Medição de distribuições 3-dimensionales cAMP em células vivas usando imagens e análises hiperespectrais de FRET 4-Dimensional (x, y, z e λ) Hiperespectrais
Summary
Devido à relação sinal-ruído inerente (SNR) de sensores baseados em transferência de energia de ressonância (FRET) Fӧrster, a medição dos sinais cAMP tem sido desafiadora, especialmente em três dimensões espaciais. Aqui, descrevemos uma metodologia hiperespectral de imagem e análise de FRET que permite a medição da distribuição cAMP em três dimensões espaciais.
Abstract
O AMP cíclico é um segundo mensageiro que está envolvido em uma ampla gama de atividades celulares e fisiológicas. Vários estudos sugerem que os sinais de cAMP são compartimentados, e que a compartimentação contribui para a sinalização da especificidade dentro da via de sinalização cAMP. O desenvolvimento de biosensores baseados em transferência de energia de ressonância Fӧrster (FRET) promoveram a capacidade de medir e visualizar sinais cAMP nas células. No entanto, essas medidas são muitas vezes limitadas a duas dimensões espaciais, o que pode resultar em má interpretação dos dados. Até o momento, houve apenas medições muito limitadas de sinais cAMP em três dimensões espaciais (x, y e z), devido às limitações técnicas no uso de sensores FRET que inerentemente exibem baixa relação sinal/ruído (SNR). Além disso, as abordagens tradicionais de imagem baseadas em filtros são muitas vezes ineficazes para a medição precisa de sinais cAMP em regiões subcelulares localizadas devido a uma série de fatores, incluindo crosstalk espectral, força limitada do sinal e autofluorescência. Para superar essas limitações e permitir que os biosensores baseados em FRET sejam usados com fluoroforos múltiplos, desenvolvemos abordagens hiperespectrais de imagem e análise de FRET que fornecem especificidade espectral para calcular a eficiência do FRET e a capacidade de separar espectralmente os sinais FRET de confundir autofluorescência e/ou sinais de rótulos fluorescentes adicionais. Aqui, apresentamos a metodologia de implementação de imagens FRET hiperespectrais, bem como a necessidade de construir uma biblioteca espectral apropriada que não seja subamostra nem supersamplada para realizar descomprturações espectrais. Enquanto apresentamos essa metodologia para medição de distribuições tridimensionais de cAMP em células endoteliais microvasculares pulmonares (PMVECs), essa metodologia poderia ser usada para estudar distribuições espaciais de cAMP em uma gama de tipos celulares.
Introduction
Monofosfato de adenosina cíclica (cAMP) é um segundo mensageiro envolvido em processos celulares e fisiológicos chave, incluindo divisão celular, influxo de cálcio, transcrição genética e transdução de sinais. Um conjunto crescente de evidências sugere a existência de compartimentos cAMP na célula através dos quais a especificidade de sinalização é alcançada1,2,3,4,5,6,7. Até recentemente, a compartimentação cAMP era inferida com base em efeitos fisiológicos ou celulares distintos induzidos por diferentes agonistas receptores acopladosG 8,9,10,11. Mais recentemente, as sondas de imagem de fluorescência baseadas em FRET forneceram novas abordagens para a medição direta e observação de sinais cAMP em uma célula12,13,14.
A transferência de energia de ressonância förster (FRET) é um fenômeno físico no qual ocorre a transferência de energia entre moléculas doadoras e aceitadoras de forma não radiativa quando as moléculas estão próximas15,16. Com o desenvolvimento de indicadores fluorescentes baseados em FRET, esse fenômeno físico tem sido utilizado em aplicações biológicas para estudar interações proteína-proteína17, co-localização proteica18, Ca+2 sinalizando19, expressão genética20,divisão celular21 e sinalização nucleotídea cíclica. Os indicadores cAMP baseados em FRET normalmente consistem em um domínio de vinculação cAMP, um fluoróforo doador e um fluoróforoaceitor 22. Por exemplo, o sensor H188 cAMP12,22 utilizado nesta metodologia consiste em um domínio de ligação cAMP obtido da Epac, sanduíche entre fluoroforos turquesa (doador) e Vênus (aceitador). Em condições basais (sem entrada), Turquesa e Vênus estão em uma orientação de tal forma que o FRET ocorre entre os fluoroforos. Ao vincular o cAMP ao domínio de ligação, ocorre uma alteração conformacional de tal forma que Turquesa e Vênus se afastam, resultando em uma diminuição do FRET.
