Biology

Medición de distribuciones de cAMP tridimensionales en células vivas utilizando imágenes y análisis FRET hiperespectrales de 4 dimensiones (x, y, z y λ)

Published: October 27, 2020 doi: 10.3791/61720

Naga S. Annamdevula^1,2, Rachel Sweat³, Hayden Gunn¹, John R. Griswold³, Andrea L. Britain^1,2, Thomas C. Rich^1,2, Silas J. Leavesley^1,2,3

¹Department of Pharmacology, University of South Alabama, ²Center for Lung Biology, University of South Alabama, ³Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of South Alabama

Summary

Debido a la baja relación señal-ruido (SNR) inherente de los sensores basados en transferencia de energía de resonancia Fӧrster (FRET), la medición de señales cAMP ha sido un desafío, especialmente en tres dimensiones espaciales. Aquí, describimos una metodología de imagen y análisis FRET hiperespectral que permite la medición de la distribución de cAMP en tres dimensiones espaciales.

Abstract

El AMP cíclico es un segundo mensajero que está involucrado en una amplia gama de actividades celulares y fisiológicas. Varios estudios sugieren que las señales cAMP están compartimentadas, y que la compartimentación contribuye a la especificidad de la señalización dentro de la vía de señalización cAMP. El desarrollo de biosensores basados en la transferencia de energía de resonancia de Fӧrster (FRET) ha potenciado la capacidad de medir y visualizar señales cAMP en las células. Sin embargo, estas mediciones a menudo se limitan a dos dimensiones espaciales, lo que puede dar lugar a una mala interpretación de los datos. Hasta la fecha, solo ha habido mediciones muy limitadas de señales cAMP en tres dimensiones espaciales (x, y y z), debido a las limitaciones técnicas en el uso de sensores FRET que inherentemente exhiben una baja relación señal-ruido (SNR). Además, los enfoques tradicionales de imágenes basadas en filtros a menudo son ineficaces para la medición precisa de señales cAMP en regiones subcelulares localizadas debido a una variedad de factores, incluida la diafonía espectral, la intensidad de señal limitada y la autofluorescencia. Para superar estas limitaciones y permitir que los biosensores basados en FRET se utilicen con múltiples fluoróforos, hemos desarrollado enfoques hiperespectrales de imágenes y análisis de FRET que proporcionan especificidad espectral para calcular las eficiencias de FRET y la capacidad de separar espectralmente las señales FRET de la autofluorescencia de confusión y / o señales de etiquetas fluorescentes adicionales. Aquí, presentamos la metodología para implementar imágenes FRET hiperespectrales, así como la necesidad de construir una biblioteca espectral apropiada que no esté ni submuestreada ni sobremuestreada para realizar la desmezcla espectral. Si bien presentamos esta metodología para la medición de distribuciones tridimensionales de cAMP en células endoteliales microvasculares pulmonares (PMVEC), esta metodología podría usarse para estudiar distribuciones espaciales de cAMP en una variedad de tipos de células.

Introduction

El monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) es un segundo mensajero involucrado en procesos celulares y fisiológicos clave, incluida la división celular, la afluencia de calcio, la transcripción de genes y la transducción de señales. Un creciente cuerpo de evidencia sugiere la existencia de compartimentos cAMP en la célula a través de los cuales se logra la especificidad de señalización^1,^2,^3,^4,^5,^6,^7. Hasta hace poco, la compartimentación de cAMP se infería en función de distintos efectos fisiológicos o celulares inducidos por diferentes agonistas del receptor acoplado g⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹. Más recientemente, las sondas de imágenes de fluorescencia basadas en FRET han proporcionado nuevos enfoques para la medición directa y la observación de señales cAMP en una celda^12,^13,¹⁴.

La transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) es un fenómeno físico en el que la transferencia de energía se produce entre las moléculas donantes y aceptoras de una manera no radiativa cuando las moléculas están muy cerca¹⁵^,¹⁶. Con el desarrollo de indicadores fluorescentes basados en FRET, este fenómeno físico se ha utilizado en aplicaciones biológicas para estudiar las interacciones proteína-proteína^17,la colocalización^{de proteínas 18,}la señalización de^Ca+2 ^19,la expresión^{génica 20,}la división celular²¹ y la señalización de nucleótidos cíclicos. Los indicadores de cAMP basados en FRET generalmente consisten en un dominio de unión a cAMP, un fluoróforo de donante y un fluoróforo^{aceptor 22}. Por ejemplo, el sensor H188 cAMP^12,²² utilizado en esta metodología consiste en un dominio de unión cAMP obtenido de Epac, intercalado entre fluoróforos Turquesa (donante) y Venus (aceptor). En condiciones basales (sin consolidar), Turquesa y Venus están en una orientación tal que fret ocurre entre los fluoróforos. Al unirse el cAMP al dominio de unión, se produce un cambio conformacional tal que Turquesa y Venus se separan, lo que resulta en una disminución de FRET.

Los enfoques de imágenes basados en FRET ofrecen una herramienta prometedora para investigar y visualizar señales de cAMP dentro de una célula. Sin embargo, las técnicas actuales de imágenes microscópicas basadas en FRET a menudo solo tienen un éxito parcial en el logro de la intensidad de señal suficiente para medir FRET con claridad espacial subcelular. Esto se debe a varios factores, incluida la intensidad de señal limitada de muchos reporteros FRET, el alto nivel de precisión requerido para cuantificar con precisión los cambios en la eficiencia fret y la presencia de factores de confusión, como la autofluorescencia celular²³^,²⁴. El resultado es a menudo una imagen FRET que está plagada de SNR débil, lo que hace que la visualización de los cambios subcelulares en FRET sea muy difícil. Además, la investigación de señales cAMP localizadas espacialmente se ha realizado casi exclusivamente en solo dos dimensiones espaciales y la distribución axial cAMP rara vez se ha considerado²⁵. Esto es probable porque el SNR bajo impidió la capacidad de medir y visualizar gradientes cAMP en tres dimensiones espaciales. Para superar las limitaciones del uso de sensores FRET con SNR bajo, hemos implementado enfoques de imágenes y análisis hiperespectrales para medir FRET en células individuales^25,^26,²⁷.

Los enfoques de imágenes hiperespectrales fueron desarrollados por la NASA para diferenciar los objetos terrestres presentes en las imágenes^satelitales²⁸,²⁹. Desde entonces, estas técnicas se han traducido al campo de la microscopía de fluorescencia^30,con varios sistemas comerciales de microscopio confocal que ofrecen detectores espectrales. En las imágenes de fluorescencia tradicionales (no espectrales), la muestra se excita utilizando un filtro de paso de banda o una línea láser, y la emisión se recoge utilizando un segundo filtro de paso de banda, a menudo seleccionado para que coincida con la longitud de onda de emisión máxima del fluoróforo (s). Por el contrario, los enfoques de imágenes hiperespectrales buscan muestrear un perfil espectral completo de la emisión de fluorescencia^26,^31,³² o la excitación^33,³⁴ a intervalos de longitud de onda específicos. En nuestros estudios previos, demostramos que los enfoques de imágenes y análisis hiperespectrales pueden ofrecer una mejor cuantificación de las señales FRET en las células en comparación con las técnicas tradicionales de imágenes FRET basadas en filtros²⁶. Aquí, presentamos una metodología para realizar imágenes y análisis FRET hiperespectrales de 4 dimensiones (x, y, z y λ) para medir y visualizar distribuciones de cAMP en tres dimensiones espaciales. Estos enfoques han permitido la visualización de gradientes espaciales cAMP inducidos por agonistas en celdas individuales²⁵. Curiosamente, dependiendo del agonista, los gradientes de cAMP pueden ser evidentes en las células. La metodología presentada aquí utiliza la desmezcla espectral de fondo no uniforme y autofluorescencia celular para mejorar la precisión de las mediciones FRET. Si bien esta metodología se demuestra en células endoteliales microvasculares pulmonares (PMVEC) utilizando un biosensor cAMP FRET, la metodología podría modificarse fácilmente para su uso con reporteros FRET alternativos o líneas celulares alternativas.

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Protocol

Este protocolo sigue los procedimientos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad del Sur de Alabama.

