Måling av 3-dimensjonale cAMP-distribusjoner i levende celler ved hjelp av 4-dimensjonale (x, y, z og λ) Hyperspektral FRET-avbildning og -analyse
Summary
På grunn av iboende lavt signal-til-støy-forhold (SNR) av Fӧrster resonansenergioverføringssensorer (FRET), har måling av cAMP-signaler vært utfordrende, spesielt i tre romlige dimensjoner. Her beskriver vi en hyperspektral FRET-avbildnings- og analysemetodikk som tillater måling av cAMP-distribusjon i tre romlige dimensjoner.
Abstract
Syklisk AMP er en annen budbringer som er involvert i et bredt spekter av cellulære og fysiologiske aktiviteter. Flere studier tyder på at cAMP-signaler er inndelt, og at oppdeling bidrar til å signalisere spesifisitet innenfor cAMP-signalveien. Utviklingen av Fӧrster resonansenergioverføring (FRET) basert biosensorer har fremmet evnen til å måle og visualisere cAMP-signaler i celler. Disse målingene er imidlertid ofte begrenset til to romlige dimensjoner, noe som kan føre til feiltolkning av data. Til dags dato har det bare vært svært begrensede målinger av cAMP-signaler i tre romlige dimensjoner (x, y og z), på grunn av de tekniske begrensningene ved bruk av FRET-sensorer som iboende viser lavt signal-til-støy-forhold (SNR). I tillegg er tradisjonelle filterbaserte avbildningsmetoder ofte ineffektive for nøyaktig måling av cAMP-signaler i lokaliserte subcellulære områder på grunn av en rekke faktorer, inkludert spektral krysstale, begrenset signalstyrke og autofluorescens. For å overvinne disse begrensningene og la FRET-baserte biosensorer brukes med flere fluoroforer, har vi utviklet hyperspektrale FRET-avbildnings- og analysetilnærminger som gir spektral spesifisitet for beregning av FRET-effektivitet og evnen til å skille FRET-signaler fra forvirrende autofluorescens og/eller signaler fra ekstra fluorescerende etiketter. Her presenterer vi metodikken for implementering av hyperspektral FRET-avbildning samt behovet for å konstruere et passende spektralbibliotek som verken er undersamplet eller oversamplet for å utføre spektral unmixing. Mens vi presenterer denne metoden for måling av tredimensjonale cAMP-distribusjoner i pulmonale mikrovaskulære endotelceller (PMVEC), kan denne metoden brukes til å studere romlige fordelinger av cAMP i en rekke celletyper.
Introduction
Syklisk adenosinmonofosfat (cAMP) er en annen budbringer involvert i viktige cellulære og fysiologiske prosesser, inkludert celledeling, kalsiumtilstrømning, gentranskripsjon og signaltransduksjon. En voksende mengde bevis antyder eksistensen av cAMP-rom i cellen der signal spesifisitet oppnås1,2,3,4,5,6,7. Inntil nylig ble cAMP-oppdeling utledet basert på distinkte fysiologiske eller cellulære effekter indusert av forskjellige G-koblede reseptoragonister8,9,10,11. Mer nylig har FRET-baserte fluorescensavbildningssonder gitt nye tilnærminger for direkte måling og observasjon av cAMP-signaler i en celle12,13,14.
Förster resonans energioverføring (FRET) er et fysisk fenomen der energioverføring skjer mellom donor og akseptormolekyler på en ikke-radiativ måte når molekylene er i nærheten15,16. Med utviklingen av FRET-baserte fluorescerende indikatorer har dette fysiske fenomenet blitt brukt i biologiske applikasjoner for å studere proteinproteininteraksjoner17, proteinkolokalisering18, Ca+2 som signaliserer19, genuttrykk20, celledeling21 og syklisk nukleotidsignalering. FRET-baserte cAMP-indikatorer består vanligvis av et cAMP-bindingsdomene, en donorfluofor og en akseptorfluofor22. For eksempel består H188 cAMP-sensoren12,22 som brukes i denne metoden av et cAMP-bindingsdomene hentet fra Epac, smurt mellom turkis (donor) og Venus (akseptor) fluoroforer. Ved basale forhold (ubundet) er Turkis og Venus i en orientering slik at FRET oppstår mellom fluoroforene. Ved binding av cAMP til bindingsdomenet oppstår en konformasjonsendring slik at Turkis og Venus beveger seg fra hverandre, noe som resulterer i en reduksjon i FRET.
