På grund af iboende lave signal-til-støj-forhold (SNR) af Fӧrster resonans energioverførsel (FRET) baserede sensorer, måling af cAMP signaler har været udfordrende, især i tre rumlige dimensioner. Her beskriver vi en hyperspektral FRET billed- og analysemetode, der gør det muligt at måle cAMP-distribution i tre rumlige dimensioner.
Cyklisk AMP er en anden messenger, der er involveret i en bred vifte af cellulære og fysiologiske aktiviteter. Flere undersøgelser tyder på, at cAMP-signaler er opdelt, og at opdeling bidrager til at signalere specificitet inden for cAMP-signalvejen. Udviklingen af Fӧrster resonans energioverførsel (FRET) baseret biosensorer har fremmet evnen til at måle og visualisere cAMP signaler i celler. Disse målinger er dog ofte begrænset til to rumlige dimensioner, hvilket kan resultere i fejlfortolkning af data. Til dato har der kun været meget begrænsede målinger af cAMP-signaler i tre rumlige dimensioner (x, y og z) på grund af de tekniske begrænsninger ved at bruge FRET-sensorer, der i sagens natur udviser lavt signal til støjforhold (SNR). Derudover er traditionelle filterbaserede billeddannelsesmetoder ofte ineffektive til nøjagtig måling af cAMP-signaler i lokaliserede subcellulære områder på grund af en række faktorer, herunder spektral krydstale, begrænset signalstyrke og autofluorescence. For at overvinde disse begrænsninger og tillade FRET-baserede biosensorer, der skal anvendes med flere fluorophorer, har vi udviklet hyperspektrale FRET billed- og analysemetoder, der giver spektral specificitet til beregning af FRET-effektivitet og evnen til at spektralt adskille FRET-signaler fra forvirrende autofluorescence og / eller signaler fra yderligere fluorescerende etiketter. Her præsenterer vi metoden til implementering af hyperspektral FRET-billeddannelse samt behovet for at konstruere et passende spektralbibliotek, der hverken er undersampled eller oversampled for at udføre spektral ublandet. Mens vi præsenterer denne metode til måling af tredimensionelle cAMP-fordelinger i lungemikrovaskulære endotelceller (PMVECs), kan denne metode bruges til at studere rumlige fordelinger af cAMP i en række celletyper.
Cyklisk adenosin monophosphat (cAMP) er en anden messenger involveret i centrale cellulære og fysiologiske processer, herunder celledeling, calcium tilstrømning, gen transskription, og signal transduktion. En voksende mængde af beviser tyder på eksistensen af cAMP rum icellen,hvorigennem signalering specificitet opnås1,2,3,4,5,6,7. Indtil for nylig blev cAMP-opdeling udledt baseret på forskellige fysiologiske eller cellulære virkninger induceret af forskellige G-koblede receptor-agonister8,9,10,11. For nylig har FRET-baserede fluorescensbilledsonder givet nye tilgange til direkte måling og observation af cAMP-signaler i en celle12,13,14.
Förster resonans energioverførsel (FRET) er et fysisk fænomen, hvor energioverførsel sker mellem donor og acceptor molekyler i en ikke-radiativ måde, når molekylerne er i nærheden15,16. Med udviklingen af FRET-baserede fluorescerende indikatorer er dette fysiske fænomen blevet brugt i biologiske anvendelser til at studere protein-protein interaktioner17,protein co-lokalisering18,Ca+2 signalering19, genekspression20, celledeling21 og cyklisk nukleotid signalering. FRET-baserede cAMP-indikatorer består typisk af et cAMP-bindingsdomæne, en donorfluohore og en acceptorfluoriphe22. For eksempel består H188 cAMP sensor12,22, der anvendes i denne metode, af et cAMP-bindingsdomæne fremstillet af Epac, klemt inde mellem turkis (donor) og Venus (acceptor) fluorophorer. Ved basale forhold (ubundet) er turkis og Venus i en retning, så FRET opstår mellem fluorophorerne. Ved binding af cAMP til bindingsdomænet sker der en kropsbygningsændring, så Turkis og Venus bevæger sig fra hinanden, hvilket resulterer i et fald i FRET.
