På grund av inneboende låg signal-till-brus-förhållande (SNR) av Fӧrster resonansenergiöverföringsbaserade sensorer (FRET) har mätningen av cAMP-signaler varit utmanande, särskilt i tre rumsliga dimensioner. Här beskriver vi en hyperspektral FRET imaging och analys metodik som möjliggör mätning av cAMP fördelning i tre rumsliga dimensioner.
Cyclic AMP är en andra budbärare som är involverad i ett brett spektrum av cellulära och fysiologiska aktiviteter. Flera studier tyder på att cAMP signaler är fackindela, och att compartmentalization bidrar till att signalera specificitet inom cAMP signalering utbildningsavsnittet. Utvecklingen av Fӧrster resonansenergiöverföring (FRET) baserade biosensorer har främjat förmågan att mäta och visualisera cAMP-signaler i celler. Dessa mätningar är dock ofta begränsade till två rumsliga dimensioner, vilket kan leda till feltolkning av data. Hittills har det endast gjorts mycket begränsade mätningar av cAMP-signaler i tre rumsliga dimensioner (x, y och z), på grund av de tekniska begränsningarna vid användning av FRET-sensorer som i sig uppvisar låg signal-till-brusförhållande (SNR). Dessutom är traditionella filterbaserade avbildningsmetoder ofta ineffektiva för noggrann mätning av cAMP-signaler i lokaliserade subcellulära regioner på grund av en rad faktorer, inklusive spektralkors, begränsad signalstyrka och autofluorescens. För att övervinna dessa begränsningar och tillåta FRET-baserade biosensorer att användas med flera fluorforer har vi utvecklat hyperspektrala FRET-avbildnings- och analysmetoder som ger spektralspecifikitet för beräkning av FRET-effektivitet och förmågan att spektroally separera FRET-signaler från förvirrande autofluorescens och / eller signaler från ytterligare fluorescerande etiketter. Här presenterar vi metodiken för att implementera hyperspektrala FRET-avbildningar samt behovet av att konstruera ett lämpligt spektralbibliotek som varken är undersamplat eller översamplat för att utföra spektral-unmixing. Medan vi presenterar denna metod för mätning av tredimensionella cAMP fördelningar i pulmonell microvascular endotelceller (PMVECs), denna metodik kan användas för att studera rumsliga fördelningar av cAMP i en rad celltyper.
Cykliskt adenosinmonofofat (cAMP) är en andra budbärare som är involverad i viktiga cellulära och fysiologiska processer inklusive celldelning, kalciumtillströmning, gentranskribering och signaltransduktion. En växande mängd bevis tyder på förekomsten av cAMP-fack i cellen genom vilken signalspecifikitet uppnås1,2,3,4,5,6,7. Fram till nyligen, cAMP compartmentalization härleddes baserat på distinkta fysiologiska eller cellulära effekter framkallas av olika G-kopplade receptor agonister8,9,10,11. På senare tid har FRET-baserade fluorescensavbildningssonder gett nya metoder för direkt mätning och observation av cAMP-signaler i en cell12,13,14.
Förster resonans energiöverföring (FRET) är ett fysiskt fenomen där energiöverföring sker mellan donator- och acceptormolekyler på ett icke-radiativt sätt när molekylerna är i närheten15,16. Med utvecklingen av FRET-baserade fluorescerande indikatorer har detta fysiska fenomen använts i biologiska tillämpningar för att studera proteinproteininteraktioner17, protein samlokalisering18, Ca+2 signalering19, genuttryck20, celldelning21 och cyklisk nukleotid signalering. FRET-baserade cAMP-indikatorer består vanligtvis av en cAMP-bindande domän, en donatorfluorofor och en acceptorfluorfor22. H188 cAMP-sensorn12,22 somanvänds i denna metod består till exempel av en cAMP-bindningsdomän som erhållits från Epac, inklämd mellan turkos (donator) och Venus (acceptor) fluorforer. Vid basala förhållanden (obundna) är turkos och Venus i en orientering så att FRET uppstår mellan fluorforerna. Vid bindning av cAMP till bindningsdomänen sker en konformationsförändring så att turkos och Venus rör sig isär vilket resulterar i en minskning av FRET.
