Summary

Måling af 3-dimensionelle cAMP-fordelinger i levende celler ved hjælp af 4-dimensionelle (x, y, z og λ) Hyperspektral FRET Imaging and Analysis

Published: October 27, 2020
doi:

Summary

På grund af iboende lave signal-til-støj-forhold (SNR) af Fӧrster resonans energioverførsel (FRET) baserede sensorer, måling af cAMP signaler har været udfordrende, især i tre rumlige dimensioner. Her beskriver vi en hyperspektral FRET billed- og analysemetode, der gør det muligt at måle cAMP-distribution i tre rumlige dimensioner.

Abstract

Cyklisk AMP er en anden messenger, der er involveret i en bred vifte af cellulære og fysiologiske aktiviteter. Flere undersøgelser tyder på, at cAMP-signaler er opdelt, og at opdeling bidrager til at signalere specificitet inden for cAMP-signalvejen. Udviklingen af Fӧrster resonans energioverførsel (FRET) baseret biosensorer har fremmet evnen til at måle og visualisere cAMP signaler i celler. Disse målinger er dog ofte begrænset til to rumlige dimensioner, hvilket kan resultere i fejlfortolkning af data. Til dato har der kun været meget begrænsede målinger af cAMP-signaler i tre rumlige dimensioner (x, y og z) på grund af de tekniske begrænsninger ved at bruge FRET-sensorer, der i sagens natur udviser lavt signal til støjforhold (SNR). Derudover er traditionelle filterbaserede billeddannelsesmetoder ofte ineffektive til nøjagtig måling af cAMP-signaler i lokaliserede subcellulære områder på grund af en række faktorer, herunder spektral krydstale, begrænset signalstyrke og autofluorescence. For at overvinde disse begrænsninger og tillade FRET-baserede biosensorer, der skal anvendes med flere fluorophorer, har vi udviklet hyperspektrale FRET billed- og analysemetoder, der giver spektral specificitet til beregning af FRET-effektivitet og evnen til at spektralt adskille FRET-signaler fra forvirrende autofluorescence og / eller signaler fra yderligere fluorescerende etiketter. Her præsenterer vi metoden til implementering af hyperspektral FRET-billeddannelse samt behovet for at konstruere et passende spektralbibliotek, der hverken er undersampled eller oversampled for at udføre spektral ublandet. Mens vi præsenterer denne metode til måling af tredimensionelle cAMP-fordelinger i lungemikrovaskulære endotelceller (PMVECs), kan denne metode bruges til at studere rumlige fordelinger af cAMP i en række celletyper.

Introduction

Cyklisk adenosin monophosphat (cAMP) er en anden messenger involveret i centrale cellulære og fysiologiske processer, herunder celledeling, calcium tilstrømning, gen transskription, og signal transduktion. En voksende mængde af beviser tyder på eksistensen af cAMP rum icellen,hvorigennem signalering specificitet opnås1,2,3,4,5,6,7. Indtil for nylig blev cAMP-opdeling udledt baseret på forskellige fysiologiske eller cellulære virkninger induceret af forskellige G-koblede receptor-agonister8,9,10,11. For nylig har FRET-baserede fluorescensbilledsonder givet nye tilgange til direkte måling og observation af cAMP-signaler i en celle12,13,14.

Förster resonans energioverførsel (FRET) er et fysisk fænomen, hvor energioverførsel sker mellem donor og acceptor molekyler i en ikke-radiativ måde, når molekylerne er i nærheden15,16. Med udviklingen af FRET-baserede fluorescerende indikatorer er dette fysiske fænomen blevet brugt i biologiske anvendelser til at studere protein-protein interaktioner17,protein co-lokalisering18,Ca+2 signalering19, genekspression20, celledeling21 og cyklisk nukleotid signalering. FRET-baserede cAMP-indikatorer består typisk af et cAMP-bindingsdomæne, en donorfluohore og en acceptorfluoriphe22. For eksempel består H188 cAMP sensor12,22, der anvendes i denne metode, af et cAMP-bindingsdomæne fremstillet af Epac, klemt inde mellem turkis (donor) og Venus (acceptor) fluorophorer. Ved basale forhold (ubundet) er turkis og Venus i en retning, så FRET opstår mellem fluorophorerne. Ved binding af cAMP til bindingsdomænet sker der en kropsbygningsændring, så Turkis og Venus bevæger sig fra hinanden, hvilket resulterer i et fald i FRET.

