Из-за низкого отношения сигнал/шум (SNR) датчиков на основе резонансной передачи энергии (FRET) измерения сигналов цАМФ были сложными, особенно в трех пространственных измерениях. Здесь мы описываем гиперспектральную методологию визуализации и анализа FRET, которая позволяет измерять распределение цАМФ в трех пространственных измерениях.
Циклический АМП является вторым мессенджером, который участвует в широком спектре клеточной и физиологической деятельности. Несколько исследований показывают, что сигналы цАМФ разделены и что компартментализация способствует специфичности сигналов в рамках сигнального пути цАМФ. Разработка биосенсоров на основе резонансного переноса энергии (FRET) на основе Fӧrster способствовала способности измерять и визуализировать сигналы цАМФ в клетках. Однако эти измерения часто ограничиваются двумя пространственными измерениями, что может привести к неправильному толкованию данных. На сегодняшний день были проведены лишь очень ограниченные измерения сигналов цАМФ в трех пространственных измерениях (x, y и z) из-за технических ограничений в использовании датчиков FRET, которые по своей природе демонстрируют низкое отношение сигнал/шум (SNR). Кроме того, традиционные подходы к визуализации на основе фильтров часто неэффективны для точного измерения сигналов цАМФ в локализованных субклеточных областях из-за ряда факторов, включая спектральные перекрестные помехи, ограниченную силу сигнала и автофлуоресценцию. Чтобы преодолеть эти ограничения и позволить использовать биосенсоры на основе FRET с несколькими флуорофорами, мы разработали гиперспектральные подходы к визуализации и анализу FRET, которые обеспечивают спектральную специфичность для расчета эффективности FRET и возможность спектрально отделять сигналы FRET от смешивающей автофлуоресценции и / или сигналов от дополнительных флуоресцентных меток. Здесь мы представляем методологию реализации гиперспектральной визуализации FRET, а также необходимость построения соответствующей спектральной библиотеки, которая не является ни недовыборочной, ни передискретированной для выполнения спектрального размешивания. Хотя мы представляем эту методологию для измерения трехмерных распределений цАМФ в легочных микрососудистых эндотелиальных клетках (PMVECs), эта методология может быть использована для изучения пространственных распределений цАМФ в ряде типов клеток.
Циклический аденозинмонофосфат (цАМФ) является вторым мессенджером, участвующим в ключевых клеточных и физиологических процессах, включая деление клеток, приток кальция, транскрипцию генов и трансдукцию сигналов. Растущее количество доказательств свидетельствует о существовании цАМФ-компартментов в клетке, благодаря которым достигается сигнальнаяспецифичность 1,2,3,4,5,6,7. До недавнего времени компартментализация цАМФ выводилась на основе различных физиологических или клеточных эффектов, индуцированных различными агонистами G-связанных рецепторов8,9,10,11. Совсем недавно флуоресцентные зонды на основе FRET предоставили новые подходы для прямого измерения и наблюдения сигналов цАМФ в ячейке12,13,14.
Резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET) — это физическое явление, при котором передача энергии происходит между донорскими и акцепторными молекулами нерадиационным образом, когда молекулы находятся в непосредственнойблизости 15,16. С развитием флуоресцентных индикаторов на основе FRET это физическое явление было использовано в биологических приложениях для изучения белково-белковых взаимодействий17,колокализации белка18,передачи сигналов Ca+2 19,экспрессии генов20,деления клеток21 и циклической нуклеотидной сигнализации. Индикаторы цАМФ на основе FRET обычно состоят из цАМФ-связывающего домена, донорского флуорофора и акцепторного флуорофора22. Например, датчик цАМФ H18812,22, используемый в данной методологии, состоит из цАМФ-связующего домена, полученного из Epac, зажатого между бирюзовыми (донорскими) и венериными (акцепторными) флуорофорами. В базальных условиях (несвязанные) бирюза и Венера находятся в такой ориентации, что между флуорофорами возникает FRET. При связывании цАМФ с связующим доменом происходит конформационное изменение, в результате чего Бирюза и Венера раздвигаются, что приводит к снижению FRET.
Подходы к визуализации на основе FRET предлагают многообещающий инструмент для исследования и визуализации сигналов цАМФ в клетке. Однако современные методы микроскопической визуализации на основе FRET часто лишь частично успешны в достижении достаточной силы сигнала для измерения FRET с субклеточной пространственной четкостью. Это связано с несколькими факторами, включая ограниченную силу сигнала многих репортеров FRET, высокий уровень точности, необходимый для точной количественной оценки изменений эффективности FRET, и наличие смешанных факторов, таких как клеточная автофлуоресценция23,24. Результатом часто является изображение FRET, которое страдает от слабого SNR, что делает визуализацию субклеточных изменений в FRET очень сложной. Кроме того, исследование пространственно локализованных сигналов цАМФ почти исключительно проводилось только в двух пространственных измерениях, а осевое распределение цАМФ редко считалось25. Вероятно, это связано с тем, что низкий SNR препятствует возможности измерения и визуализации градиентов цАМФ в трех пространственных измерениях. Чтобы преодолеть ограничения использования датчиков FRET с низким SNR, мы внедрили гиперспектральные подходы к визуализации и анализу для измерения FRET в отдельных клетках25,26,27.