1. Preparación de células, muestras y reactivos para imágenes

Aislar las células endoteliales microvasculares pulmonares de rata (PMVEC) como se describió anteriormente³⁵.
NOTA: Las células fueron aisladas y cultivadas por el Cell Culture Core de la Universidad del Sur de Alabama, Mobile, AL en platos de cultivo celular de 100 mm.
Sepepe PMVEC aislados en cubiertas de vidrio redondas de 25 mm y déjelos crecer en la incubadora a 37 ° C hasta que las células alcancen al menos el 80% de confluencia (al menos 24 horas).
NOTA: Las células y el tipo de célula pueden variar de un estudio a otro y, por lo tanto, se deben seguir procedimientos de cultivo celular específicos de la célula para sembrar y cultivar células. El protocolo de siembra y cultivo celular utilizado en estos estudios está disponible como información complementaria en el archivo denominado "Cultivo y Transfección de File_Cell Suplementario".
Transfecta PMVECs con un biosensor FRET e incuba durante 48 horas a 37 °C.
NOTA: El protocolo para transfectar PMVEC también se describe en el archivo de información suplementaria denominado "Cultivo y transfección de File_Cell suplementarios".
El día de la imagen, caliente el tampón de Tyrode a 37 ° C en un baño de agua.
NOTA: El búfer de Tyrode consta de 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 10 mM HEPES, 10 mM glucosa, 1 mM MgCl₂ y 1 mM CaCl₂
Monte una cubierta que contenga celdas transfectadas en una cámara de celda y asegure la parte superior con una junta de montaje para evitar fugas.
Limpie la parte inferior de la funda con una delicada limpieza de tareas para limpiar cualquier exceso de medios o células adherentes.
Agregue 800 μL de tampón de trabajo y 4 μL de etiqueta nuclear de 5 mM a la cámara celular y meca suavemente durante 5 a 10 segundos.
NOTA: Al agregar soluciones tampón o reactivos a los cocoláculos montados en la cámara celular, asegúrese de agregar la solución suavemente y al costado de la cámara celular para no desalojar las células adherentes. La adición de 4 μL de etiqueta nuclear de 5 mM a 800 μL de tampón hace que la concentración final de 25 μM de la etiqueta nuclear. Para células poco adherentes, como las células HEK293, mezcle primero la etiqueta nuclear y el tampón en un vial y luego agréguelos a los cofundidos montados en la cámara celular. Esto evitará levantar las células de la cubierta.
Cubra la cámara de la celda con papel de aluminio para proteger de la luz e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Preparación del reactivo: Añadir 1 μL de forskolina de 50 mM a 199 μL de tampón. Esto producirá una concentración final de forskolina de 50 μM cuando se agrega a las células que se prepararon con 800 μL de tampón. También debe prepararse 1 μL de DMSO en 199 μL de tampón para ser utilizado como control del vehículo.
NOTA: En estos estudios, la forskolina se utiliza como un activador de la adenicilo ciclasa para estimular la producción de cAMP. Si se desea, esta metodología puede modificarse fácilmente para permitir el tratamiento con reactivos alternativos para estimular o inhibir la adenicilo ciclasa, fosfodiesterasas, etc.

2. Adquisición de imágenes

Utilice un microscopio confocal equipado con un detector espectral.
NOTA: Todos los pasos de adquisición de imágenes descritos aquí se desarrollaron utilizando un sistema de microscopio Nikon A1R disponible comercialmente. Es posible que sea necesario ajustar estos pasos si se utiliza un microscopio espectral alternativo. Asegúrese de que todo el equipo esté encendido al menos 30 minutos antes del inicio del experimento para alcanzar condiciones de funcionamiento estables.
Seleccione el objetivo de inmersión en agua 60x y agregue una gota de agua al objetivo.
NOTA: Para imágenes de células vivas de alta resolución, se recomienda utilizar un objetivo de apertura numérica alta. Consulte la Lista de materiales para obtener información sobre el objetivo utilizado en estos estudios.
Coloque la cámara celular cargada (a partir del paso 1.7) en la etapa del microscopio.
Seleccione el conjunto de filtros DFT (DAPI/FITC/TRITC) ajustando la perilla del filtro en el lado derecho del microscopio.
Opere el microscopio en modo de campo ancho de fluorescencia utilizando los oculares para seleccionar un campo de visión que contenga células que expresen el sensor cAMP FRET.
NOTA: Asegúrese de que la intensidad media de la señal FRET en la longitud de onda máxima de emisión del donante o aceptor en la celda seleccionada sea de al menos 100 unidades de intensidad (U.A.) o al menos 4 veces la señal de referencia de una región sin células expresas. Esto se puede confirmar utilizando el visor de perfiles de espectro disponible en el software NIS Elements. Cuando se busca una célula con buena señal, es recomendable descartar células excesivamente brillantes (pueden estar comprometidas).
Abra el software NIS, cambie al modo confocal, desbloquee el botón de enclavamiento láser y haga clic en Live.
Utilice la perilla de enfoque para centrarse en las celdas mirando la vista previa en la pantalla.
Configure los ajustes del dispositivo, la adquisición y la pila z en el software, como se describe a continuación.
Configuración de adquisición:
NOTA: La configuración de adquisición de la cámara y el dispositivo se puede aplicar utilizando una imagen adquirida previamente. Abra la imagen, haga clic con el botón derecho y seleccione Reutilizar configuración de cámara.
1. Abra el menú de configuración A1, marque las casillas correspondientes a las líneas láser de 405 nm y 561 nm, seleccione SD para el detector espectral, seleccione 10 para la resolución y 31 para los canales.
  NOTA: El menú de configuración de A1 se muestra como un pequeño icono de engranaje en la esquina superior izquierda de la ventana configuración de A1 Plus. El láser de 405 nm se utiliza para la excitación del donante y el láser de 561 nm se utiliza para la excitación de la etiqueta nuclear.
2. Establezca el rango de longitud de onda (410 – 730 nm) seleccionando los valores de longitud de onda inicial y final.
3. Haga clic en el icono de binning/skip en el menú de configuración de A1 y seleccione el cuadro numerado 15 y, a continuación, haga clic en Aceptar en el menú de configuración de A1.
  NOTA: Esto es para eliminar el canal de longitud de onda que corresponde al láser de excitación de 561 nm (este es típicamente el canal de longitud^de onda 15). Es importante no utilizar esta banda de longitud de onda para evitar una señal artificialmente baja, que puede crear un artefacto espectral. La señal es más baja en esta banda debido al dedo mecánico que cubre el elemento detector para protegerlo del daño del láser.
4. Establezca las intensidades del láser en 8% y 2% para los láseres de 405 nm y 561 nm, respectivamente, Si Hv (ganancia del detector) en 149 y un radio estenopeico de 2,4 unidades de disco aireado (AU).
