Summary

Måling av 3-dimensjonale cAMP-distribusjoner i levende celler ved hjelp av 4-dimensjonale (x, y, z og λ) Hyperspektral FRET-avbildning og -analyse

Published: October 27, 2020
doi:

Summary

På grunn av iboende lavt signal-til-støy-forhold (SNR) av Fӧrster resonansenergioverføringssensorer (FRET), har måling av cAMP-signaler vært utfordrende, spesielt i tre romlige dimensjoner. Her beskriver vi en hyperspektral FRET-avbildnings- og analysemetodikk som tillater måling av cAMP-distribusjon i tre romlige dimensjoner.

Abstract

Syklisk AMP er en annen budbringer som er involvert i et bredt spekter av cellulære og fysiologiske aktiviteter. Flere studier tyder på at cAMP-signaler er inndelt, og at oppdeling bidrar til å signalisere spesifisitet innenfor cAMP-signalveien. Utviklingen av Fӧrster resonansenergioverføring (FRET) basert biosensorer har fremmet evnen til å måle og visualisere cAMP-signaler i celler. Disse målingene er imidlertid ofte begrenset til to romlige dimensjoner, noe som kan føre til feiltolkning av data. Til dags dato har det bare vært svært begrensede målinger av cAMP-signaler i tre romlige dimensjoner (x, y og z), på grunn av de tekniske begrensningene ved bruk av FRET-sensorer som iboende viser lavt signal-til-støy-forhold (SNR). I tillegg er tradisjonelle filterbaserte avbildningsmetoder ofte ineffektive for nøyaktig måling av cAMP-signaler i lokaliserte subcellulære områder på grunn av en rekke faktorer, inkludert spektral krysstale, begrenset signalstyrke og autofluorescens. For å overvinne disse begrensningene og la FRET-baserte biosensorer brukes med flere fluoroforer, har vi utviklet hyperspektrale FRET-avbildnings- og analysetilnærminger som gir spektral spesifisitet for beregning av FRET-effektivitet og evnen til å skille FRET-signaler fra forvirrende autofluorescens og/eller signaler fra ekstra fluorescerende etiketter. Her presenterer vi metodikken for implementering av hyperspektral FRET-avbildning samt behovet for å konstruere et passende spektralbibliotek som verken er undersamplet eller oversamplet for å utføre spektral unmixing. Mens vi presenterer denne metoden for måling av tredimensjonale cAMP-distribusjoner i pulmonale mikrovaskulære endotelceller (PMVEC), kan denne metoden brukes til å studere romlige fordelinger av cAMP i en rekke celletyper.

Introduction

Syklisk adenosinmonofosfat (cAMP) er en annen budbringer involvert i viktige cellulære og fysiologiske prosesser, inkludert celledeling, kalsiumtilstrømning, gentranskripsjon og signaltransduksjon. En voksende mengde bevis antyder eksistensen av cAMP-rom i cellen der signal spesifisitet oppnås1,2,3,4,5,6,7. Inntil nylig ble cAMP-oppdeling utledet basert på distinkte fysiologiske eller cellulære effekter indusert av forskjellige G-koblede reseptoragonister8,9,10,11. Mer nylig har FRET-baserte fluorescensavbildningssonder gitt nye tilnærminger for direkte måling og observasjon av cAMP-signaler i en celle12,13,14.

Förster resonans energioverføring (FRET) er et fysisk fenomen der energioverføring skjer mellom donor og akseptormolekyler på en ikke-radiativ måte når molekylene er i nærheten15,16. Med utviklingen av FRET-baserte fluorescerende indikatorer har dette fysiske fenomenet blitt brukt i biologiske applikasjoner for å studere proteinproteininteraksjoner17, proteinkolokalisering18, Ca+2 som signaliserer19, genuttrykk20, celledeling21 og syklisk nukleotidsignalering. FRET-baserte cAMP-indikatorer består vanligvis av et cAMP-bindingsdomene, en donorfluofor og en akseptorfluofor22. For eksempel består H188 cAMP-sensoren12,22 som brukes i denne metoden av et cAMP-bindingsdomene hentet fra Epac, smurt mellom turkis (donor) og Venus (akseptor) fluoroforer. Ved basale forhold (ubundet) er Turkis og Venus i en orientering slik at FRET oppstår mellom fluoroforene. Ved binding av cAMP til bindingsdomenet oppstår en konformasjonsendring slik at Turkis og Venus beveger seg fra hverandre, noe som resulterer i en reduksjon i FRET.