FRET-baserade bildmetoder erbjuder ett lovande verktyg för att undersöka och visualisera cAMP-signaler i en cell. Nuvarande FRET-baserade mikroskopiska bildframställning tekniker är dock ofta bara delvis framgångsrika för att uppnå tillräcklig signal styrka för att mäta FRET med subcellulära rumsliga klarhet. Detta beror på flera faktorer, inklusive den begränsade signalstyrkan hos många FRET-reportrar, den höga precisionsnivå som krävs för att exakt kvantifiera förändringar i FRET-effektivitet och närvaron av förvirrande faktorer, såsom cellulär autofluorescens23,24. Resultatet är ofta en FRET-bild som plågas av svag SNR, vilket gör visualisering av subcellulära förändringar i FRET mycket svårt. Dessutom har undersökning av rumsligt lokaliserade cAMP-signaler nästan uteslutande utförts i endast två rumsliga dimensioner och den axiella cAMP-fördelningen har sällan ansettsvara 25. Detta beror sannolikt på att låg SNR hindrade förmågan att mäta och visualisera cAMP-gradienter i tre rumsliga dimensioner. För att övervinna begränsningarna med att använda FRET-sensorer med låg SNR har vi implementerat hyperspektrala avbildnings- och analysmetoder för att mäta FRET i enstakaceller 25,26,27.
Hyperspektrala avbildningsmetoder utvecklades av NASA för att skilja markbundna objekt som finns i satellitbilder28,29. Dessa tekniker har sedan dess översatts till fluorescensmikroskopifältet30, med flera kommersiella konfokala mikroskopsystem som erbjuder spektraldetektorer. I traditionell (icke-spektral) fluorescensavbildning är provet upphetsad med hjälp av ett bandpassfilter eller en laserlinje, och utsläppet samlas in med hjälp av ett andra bandpassfilter, ofta valt för att matcha fluorforens topputsläppsvåglängd. Däremot försöker hyperspektrala avbildningsmetoder att prova en komplett spektralprofil av antingen fluorescensutsläppet26,31,32 eller excitation33,34 med specifika våglängdsintervall. I våra tidigare studier visade vi att hyperspektral avbildning och analysmetoder kan erbjuda förbättrad kvantifiering av FRET-signaler i celler jämfört med traditionella filterbaserade FRET-bildtekniker26. Här presenterar vi en metodik för att utföra 4-dimensionella (x, y, z och λ) hyperspektrala FRET-avbildning och analys för att mäta och visualisera cAMP-fördelningar i tre rumsliga dimensioner. Dessa metoder har tillåtit visualisering av agonist-inducerad cAMP rumsliga gradienter i enstaka celler25. Intressant, beroende på agonisten, cAMP gradienter kan vara uppenbart i celler. Den metod som presenteras här använder spektral unmixing av icke-enhetlig bakgrund och cellulära autofluorescens för att förbättra noggrannheten i FRET mätningar. Medan denna metod visas i pulmonell microvascular endotelceller (PMVECs) med hjälp av en cAMP FRET biosensor, metoden kan lätt ändras för användning med alternativa FRET reportrar eller alternativa cellinjer.
Utvecklingen av FRET-biosensorer har gjort det möjligt att mäta och visualisera cykliska nukleotidsignaler i enstaka celler, och det finns ett stort löfte om att visualisera subcellulära signalhändelser13,22,37,38. Användningen av FRET-biosensorer innebär dock flera begränsningar, inklusive de låga signal-till-brus-egenskaperna hos många fluorescerande proteinbaserade FRET-reportrar o…
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill erkänna Dr. Kees Jalink (Nederländerna Cancer Institute och van Leeuwenhoek Center for Advanced Microscopy, Amsterdam, Nederländerna) för att ge oss H188 cAMP FRET biosensor och Kenny Trinh (College of Engineering, University of South Alabama) för teknisk hjälp för att minska den tid det tar att köra våra specialutvecklade programmeringsskript.