FRET-baserte bildemetoder tilbyr et lovende verktøy for å undersøke og visualisere CAMP-signaler i en celle. Imidlertid er nåværende FRET-baserte mikroskopiske avbildningsteknikker ofte bare delvis vellykkede med å oppnå tilstrekkelig signalstyrke til å måle FRET med subcellulær romlig klarhet. Dette skyldes flere faktorer, inkludert den begrensede signalstyrken til mange FRET-reportere, det høye presisjonsnivået som kreves for å nøyaktig kvantifisere endringer i FRET-effektivitet, og tilstedeværelsen av forvirrende faktorer, for eksempel cellulær autofluorescence23,24. Resultatet er ofte et FRET-bilde som er plaget av svak SNR, noe som gjør visualisering av subcellulære endringer i FRET svært vanskelig. I tillegg har undersøkelse av romlig lokaliserte cAMP-signaler nesten utelukkende blitt utført i bare to romlige dimensjoner, og den aksiale cAMP-fordelingen har sjelden blitt vurdert som25. Dette skyldes sannsynligvis at lav SNR hindret muligheten til å måle og visualisere cAMP-graderinger i tre romlige dimensjoner. For å overvinne begrensninger ved bruk av FRET-sensorer med lav SNR, har vi implementert hyperspektral avbildning og analysetilnærminger for å måle FRET i enkeltceller25,26,27.
Hyperspektral avbildning tilnærminger ble utviklet av NASA for å skille terrestriske objekter til stede i satellittbilder28,29. Disse teknikkene har siden blitt oversatt til fluorescensmikroskopifeltet30, med flere kommersielle konfektmikroskopsystemer som tilbyr spektraldetektorer. I tradisjonell (ikke-spektral) fluorescensavbildning er prøven spent ved hjelp av et båndpassfilter eller en laserlinje, og utslippet samles ved hjelp av et annet båndpassfilter, ofte valgt for å matche topputslippsbølgelengden til fluorofor(e). Til sammenligning søker hyperspektrale avbildningsmetoder å prøve en komplett spektralprofil av enten fluorescensutslippet26,31,32 eller eksitasjon33,34 ved bestemte bølgelengdeintervaller. I våre tidligere studier viste vi at hyperspektral avbildning og analyse tilnærminger kan tilby forbedret kvantifisering av FRET-signaler i celler sammenlignet med tradisjonelle filterbaserte FRET-avbildningsteknikker26. Her presenterer vi en metodikk for å utføre 4-dimensjonale (x, y, z og λ) hyperspektral FRET-avbildning og analyse for å måle og visualisere cAMP-distribusjoner i tre romlige dimensjoner. Disse metodene har tillatt visualisering av agonistinduserte cAMP-romlige gradienter i enkeltceller25. Interessant, avhengig av agonisten, kan cAMP-gradienter være tydelige i celler. Metodikken som presenteres her benytter spektral unmixing av ikke-jevn bakgrunn og cellulær autofluorescence for å forbedre nøyaktigheten av FRET-målingene. Mens denne metodikken er demonstrert i lungemikrovaskulære endotelceller (PMVEC) ved hjelp av en cAMP FRET biosensor, kan metodikken enkelt endres for bruk med alternative FRET-reportere eller alternative cellelinjer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utviklingen av FRET biosensorer har tillatt måling og visualisering av sykliske nukleotidsignaler i enkeltceller, og det er stort løfte om å visualisere subcellulære signalhendelser13,22,37,38. Bruken av FRET biosensorer presenterer imidlertid flere begrensninger, inkludert de lave signal-til-støy-egenskapene til mange fluorescerende proteinbaserte FRET-reportere og de svake transfeksjons-…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gjerne anerkjenne Dr. Kees Jalink (The Netherlands Cancer Institute og van Leeuwenhoek Center for Advanced Microscopy, Amsterdam, Nederland) for å gi oss H188 cAMP FRET biosensor og Kenny Trinh (College of Engineering, University of South Alabama) for teknisk hjelp til å redusere tiden det tar å kjøre våre spesialutviklede programmeringsskript.