FRET-baserte bildemetoder tilbyr et lovende verktøy for å undersøke og visualisere CAMP-signaler i en celle. Imidlertid er nåværende FRET-baserte mikroskopiske avbildningsteknikker ofte bare delvis vellykkede med å oppnå tilstrekkelig signalstyrke til å måle FRET med subcellulær romlig klarhet. Dette skyldes flere faktorer, inkludert den begrensede signalstyrken til mange FRET-reportere, det høye presisjonsnivået som kreves for å nøyaktig kvantifisere endringer i FRET-effektivitet, og tilstedeværelsen av forvirrende faktorer, for eksempel cellulær autofluorescence23,24. Resultatet er ofte et FRET-bilde som er plaget av svak SNR, noe som gjør visualisering av subcellulære endringer i FRET svært vanskelig. I tillegg har undersøkelse av romlig lokaliserte cAMP-signaler nesten utelukkende blitt utført i bare to romlige dimensjoner, og den aksiale cAMP-fordelingen har sjelden blitt vurdert som25. Dette skyldes sannsynligvis at lav SNR hindret muligheten til å måle og visualisere cAMP-graderinger i tre romlige dimensjoner. For å overvinne begrensninger ved bruk av FRET-sensorer med lav SNR, har vi implementert hyperspektral avbildning og analysetilnærminger for å måle FRET i enkeltceller25,26,27.

Hyperspektral avbildning tilnærminger ble utviklet av NASA for å skille terrestriske objekter til stede i satellittbilder28,29. Disse teknikkene har siden blitt oversatt til fluorescensmikroskopifeltet30, med flere kommersielle konfektmikroskopsystemer som tilbyr spektraldetektorer. I tradisjonell (ikke-spektral) fluorescensavbildning er prøven spent ved hjelp av et båndpassfilter eller en laserlinje, og utslippet samles ved hjelp av et annet båndpassfilter, ofte valgt for å matche topputslippsbølgelengden til fluorofor(e). Til sammenligning søker hyperspektrale avbildningsmetoder å prøve en komplett spektralprofil av enten fluorescensutslippet26,31,32 eller eksitasjon33,34 ved bestemte bølgelengdeintervaller. I våre tidligere studier viste vi at hyperspektral avbildning og analyse tilnærminger kan tilby forbedret kvantifisering av FRET-signaler i celler sammenlignet med tradisjonelle filterbaserte FRET-avbildningsteknikker26. Her presenterer vi en metodikk for å utføre 4-dimensjonale (x, y, z og λ) hyperspektral FRET-avbildning og analyse for å måle og visualisere cAMP-distribusjoner i tre romlige dimensjoner. Disse metodene har tillatt visualisering av agonistinduserte cAMP-romlige gradienter i enkeltceller25. Interessant, avhengig av agonisten, kan cAMP-gradienter være tydelige i celler. Metodikken som presenteres her benytter spektral unmixing av ikke-jevn bakgrunn og cellulær autofluorescence for å forbedre nøyaktigheten av FRET-målingene. Mens denne metodikken er demonstrert i lungemikrovaskulære endotelceller (PMVEC) ved hjelp av en cAMP FRET biosensor, kan metodikken enkelt endres for bruk med alternative FRET-reportere eller alternative cellelinjer.

Protocol

Denne protokollen følger prosedyrer godkjent av University of South Alabama Institutional Animal Care and Use Committee. 1. Celle-, prøve- og reagensforberedelse for avbildning Isoler rotte lungemikrovaskulære endotelceller (PMVEC) som beskrevet tidligere35.MERK: Celler ble isolert og dyrket av Cell Culture Core ved University of South Alabama, Mobile, AL på 100 mm cellekulturretter. Frøisolerte PMVECer på 25 mm runde glassdeksler og la dem…

Representative Results

Denne protokollen beskriver bruken av hyperspektrale FRET-avbildnings- og analysemetoder for å måle cAMP-gradienter i tre romlige dimensjoner i levende celler. Det er flere viktige trinn som er involvert i å generere disse resultatene, som det kreves nøye oppmerksomhet for mens du analyserer og kvantifiserer dataene. Disse viktige trinnene inkluderer bygging av et passende spektralbibliotek, bakgrunnsspektral unmixing, terring for å identifisere cellekantlinjer og FRET-effektivitetsberegninger. …