  NOTA: Es posible que las intensidades del láser deban ajustarse según la edad del instrumento y la condición de los láseres. Si se ajustan las intensidades del láser entre diferentes muestras o grupos experimentales, es importante mantener la misma proporción de intensidades del láser (por ejemplo, 8:2). Además, es importante seleccionar una intensidad de láser que no sea tan brillante como para crear un fotobleaching rápido. La ganancia del detector debe ajustarse para maximizar la intensidad de la señal y minimizar el ruido del detector. Para estos estudios, se utilizó una ganancia de 149. Se seleccionó un tamaño estenopeico de 2,4 UA como equilibrio entre la adquisición de imágenes con suficiente relación señal/ruido (SNR) y el mantenimiento de la sección óptica (confocalidad). Un aumento en el tamaño del agujero de alfiler aumenta el SNR pero disminuye la confocalidad.
5. Establezca la velocidad de escaneo en 0,25 fotogramas espectrales por segundo, seleccione el icono correspondiente a unidireccional para la dirección de escaneo, introduzca 4 para el recuento y establezca 1024 x 1024 para el tamaño de escaneo.
  NOTA: Las señales FRET son débiles y, a menudo, se requiere una velocidad de escaneo lenta. Utilizando una velocidad de escaneo de 0.25, la adquisición de una pila z espectral se completa en ~ 3 minutos. La velocidad de escaneo se puede aumentar o disminuir dependiendo de los fluoróforos utilizados. Por ejemplo, para fluoróforos más brillantes como eGFP, se puede utilizar una velocidad de escaneo más rápida (2 fotogramas / segundo). El número ingresado bajo conteo corresponde a un valor promedio de fotograma de 4, lo que ayuda en la reducción de ruido durante la adquisición de imágenes. Para muestras muy estables y donde el tiempo no es una restricción, se pueden utilizar valores de promedio más altos (hasta 16) para obtener imágenes con SNR mejorado.
Defina los parámetros de adquisición de z-stack:
NOTA: Es posible que sea necesario ajustar los valores introducidos en los pasos 2.10 para adaptarse a los cambios en la unión o concentración de etiquetas fluorescentes, el tipo de etiqueta, el número de etiquetas utilizadas, la línea celular y otros cambios en la preparación de la muestra que pueden afectar la densidad del etiquetado celular y / o la autofluorescencia celular. Al ajustar los parámetros de adquisición, se debe tener cuidado para lograr un SNR suficiente al tiempo que se minimiza el fotobleaching. Además, al configurar un ensayo FRET espectral, se debe tener cuidado de garantizar que los parámetros funcionen bien en todos los grupos de tratamiento. Es aconsejable realizar un ensayo de cada grupo de tratamiento con la configuración de parámetros propuesta para garantizar que el SNR sea suficiente y que se minimice el fotobleaching.
1. Abra la ventana de adquisición de ND haciendo clic en ver → control de adquisición → adquisición de ND.
2. Introduzca la ruta/destino y un nombre de archivo para guardar el archivo ND en la ventana emergente.
3. Marque la casilla correspondiente a la serie z.
4. Haga clic en live en la ventana Configuración de A1 Plus. Esto abrirá una ventana de visualización en vivo.
5. Ajuste la perilla de enfoque en el microscopio para seleccionar la parte superior de la celda y haga clic en Arriba en la ventana de adquisición de ND para establecer la posición actual como la parte superior.
  NOTA: Se sugiere enfocar ligeramente por encima de la parte superior de la celda para asegurarse de que toda la celda se muestree en la serie z.
6. Ajuste la perilla de enfoque en el microscopio para seleccionar la parte inferior de la celda y haga clic en Inferior en la ventana de adquisición de ND para establecer la posición actual como la parte inferior.
  NOTA: Enfoque ligeramente por debajo de la parte inferior de la celda para asegurarse de que se muestrea toda la celda.
7. Introduzca 1 μm para el tamaño del paso, seleccione la parte superior inferior para la dirección z-scan y haga clic en ejecutar en la ventana Adquisición ND para adquirir una pila z.
  NOTA: El tamaño del paso determina el número de cortes z que se adquirirán dependiendo de las ubicaciones superiores e inferiores (es decir, la distancia recorrida). Se seleccionó un tamaño de paso de 1 μm como compromiso entre la velocidad de imagen, el muestreo del eje Z y el fotobleaching. El uso del diámetro de agujero de alfiler confocal de 2,4 UA y el objetivo de inmersión en agua 60x dio como resultado un espesor de sección óptica de 1,73 μm. Por lo tanto, un tamaño de paso de 1 μm está ligeramente por debajo de los criterios de muestreo de Nyquist, pero este es un compromiso que se hizo para reducir el tiempo necesario para adquirir una pila z. Para muestras muy estables, para las cuales la velocidad no es crítica, se puede usar un paso de eje Z más pequeño y posiblemente un diámetro de agujero de alfiler confocal más pequeño para aumentar la resolución del eje z. La parte inferior superior debe producir resultados similares y se puede usar para evaluar cualquier efecto del fotobleaching que pueda ocurrir durante el escaneo z.
Configure el sistema de enfoque perfecto (PFS) si está disponible:
NOTA: PFS permite que el sistema compense las fluctuaciones en la profundidad focal durante la adquisición de imágenes. Los siguientes pasos se pueden utilizar para configurar PFS, y estos pasos pueden variar ligeramente dependiendo de la versión de la Nikon A1R y la versión de NIS Elements utilizada.
1. Resalte el modo simétrico definido por el icono de rango en la ventana de adquisición de ND.
2. Encienda el botón PFS en la cara frontal del microscopio (asegúrese de que la perilla del espejo dicroico ubicada en la sección debajo de la etapa de muestra esté "en").
3. Redefina la parte superior (gire en sentido contrario a las agujas del reloj) y la parte inferior (gire en el sentido de las agujas del reloj) utilizando la perilla en la cara frontal del controlador de desplazamiento PFS.
4. Defina una posición z relativa/profundidad z haciendo clic en 'relativo' en la ventana de adquisición de ND.
5. Haga clic en la memoria en la cara frontal del microscopio para que el software memoriza la profundidad z relativa.
Una vez completada la adquisición de la pila z, agregue suavemente el reactivo deseado (forskolina o control del vehículo) con una pipeta y espere 10 minutos.
NOTA: Agregue el reactivo muy suavemente para no perturbar las células o mover la posición de la cámara celular dentro de la etapa XY del microscopio; es útil verificar en una vista en vivo o imagen posterior que el campo de visión no se ha desplazado durante la adición del reactivo. El tiempo de espera de 10 minutos es para que el tratamiento con forskolina surta efecto. Si se utiliza un tratamiento alternativo, es posible que sea necesario ajustar el tiempo de espera.
Después de 10 minutos, cambie el nombre del archivo y haga clic en ejecutar en la ventana de adquisición de ND.
Repita los pasos 2.11 – 2.13 como se describió anteriormente para al menos 5 cubiertas a fin de lograr resultados suficientes para el análisis estadístico (n = 5 para cada grupo de tratamiento – forskolina y control del vehículo).
Prepare muestras y muestras en blanco para construir la biblioteca espectral y adquirir imágenes espectrales utilizando configuraciones de adquisición similares a las descritas en los pasos 2.9 y 2.10.