FRET-baserede billedbehandlingsmetoder er et lovende værktøj til at undersøge og visualisere cAMP-signaler i en celle. Men, nuværende FRET baseret mikroskopiske billeddannelse teknikker er ofte kun delvis vellykket i at opnå tilstrækkelig signalstyrke til at måle FRET med subcellulære rumlige klarhed. Dette skyldes flere faktorer, herunder den begrænsede signalstyrke hos mange FRET-journalister, det høje præcisionsniveau, der kræves for præcist at kvantificere ændringer i FRET-effektivitet, og tilstedeværelsen af forvirrende faktorer, såsom cellulær autofluorescence23,24. Resultatet er ofte et FRET-billede, der er plaget af svag SNR, hvilket gør visualisering af subcellulære ændringer i FRET meget vanskelige. Desuden er undersøgelsen af rumligt lokaliserede cAMP-signaler næsten udelukkende blevet udført i to rumlige dimensioner, og den aksiale cAMP-fordeling er sjældent blevet betragtet som25. Dette skyldes sandsynligvis, at lav SNR hindrede evnen til at måle og visualisere cAMP-gradienter i tre rumlige dimensioner. For at overvinde begrænsninger ved at bruge FRET-sensorer med lav SNR har vi implementeret hyperspektral billeddannelse og analysemetoder til måling af FRET i enkeltceller25,26,27.

Hyperspektral billeddannelse tilgange blev udviklet af NASA til at differentiere jordbaserede objekter til stede i satellitbilleder28,29. Disse teknikker er siden blevet oversat til fluorescensmikroskopifelt30, med flere kommercielle konfokale mikroskopsystemer, der tilbyder spektraldetektorer. I traditionelle (ikke-spektrale) fluorescens imaging, prøven er ophidset ved hjælp af et band-pass filter eller en laser linje, og emissionen indsamles ved hjælp af en anden band-pass filter, ofte udvalgt til at matche peak emission bølgelængde af fluorophore (r). I modsætning hertil søger hyperspektral billeddannelsesmetoder at prøve en komplet spektral profil af enten fluorescensemissionen26,31,32 eller excitation33,34 med bestemte bølgelængdeintervaller. I vores tidligere undersøgelser viste vi, at hyperspektral billeddannelse og analyse tilgange kan tilbyde forbedret kvantificering af FRET-signaler i celler i forhold til traditionelle filter-baserede FRET billeddannelse teknikker26. Her præsenterer vi en metode til udførelse af 4-dimensionelle (x, y, z og λ) hyperspektral FRET billeddannelse og analyse til at måle og visualisere cAMP fordelinger i tre rumlige dimensioner. Disse tilgange har gjort det muligt visualisering af agonistiske-inducerede cAMP rumlige gradienter i enkeltceller25. Interessant, afhængigt af agonist, cAMP gradienter kan være synlige i celler. Den metode, der præsenteres her, udnytter spektral blanding af ikke-ensartet baggrund og cellulær autofluorescence til at forbedre nøjagtigheden af FRET-målingerne. Mens denne metode er demonstreret i lungemikrovaskulære endotelceller (PMVECs) ved hjælp af en cAMP FRET biosensor, kan metoden let ændres til brug med alternative FRET-journalister eller alternative cellelinjer.

Protocol

Denne protokol følger procedurer godkendt af University of South Alabama Institutional Animal Care and Use Committee. 1. Fremstilling af celler, prøver og reagenser til billeddannelse Isoler rottepulmonale mikrovaskulære endotelceller (PMVECs) som beskrevet tidligere35.BEMÆRK: Celler blev isoleret og kultiveret af Cell Culture Core ved University of South Alabama, Mobile, AL på 100 mm cellekultur retter. Frø isolerede PMVECs på 25 mm runde…

Representative Results

Denne protokol beskriver brugen af hyperspektrale FRET-billed- og analysemetoder til måling af cAMP-gradienter i tre rumlige dimensioner i levende celler. Der er flere vigtige trin involveret i at generere disse resultater, for hvilke der kræves omhyggelig opmærksomhed, mens du analyserer og kvantificerer dataene. Disse vigtige trin omfatter opførelse af et passende spektralbibliotek, baggrundsspektral spektral ub blanding, tærskeling for at identificere cellekanter og FRET-effektivitetsberegninger. <strong class="x…