Подходы к гиперспектральной визуализации были разработаны НАСА для дифференциации наземных объектов, присутствующих на спутниковых снимках28,29. С тех пор эти методы были переведены в поле флуоресцентной микроскопии30,с несколькими коммерческими системами конфокальных микроскопов, предлагающими спектральные детекторы. В традиционной (неспектральной) флуоресцентной визуализации образец возбуждается с помощью полосового фильтра или лазерной линии, а излучение собирается с помощью второго полосового фильтра, часто выбираемого в соответствии с пиковой длиной волны излучения флуорофора (флуорофоров). Напротив, подходы к гиперспектральной визуализации направлены на выборку полного спектрального профиля либо флуоресцентного излучения26,31,32, либо возбуждения33,34 на определенных интервалах длин волн. В наших предыдущих исследованиях мы показали, что гиперспектральные подходы к визуализации и анализу могут предложить улучшенную количественную оценку сигналов FRET в клетках по сравнению с традиционными методами визуализации FRET на основе фильтров26. Здесь мы представляем методологию выполнения 4-мерной (x, y, z и λ) гиперспектральной визуализации и анализа FRET для измерения и визуализации распределений цАМФ в трех пространственных измерениях. Эти подходы позволили визуализировать агонист-индуцированные цАМФ пространственные градиенты в одиночных ячейках25. Интересно, что в зависимости от агониста градиенты цАМФ могут быть очевидны в клетках. Представленная здесь методология использует спектральное размешивание неоднородного фона и клеточной автофлуоресценции для повышения точности измерений FRET. Хотя эта методология демонстрируется в легочных микрососудистых эндотелиальных клетках (PMVEC) с использованием биосенсора цАМФ FRET, методология может быть легко модифицирована для использования с альтернативными репортерами FRET или альтернативными клеточными линиями.
Разработка биосенсоров FRET позволила измерять и визуализировать циклические нуклеотидные сигналы в отдельных клетках, и существует большая перспектива для визуализации субклеточных сигнальных событий13,22,37,38. Однак…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить доктора Кейса Джалинка (Нидерландский институт рака и Центр передовой микроскопии ван Левенгука, Амстердам, Нидерланды) за предоставление нам биосенсора H188 cAMP FRET и Кенни Тринха (Инженерный колледж Университета Южной Алабамы) за техническую помощь в сокращении времени, занимаемого для запуска наших специально разработанных программных сценариев.
Авторы хотели бы отметить источники финансирования: Американская кардиологическая ассоциация (16PRE27130004), Национальный научный фонд; (1725937) NIH, S100D020149, S10RR027535, R01HL058506, P01HL066299).
Attofluor Cell Chamber | Invitrogen | A7816 | Attofluor contains steel cell chambers and a rubber O-ring. Cell chamber holds the coverslip and O-ring provides a lock in mechanism to hold the buffer in cell chamber with out leakage |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | Solvent used to prepare stock solution forskolin. |
DRAQ5 Fluoroscent Probe Solution | Thermo Scientific | 62252 | Nuclear label |
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | Contains nutrients and growth factors for the cells to grow and divide in the culture dishes. |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F6178 | Growth factor suppliment that is added to culture medium, DMEM |
Forskolin | Sigma | F3917 | Adenyly cyclase activator. |
H188 Cyclic AMP FRET biosensor | Netherland Cancer Institute, Dr. K. Jalink | Gift | Plasmid encoding Turquoise (donor fluorophore), Venus (acceptor fluorophore), and binding domain obtained from Epac. |
Image J | image.net | Free download | Another image processing platform used to extact spectral information and image processing. |
Integrating Sphere | Ocean Optics | FOIS-1 | Used to measure illumination intensity of the laser line at different laser intensities (?). |
Laminin Mouse Protein, Natural | Invitrogen | 23017-015 | Coverslips are coated with laminin and this helps in cell attachment, growth and motility of the cell. |
Lipofectamine 3000 Transfection Kit | Invitrogen | L3000-015 | Transfection reagent used to transfect cells with H188 FRET biosensor |
MATLAB | Mathworks | R2019a | Image processing operations (linear unmixing and FRET efficiency calculations) are performed by writing custom programs in MATLAB programming environment |
Nikon A1R confocal microscope | Nikon Instruments | Nikon A1R | Spectral image acquisition is performed using confocal microscope. |
Nikon Elements Software | Nikon Instruments | Software dongle | used to export and handle nd2 image files (multidimensional image files) that are aquired using Nikon A1R |
NIST-Traceable Calibration Lamp | Ocean Optics | LS-1-CAL-INT | A lamp with a known spectrum for use as a standard |
PBS pH 7.4 (1X) | Gibco | 10010-023 | coomonly used buffer suring cell culture |
Pulmonary Microvascular Endothelial Cells (PMVECs) | In house – Cell culture core, Univeristy of South Alabama | Isolated from Rat pulmonary microvasculature | PMVECs form inner lining of a blood vessel. |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco | 15140-122 | antibiotics are added to culture medum to prevent contamination of the cells. |
Pre-Cleaned Gold Seal Micro Slides | Clay Adams | 3010 | Microscope slides used for cell fixation |
ProLong Diamond Antifade Mounting Media | Invitrogen | P36961 | If samples are fixed using antifade mountant, then the later protects fluoroscent dyes and chromophores from fading. |
Spectrometer | Ocean Optics | QE65000 | Used to measure spectral response of the light source (?) |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 | Digests the protein-protein bond between the cell and cell matrix and helps to disscociate and lift the cells during cell plating. |
Tyrodes Buffer | Made in-house | Made in-house | Tyrodes buffer is used to make working solutions and to maintain cells in aqueous solution during image acquisition. |
6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3506 | Laminin coated coverslips are placed in 6-well culture dish (one coverlisps/well). Cells along with medium is added into each well. |
25 mm Round Microscope Cover Slips | Fisher Scientific | 12545102 | Cells were grown on round glass coverslips |
60X Ojective | Nikon Instruments | Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 | water immersion and commonly used objective for cells |