3. Análisis de imágenes

NOTA: Estas imágenes se utilizarán para construir una biblioteca espectral que contenga los espectros puros de todos los miembros finales individuales presentes en el estudio. Los miembros finales de la biblioteca espectral pueden variar de un estudio a otro si se utilizan diferentes fluoróforos. Un procedimiento detallado para construir la biblioteca espectral se proporciona en un archivo de información suplementaria llamado "Biblioteca de File_Spectral suplementaria". Aquí, describimos la exportación de datos a archivos .tiff, la desmezcla espectral lineal, las mediciones de eficiencia FRET, la reconstrucción tridimensional y la estimación de niveles de cAMP. El análisis de imágenes se puede realizar utilizando diferentes plataformas de análisis y programación de imágenes como ImageJ, Python, MATLAB o CellProfiler. En estos estudios, se utilizaron scripts de MATLAB.

Exportar datos de imagen:
1. Cree nuevas carpetas con el mismo nombre de archivo correspondiente a las imágenes espectrales z-stack adquiridas en los pasos 2.13 y 2.14.
  NOTA: Los siguientes pasos descritos para exportar datos son específicos para NIS Elements AR versión 4.30.01. Estos pasos pueden variar ligeramente dependiendo de la versión del software.
2. Haga clic en Archivo, que abrirá una ventana de archivo. Busque y seleccione el archivo de imagen espectral adquirido en el paso 2.12 y haga clic en Abrir.
3. Una vez que se cargue el archivo, haga clic en Archivo→ Importar/Exportar→ exportar documento ND.
4. En la ventana emergente: busque y seleccione la carpeta creada en el paso 3.1.1, seleccione Formato de imagen etiquetado (TIF) para Tipo de archivo, luego seleccione Imagen mono para cada canal y Mantener profundidad de bits.
  NOTA: El prefijo Archivo se generará previamente; cambie este valor por conveniencia. El orden del índice cambiará en función de los canales seleccionados y debe mostrar "z, c" para la indexación de acuerdo con la ubicación del segmento z primero y el número de banda de longitud de onda en segundo lugar. Asegúrese de que los cuadros correspondientes a Aplicar LUT o Insertar superposiciones o Usar nombres de punto no estén seleccionados.
5. Haga clic en Exportar para exportar los archivos tiff a una carpeta de destino como archivos tiff individuales.
6. Repita los pasos 3.1.2 – 3.1.5 para exportar archivos de imagen espectral adquiridos en el paso 2.13.
Desmezcla espectral lineal:
1. Abra el software de programación.
  NOTA: El script de programación desarrollado a medida para desmezclar imágenes espectrales en bruto se proporciona en el sitio web de BioImaging y BioSystems de la Universidad del Sur de Alabama, en la pestaña Recursos (https://www.southalabama.edu/centers/bioimaging/resources.html).
2. Abra el archivo etiquetado como "Desmezcla lineal.m" y haga clic en el botón Ejecutar en la barra de herramientas del editor.
3. Busque y seleccione la carpeta que contiene la secuencia de archivos *.tif exportada generada por el software NIS Elements.
4. Haga clic en Aceptar para continuar, que abrirá una nueva ventana llamada Longitud de onda y Z-Slice.
5. Copie el nombre de archivo del primer archivo (sin z-slice y número de canal) en la carpeta seleccionada en el paso 3.2.4 y péguelo en el primer paso del cuadro de diálogo con la etiqueta "Introduzca el nombre de la imagen".
6. Ingrese el número de canales en el segundo paso etiquetado como "Ingrese el número de bandas de longitud de onda", el número de cortes z en el tercer paso etiquetado como "Ingrese el número de cortes Z" y haga clic en Aceptar.
  NOTA: El número de bandas de longitudes de onda puede cambiar si se realizan cambios en la configuración de adquisición, como ajustar el rango de longitud de onda o el tamaño del paso de longitud de onda. El número de cortes Z también puede cambiar dependiendo de la altura de la celda.
7. Busque y seleccione el archivo de longitud de onda llamado "Wavelength.mat" en la ventana emergente etiquetada "Seleccione el archivo de información de longitud de onda" y haga clic en abrir.
8. Busque y seleccione el archivo "Library.mat" en la nueva ventana emergente etiquetada "Seleccionar el archivo de biblioteca espectral", haga clic en abrir y espere hasta que finalice la desmezcla de los segmentos.
  NOTA: El archivo Library.mat es un archivo que contiene espectros puros para cada fluoróforo de miembro final junto con autofluorescencia celular y firmas espectrales de fondo. En este caso, los fluoróforos de los miembros finales incluyen Turquesa, Venus y DRAQ5. Las firmas espectrales de fondo incluyen autofluorescencia celular o matricial, fluorescencia de recubre y difracción de la cubierta. El archivo Wavelength.mat es un archivo que contiene información del canal de longitud de onda utilizada para adquirir la imagen espectral. Un archivo de biblioteca de ejemplo y un archivo de longitud de onda están disponibles en el sitio web de Bioimaging and Biosystems (consulte la nota en 3.2.1). Para obtener más información sobre cómo generar archivos de biblioteca espectral y longitud de onda, consulte el archivo de información suplementaria denominado "Biblioteca de File_Spectral suplementaria". Las imágenes no mezcladas correspondientes a cada z-slice se guardarán en la carpeta llamada "Unmixed" creada durante el proceso de desmezcla dentro de la carpeta que se seleccionó en el paso 3.2.3.
Cálculo de la eficiencia de FRET:
1. Abra el script de programación llamado "multiFRRCF.m" y haga clic en ejecutar.
  NOTA: Este archivo de programación está disponible en el sitio web de Bioimaging and Biosystems de la Universidad del Sur de Alabama (consulte la nota en el paso 3.2.1).
2. Introduzca el número de ensayos experimentales que desea analizar en el cuadro de diálogo emergente denominado "cuántas carpetas desea volver a utilizar" y haga clic en Aceptar.
  NOTA: Los datos de imagen de cada experimento deben guardarse en una carpeta de imágenes sin mezclar separada. Este paso simplemente permite que el código de análisis se repita en muchas carpetas como un paso que ahorra tiempo.
3. Busque y seleccione las carpetas sin mezclar y haga clic en Aceptar.
  NOTA: El número de veces que se abre la ventana emergente "Buscar carpeta" depende del número especificado en el cuadro de diálogo "Cuántas carpetas se van a cambiar" en el paso anterior. Busque y seleccione las carpetas una tras otra.
4. En la nueva ventana emergente, ingrese la siguiente información en los cuadros respectivos: el factor de escala es 12.4, el umbral es 5.6, la frecuencia X, Y y Z son 5, 5 y 1 respectivamente, y el algoritmo de suavizado es gaussiano.
  NOTA: El factor de escala es un valor en píxeles/μm y se utilizará para escalar el muestreo de dirección Z al de la dirección XY. El factor de escala se obtiene del tamaño del píxel de la imagen, que generalmente se proporciona como metadatos en la imagen para la mayoría de los sistemas de microscopio confocal. Por ejemplo, si la imagen se adquiere con un espaciado de 0,08 μm/píxeles, el factor de escala debe ser de 12,5 píxeles/μm. El valor de umbral se utilizará para establecer el umbral de las imágenes y generar una máscara binaria de la celda. Creamos una lista de valores óptimos basados en la intensidad de la imagen donante+aceptor. Utilice 4,5 como valor de umbral si la imagen tiene una intensidad brillante donante+aceptor y un fondo bajo, un valor entre 5,6 y 6,5 para las imágenes que solo tienen una intensidad moderada donante+aceptor y/o un fondo más alto, y un valor de 7,5 y superior para las imágenes que tienen una intensidad donante+aceptor inferior al fondo. El valor de frecuencia corresponde al intervalo, en número de píxeles, en el que se realiza el corte en los pasos siguientes. Por ejemplo, si la profundidad Z de la celda es de 17 μm con un tamaño de paso de 1 μm y se utiliza un factor de escala de 12,5 píxeles/μm en la dirección XY, entonces la profundidad del conjunto de datos de imagen en 3 dimensiones se volverá a muestrear a 212 píxeles (dirección Z). Según el valor de frecuencia Z introducido (por ejemplo, 1 píxel), el conjunto de datos de imagen en 3 dimensiones se volverá a dividir comenzando en la parte superior del conjunto de datos de imagen y luego moviéndose en incrementos de 1 píxel hacia abajo. Esto da como resultado 212 imágenes recortadas. Si se ingresara un intervalo de valor de frecuencia mayor para la frecuencia Z, se generarían menos imágenes recortadas. Las imágenes redimensionadas se guardan en pasos posteriores.
5. Haga clic en ejecutar y espere hasta que se realicen todas las mediciones fret y el reslicing.
  Nota : se crea una carpeta independiente dentro del directorio primario en la que se guardan las imágenes de eficiencia FRET en escala de grises redimensionadas y las imágenes de eficiencia FRET coloreadas (un mapa de color aplicado). Por ejemplo, todas las imágenes FRET en escala de grises y mapa de colores redimensionadas en la dirección X (plano YZ) se guardan en una carpeta llamada "Resliced_XFRET".
6. Repita el análisis con configuraciones similares para todos los experimentos: antes y después de los tratamientos con forskolina y los controles del vehículo.
  NOTA: Los pasos mencionados en la sección 3.3 describen los valores que se deben introducir para el script de programación de análisis FRET personalizado para generar datos de imagen FRET en 3 dimensiones. Sin embargo, este script ejecuta varias operaciones mientras se ejecuta, que incluyen: cargar datos de imagen, crear pilas de imágenes, suavizar, cálculos de eficiencia FRET, crear y aplicar una máscara de borde de celda, reconstrucción de imagen en 3 dimensiones, reslicing de imágenes tridimensionales a intervalos especificados (frecuencias), aplicación de un mapa de colores para visualizar los cambios fret y guardar los datos de imagen redimensionados en el mismo directorio. Se han incluido detalles adicionales como comentarios en el script del programa.

4. Mapeo de la eficiencia fret a los niveles de cAMP

Abra el archivo de programación llamado 'Mapping_FRET Efficiency_to_cAMP_concentration.m' y haga clic en ejecutar en la ventana principal.
NOTA: El archivo está disponible en el sitio web de BioImaging y BioSystems (consulte la nota en 3.2.1). Este archivo lee imágenes de eficiencia FRET en escala de grises y las convierte a niveles cAMP basados en una curva característica. Esta curva característica utiliza una relación cAMP-a-FRET documentada en la literatura¹⁵^,³⁶ que se describe mediante la ecuación de Hill (la tercera ecuación que se muestra a continuación). Sin embargo, K_d de la sonda en células intactas es difícil de estimar y hemos asumido que es 1 μM en nuestros cálculos. Por lo tanto, los resultados se muestran en función de K_d. (es decir, [cAMP] = x* K_d). Las ecuaciones utilizadas para medir la eficiencia de FRET y mapear FRET a niveles de cAMP se muestran a continuación:

Donde E es la eficiencia FRET, y una_aparente y d_aparente son intensidades de píxeles no mezcladas de imágenes aceptoras y donantes, respectivamente.
Q_a y Q_d son rendimientos cuánticos de aceptor y donante. Nótese que Q a y Q_d se cancelan cuando la ecuación para k^λ se incorpora en la ecuación de eficiencia FRET, k^λ es un factor de corrección:

y son coeficientes de extinción de donante y aceptor en la longitud de onda de excitación del donante, i (405nm).

E es la eficiencia FRET y K_D= constante de disociación = 1 μM.
Navegue y seleccione la primera imagen FRET en escala de grises (guardada en el paso 3.3.5) y haga clic en Aceptar.
Abra las imágenes FRET/cAMP para inspeccionar la distribución de señales cAMP en tres dimensiones.

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Representative Results

Este protocolo describe el uso de imágenes y enfoques de análisis FRET hiperespectrales para medir gradientes de cAMP en tres dimensiones espaciales en células vivas. Hay varios pasos clave involucrados en la generación de estos resultados, para los cuales se requiere una atención cuidadosa al analizar y cuantificar los datos. Estos pasos clave incluyen la construcción de una biblioteca espectral apropiada, la desmezcla espectral de fondo, el umbral para identificar los bordes de las celdas y los cálculos de eficiencia FRET. La Figura 1 ilustra el flujo esquemático de todos los pasos involucrados en la medición de la eficiencia fret y los niveles de cAMP en células vivas. Cuando se realizan correctamente, estos pasos de imagen y análisis permitirán la medición de la eficiencia de FRET y la estimación de gradientes espaciales cAMP en 3 dimensiones en una celda, al tiempo que tienen en cuenta las señales de fondo no uniformes.

La Figura 2 muestra vistas tridimensionales de datos de imágenes hiperespectrales crudas de colores falsos adquiridos con un microscopio confocal Nikon A1R en condiciones basales(Figura 2A)y 10 minutos después(Figura 2B)del tratamiento con forskolina. Tenga en cuenta que se utilizaron parámetros similares del detector y del sistema para adquirir pilas de imágenes de tratamiento antes y después para mantener la consistencia para el análisis cuantitativo. También tenga en cuenta que los cambios en FRET no son obvios en esta imagen, ya que se trata puramente de una visualización de datos sin procesar, antes de calcular la eficiencia de FRET.