Forfatterne ønsker å anerkjenne finansieringskildene: American Heart Association (16PRE27130004), National Science Foundation; (1725937) NIH, S100D020149, S10RR027535, R01HL058506, P01HL066299).
Materials
| Attofluor Cell Chamber | Invitrogen | A7816 | Attofluor contains steel cell chambers and a rubber O-ring. Cell chamber holds the coverslip and O-ring provides a lock in mechanism to hold the buffer in cell chamber with out leakage |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | Solvent used to prepare stock solution forskolin. |
| DRAQ5 Fluoroscent Probe Solution | Thermo Scientific | 62252 | Nuclear label |
| Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | Contains nutrients and growth factors for the cells to grow and divide in the culture dishes. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F6178 | Growth factor suppliment that is added to culture medium, DMEM |
| Forskolin | Sigma | F3917 | Adenyly cyclase activator. |
| H188 Cyclic AMP FRET biosensor | Netherland Cancer Institute, Dr. K. Jalink | Gift | Plasmid encoding Turquoise (donor fluorophore), Venus (acceptor fluorophore), and binding domain obtained from Epac. |
| Image J | image.net | Free download | Another image processing platform used to extact spectral information and image processing. |
| Integrating Sphere | Ocean Optics | FOIS-1 | Used to measure illumination intensity of the laser line at different laser intensities (?). |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Invitrogen | 23017-015 | Coverslips are coated with laminin and this helps in cell attachment, growth and motility of the cell. |
| Lipofectamine 3000 Transfection Kit | Invitrogen | L3000-015 | Transfection reagent used to transfect cells with H188 FRET biosensor |
| MATLAB | Mathworks | R2019a | Image processing operations (linear unmixing and FRET efficiency calculations) are performed by writing custom programs in MATLAB programming environment |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon Instruments | Nikon A1R | Spectral image acquisition is performed using confocal microscope. |
| Nikon Elements Software | Nikon Instruments | Software dongle | used to export and handle nd2 image files (multidimensional image files) that are aquired using Nikon A1R |
| NIST-Traceable Calibration Lamp | Ocean Optics | LS-1-CAL-INT | A lamp with a known spectrum for use as a standard |
| PBS pH 7.4 (1X) | Gibco | 10010-023 | coomonly used buffer suring cell culture |
| Pulmonary Microvascular Endothelial Cells (PMVECs) | In house – Cell culture core, Univeristy of South Alabama | Isolated from Rat pulmonary microvasculature | PMVECs form inner lining of a blood vessel. |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco | 15140-122 | antibiotics are added to culture medum to prevent contamination of the cells. |
| Pre-Cleaned Gold Seal Micro Slides | Clay Adams | 3010 | Microscope slides used for cell fixation |
| ProLong Diamond Antifade Mounting Media | Invitrogen | P36961 | If samples are fixed using antifade mountant, then the later protects fluoroscent dyes and chromophores from fading. |
| Spectrometer | Ocean Optics | QE65000 | Used to measure spectral response of the light source (?) |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 | Digests the protein-protein bond between the cell and cell matrix and helps to disscociate and lift the cells during cell plating. |
| Tyrodes Buffer | Made in-house | Made in-house | Tyrodes buffer is used to make working solutions and to maintain cells in aqueous solution during image acquisition. |
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3506 | Laminin coated coverslips are placed in 6-well culture dish (one coverlisps/well). Cells along with medium is added into each well. |
| 25 mm Round Microscope Cover Slips | Fisher Scientific | 12545102 | Cells were grown on round glass coverslips |
| 60X Ojective | Nikon Instruments | Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 | water immersion and commonly used objective for cells |
References
- Corbin, J. D., Sugden, P. H., Lincoln, T. M., Keely, S. L. Compartmentalization of adenosine 3′:5′-monophosphate and adenosine 3′:5′-monophosphate-dependent protein kinase in heart tissue. The Journal of Biological Chemistry. 252, 3854-3861 (1977).