As abordagens de imagem baseadas em FRET oferecem uma ferramenta promissora para investigar e visualizar sinais cAMP dentro de uma célula. No entanto, as técnicas atuais de imagem microscópica baseadas em FRET são muitas vezes apenas parcialmente bem sucedidas em alcançar força de sinal suficiente para medir o FRET com clareza espacial subcelular. Isso se deve a vários fatores, incluindo a intensidade limitada do sinal de muitos repórteres da FRET, o alto nível de precisão necessário para quantificar com precisão as mudanças na eficiência do FRET e a presença de fatores de confusão, como a autofluorescência celular23,24. O resultado é muitas vezes uma imagem FRET que é atormentada por SNR fraco, tornando muito difícil a visualização de mudanças subcelulares no FRET. Além disso, a investigação de sinais cAMP espacialmente localizados tem sido realizada quase exclusivamente em apenas duas dimensões espaciais e a distribuição axial cAMP raramente foi considerada25. Isso é provável porque o SNR baixo impediu a capacidade de medir e visualizar gradientes cAMP em três dimensões espaciais. Para superar as limitações do uso de sensores FRET com baixo SNR, implementamos abordagens hiperespectrais de imagem e análise para medir o FRET em células únicas25,26,27.
Abordagens de imagem hiperespectral foram desenvolvidas pela NASA para diferenciar objetos terrestres presentes em imagens de satélite28,29. Essas técnicas foram traduzidas para o campo de microscopia de fluorescência30,com vários sistemas comerciais de microscópio confocal oferecendo detectores espectrais. Em imagens tradicionais (não espectrais) de fluorescência, a amostra é animada usando um filtro de passe de banda ou uma linha laser, e a emissão é coletada usando um segundo filtro de passe de banda, muitas vezes selecionado para corresponder ao comprimento de onda de emissão máxima do fluoróforo(s). Em contrapartida, as abordagens de imagem hiperespectral buscam amostrar um perfil espectral completo da emissão de fluorescência26,31,32 ou excitação33,34 em intervalos específicos de comprimento de onda. Em nossos estudos anteriores, mostramos que as abordagens de imagem e análise hiperespectral podem oferecer uma quantificação melhorada dos sinais DE TRAC nas células quando comparadas às técnicas tradicionais de imagem FRET baseadas emfiltros 26. Aqui, apresentamos uma metodologia para a realização de imagens e análises hiperespectrais de FRET hiperdimensionais (x, y, z e λ) para medir e visualizar distribuições cAMP em três dimensões espaciais. Essas abordagens permitiram a visualização de gradientes espaciais cAMP induzidos por agonista em célulasúnicas 25. Curiosamente, dependendo do agonista, gradientes cAMP podem ser aparentes nas células. A metodologia aqui apresentada utiliza o descompreamento espectral de fundo não uniforme e autofluorescência celular para melhorar a precisão das medições de FRET. Embora essa metodologia seja demonstrada em células endoteliais microvasculares pulmonares (PMVECs) utilizando um biosensor CAMP FRET, a metodologia poderia ser facilmente modificada para uso com repórteres fret alternativos ou linhas celulares alternativas.
Protocol
Representative Results
Discussion
O desenvolvimento de biosensores FRET permitiu a medição e visualização de sinais nucleotídeos cíclicos em células únicas, e há grande promessa de visualização de eventos de sinalização subcelular13,22,37,38. No entanto, o uso de biosensores FRET apresenta várias limitações, incluindo as características de baixo sinal-ruído de muitos repórteres fret à base de proteína fluor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de reconhecer o Dr. Kees Jalink (Instituto de Câncer dos Países Baixos e o Centro de Microscopia Avançada van Leeuwenhoek, Amsterdã, Holanda) por nos fornecer o biosensor H188 cAMP FRET e Kenny Trinh (College of Engineering, University of South Alabama) para ajuda técnica na redução do tempo de tempo que leva para executar nossos scripts de programação desenvolvidos sob medida.