Se necesita una biblioteca espectral con espectros puros de todos los miembros finales para analizar más a fondo los datos de imágenes espectrales en bruto. La construcción de una biblioteca espectral adecuada es uno de los pasos clave para garantizar mediciones adecuadas de la eficiencia de FRET. La Figura 3 demuestra la construcción de una biblioteca espectral que contiene los espectros puros de los miembros finales (en estos estudios actuales, los miembros finales son Turquesa, Venus y DRAQ5). Para medir la eficiencia de FRET, es importante obtener los espectros de Turquesa y Venus utilizando una muestra con estequiometría 1:1. Aquí, hemos proporcionado un enfoque donde el fluoróforo aceptor está completamente fotodestruido, lo que permite obtener firmas espectrales del donante y aceptor con estequiometría 1: 1(Figura 3A-F). Además, se aplicaron relaciones de potencia lineal entre los láseres (Figura Suplementaria 1) para calcular el espectro aceptor con una intensidad que se esperaría si se excitara utilizando el láser de excitación del donante, en este caso 405 nm para Turquesa(Figura 3G). Esto asegura que las señales de donante y aceptor no mezcladas sean comparables en intensidad absoluta cuando FRET se excita con una sola línea láser de 405 nm. Se utilizaron células no transfectadas etiquetadas con el colorante nuclear, DRAQ5(Figura 3H)para obtener el espectro puro de DRAQ5(Figura 3I). Combinando los espectros del donante, Turquesa(Figura 3F),aceptor, Venus(Figura 3G)y DRAQ5(Figura 3I),se creó una biblioteca de 3 componentes(Figura 3J).

Las señales de fuentes distintas de las etiquetas fluorescentes también pueden estar presentes en una muestra. Para dar cuenta de esto, se identificaron tres firmas espectrales diferentes con picos que ocurren a 424 nm, 504 nm y 574 nm dentro de muestras celulares no etiquetadas. Creemos que estas firmas espectrales corresponden a la reflectancia de la cubierta y la matriz celular o autofluorescencia celular. La Figura 4 muestra las fuentes de estas tres firmas espectrales de fondo. Es importante tener en cuenta que estas señales se distribuyen de manera no uniforme dentro de la muestra y, por lo tanto, no se pueden restar simplemente. Sin embargo, agregar las firmas espectrales de estas señales a la biblioteca espectral y usar la desmezcla lineal para separar las señales presenta un enfoque para eliminar estas señales de confusión de las señales donante y aceptora antes de calcular las eficiencias FRET. Para lograr esto, las tres firmas espectrales de fondo se agregaron a la biblioteca espectral de 3 componentes, formando una nueva biblioteca de 6 componentes que consta de donante (Turquesa), aceptor (Venus), DRAQ5 y tres firmas espectrales de fondo.

Se escribió un script de programación personalizado para desmezclar los datos de la imagen espectral en miembros finales individuales, y se escribió un script separado para realizar cálculos posteriores de eficiencia FRET. La desmezcla espectral lineal (ilustrada en la Figura 5)se realizó utilizando la biblioteca espectral de 6 componentes. La desmezcla se realizó para cada segmento en la pila de imágenes axiales, también conocida como pila z (consulte la visualización en 3 dimensiones de datos de imágenes espectrales sin procesar en la Figura 5A). Esto dio como resultado imágenes separadas sin mezclar para cada miembro final, para cada segmento z en la pila z(Figura 5C-E,no se muestran imágenes sin mezclar de fondo). Si se desea, las señales no mezcladas pueden ser de color falso para su visualización con un color diferente asignado a cada señal no mezclada (Figura 5F-H).

La Figura 6 ilustra los pasos involucrados en los cálculos de eficiencia fret, así como los pasos para asignar la eficiencia FRET a los niveles cAMP. Se generó una imagen de eficiencia FRET utilizando imágenes suavizadas de donantes y aceptores sin mezclar. Se obtuvo una imagen de máscara binaria utilizando imágenes de donantes, aceptores y nucleares no mezclados. La máscara se aplicó a la imagen de eficiencia FRET para eliminar las contribuciones de los píxeles fuera de la celda. Aunque se utilizaron imágenes no mezcladas de cortes z individuales para la demostración pictórica de las mediciones de eficiencia FRET, estos cálculos se realizaron en cada segmento dentro de la pila de imágenes en 3 dimensiones. El conjunto de datos de imágenes FRET en 3 dimensiones se reslicó en tres planos ortogonales para visualizar gradientes espaciales de señales cAMP en diferentes direcciones.

Visualización de los cambios inducidos por agonistas en la eficiencia de FRET y los niveles de cAMP
Los pasos descritos anteriormente proporcionan un método para calcular la eficiencia fret y los niveles de cAMP a partir de datos de imágenes hiperespectrales en tres dimensiones espaciales. Estos pasos se pueden aplicar a preparaciones celulares antes y después del tratamiento con compuestos que provocan una respuesta cAMP, como la forskolina. Aquí, proporcionamos un ejemplo de uso de este enfoque para observar cambios en la distribución de FRET y cAMP en PMVÉC después del tratamiento con forskolina de 50 μM. La Figura 7 ilustra los cambios en la eficiencia de FRET y los niveles de cAMP en diferentes cortes planos XY (cortes z), de apical a basal, lo que permite la comparación de las condiciones basales (antes del tratamiento con forskolina) y 10 minutos después del tratamiento. En este ejemplo ilustrativo, la eficiencia de FRET disminuyó (columnas 1 y 3 en la Figura 7)tras el tratamiento con forskolina, correlacionándose con un aumento en los niveles de cAMP (columnas 2 y 4 en la Figura 7). Se observó una variación espacial mínima de cAMP dentro de un solo plano XY. Sin embargo, se observaron gradientes espaciales axiales (apicales a basales) de cAMP, como se puede conjeturar al observar que la rebanada apical tiene un color rojo más profundo (lo que indica niveles más altos de cAMP a través de la tabla de búsqueda de color que se aplicó) que la rebanada basal después del tratamiento con forskolina (columna 4 en la Figura 7). Las distribuciones axiales FRET o cAMP a menudo se pueden visualizar mejor utilizando imágenes obtenidas de los dos planos espaciales ortogonales: la Figura 8 representa la eficiencia FRET y los niveles de cAMP en el plano YZ al inicio (columnas 1 y 2) y 10 minutos después del tratamiento con forskolina (columnas 3 y 4), mientras que la Figura Suplementaria 2 representa la eficiencia FRET y los cambios en el nivel cAMP en el plano XZ. Estos resultados demuestran la viabilidad de medir FRET y estimar los niveles de cAMP a partir de datos de imágenes hiperespectrales en 3 dimensiones y también demuestran la importancia de visualizar distribuciones axiales de FRET o cAMP. Si bien está más allá del alcance de este documento metodológico, puede ser que las distribuciones espaciales axiales de nucleótidos cíclicos contribuyan a la especificidad dentro de las vías de señalización de nucleótidos cíclicos.

Al realizar los métodos descritos anteriormente, es importante verificar meticulosamente la precisión de los pasos y ejecutar los controles experimentales y de vehículos apropiados para garantizar que los cambios en FRET (y el cAMP correspondiente) se deban a cambios reales en las señales de donantes y aceptores y no sean artefactos de imágenes. Por ejemplo, los pasos importantes a considerar incluyen:

Uso de una biblioteca espectral apropiada que contenga todos los componentes espectrales necesarios
Como se mencionó, puede haber una contribución significativa de las señales de fondo de la autofluorescencia celular, la matriz depositada o la luz reflejada de la cubierta (sangrado de emisión de excitación). La Figura 9 representa un conjunto de datos de ejemplo que ilustra que la señal de fondo se retuvo dentro de las imágenes cuando se utilizó una biblioteca de 3 componentes (Turquesa, Venus y DRAQ5) para desmezclar los datos espectrales. Por el contrario, la señal de fondo se eliminó efectivamente cuando se utilizó una biblioteca espectral de 6 componentes más completa (y apropiada).

Uso de un valor de umbral óptimo para generar una máscara de celda
En muchos de los experimentos que hemos realizado, la intensidad de la señal de fondo es aproximadamente el 50-60% de la intensidad de la señal FRET que está presente dentro de los datos de imagen espectral en bruto (es decir, al visualizar datos de imagen espectral no procesados, el pico de la señal FRET es solo ~ 2 veces mayor que el de la señal de fondo circundante). Por lo tanto, la separación de la señal de fondo de la señal de primer plano utilizando un valor umbral para obtener una máscara binaria es un paso sensible y debe realizarse cuidadosamente para evitar artefactos de análisis. La figura 10 ilustra el efecto de los diferentes valores de umbral aplicados a la segmentación de celdas para crear una máscara binaria de la celda. Un valor umbral bajo puede incluir señal de fondo como parte de la celda de expresión. Por otro lado, un valor umbral demasiado alto puede impedir la medición de FRET en células de baja expresión o regiones de una célula con baja señal donante+aceptor (ya sea porciones muy delgadas de la célula o porciones que pueden tener una concentración regional más baja de la sonda FRET).

Selección de una célula transfectada con intensidad de señal donante+aceptor ≥ señal de fondo
La Figura 11 ilustra un conjunto de datos de ejemplo donde las eficiencias fret y los niveles correspondientes se midieron a partir de imágenes no mezcladas obtenidas utilizando una biblioteca espectral de 6 componentes para la desmezcla espectral lineal. A pesar de usar la biblioteca de 6 componentes para desmezclar datos de imágenes espectrales y seleccionar un umbral alto para crear el borde de la celda y la máscara nuclear, las imágenes de eficiencia FRET seguían siendo propensas a una señal de alto ruido de fondo cerca del lado basal de la célula. En este caso, la presencia de ruido de fondo se debió a la selección de una célula que solo expresaba débilmente la sonda FRET, y la intensidad de la señal donante + aceptor era aproximadamente igual a la intensidad de la señal de fondo, incluso después de desmezclar. Por lo tanto, además de aplicar los sofisticados pasos de análisis descritos anteriormente, también es importante seleccionar una célula con suficiente expresión de la sonda FRET y, en consecuencia, suficiente señal FRET (señal donante y aceptora al menos igual o superior a la señal de ruido) durante la adquisición para garantizar resultados de alta calidad.