- Terrin, A., et al. PGE1 stimulation of HEK293 cells generates multiple contiguous domains with different [cAMP]: role of compartmentalized phosphodiesterases. The Journal of Cell Biology. 175, 441-451 (2006).
- Bacskai, B. J., et al. Spatially resolved dynamics of cAMP and protein kinase A subunits in Aplysia sensory neurons. Science. 260, 222-226 (1993).
- Iancu, R. V., Ramamurthy, G., Harvey, R. D. Spatial and temporal aspects of cAMP signalling in cardiac myocytes. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 35, 1343-1348 (2008).
- Brunton, L. L., Hayes, J. S., Mayer, S. E. Functional compartmentation of cyclic AMP and protein kinase in heart. Advances in Cyclic Nucleotide Research. 14, 391-397 (1981).
- Hohl, C. M., Li, Q. Compartmentation of cAMP in adult canine ventricular myocytes. Relation to single-cell free Ca2+ transients. Circulation Research. 69, 1369-1379 (1991).
- Rich, T. C., et al. A uniform extracellular stimulus triggers distinct cAMP signals in different compartments of a simple cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 13049-13054 (2001).
- Sayner, S. L., Alexeyev, M., Dessauer, C. W., Stevens, T. Soluble adenylyl cyclase reveals the significance of cAMP compartmentation on pulmonary microvascular endothelial cell barrier. Circulation Research. 98, 675-681 (2006).
- Rich, T. C., Tse, T. E., Rohan, J. G., Schaack, J., Karpen, J. W. In vivo assessment of local phosphodiesterase activity using tailored cyclic nucleotide-gated channels as cAMP sensors. The Journal of General Physiology. 118, 63-78 (2001).
- Blackman, B. E., et al. PDE4D and PDE4B function in distinct subcellular compartments in mouse embryonic fibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 286, 12590-12601 (2011).
- Sayner, S. L., et al. Paradoxical cAMP-induced lung endothelial hyperpermeability revealed by Pseudomonas aeruginosa ExoY. Circulation Research. 95, 196-203 (2004).
- Klarenbeek, J., Jalink, K. Detecting cAMP with an EPAC-based FRET sensor in single living cells. Methods in Molecular Biology. 1071, 49-58 (2014).
- Surdo, N. C., et al. FRET biosensor uncovers cAMP nano-domains at β-adrenergic targets that dictate precise tuning of cardiac contractility. Nature Communications. 8, 15031 (2017).
- Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. EMBO Reports. 5, 1176-1180 (2004).
- Vogel, S. S., Thaler, C., Koushik, S. V. Fanciful FRET. Science’s STKE. 2006, (2006).
- Clegg, R. M. The History of FRET: From conception through the labors of birth. Reviews in Fluorescence. 3, (2006).
- Giepmans, B. N. G., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312, 217-224 (2006).
- Manzella-Lapeira, J., Brzostowski, J. A. Imaging protein-protein interactions by Förster resonance energy transfer (FRET) microscopy in live cells. Current Protocols in Protein Science. 93, 58 (2018).
- Cooper, D. M. F., Mons, N., Karpen, J. W. Adenylyl cyclases and the interaction between calcium and cAMP signalling. Nature. 374, 421-424 (1995).
- Sassone-Corsi, P. Coupling gene expression to cAMP signalling: role of CREB and CREM. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 30, 27-38 (1998).
- Rebhun, L. I. Cyclic nucleotides, calcium, and cell division. International Review of Cytology. 49, 1-54 (1977).