Discussion

Udviklingen af FRET biosensorer har gjort det muligt at måle og visualisere cykliske nukleotidsignaler i enkelte celler, og der er store løfter om at visualisere subcellulære signalhændelser13,22,37,38. Brugen af FRET biosensorer præsenterer imidlertid flere begrænsninger, herunder de lave signal-til-støj-egenskaber hos mange fluorescerende proteinbaserede FRET-reportere og FRET-journali…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne vil gerne anerkende Dr. Kees Jalink (The Netherlands Cancer Institute og van Leeuwenhoek Center for Advanced Microscopy, Amsterdam, Holland) for at give os H188 cAMP FRET biosensor og Kenny Trinh (College of Engineering, University of South Alabama) for teknisk hjælp til at reducere den tid, det tog at køre vores specialudviklede programmering scripts.

Forfatterne vil gerne anerkende finansieringskilderne: American Heart Association (16PRE27130004), National Science Foundation; (1725937) NIH, S100D020149, S10RR027535, R01HL058506, P01HL066299).

Materials

Attofluor Cell Chamber Invitrogen A7816 Attofluor contains steel cell chambers and a rubber O-ring. Cell chamber holds the coverslip and O-ring provides a lock in mechanism to hold the buffer in cell chamber with out leakage
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific BP231-100 Solvent used to prepare stock solution forskolin.
DRAQ5 Fluoroscent Probe Solution Thermo Scientific 62252 Nuclear label
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11965-092 Contains nutrients and growth factors for the cells to grow and divide in the culture dishes.
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F6178 Growth factor suppliment that is added to culture medium, DMEM
Forskolin Sigma F3917 Adenyly cyclase activator.
H188 Cyclic AMP FRET biosensor Netherland Cancer Institute, Dr. K. Jalink Gift Plasmid encoding Turquoise (donor fluorophore), Venus (acceptor fluorophore), and binding domain obtained from Epac.
Image J image.net Free download Another image processing platform used to extact spectral information and image processing.
Integrating Sphere Ocean Optics FOIS-1 Used to measure illumination intensity of the laser line at different laser intensities (?).
Laminin Mouse Protein, Natural Invitrogen 23017-015 Coverslips are coated with laminin and this helps in cell attachment, growth and motility of the cell.
Lipofectamine 3000 Transfection Kit Invitrogen L3000-015 Transfection reagent used to transfect cells with H188 FRET biosensor
MATLAB Mathworks R2019a Image processing operations (linear unmixing and FRET efficiency calculations) are performed by writing custom programs in MATLAB programming environment
Nikon A1R confocal microscope Nikon Instruments Nikon A1R Spectral image acquisition is performed using confocal microscope.
Nikon Elements Software Nikon Instruments Software dongle used to export and handle nd2 image files (multidimensional image files) that are aquired using Nikon A1R
NIST-Traceable Calibration Lamp Ocean Optics LS-1-CAL-INT A lamp with a known spectrum for use as a standard
PBS pH 7.4 (1X) Gibco 10010-023 coomonly used buffer suring cell culture
Pulmonary Microvascular Endothelial Cells (PMVECs) In house – Cell culture core, Univeristy of South Alabama Isolated from Rat pulmonary microvasculature PMVECs form inner lining of a blood vessel.
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Gibco 15140-122 antibiotics are added to culture medum to prevent contamination of the cells.
Pre-Cleaned Gold Seal Micro Slides Clay Adams 3010 Microscope slides used for cell fixation
ProLong Diamond Antifade Mounting Media Invitrogen P36961 If samples are fixed using antifade mountant, then the later protects fluoroscent dyes and chromophores from fading.
Spectrometer Ocean Optics QE65000 Used to measure spectral response of the light source (?)
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200-056 Digests the protein-protein bond between the cell and cell matrix and helps to disscociate and lift the cells during cell plating.
Tyrodes Buffer Made in-house Made in-house Tyrodes buffer is used to make working solutions and to maintain cells in aqueous solution during image acquisition.
6 Well Cell Culture Plate Corning 3506 Laminin coated coverslips are placed in 6-well culture dish (one coverlisps/well). Cells along with medium is added into each well.
25 mm Round Microscope Cover Slips Fisher Scientific 12545102 Cells were grown on round glass coverslips
60X Ojective Nikon Instruments Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 water immersion and commonly used objective for cells