Os autores gostariam de reconhecer as fontes de financiamento: American Heart Association (16PRE27130004), National Science Foundation; (1725937) NIH, S100D020149, S10RR027535, R01HL058506, P01HL066299).
Materials
| Attofluor Cell Chamber | Invitrogen | A7816 | Attofluor contains steel cell chambers and a rubber O-ring. Cell chamber holds the coverslip and O-ring provides a lock in mechanism to hold the buffer in cell chamber with out leakage |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | Solvent used to prepare stock solution forskolin. |
| DRAQ5 Fluoroscent Probe Solution | Thermo Scientific | 62252 | Nuclear label |
| Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | Contains nutrients and growth factors for the cells to grow and divide in the culture dishes. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F6178 | Growth factor suppliment that is added to culture medium, DMEM |
| Forskolin | Sigma | F3917 | Adenyly cyclase activator. |
| H188 Cyclic AMP FRET biosensor | Netherland Cancer Institute, Dr. K. Jalink | Gift | Plasmid encoding Turquoise (donor fluorophore), Venus (acceptor fluorophore), and binding domain obtained from Epac. |
| Image J | image.net | Free download | Another image processing platform used to extact spectral information and image processing. |
| Integrating Sphere | Ocean Optics | FOIS-1 | Used to measure illumination intensity of the laser line at different laser intensities (?). |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Invitrogen | 23017-015 | Coverslips are coated with laminin and this helps in cell attachment, growth and motility of the cell. |
| Lipofectamine 3000 Transfection Kit | Invitrogen | L3000-015 | Transfection reagent used to transfect cells with H188 FRET biosensor |
| MATLAB | Mathworks | R2019a | Image processing operations (linear unmixing and FRET efficiency calculations) are performed by writing custom programs in MATLAB programming environment |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon Instruments | Nikon A1R | Spectral image acquisition is performed using confocal microscope. |
| Nikon Elements Software | Nikon Instruments | Software dongle | used to export and handle nd2 image files (multidimensional image files) that are aquired using Nikon A1R |
| NIST-Traceable Calibration Lamp | Ocean Optics | LS-1-CAL-INT | A lamp with a known spectrum for use as a standard |
| PBS pH 7.4 (1X) | Gibco | 10010-023 | coomonly used buffer suring cell culture |
| Pulmonary Microvascular Endothelial Cells (PMVECs) | In house – Cell culture core, Univeristy of South Alabama | Isolated from Rat pulmonary microvasculature | PMVECs form inner lining of a blood vessel. |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco | 15140-122 | antibiotics are added to culture medum to prevent contamination of the cells. |
| Pre-Cleaned Gold Seal Micro Slides | Clay Adams | 3010 | Microscope slides used for cell fixation |
| ProLong Diamond Antifade Mounting Media | Invitrogen | P36961 | If samples are fixed using antifade mountant, then the later protects fluoroscent dyes and chromophores from fading. |
| Spectrometer | Ocean Optics | QE65000 | Used to measure spectral response of the light source (?) |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 | Digests the protein-protein bond between the cell and cell matrix and helps to disscociate and lift the cells during cell plating. |
| Tyrodes Buffer | Made in-house | Made in-house | Tyrodes buffer is used to make working solutions and to maintain cells in aqueous solution during image acquisition. |
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3506 | Laminin coated coverslips are placed in 6-well culture dish (one coverlisps/well). Cells along with medium is added into each well. |
| 25 mm Round Microscope Cover Slips | Fisher Scientific | 12545102 | Cells were grown on round glass coverslips |
| 60X Ojective | Nikon Instruments | Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 | water immersion and commonly used objective for cells |
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