Författarna vill erkänna finansieringskällorna: American Heart Association (16PRE27130004), National Science Foundation; (1725937) NIH, S100D020149, S10RR027535, R01HL058506, P01HL066299).
Attofluor Cell Chamber | Invitrogen | A7816 | Attofluor contains steel cell chambers and a rubber O-ring. Cell chamber holds the coverslip and O-ring provides a lock in mechanism to hold the buffer in cell chamber with out leakage |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | Solvent used to prepare stock solution forskolin. |
DRAQ5 Fluoroscent Probe Solution | Thermo Scientific | 62252 | Nuclear label |
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | Contains nutrients and growth factors for the cells to grow and divide in the culture dishes. |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F6178 | Growth factor suppliment that is added to culture medium, DMEM |
Forskolin | Sigma | F3917 | Adenyly cyclase activator. |
H188 Cyclic AMP FRET biosensor | Netherland Cancer Institute, Dr. K. Jalink | Gift | Plasmid encoding Turquoise (donor fluorophore), Venus (acceptor fluorophore), and binding domain obtained from Epac. |
Image J | image.net | Free download | Another image processing platform used to extact spectral information and image processing. |
Integrating Sphere | Ocean Optics | FOIS-1 | Used to measure illumination intensity of the laser line at different laser intensities (?). |
Laminin Mouse Protein, Natural | Invitrogen | 23017-015 | Coverslips are coated with laminin and this helps in cell attachment, growth and motility of the cell. |
Lipofectamine 3000 Transfection Kit | Invitrogen | L3000-015 | Transfection reagent used to transfect cells with H188 FRET biosensor |
MATLAB | Mathworks | R2019a | Image processing operations (linear unmixing and FRET efficiency calculations) are performed by writing custom programs in MATLAB programming environment |
Nikon A1R confocal microscope | Nikon Instruments | Nikon A1R | Spectral image acquisition is performed using confocal microscope. |
Nikon Elements Software | Nikon Instruments | Software dongle | used to export and handle nd2 image files (multidimensional image files) that are aquired using Nikon A1R |
NIST-Traceable Calibration Lamp | Ocean Optics | LS-1-CAL-INT | A lamp with a known spectrum for use as a standard |
PBS pH 7.4 (1X) | Gibco | 10010-023 | coomonly used buffer suring cell culture |
Pulmonary Microvascular Endothelial Cells (PMVECs) | In house – Cell culture core, Univeristy of South Alabama | Isolated from Rat pulmonary microvasculature | PMVECs form inner lining of a blood vessel. |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco | 15140-122 | antibiotics are added to culture medum to prevent contamination of the cells. |
Pre-Cleaned Gold Seal Micro Slides | Clay Adams | 3010 | Microscope slides used for cell fixation |
ProLong Diamond Antifade Mounting Media | Invitrogen | P36961 | If samples are fixed using antifade mountant, then the later protects fluoroscent dyes and chromophores from fading. |
Spectrometer | Ocean Optics | QE65000 | Used to measure spectral response of the light source (?) |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 | Digests the protein-protein bond between the cell and cell matrix and helps to disscociate and lift the cells during cell plating. |
Tyrodes Buffer | Made in-house | Made in-house | Tyrodes buffer is used to make working solutions and to maintain cells in aqueous solution during image acquisition. |
6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3506 | Laminin coated coverslips are placed in 6-well culture dish (one coverlisps/well). Cells along with medium is added into each well. |
25 mm Round Microscope Cover Slips | Fisher Scientific | 12545102 | Cells were grown on round glass coverslips |
60X Ojective | Nikon Instruments | Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 | water immersion and commonly used objective for cells |