FRET-baserede billedbehandlingsmetoder er et lovende værktøj til at undersøge og visualisere cAMP-signaler i en celle. Men, nuværende FRET baseret mikroskopiske billeddannelse teknikker er ofte kun delvis vellykket i at opnå tilstrækkelig signalstyrke til at måle FRET med subcellulære rumlige klarhed. Dette skyldes flere faktorer, herunder den begrænsede signalstyrke hos mange FRET-journalister, det høje præcisionsniveau, der kræves for præcist at kvantificere ændringer i FRET-effektivitet, og tilstedeværelsen af forvirrende faktorer, såsom cellulær autofluorescence23,24. Resultatet er ofte et FRET-billede, der er plaget af svag SNR, hvilket gør visualisering af subcellulære ændringer i FRET meget vanskelige. Desuden er undersøgelsen af rumligt lokaliserede cAMP-signaler næsten udelukkende blevet udført i to rumlige dimensioner, og den aksiale cAMP-fordeling er sjældent blevet betragtet som25. Dette skyldes sandsynligvis, at lav SNR hindrede evnen til at måle og visualisere cAMP-gradienter i tre rumlige dimensioner. For at overvinde begrænsninger ved at bruge FRET-sensorer med lav SNR har vi implementeret hyperspektral billeddannelse og analysemetoder til måling af FRET i enkeltceller25,26,27.
Hyperspektral billeddannelse tilgange blev udviklet af NASA til at differentiere jordbaserede objekter til stede i satellitbilleder28,29. Disse teknikker er siden blevet oversat til fluorescensmikroskopifelt30, med flere kommercielle konfokale mikroskopsystemer, der tilbyder spektraldetektorer. I traditionelle (ikke-spektrale) fluorescens imaging, prøven er ophidset ved hjælp af et band-pass filter eller en laser linje, og emissionen indsamles ved hjælp af en anden band-pass filter, ofte udvalgt til at matche peak emission bølgelængde af fluorophore (r). I modsætning hertil søger hyperspektral billeddannelsesmetoder at prøve en komplet spektral profil af enten fluorescensemissionen26,31,32 eller excitation33,34 med bestemte bølgelængdeintervaller. I vores tidligere undersøgelser viste vi, at hyperspektral billeddannelse og analyse tilgange kan tilbyde forbedret kvantificering af FRET-signaler i celler i forhold til traditionelle filter-baserede FRET billeddannelse teknikker26. Her præsenterer vi en metode til udførelse af 4-dimensionelle (x, y, z og λ) hyperspektral FRET billeddannelse og analyse til at måle og visualisere cAMP fordelinger i tre rumlige dimensioner. Disse tilgange har gjort det muligt visualisering af agonistiske-inducerede cAMP rumlige gradienter i enkeltceller25. Interessant, afhængigt af agonist, cAMP gradienter kan være synlige i celler. Den metode, der præsenteres her, udnytter spektral blanding af ikke-ensartet baggrund og cellulær autofluorescence til at forbedre nøjagtigheden af FRET-målingerne. Mens denne metode er demonstreret i lungemikrovaskulære endotelceller (PMVECs) ved hjælp af en cAMP FRET biosensor, kan metoden let ændres til brug med alternative FRET-journalister eller alternative cellelinjer.
Udviklingen af FRET biosensorer har gjort det muligt at måle og visualisere cykliske nukleotidsignaler i enkelte celler, og der er store løfter om at visualisere subcellulære signalhændelser13,22,37,38. Brugen af FRET biosensorer præsenterer imidlertid flere begrænsninger, herunder de lave signal-til-støj-egenskaber hos mange fluorescerende proteinbaserede FRET-reportere og FRET-journali…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne anerkende Dr. Kees Jalink (The Netherlands Cancer Institute og van Leeuwenhoek Center for Advanced Microscopy, Amsterdam, Holland) for at give os H188 cAMP FRET biosensor og Kenny Trinh (College of Engineering, University of South Alabama) for teknisk hjælp til at reducere den tid, det tog at køre vores specialudviklede programmering scripts.