Figura 1: Diagrama de flujo que representa los pasos involucrados en la eficiencia de FRET y las mediciones de nivel en tres dimensiones espaciales utilizando imágenes y análisis FRET hiperespectrales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Visualización tridimensional de una célula que expresa el reportero FRET cAMP (verde) y núcleos de la célula y las células no expresantes circundantes (rojo). Los datos de imagen espectral en bruto adquiridos con un microscopio confocal espectral Nikon A1R han sido coloreados falsamente según la longitud de onda y visualizados en 3 dimensiones utilizando el software NIS Elements. A) Datos de imágenes tridimensionales al inicio y B) 10 minutos después del tratamiento con forskolina de 50 μM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Construcción de una biblioteca espectral que contiene los espectros puros de las etiquetas fluorescentes en el estudio (denominados miembros finales por el campo de teledetección). A) Una imagen de color falso de células que expresan el biosensor FRET adquirido a 405 nm de excitación (excitación del donante). B) Espectro correspondiente a la señal FRET: se dibujaron 4 regiones de interés (ROI) diferentes en la imagen A mostrada por rectángulos rojos, amarillos, azules y verdes. Se exportó la intensidad media en cada longitud de onda para cada ROI seleccionado. La intensidad promedio de estos 4 ROI se trazó en cada longitud de onda de emisión. Los picos de emisión del espectro corresponden tanto a los fluoróforos donantes (Turquesa) como al aceptor (Venus). C) Imagen falsa coloreada de células que expresan el biosensor FRET adquirida a 488 nm de excitación (excitación aceptora). D) El espectro medio se estimó como se explica en B a partir de varios ROI en C (las mismas regiones que en A) con pico de emisión debido solo al aceptor. E) Una imagen de color falso de células que expresan el biosensor FRET adquirida a 405 nm de excitación después de la fotodestrucción del fluoróforo aceptor por irradiación de 514 nm. F) El espectro medio se estimó como se explica en B a partir de varios ROI en E (las mismas regiones que A) con pico de emisión debido solo al donante. TENGA en cuenta que la intensidad del donante aumenta en F en comparación con la de la señal FRET original, lo que indica que después del fotoblanqueo del aceptor, la excitación del donante está dando lugar a la emisión directa del donante. G) El espectro aceptor como se esperaría si se obtuviera utilizando excitación de 405 nm. Esto se estimó utilizando los hechos de que los láseres de excitación de 405 nm y 488 nm tienen una respuesta lineal que se puede caracterizar utilizando un espectrómetro y una esfera integradora(Figura suplementaria 1)y el coeficiente de extinción dependiente de la longitud de onda de Venus. Por lo tanto, el espectro de Venus obtenido a 488 nm de excitación se puede convertir en el espectro de Venus que se esperaría si se obtuviera a 405 nm de excitación H) Una imagen de color falso de células etiquetadas con la etiqueta nuclear, DRAQ5. I) El espectro promedio de varias regiones de interés en H. J) La biblioteca espectral resultante que contiene los espectros puros normalizados del donante y DRAQ5 y el espectro corregido de longitud de onda de excitación del aceptor. Tenga en cuenta que los espectros Turquesa y Venus se normalizaron al valor máximo de los datos espectrales combinados de Turquesa + Venus, mientras que DRAQ5 simplemente se normalizó a la unidad en el valor de la longitud de onda de emisión máxima. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Se identificaron firmas espectrales de fondo y se incluyeron en la biblioteca espectral para tener en cuenta las señales de fluorescencia de fondo durante el proceso de desmezcla. A, B) Se observaron dos firmas espectrales de fluorescencia de fondo al caracterizar una muestra en blanco (cubierta sin etiquetar). Estas firmas espectrales se nombraron en función de sus longitudes de onda máximas: una a 424 nm (por fluorescencia de deslizamiento de cubierta) y la otra a 504 nm (probablemente por reflectancia o dispersión posterior). C) Se observó una tercera firma espectral de fondo con una longitud de onda de emisión máxima de 574 nm cuando se analizaron células no etiquetadas, potencialmente de autofluorescencia celular o fluorescencia de la matriz subyacente. D) Espectros de fondo extraídos de las imágenes A, B y C. Estos tres espectros de fondo se agregaron a la biblioteca existente de 3 componentes(Figura 3J)para desarrollar una biblioteca espectral de 6 componentes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Desmezcla espectral lineal utilizando una biblioteca espectral de 6 componentes que tiene en cuenta las señales de fondo. A) Datos de imagen espectral en bruto adquiridos como una pila z axial. B) Biblioteca espectral de 6 componentes utilizada para desmezclar linealmente datos espectrales en bruto. C, D y E) Las imágenes no mezcladas en escala de grises de DRAQ5, Turquesa y Venus, respectivamente, resultaron de la desmezcla espectral lineal. F, G y H) Imágenes falsas no mezcladas de DRAQ5, Turquesa y Venus respectivamente. También se calcularon imágenes no mezcladas de señales de fondo (datos que no se muestran aquí, ya que solo las etiquetas fluorescentes son de interés para esta metodología; consulte la Figura 4 en Annamdevula, et al. para obtener ejemplos de señales de fondo no mezcladas²⁵). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Diagrama de flujo que representa los pasos involucrados en el cálculo de los niveles de FRET y cAMP a partir de datos de imágenes espectrales no mezclados. A) Imagen representativa sin mezclar del donante, Turquesa. B) Imagen representativa no mezclada del aceptor, Venus. C) Imagen representativa no mezclada de núcleos, DRAQ5. D) La máscara de célula binaria se genera mediante el umbral de la imagen sumada donante + aceptor no mezclado. E) Se aplica un umbral a la imagen nuclear para crear una máscara binaria del núcleo. F) La eficiencia de FRET en píxeles se calculó a partir de imágenes de donantes y aceptores no mezclados. G) Se creó una máscara binaria compuesta a partir de borde celular y máscaras nucleares. H) Imagen de eficiencia FRET enmascarada: se aplicó máscara celular compuesta a la imagen de eficiencia FRET para excluir señales FRET no específicas fuera de la célula y dentro del núcleo. I) Se aplicó un mapa de colores a la imagen de eficiencia FRET enmascarada para visualizar mejor los cambios espaciales en FRET. J) La imagen de niveles cAMP que se estimó a partir de la imagen de eficiencia FRET. K) Se aplicó Colormap para visualizar mejor los cambios espaciales en cAMP. Las barras de colores que se muestran en el lado derecho se utilizaron para visualizar la eficiencia FRET (panel superior) y los niveles de cAMP (panel inferior). Las imágenes que se muestran en esta figura son representativas de una sola rebanada z axial, pero la operación de análisis descrita en esta figura se realiza en toda la pila z axial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Eficiencia FRET inducida por forskolina y gradientes espaciales cAMP visualizados en PMVECs. Las imágenes del plano XY se generaron reslicándose los datos de imagen FRET y cAMP reconstruidos en 3 dimensiones en la dirección axial (Z) desde el lado apical hasta el basal de la célula. Se muestran cinco segmentos XY contiguos. Las columnas 1 y 3 representan la eficiencia de FRET al inicio y 10 minutos después del tratamiento con forskolina de 50 μM, respectivamente. Las columnas 2 y 4 indican los niveles al inicio y 10 minutos después del tratamiento con forskolina. Las barras de color se utilizaron para relacionar los cambios en el mapa de colores con la eficiencia FRET (arriba) y los niveles de cAMP (abajo). Las líneas blancas que se muestran en las imágenes de las columnas 2 y 4 se utilizan para generar el perfil de intensidad (perfil de escaneo de línea) de las señales cAMP a través de esta línea seleccionada. La gráfica del perfil de intensidad obtenida de la mitad de la célula al inicio (perfil azul) y después del tratamiento con forskolina (perfil verde) demuestra la distribución espacial de las señales cAMP a través de la exploración de línea. La barra de escala indica 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Eficiencia FRET inducida por forskolina y gradientes espaciales cAMP visualizados en la dirección axial. Las imágenes del plano YZ se generaron reslicando los datos de imagen FRET y cAMP reconstruidos en 3 dimensiones en la dirección lateral (X) (de izquierda a derecha de la célula). Las columnas 1 y 3 representan la eficiencia de FRET al inicio y a los 10 minutos después del tratamiento con forskolina de 50 μM, respectivamente. Las columnas 2 y 4 representan los niveles de pJAM al inicio y a los 10 minutos después del tratamiento con forskolina. Las barras de color de la derecha se utilizaron para relacionar los cambios en el mapa de colores con la eficiencia fret (arriba) y los niveles de cAMP (abajo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: Una comparación de la efectividad de utilizar una biblioteca espectral de 3 o 6 componentes para calcular imágenes de niveles FRET y cAMP. Se observaron señales de fondo inespecíficas en imágenes calculadas utilizando una biblioteca de 3 componentes, que no tuvo en cuenta las firmas espectrales de fondo. Esto fue especialmente cierto para las imágenes cerca del lado basal de la célula después del tratamiento con forskolina de 50 μM (columna 2). Por el contrario, los artefactos de señal de fondo se eliminaron de manera efectiva cuando se usaba una biblioteca de 6 componentes que incluía firmas espectrales de fondo, mejorando la capacidad de segmentar la celda y analizar señales FRET y cAMP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 10: Se pueden introducir artefactos de análisis de imágenes si no se selecciona un valor umbral apropiado para delinear los bordes celulares y nucleares. Se utilizaron imágenes de donantes y aceptores no mezclados para crear una máscara con tres valores umbral diferentes: 0,35 (columnas 1 como 2), 0,65 (columnas 3 y 4) y 0,9 (columnas 5 y 6). Las columnas 1, 3 y 5 muestran la eficiencia de FRET en la línea de base. Las columnas 2, 4 y 6 muestran la eficiencia fret a los 10 minutos después del tratamiento con forskolina de 50 μM. La selección de un umbral que era demasiado bajo dio como resultado que partes del fondo, o región extracelular, se incluyeran con la célula para el análisis, mientras que la selección de un umbral que es demasiado alto resultó en la pérdida de parte de la célula (ver la rebanada apical en las columnas 4-5 en comparación con las columnas 3-4). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 11: Los artefactos de señal de fondo aún pueden persistir incluso después de desmezclar el fondo y seleccionar un umbral apropiado durante la creación de una máscara binaria. La columna 1 muestra cortes apicales, medios y basales representativos al inicio y la columna 2 muestra lo mismo a los 10 minutos después del tratamiento con forskolina de 50 μM. A pesar de usar una biblioteca de 6 componentes para desmezclar que tenía en cuenta las señales de fondo y utilizar un umbral más alto de 0.85 para la generación de máscaras binarias, las regiones de fondo aún se identificaron como parte de la célula, especialmente después del tratamiento con forskolina. Si esto ocurre, una posible explicación puede ser que se seleccionó una célula con una expresión débil del reportero FRET para la obtención de imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura suplementaria 1: Mediciones de la intensidad de la línea láser en función de la configuración del láser en el software. Un espectrómetro acoplado a fibra y una esfera integradora se calibraron en una lámpara trazable por el NIST para medir la intensidad del láser tanto para la línea láser de 405 nm como para la línea láser de 488 nm. A) Número total de fotones medidos en la etapa del microscopio correspondientes a diferentes intensidades láser del láser de 405 nm. B) Número total de fotones medidos en la etapa del microscopio correspondientes a diferentes intensidades láser de láser de 488 nm. Se observó una respuesta lineal en la intensidad del láser tanto para los láseres como se midió en la etapa del microscopio. Se ajustó una línea de tendencia lineal y se utilizó la ecuación de línea de tendencia para cada línea láser para calcular el espectro aceptor que se esperaría si se excitara con la línea láser de 405 nm (excitación del donante). Haga clic aquí para descargar esta figura.