References

  1. Corbin, J. D., Sugden, P. H., Lincoln, T. M., Keely, S. L. Compartmentalization of adenosine 3′:5′-monophosphate and adenosine 3′:5′-monophosphate-dependent protein kinase in heart tissue. The Journal of Biological Chemistry. 252, 3854-3861 (1977).
  2. Terrin, A., et al. PGE1 stimulation of HEK293 cells generates multiple contiguous domains with different [cAMP]: role of compartmentalized phosphodiesterases. The Journal of Cell Biology. 175, 441-451 (2006).
  3. Bacskai, B. J., et al. Spatially resolved dynamics of cAMP and protein kinase A subunits in Aplysia sensory neurons. Science. 260, 222-226 (1993).
  4. Iancu, R. V., Ramamurthy, G., Harvey, R. D. Spatial and temporal aspects of cAMP signalling in cardiac myocytes. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 35, 1343-1348 (2008).
  5. Brunton, L. L., Hayes, J. S., Mayer, S. E. Functional compartmentation of cyclic AMP and protein kinase in heart. Advances in Cyclic Nucleotide Research. 14, 391-397 (1981).
  6. Hohl, C. M., Li, Q. Compartmentation of cAMP in adult canine ventricular myocytes. Relation to single-cell free Ca2+ transients. Circulation Research. 69, 1369-1379 (1991).
  7. Rich, T. C., et al. A uniform extracellular stimulus triggers distinct cAMP signals in different compartments of a simple cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 13049-13054 (2001).
  8. Sayner, S. L., Alexeyev, M., Dessauer, C. W., Stevens, T. Soluble adenylyl cyclase reveals the significance of cAMP compartmentation on pulmonary microvascular endothelial cell barrier. Circulation Research. 98, 675-681 (2006).
  9. Rich, T. C., Tse, T. E., Rohan, J. G., Schaack, J., Karpen, J. W. In vivo assessment of local phosphodiesterase activity using tailored cyclic nucleotide-gated channels as cAMP sensors. The Journal of General Physiology. 118, 63-78 (2001).
  10. Blackman, B. E., et al. PDE4D and PDE4B function in distinct subcellular compartments in mouse embryonic fibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 286, 12590-12601 (2011).
  11. Sayner, S. L., et al. Paradoxical cAMP-induced lung endothelial hyperpermeability revealed by Pseudomonas aeruginosa ExoY. Circulation Research. 95, 196-203 (2004).
  12. Klarenbeek, J., Jalink, K. Detecting cAMP with an EPAC-based FRET sensor in single living cells. Methods in Molecular Biology. 1071, 49-58 (2014).
  13. Surdo, N. C., et al. FRET biosensor uncovers cAMP nano-domains at β-adrenergic targets that dictate precise tuning of cardiac contractility. Nature Communications. 8, 15031 (2017).
  14. Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. EMBO Reports. 5, 1176-1180 (2004).
  15. Vogel, S. S., Thaler, C., Koushik, S. V. Fanciful FRET. Science’s STKE. 2006, (2006).
  16. Clegg, R. M. The History of FRET: From conception through the labors of birth. Reviews in Fluorescence. 3, (2006).
  17. Giepmans, B. N. G., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312, 217-224 (2006).
  18. Manzella-Lapeira, J., Brzostowski, J. A. Imaging protein-protein interactions by Förster resonance energy transfer (FRET) microscopy in live cells. Current Protocols in Protein Science. 93, 58 (2018).
  19. Cooper, D. M. F., Mons, N., Karpen, J. W. Adenylyl cyclases and the interaction between calcium and cAMP signalling. Nature. 374, 421-424 (1995).
  20. Sassone-Corsi, P. Coupling gene expression to cAMP signalling: role of CREB and CREM. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 30, 27-38 (1998).
  21. Rebhun, L. I. Cyclic nucleotides, calcium, and cell division. International Review of Cytology. 49, 1-54 (1977).