Forfatterne vil gerne anerkende finansieringskilderne: American Heart Association (16PRE27130004), National Science Foundation; (1725937) NIH, S100D020149, S10RR027535, R01HL058506, P01HL066299).
Attofluor Cell Chamber | Invitrogen | A7816 | Attofluor contains steel cell chambers and a rubber O-ring. Cell chamber holds the coverslip and O-ring provides a lock in mechanism to hold the buffer in cell chamber with out leakage |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | Solvent used to prepare stock solution forskolin. |
DRAQ5 Fluoroscent Probe Solution | Thermo Scientific | 62252 | Nuclear label |
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | Contains nutrients and growth factors for the cells to grow and divide in the culture dishes. |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F6178 | Growth factor suppliment that is added to culture medium, DMEM |
Forskolin | Sigma | F3917 | Adenyly cyclase activator. |
H188 Cyclic AMP FRET biosensor | Netherland Cancer Institute, Dr. K. Jalink | Gift | Plasmid encoding Turquoise (donor fluorophore), Venus (acceptor fluorophore), and binding domain obtained from Epac. |
Image J | image.net | Free download | Another image processing platform used to extact spectral information and image processing. |
Integrating Sphere | Ocean Optics | FOIS-1 | Used to measure illumination intensity of the laser line at different laser intensities (?). |
Laminin Mouse Protein, Natural | Invitrogen | 23017-015 | Coverslips are coated with laminin and this helps in cell attachment, growth and motility of the cell. |
Lipofectamine 3000 Transfection Kit | Invitrogen | L3000-015 | Transfection reagent used to transfect cells with H188 FRET biosensor |
MATLAB | Mathworks | R2019a | Image processing operations (linear unmixing and FRET efficiency calculations) are performed by writing custom programs in MATLAB programming environment |
Nikon A1R confocal microscope | Nikon Instruments | Nikon A1R | Spectral image acquisition is performed using confocal microscope. |
Nikon Elements Software | Nikon Instruments | Software dongle | used to export and handle nd2 image files (multidimensional image files) that are aquired using Nikon A1R |
NIST-Traceable Calibration Lamp | Ocean Optics | LS-1-CAL-INT | A lamp with a known spectrum for use as a standard |
PBS pH 7.4 (1X) | Gibco | 10010-023 | coomonly used buffer suring cell culture |
Pulmonary Microvascular Endothelial Cells (PMVECs) | In house – Cell culture core, Univeristy of South Alabama | Isolated from Rat pulmonary microvasculature | PMVECs form inner lining of a blood vessel. |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco | 15140-122 | antibiotics are added to culture medum to prevent contamination of the cells. |
Pre-Cleaned Gold Seal Micro Slides | Clay Adams | 3010 | Microscope slides used for cell fixation |
ProLong Diamond Antifade Mounting Media | Invitrogen | P36961 | If samples are fixed using antifade mountant, then the later protects fluoroscent dyes and chromophores from fading. |
Spectrometer | Ocean Optics | QE65000 | Used to measure spectral response of the light source (?) |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 | Digests the protein-protein bond between the cell and cell matrix and helps to disscociate and lift the cells during cell plating. |
Tyrodes Buffer | Made in-house | Made in-house | Tyrodes buffer is used to make working solutions and to maintain cells in aqueous solution during image acquisition. |
6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3506 | Laminin coated coverslips are placed in 6-well culture dish (one coverlisps/well). Cells along with medium is added into each well. |
25 mm Round Microscope Cover Slips | Fisher Scientific | 12545102 | Cells were grown on round glass coverslips |
60X Ojective | Nikon Instruments | Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 | water immersion and commonly used objective for cells |