Figura suplementaria 2: Eficiencia FRET inducida por forskolina y gradientes espaciales cAMP visualizados en la dirección axial. Las imágenes del plano XZ se generaron reslicando los datos de imagen FRET y cAMP reconstruidos en 3 dimensiones en la dirección lateral (Y) (de adelante hacia atrás de la celda). Las columnas 1 y 3 representan la eficiencia de FRET al inicio y a los 10 minutos después del tratamiento con forskolina de 50 μM, respectivamente. Las columnas 2 y 4 representan los niveles de pJAM al inicio y a los 10 minutos después del tratamiento con forskolina. Las barras de color de la derecha se utilizaron para relacionar los cambios en el mapa de colores con la eficiencia fret (arriba) y los niveles de cAMP (abajo). De manera similar a los resultados mostrados para los planos YZ(Figura 8),los gradientes espaciales apicales a basales en la eficiencia FRET y los niveles de cAMP pueden visualizarse como cambios de color de la parte superior a inferior de una sola rebanada YZ, tanto en condiciones basales (cualquier rebanada dada en las columnas 1-2) como después del tratamiento con forskolina de 50 μM (columnas 3-4). Haga clic aquí para descargar esta figura.

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Discussion

El desarrollo de biosensores FRET ha permitido la medición y visualización de señales de nucleótidos cíclicos en células individuales, y existe una gran promesa para visualizar eventos de señalización subcelular^13,^22,^37,^38. Sin embargo, el uso de biosensores FRET presenta varias limitaciones, incluyendo las características de baja señal a ruido de muchos reporteros FRET basados en proteínas fluorescentes y las débiles eficiencias de transfección o expresión de los reporteros FRET (esto puede ser especialmente desafiante en ciertas líneas celulares, como PMVEC)²³^,²⁴. Las imágenes de proteínas fluorescentes débilmente expresadas, combinadas con cálculos ratiométricos de FRET, a menudo producen un alto grado de incertidumbre o fluctuación en la eficiencia de FRET calculada. En un esfuerzo por mejorar la fiabilidad de las mediciones FRET, nosotros y otros hemos demostrado previamente el uso de imágenes y análisis hiperespectrales para medir las señales FRET y para reducir la diafonía o el sangrado a través de las señales de fluorescencia entre las etiquetas fluorescentes y los efectos de autofluorescencia²⁶^,³¹^,³²^,³⁹. Debido a las limitaciones en la intensidad de la señal, estos estudios ESPECTRALES FRET se limitaron a dos (X e Y) dimensiones espaciales hasta hace muy poco. Por lo tanto, proporcionaron una vista de un solo segmento de los cambios FRET dentro de una celda.

En estudios recientes, observamos que FRET (y los niveles correspondientes de cAMP) parecían estar distribuidos espacialmente no solo en el plano XY, sino también en los planos XZ e YZ²⁵. El enfoque de imágenes FRET hiperespectrales descrito aquí amplía nuestra capacidad para visualizar y medir los cambios FRET y nucleótidos cíclicos (cAMP) en tres dimensiones espaciales, abriendo nuevas posibilidades para evaluar la compartimentación de la señal. Este enfoque de imagen y análisis hiperespectral de 4 dimensiones (X, Y, Z y λ) permite la medición y visualización de gradientes cAMP en tres dimensiones espaciales al tiempo que tiene en cuenta las señales de fondo no uniformes. Aquí, hemos demostrado cómo implementar este enfoque a través del ejemplo de gradientes espaciales cAMP inducidos por forskolina. En los datos de imagen posteriores al tratamiento, se pueden observar gradientes espaciales de cAMP desde el lado apical hasta el basal de la célula(Figura 7 y Figura 8). El cAMP producido tras el tratamiento con forskolina no pareció alcanzar las uniones célula-célula(Figura 7 y Figura 8).

Al utilizar la metodología descrita aquí, era importante tener en cuenta las diferentes fuentes de señales de fondo y autofluorescencia para permitir una estimación precisa de las eficiencias de FRET. La desmezcla lineal proporciona una vía potencial para tener en cuenta espectros de fondo únicos, si sus firmas son diferentes a las sondas fluorescentes de interés. En particular, la desmezcla lineal es más adecuada para separar las señales de fondo y autofluorescencia que la sustracción de fondo estándar. ⁴⁰^,⁴¹^,⁴² En el ejemplo que se muestra aquí, se midieron tres firmas espectrales diferentes y se les asignó un nombre basado en la longitud de onda de emisión máxima de la firma: el espectro de fondo de 424 nm (posiblemente de la fluorescencia de la cubierta), el espectro de fondo de 504 nm (probablemente debido a la luz reflejada o retrodespersada) y el espectro de fondo de 574 nm (posiblemente debido a la autofluorescencia de la matriz celular o celular). Para ilustrar los efectos de no tener en cuenta estas firmas, se crearon dos bibliotecas espectrales y se compararon imágenes no mezcladas. Primero, se creó una biblioteca espectral que contenía solo las etiquetas fluorescentes en la muestra, Turquesa, Venus y DRAQ5, y se etiquetó la biblioteca de 3 componentes. En segundo lugar, se creó una biblioteca espectral que contenía adicionalmente las tres firmas espectrales de fondo y se etiquetó como la biblioteca de 6 componentes. Como se muestra arriba, la desmezcla con la biblioteca de 6 componentes (desmezcla de fondo) permitió la eliminación de señales de fondo, mientras que la desmezcla con la biblioteca de 3 componentes no lo hizo (Figura 9). En trabajos anteriores, hemos demostrado que el error cuadrado medio de la raíz (RMSE) asociado con la desmezcla lineal disminuye cuando se utiliza una biblioteca espectral que tiene en cuenta tanto las etiquetas fluorescentes como las firmas de fondo. Cabe señalar que la distribución axial de la fluorescencia de fondo a menudo no es uniforme y, por lo tanto, una simple sustracción de fondo no funcionará para corregir los datos de la imagen. Por lo tanto, se necesita el enfoque de desmezcla espectral para proporcionar una eliminación precisa del fondo y mediciones FRET confiables.

