM. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 30, 27-38 (1998).
  21. Rebhun, L. I. Cyclic nucleotides, calcium, and cell division. International Review of Cytology. 49, 1-54 (1977).
  22. Klarenbeek, J., Goedhart, J., Van Batenburg, A., Groenewald, D., Jalink, K. Fourth-generation Epac-based FRET sensors for cAMP feature exceptional brightness, photostability and dynamic range: characterization of dedicated sensors for FLIM, for ratiometry and with high affinity. PLOS ONE. 10, 0122513 (2015).
  23. Leavesley, S. J., Rich, T. C. FRET: signals hidden within the noise. Cytometry Part A. 85, 918-920 (2014).
  24. Rich, T. C., Webb, K. J., Leavesley, S. J. Can we decipher the information content contained within cyclic nucleotide signals. The Journal of General Physiology. 143, 17-27 (2014).
  25. Annamdevula, N. S., et al. Spectral imaging of FRET-based sensors reveals sustained cAMP gradients in three spatial dimensions. Cytometry Part A. 93 (10), 1029-1038 (2018).
  26. Leavesley, S. J., Britain, A. L., Cichon, L. K., Nikolaev, V. O., Rich, T. C. Assessing FRET using spectral techniques. Cytometry Part A. 83, 898-912 (2013).
  27. Leavesley, S. J., Rich, T. C. Overcoming limitations of FRET measurements. Cytometry Part A. 89, 325-327 (2016).
  28. Fink, D. J. Monitoring Earcths Resources from Space. Technology Review. 75, 32-41 (1973).
  29. Goetz, A. F. H., Vane, G., Solomon, J. E., Rock, B. N. Imaging Spectrometry for Earth Remote Sensing. Science. 228, 1147-1153 (1985).
  30. Bücherl, C. A., Bader, A., Westphal, A. H., Laptenok, S. P., Borst, J. W. FRET-FLIM applications in plant systems. Protoplasma. 251, 383-394 (2014).
  31. Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions. Journal of Microscopy. 228, 139-152 (2007).
  32. Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair. FEBS Letters. 531, 245-249 (2002).
  33. Griswold, J. R., Annamdevula, N., Deal, J., Rich, T., Leavesley, S. Estimating FRET Efficiency using Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging. Biophysical Journal. 112, 586 (2017).
  34. Favreau, P. F., et al. Excitation-scanning hyperspectral imaging microscope. Journal of Biomedical Optics. 19, 046010 (2014).
  35. King, J., et al. Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes. Microvascular Research. 67, 139-151 (2004).
  36. Thaler, C., Koushik, S. V., Blank, P. S., Vogel, S. S. Quantitative multiphoton spectral imaging and its use for measuring resonance energy transfer. Biophysical Journal. 89, 2736-2749 (2005).
  37. Agarwal, S. R., et al. Compartmentalized cAMP signaling associated with lipid raft and non-raft membrane domains in adult ventricular myocytes. Frontiers in Pharmacology. 9, 332 (2018).
  38. Johnstone, T. B., Agarwal, S. R., Harvey, R. D., Ostrom, R. S. cAMP signaling compartmentation: Adenylyl cyclases as anchors of dynamic signaling complexes. Mol Pharmacol. , (2017).
  39. Zhang, J., Li, H., Chai, L., Zhang, L., Qu, J., Chen, T. Quantitative FRET measurement using emission-spectral unmixing with independent excitation crosstalk correction. Journal of Microscopy. 257, 104-116 (2015).
  40. Zhang, J., Lin, F., Chai, L., Wei, L., Chen, T. IIem-spFRET: improved Iem-spFRET method for robust FRET measurement. Journal of Biomedical Optics. 21, 105003 (2016).
  41. Levy, S., et al. SpRET: highly sensitive and reliable spectral measurement of absolute FRET efficiency. Microscopy and Microanalysis. 17, 176-190 (2011).
  42. West, S. J., et al. Hyperspectral Measurements Allow Separation of FRET Signals from Non-Uniform Background Fluorescence. Biophysical Journal. 112, 453 (2017).
  43. Annamdevula, N. S., et al. An approach for characterizing and comparing hyperspectral microscopy systems. Sensors. 13, 9267-9293 (2013).

Play Video

Cite This Article
Annamdevula, N. S., Sweat, R., Gunn, H., Griswold, J. R., Britain, A. L., Rich, T. C., Leavesley, S. J. Measurement of 3-Dimensional cAMP Distributions in Living Cells using 4-Dimensional (x, y, z, and λ) Hyperspectral FRET Imaging and Analysis. J. Vis. Exp. (164), e61720, doi:10.3791/61720 (2020).

View Video