Discussion

Utviklingen av FRET biosensorer har tillatt måling og visualisering av sykliske nukleotidsignaler i enkeltceller, og det er stort løfte om å visualisere subcellulære signalhendelser13,22,37,38. Bruken av FRET biosensorer presenterer imidlertid flere begrensninger, inkludert de lave signal-til-støy-egenskapene til mange fluorescerende proteinbaserte FRET-reportere og de svake transfeksjons-…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne vil gjerne anerkjenne Dr. Kees Jalink (The Netherlands Cancer Institute og van Leeuwenhoek Center for Advanced Microscopy, Amsterdam, Nederland) for å gi oss H188 cAMP FRET biosensor og Kenny Trinh (College of Engineering, University of South Alabama) for teknisk hjelp til å redusere tiden det tar å kjøre våre spesialutviklede programmeringsskript.

Forfatterne ønsker å anerkjenne finansieringskildene: American Heart Association (16PRE27130004), National Science Foundation; (1725937) NIH, S100D020149, S10RR027535, R01HL058506, P01HL066299).

Materials

Attofluor Cell Chamber Invitrogen A7816 Attofluor contains steel cell chambers and a rubber O-ring. Cell chamber holds the coverslip and O-ring provides a lock in mechanism to hold the buffer in cell chamber with out leakage
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific BP231-100 Solvent used to prepare stock solution forskolin.
DRAQ5 Fluoroscent Probe Solution Thermo Scientific 62252 Nuclear label
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11965-092 Contains nutrients and growth factors for the cells to grow and divide in the culture dishes.
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F6178 Growth factor suppliment that is added to culture medium, DMEM
Forskolin Sigma F3917 Adenyly cyclase activator.
H188 Cyclic AMP FRET biosensor Netherland Cancer Institute, Dr. K. Jalink Gift Plasmid encoding Turquoise (donor fluorophore), Venus (acceptor fluorophore), and binding domain obtained from Epac.
Image J image.net Free download Another image processing platform used to extact spectral information and image processing.
Integrating Sphere Ocean Optics FOIS-1 Used to measure illumination intensity of the laser line at different laser intensities (?).
Laminin Mouse Protein, Natural Invitrogen 23017-015 Coverslips are coated with laminin and this helps in cell attachment, growth and motility of the cell.
Lipofectamine 3000 Transfection Kit Invitrogen L3000-015 Transfection reagent used to transfect cells with H188 FRET biosensor
MATLAB Mathworks R2019a Image processing operations (linear unmixing and FRET efficiency calculations) are performed by writing custom programs in MATLAB programming environment
Nikon A1R confocal microscope Nikon Instruments Nikon A1R Spectral image acquisition is performed using confocal microscope.
Nikon Elements Software Nikon Instruments Software dongle used to export and handle nd2 image files (multidimensional image files) that are aquired using Nikon A1R
NIST-Traceable Calibration Lamp Ocean Optics LS-1-CAL-INT A lamp with a known spectrum for use as a standard
PBS pH 7.4 (1X) Gibco 10010-023 coomonly used buffer suring cell culture
Pulmonary Microvascular Endothelial Cells (PMVECs) In house – Cell culture core, Univeristy of South Alabama Isolated from Rat pulmonary microvasculature PMVECs form inner lining of a blood vessel.
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Gibco 15140-122 antibiotics are added to culture medum to prevent contamination of the cells.
Pre-Cleaned Gold Seal Micro Slides Clay Adams 3010 Microscope slides used for cell fixation
ProLong Diamond Antifade Mounting Media Invitrogen P36961 If samples are fixed using antifade mountant, then the later protects fluoroscent dyes and chromophores from fading.
Spectrometer Ocean Optics QE65000 Used to measure spectral response of the light source (?)
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200-056 Digests the protein-protein bond between the cell and cell matrix and helps to disscociate and lift the cells during cell plating.
Tyrodes Buffer Made in-house Made in-house Tyrodes buffer is used to make working solutions and to maintain cells in aqueous solution during image acquisition.
6 Well Cell Culture Plate Corning 3506 Laminin coated coverslips are placed in 6-well culture dish (one coverlisps/well). Cells along with medium is added into each well.
25 mm Round Microscope Cover Slips Fisher Scientific 12545102 Cells were grown on round glass coverslips
60X Ojective Nikon Instruments Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 water immersion and commonly used objective for cells