Es importante optimizar los parámetros del sistema para seleccionar la mejor configuración posible del sistema y la cámara al adquirir imágenes espectrales. El objetivo general debe ser optimizar el SNR al tiempo que se minimiza el tiempo de adquisición y se evita el fotobleaching. ⁴³ Por lo tanto, al optimizar un sistema de imágenes, a menudo se necesita un compromiso entre las resoluciones espaciales, temporales y espectrales. En estos estudios, se seleccionaron valores óptimos para la configuración del sistema y la cámara, incluido el tamaño estenopeico, la potencia del láser, la velocidad de escaneo, el tamaño del escaneo y el promedio de fotogramas como se describe en la sección de protocolo. Utilizando estos ajustes, el muestreo espacial de 80 nm/píxel, el muestreo temporal de ~3 minutos por pila z espectral (~10 segundos/imagen XY) y el muestreo espectral de intervalo de 10 nm se logran con fotobleaching insignificante o mínimo.

Para garantizar estimaciones precisas de la eficiencia de FRET, es necesario medir los espectros de donantes y aceptores como se esperaría con estequiometría 1:1 y longitudes de onda de excitación idénticas(Figura 3). Los espectros turquesa y Venus se normalizaron con respecto a la longitud de onda de emisión máxima turquesa. La eficiencia FRET que se estimó utilizando esta biblioteca espectral produjo valores similares a los reportados en la literatura^12,²². Normalmente, los espectros de los miembros finales de la biblioteca se normalizan a la unidad. Sin embargo, para calcular con precisión la eficiencia FRET, el espectro aceptor debe adquirirse con respecto al espectro donante (es decir, a concentración equimolar o estequiometría 1:1 y referenciado a la misma longitud de onda de excitación). Además del uso de una biblioteca construida correctamente, varios pasos están involucrados en la estimación adecuada de la eficiencia de FRET y la evitación de artefactos de análisis. Estos incluyen la selección de una célula expresante con una intensidad de señal adecuada(Figura 11),el suavizado de imágenes no mezcladas antes de estimar la eficiencia FRET (en este ejemplo se aplicó el desenfoque gaussiano), el uso de un valor umbral apropiado para crear la máscara(Figura 10)y la estimación de un factor de corrección utilizando coeficientes de extinción de donante y aceptor (Biblioteca de File_Spectral suplementaria). Cuando se siguen estos pasos, las distribuciones tridimensionales de la eficiencia fret y los niveles subyacentes de cAMP se pueden visualizar con precisión en células individuales.

Las señales cAMP localizadas se han estimado en dimensiones 2 espaciales utilizando biosensores FRET dirigidos¹³^,³⁷. Sin embargo, dirigir las sondas FRET a compartimentos subcelulares específicos (por ejemplo, membrana plasmática o balsas lipídicas) generalmente resulta en una mayor concentración local de sonda. Esto puede resultar en artefactos de medición introducidos debido a FRET intermolecular o bimolecular. Además, los resultados presentados aquí y en Annamdevula et.al., 2018, Cytometry A²⁵ demuestran la importancia de las mediciones tridimensionales de FRET a partir de sondas solubles o dirigidas.

A pesar de la importancia de medir las señales cAMP en tres dimensiones espaciales, este enfoque también tiene limitaciones. La limitación más restrictiva son los largos tiempos de adquisición requeridos: aproximadamente 3 minutos por pila z espectral. Esta tasa de adquisición impide el uso de este enfoque para detectar cualquier cosa que no sea distribuciones de cAMP de estado cuasi estacionario en las células. Dicho esto, los resultados presentados demuestran la importancia de incluir mediciones de cAMP en 3 dimensiones (x, y, z) en estado estacionario como complementos críticos de las mediciones estándar de 2 dimensiones (x, y). En el futuro será interesante incorporar proteínas y estructuras celulares etiquetadas en el diseño experimental. La elección cuidadosa de los fluoróforos utilizados para etiquetar proteínas (y / o estructuras) permitiría la evaluación de las distribuciones tridimensionales de las proteínas etiquetadas y FRET sin pérdida adicional de velocidad de adquisición. Esto a su vez permitiría la medición de señales cAMP localizadas y señales cAMP cerca de las proteínas etiquetadas en tres dimensiones espaciales, ofreciendo así un complemento experimental importante para las sondas cAMP dirigidas y expandiendo aún más la utilidad de las mediciones hiperespectrales de distribuciones cAMP tridimensionales en células vivas.

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Disclosures

Los doctores Leavesley y Rich revelan interés financiero en una empresa de nueva creación, SpectraCyte, LLC, que se formó para comercializar tecnologías de imágenes espectrales. Sin embargo, todos los procedimientos descritos en este protocolo se llevaron a cabo utilizando productos disponibles comercialmente no asociados con SpectraCyte, LLC.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer al Dr. Kees Jalink (Instituto del Cáncer de los Países Bajos y centro van Leeuwenhoek de Microscopía Avanzada, Ámsterdam, Países Bajos) por proporcionarnos el biosensor H188 cAMP FRET y a Kenny Trinh (Facultad de Ingeniería, Universidad del Sur de Alabama) por su ayuda técnica para reducir el tiempo necesario para ejecutar nuestros scripts de programación desarrollados a medida.

Los autores desean reconocer las fuentes de financiación: American Heart Association (16PRE27130004), National Science Foundation; (1725937) NIH, S100D020149, S10RR027535, R01HL058506, P01HL066299).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Attofluor Cell Chamber	Invitrogen	A7816	Attofluor contains steel cell chambers and a rubber O-ring. Cell chamber holds the coverslip and O-ring provides a lock in mechanism to hold the buffer in cell chamber with out leakage
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	BP231-100	Solvent used to prepare stock solution forskolin.
DRAQ5 Fluoroscent Probe Solution	Thermo Scientific	62252	Nuclear label
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965-092	Contains nutrients and growth factors for the cells to grow and divide in the culture dishes.
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma	F6178	Growth factor suppliment that is added to culture medium, DMEM
Forskolin	Sigma	F3917	Adenyly cyclase activator.
H188 Cyclic AMP FRET biosensor	Netherland Cancer Institute, Dr. K. Jalink	Gift	Plasmid encoding Turquoise (donor fluorophore), Venus (acceptor fluorophore), and binding domain obtained from Epac.
Image J	image.net	Free download	Another image processing platform used to extact spectral information and image processing.
Integrating Sphere	Ocean Optics	FOIS-1	Used to measure illumination intensity of the laser line at different laser intensities (?).
Laminin Mouse Protein, Natural	Invitrogen	23017-015	Coverslips are coated with laminin and this helps in cell attachment, growth and motility of the cell.
Lipofectamine 3000 Transfection Kit	Invitrogen	L3000-015	Transfection reagent used to transfect cells with H188 FRET biosensor
MATLAB	Mathworks	R2019a	Image processing operations (linear unmixing and FRET efficiency calculations) are performed by writing custom programs in MATLAB programming environment
Nikon A1R confocal microscope	Nikon Instruments	Nikon A1R	Spectral image acquisition is performed using confocal microscope.
Nikon Elements Software	Nikon Instruments	Software dongle	used to export and handle nd2 image files (multidimensional image files) that are aquired using Nikon A1R
NIST-Traceable Calibration Lamp	Ocean Optics	LS-1-CAL-INT	A lamp with a known spectrum for use as a standard
PBS pH 7.4 (1X)	Gibco	10010-023	coomonly used buffer suring cell culture
Pulmonary Microvascular Endothelial Cells (PMVECs)	In house - Cell culture core, Univeristy of South Alabama	Isolated from Rat pulmonary microvasculature	PMVECs form inner lining of a blood vessel.
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco	15140-122	antibiotics are added to culture medum to prevent contamination of the cells.
Pre-Cleaned Gold Seal Micro Slides	Clay Adams	3010	Microscope slides used for cell fixation
ProLong Diamond Antifade Mounting Media	Invitrogen	P36961	If samples are fixed using antifade mountant, then the later protects fluoroscent dyes and chromophores from fading.
Spectrometer	Ocean Optics	QE65000	Used to measure spectral response of the light source (?)
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200-056	Digests the protein-protein bond between the cell and cell matrix and helps to disscociate and lift the cells during cell plating.
Tyrodes Buffer	Made in-house	Made in-house	Tyrodes buffer is used to make working solutions and to maintain cells in aqueous solution during image acquisition.
6 Well Cell Culture Plate	Corning	3506	Laminin coated coverslips are placed in 6-well culture dish (one coverlisps/well). Cells along with medium is added into each well.
25 mm Round Microscope Cover Slips	Fisher Scientific	12545102	Cells were grown on round glass coverslips
60X Ojective	Nikon Instruments	Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27	water immersion and commonly used objective for cells

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References

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Biology

Medición de distribuciones de cAMP tridimensionales en células vivas utilizando imágenes y análisis FRET hiperespectrales de 4 dimensiones (x, y, z y λ)

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

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