  22. Klarenbeek, J., Goedhart, J., Van Batenburg, A., Groenewald, D., Jalink, K. Fourth-generation Epac-based FRET sensors for cAMP feature exceptional brightness, photostability and dynamic range: characterization of dedicated sensors for FLIM, for ratiometry and with high affinity. PLOS ONE. 10, 0122513 (2015).
  23. Leavesley, S. J., Rich, T. C. FRET: signals hidden within the noise. Cytometry Part A. 85, 918-920 (2014).
  24. Rich, T. C., Webb, K. J., Leavesley, S. J. Can we decipher the information content contained within cyclic nucleotide signals. The Journal of General Physiology. 143, 17-27 (2014).
  25. Annamdevula, N. S., et al. Spectral imaging of FRET-based sensors reveals sustained cAMP gradients in three spatial dimensions. Cytometry Part A. 93 (10), 1029-1038 (2018).
  26. Leavesley, S. J., Britain, A. L., Cichon, L. K., Nikolaev, V. O., Rich, T. C. Assessing FRET using spectral techniques. Cytometry Part A. 83, 898-912 (2013).
  27. Leavesley, S. J., Rich, T. C. Overcoming limitations of FRET measurements. Cytometry Part A. 89, 325-327 (2016).
  28. Fink, D. J. Monitoring Earcths Resources from Space. Technology Review. 75, 32-41 (1973).
  29. Goetz, A. F. H., Vane, G., Solomon, J. E., Rock, B. N. Imaging Spectrometry for Earth Remote Sensing. Science. 228, 1147-1153 (1985).
  30. Bücherl, C. A., Bader, A., Westphal, A. H., Laptenok, S. P., Borst, J. W. FRET-FLIM applications in plant systems. Protoplasma. 251, 383-394 (2014).
  31. Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions. Journal of Microscopy. 228, 139-152 (2007).
  32. Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair. FEBS Letters. 531, 245-249 (2002).
  33. Griswold, J. R., Annamdevula, N., Deal, J., Rich, T., Leavesley, S. Estimating FRET Efficiency using Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging. Biophysical Journal. 112, 586 (2017).
  34. Favreau, P. F., et al. Excitation-scanning hyperspectral imaging microscope. Journal of Biomedical Optics. 19, 046010 (2014).
  35. King, J., et al. Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes. Microvascular Research. 67, 139-151 (2004).
  36. Thaler, C., Koushik, S. V., Blank, P. S., Vogel, S. S. Quantitative multiphoton spectral imaging and its use for measuring resonance energy transfer. Biophysical Journal. 89, 2736-2749 (2005).
  37. Agarwal, S. R., et al. Compartmentalized cAMP signaling associated with lipid raft and non-raft membrane domains in adult ventricular myocytes. Frontiers in Pharmacology. 9, 332 (2018).
  38. Johnstone, T. B., Agarwal, S. R., Harvey, R. D., Ostrom, R. S. cAMP signaling compartmentation: Adenylyl cyclases as anchors of dynamic signaling complexes. Mol Pharmacol. , (2017).
  39. Zhang, J., Li, H., Chai, L., Zhang, L., Qu, J., Chen, T. Quantitative FRET measurement using emission-spectral unmixing with independent excitation crosstalk correction. Journal of Microscopy. 257, 104-116 (2015).
  40. Zhang, J., Lin, F., Chai, L., Wei, L., Chen, T. IIem-spFRET: improved Iem-spFRET method for robust FRET measurement. Journal of Biomedical Optics. 21, 105003 (2016).
  41. Levy, S., et al. SpRET: highly sensitive and reliable spectral measurement of absolute FRET efficiency. Microscopy and Microanalysis. 17, 176-190 (2011).
  42. West, S. J., et al. Hyperspectral Measurements Allow Separation of FRET Signals from Non-Uniform Background Fluorescence. Biophysical Journal. 112, 453 (2017).
  43. Annamdevula, N. S., et al. An approach for characterizing and comparing hyperspectral microscopy systems. Sensors. 13, 9267-9293 (2013).

Play Video

Cite This Article
Annamdevula, N. S., Sweat, R., Gunn, H., Griswold, J. R., Britain, A. L., Rich, T. C., Leavesley, S. J. Measurement of 3-Dimensional cAMP Distributions in Living Cells using 4-Dimensional (x, y, z, and λ) Hyperspectral FRET Imaging and Analysis. J. Vis. Exp. (164), e61720, doi:10.3791/61720 (2020).

View Video