- Klarenbeek, J., Goedhart, J., Van Batenburg, A., Groenewald, D., Jalink, K. Fourth-generation Epac-based FRET sensors for cAMP feature exceptional brightness, photostability and dynamic range: characterization of dedicated sensors for FLIM, for ratiometry and with high affinity. PLOS ONE. 10, 0122513 (2015).
- Leavesley, S. J., Rich, T. C. FRET: signals hidden within the noise. Cytometry Part A. 85, 918-920 (2014).
- Rich, T. C., Webb, K. J., Leavesley, S. J. Can we decipher the information content contained within cyclic nucleotide signals. The Journal of General Physiology. 143, 17-27 (2014).
- Annamdevula, N. S., et al. Spectral imaging of FRET-based sensors reveals sustained cAMP gradients in three spatial dimensions. Cytometry Part A. 93 (10), 1029-1038 (2018).
- Leavesley, S. J., Britain, A. L., Cichon, L. K., Nikolaev, V. O., Rich, T. C. Assessing FRET using spectral techniques. Cytometry Part A. 83, 898-912 (2013).
- Leavesley, S. J., Rich, T. C. Overcoming limitations of FRET measurements. Cytometry Part A. 89, 325-327 (2016).
- Fink, D. J. Monitoring Earcths Resources from Space. Technology Review. 75, 32-41 (1973).
- Goetz, A. F. H., Vane, G., Solomon, J. E., Rock, B. N. Imaging Spectrometry for Earth Remote Sensing. Science. 228, 1147-1153 (1985).
- Bücherl, C. A., Bader, A., Westphal, A. H., Laptenok, S. P., Borst, J. W. FRET-FLIM applications in plant systems. Protoplasma. 251, 383-394 (2014).
- Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions. Journal of Microscopy. 228, 139-152 (2007).
- Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair. FEBS Letters. 531, 245-249 (2002).
- Griswold, J. R., Annamdevula, N., Deal, J., Rich, T., Leavesley, S. Estimating FRET Efficiency using Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging. Biophysical Journal. 112, 586 (2017).
- Favreau, P. F., et al. Excitation-scanning hyperspectral imaging microscope. Journal of Biomedical Optics. 19, 046010 (2014).
- King, J., et al. Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes. Microvascular Research. 67, 139-151 (2004).
- Thaler, C., Koushik, S. V., Blank, P. S., Vogel, S. S. Quantitative multiphoton spectral imaging and its use for measuring resonance energy transfer. Biophysical Journal. 89, 2736-2749 (2005).
- Agarwal, S. R., et al. Compartmentalized cAMP signaling associated with lipid raft and non-raft membrane domains in adult ventricular myocytes. Frontiers in Pharmacology. 9, 332 (2018).
- Johnstone, T. B., Agarwal, S. R., Harvey, R. D., Ostrom, R. S. cAMP signaling compartmentation: Adenylyl cyclases as anchors of dynamic signaling complexes. Mol Pharmacol. , (2017).
- Zhang, J., Li, H., Chai, L., Zhang, L., Qu, J., Chen, T. Quantitative FRET measurement using emission-spectral unmixing with independent excitation crosstalk correction. Journal of Microscopy. 257, 104-116 (2015).
- Zhang, J., Lin, F., Chai, L., Wei, L., Chen, T. IIem-spFRET: improved Iem-spFRET method for robust FRET measurement. Journal of Biomedical Optics. 21, 105003 (2016).
- Levy, S., et al. SpRET: highly sensitive and reliable spectral measurement of absolute FRET efficiency. Microscopy and Microanalysis. 17, 176-190 (2011).
- West, S. J., et al. Hyperspectral Measurements Allow Separation of FRET Signals from Non-Uniform Background Fluorescence. Biophysical Journal. 112, 453 (2017).
- Annamdevula, N. S., et al. An approach for characterizing and comparing hyperspectral microscopy systems. Sensors. 13, 9267-9293 (2013).