References

  1. Corbin, J. D., Sugden, P. H., Lincoln, T. M., Keely, S. L. Compartmentalization of adenosine 3′:5′-monophosphate and adenosine 3′:5′-monophosphate-dependent protein kinase in heart tissue. The Journal of Biological Chemistry. 252, 3854-3861 (1977).
  2. Terrin, A., et al. PGE1 stimulation of HEK293 cells generates multiple contiguous domains with different [cAMP]: role of compartmentalized phosphodiesterases. The Journal of Cell Biology. 175, 441-451 (2006).
  3. Bacskai, B. J., et al. Spatially resolved dynamics of cAMP and protein kinase A subunits in Aplysia sensory neurons. Science. 260, 222-226 (1993).
  4. Iancu, R. V., Ramamurthy, G., Harvey, R. D. Spatial and temporal aspects of cAMP signalling in cardiac myocytes. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 35, 1343-1348 (2008).
  5. Brunton, L. L., Hayes, J. S., Mayer, S. E. Functional compartmentation of cyclic AMP and protein kinase in heart. Advances in Cyclic Nucleotide Research. 14, 391-397 (1981).
  6. Hohl, C. M., Li, Q. Compartmentation of cAMP in adult canine ventricular myocytes. Relation to single-cell free Ca2+ transients. Circulation Research. 69, 1369-1379 (1991).
  7. Rich, T. C., et al. A uniform extracellular stimulus triggers distinct cAMP signals in different compartments of a simple cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 13049-13054 (2001).
  8. Sayner, S. L., Alexeyev, M., Dessauer, C. W., Stevens, T. Soluble adenylyl cyclase reveals the significance of cAMP compartmentation on pulmonary microvascular endothelial cell barrier. Circulation Research. 98, 675-681 (2006).
  9. Rich, T. C., Tse, T. E., Rohan, J. G., Schaack, J., Karpen, J. W. In vivo assessment of local phosphodiesterase activity using tailored cyclic nucleotide-gated channels as cAMP sensors. The Journal of General Physiology. 118, 63-78 (2001).
  10. Blackman, B. E., et al. PDE4D and PDE4B function in distinct subcellular compartments in mouse embryonic fibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 286, 12590-12601 (2011).
  11. Sayner, S. L., et al. Paradoxical cAMP-induced lung endothelial hyperpermeability revealed by Pseudomonas aeruginosa ExoY. Circulation Research. 95, 196-203 (2004).
  12. Klarenbeek, J., Jalink, K. Detecting cAMP with an EPAC-based FRET sensor in single living cells. Methods in Molecular Biology. 1071, 49-58 (2014).
  13. Surdo, N. C., et al. FRET biosensor uncovers cAMP nano-domains at β-adrenergic targets that dictate precise tuning of cardiac contractility. Nature Communications. 8, 15031 (2017).
  14. Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. EMBO Reports. 5, 1176-1180 (2004).
  15. Vogel, S. S., Thaler, C., Koushik, S. V. Fanciful FRET. Science’s STKE. 2006, (2006).
  16. Clegg, R. M. The History of FRET: From conception through the labors of birth. Reviews in Fluorescence. 3, (2006).
  17. Giepmans, B. N. G., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312, 217-224 (2006).
  18. Manzella-Lapeira, J., Brzostowski, J. A. Imaging protein-protein interactions by Förster resonance energy transfer (FRET) microscopy in live cells. Current Protocols in Protein Science. 93, 58 (2018).
  19. Cooper, D. M. F., Mons, N., Karpen, J. W. Adenylyl cyclases and the interaction between calcium and cAMP signalling. Nature. 374, 421-424 (1995).
  20. Sassone-Corsi, P. Coupling gene expression to cAMP signalling: role of CREB and CREM. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 30, 27-38 (1998).
  21. Rebhun, L. I. Cyclic nucleotides, calcium, and cell division. International Review of Cytology. 49, 1-54 (1977).
  22. Klarenbeek, J., Goedhart, J., Van Batenburg, A., Groenewald, D., Jalink, K. Fourth-generation Epac-based FRET sensors for cAMP feature exceptional brightness, photostability and dynamic range: characterization of dedicated sensors for FLIM, for ratiometry and with high affinity. PLOS ONE. 10, 0122513 (2015).
  23. Leavesley, S. J., Rich, T. C. FRET: signals hidden within the noise. Cytometry Part A. 85, 918-920 (2014).
  24. Rich, T. C., Webb, K. J., Leavesley, S. J. Can we decipher the information content contained within cyclic nucleotide signals. The Journal of General Physiology. 143, 17-27 (2014).
  25. Annamdevula, N. S., et al. Spectral imaging of FRET-based sensors reveals sustained cAMP gradients in three spatial dimensions. Cytometry Part A. 93 (10), 1029-1038 (2018).
  26. Leavesley, S. J., Britain, A. L., Cichon, L. K., Nikolaev, V. O., Rich, T. C. Assessing FRET using spectral techniques. Cytometry Part A. 83, 898-912 (2013).
  27. Leavesley, S. J., Rich, T. C. Overcoming limitations of FRET measurements. Cytometry Part A. 89, 325-327 (2016).
  28. Fink, D. J. Monitoring Earcths Resources from Space. Technology Review. 75, 32-41 (1973).
  29. Goetz, A. F. H., Vane, G., Solomon, J. E., Rock, B. N. Imaging Spectrometry for Earth Remote Sensing. Science. 228, 1147-1153 (1985).
  30. Bücherl, C. A., Bader, A., Westphal, A. H., Laptenok, S. P., Borst, J. W. FRET-FLIM applications in plant systems. Protoplasma. 251, 383-394 (2014).
  31. Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions. Journal of Microscopy. 228, 139-152 (2007).
  32. Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair. FEBS Letters. 531, 245-249 (2002).
  33. Griswold, J. R., Annamdevula, N., Deal, J., Rich, T., Leavesley, S. Estimating FRET Efficiency using Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging. Biophysical Journal. 112, 586 (2017).
  34. Favreau, P. F., et al. Excitation-scanning hyperspectral imaging microscope. Journal of Biomedical Optics. 19, 046010 (2014).
  35. King, J., et al. Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes. Microvascular Research. 67, 139-151 (2004).
  36. Thaler, C., Koushik, S. V., Blank, P. S., Vogel, S. S. Quantitative multiphoton spectral imaging and its use for measuring resonance energy transfer. Biophysical Journal. 89, 2736-2749 (2005).
  37. Agarwal, S. R., et al. Compartmentalized cAMP signaling associated with lipid raft and non-raft membrane domains in adult ventricular myocytes. Frontiers in Pharmacology. 9, 332 (2018).
  38. Johnstone, T. B., Agarwal, S. R., Harvey, R. D., Ostrom, R. S. cAMP signaling compartmentation: Adenylyl cyclases as anchors of dynamic signaling complexes. Mol Pharmacol. , (2017).
  39. Zhang, J., Li, H., Chai, L., Zhang, L., Qu, J., Chen, T. Quantitative FRET measurement using emission-spectral unmixing with independent excitation crosstalk correction. Journal of Microscopy. 257, 104-116 (2015).
  40. Zhang, J., Lin, F., Chai, L., Wei, L., Chen, T. IIem-spFRET: improved Iem-spFRET method for robust FRET measurement. Journal of Biomedical Optics. 21, 105003 (2016).
  41. Levy, S., et al. SpRET: highly sensitive and reliable spectral measurement of absolute FRET efficiency. Microscopy and Microanalysis. 17, 176-190 (2011).
  42. West, S. J., et al. Hyperspectral Measurements Allow Separation of FRET Signals from Non-Uniform Background Fluorescence. Biophysical Journal. 112, 453 (2017).
  43. Annamdevula, N. S., et al. An approach for characterizing and comparing hyperspectral microscopy systems. Sensors. 13, 9267-9293 (2013).

Play Video

Cite This Article
Annamdevula, N. S., Sweat, R., Gunn, H., Griswold, J. R., Britain, A. L., Rich, T. C., Leavesley, S. J. Measurement of 3-Dimensional cAMP Distributions in Living Cells using 4-Dimensional (x, y, z, and λ) Hyperspectral FRET Imaging and Analysis. J. Vis. Exp. (164), e61720, doi:10.3791/61720 (2020).

View Video