Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Måling af 3-dimensionelle cAMP-fordelinger i levende celler ved hjælp af 4-dimensionelle (x, y, z og λ) Hyperspektral FRET Imaging and Analysis

Published: October 27, 2020 doi: 10.3791/61720
Automatic Translation
1,2, 3, 1, 3, 1,2, 1,2, 1,2,3
1Department of Pharmacology, University of South Alabama, 2Center for Lung Biology, University of South Alabama, 3Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of South Alabama

Summary

På grund af iboende lave signal-til-støj-forhold (SNR) af Fӧrster resonans energioverførsel (FRET) baserede sensorer, måling af cAMP signaler har været udfordrende, især i tre rumlige dimensioner. Her beskriver vi en hyperspektral FRET billed- og analysemetode, der gør det muligt at måle cAMP-distribution i tre rumlige dimensioner.

Abstract

Cyklisk AMP er en anden messenger, der er involveret i en bred vifte af cellulære og fysiologiske aktiviteter. Flere undersøgelser tyder på, at cAMP-signaler er opdelt, og at opdeling bidrager til at signalere specificitet inden for cAMP-signalvejen. Udviklingen af Fӧrster resonans energioverførsel (FRET) baseret biosensorer har fremmet evnen til at måle og visualisere cAMP signaler i celler. Disse målinger er dog ofte begrænset til to rumlige dimensioner, hvilket kan resultere i fejlfortolkning af data. Til dato har der kun været meget begrænsede målinger af cAMP-signaler i tre rumlige dimensioner (x, y og z) på grund af de tekniske begrænsninger ved at bruge FRET-sensorer, der i sagens natur udviser lavt signal til støjforhold (SNR). Derudover er traditionelle filterbaserede billeddannelsesmetoder ofte ineffektive til nøjagtig måling af cAMP-signaler i lokaliserede subcellulære områder på grund af en række faktorer, herunder spektral krydstale, begrænset signalstyrke og autofluorescence. For at overvinde disse begrænsninger og tillade FRET-baserede biosensorer, der skal anvendes med flere fluorophorer, har vi udviklet hyperspektrale FRET billed- og analysemetoder, der giver spektral specificitet til beregning af FRET-effektivitet og evnen til at spektralt adskille FRET-signaler fra forvirrende autofluorescence og / eller signaler fra yderligere fluorescerende etiketter. Her præsenterer vi metoden til implementering af hyperspektral FRET-billeddannelse samt behovet for at konstruere et passende spektralbibliotek, der hverken er undersampled eller oversampled for at udføre spektral ublandet. Mens vi præsenterer denne metode til måling af tredimensionelle cAMP-fordelinger i lungemikrovaskulære endotelceller (PMVECs), kan denne metode bruges til at studere rumlige fordelinger af cAMP i en række celletyper.

Introduction

Cyklisk adenosin monophosphat (cAMP) er en anden messenger involveret i centrale cellulære og fysiologiske processer, herunder celledeling, calcium tilstrømning, gen transskription, og signal transduktion. En voksende mængde af beviser tyder på eksistensen af cAMP rum icellen,hvorigennem signalering specificitet opnås1,2,3,4,5,6,7. Indtil for nylig blev cAMP-opdeling udledt baseret på forskellige fysiologiske eller cellulære virkninger induceret af forskellige G-koblede receptor-agonister8,9,10,11. For nylig har FRET-baserede fluorescensbilledsonder givet nye tilgange til direkte måling og observation af cAMP-signaler i en celle12,13,14.

Förster resonans energioverførsel (FRET) er et fysisk fænomen, hvor energioverførsel sker mellem donor og acceptor molekyler i en ikke-radiativ måde, når molekylerne er i nærheden15,16. Med udviklingen af FRET-baserede fluorescerende indikatorer er dette fysiske fænomen blevet brugt i biologiske anvendelser til at studere protein-protein interaktioner17,protein co-lokalisering18,Ca+2 signalering19, genekspression20, celledeling21 og cyklisk nukleotid signalering. FRET-baserede cAMP-indikatorer består typisk af et cAMP-bindingsdomæne, en donorfluohore og en acceptorfluoriphe22. For eksempel består H188 cAMP sensor12,22, der anvendes i denne metode, af et cAMP-bindingsdomæne fremstillet af Epac, klemt inde mellem turkis (donor) og Venus (acceptor) fluorophorer. Ved basale forhold (ubundet) er turkis og Venus i en retning, så FRET opstår mellem fluorophorerne. Ved binding af cAMP til bindingsdomænet sker der en kropsbygningsændring, så Turkis og Venus bevæger sig fra hinanden, hvilket resulterer i et fald i FRET.

FRET-baserede billedbehandlingsmetoder er et lovende værktøj til at undersøge og visualisere cAMP-signaler i en celle. Men, nuværende FRET baseret mikroskopiske billeddannelse teknikker er ofte kun delvis vellykket i at opnå tilstrækkelig signalstyrke til at måle FRET med subcellulære rumlige klarhed. Dette skyldes flere faktorer, herunder den begrænsede signalstyrke hos mange FRET-journalister, det høje præcisionsniveau, der kræves for præcist at kvantificere ændringer i FRET-effektivitet, og tilstedeværelsen af forvirrende faktorer, såsom cellulær autofluorescence23,24. Resultatet er ofte et FRET-billede, der er plaget af svag SNR, hvilket gør visualisering af subcellulære ændringer i FRET meget vanskelige. Desuden er undersøgelsen af rumligt lokaliserede cAMP-signaler næsten udelukkende blevet udført i to rumlige dimensioner, og den aksiale cAMP-fordeling er sjældent blevet betragtet som25. Dette skyldes sandsynligvis, at lav SNR hindrede evnen til at måle og visualisere cAMP-gradienter i tre rumlige dimensioner. For at overvinde begrænsninger ved at bruge FRET-sensorer med lav SNR har vi implementeret hyperspektral billeddannelse og analysemetoder til måling af FRET i enkeltceller25,26,27.

Hyperspektral billeddannelse tilgange blev udviklet af NASA til at differentiere jordbaserede objekter til stede i satellitbilleder28,29. Disse teknikker er siden blevet oversat til fluorescensmikroskopifelt30, med flere kommercielle konfokale mikroskopsystemer, der tilbyder spektraldetektorer. I traditionelle (ikke-spektrale) fluorescens imaging, prøven er ophidset ved hjælp af et band-pass filter eller en laser linje, og emissionen indsamles ved hjælp af en anden band-pass filter, ofte udvalgt til at matche peak emission bølgelængde af fluorophore (r). I modsætning hertil søger hyperspektral billeddannelsesmetoder at prøve en komplet spektral profil af enten fluorescensemissionen26,31,32 eller excitation33,34 med bestemte bølgelængdeintervaller. I vores tidligere undersøgelser viste vi, at hyperspektral billeddannelse og analyse tilgange kan tilbyde forbedret kvantificering af FRET-signaler i celler i forhold til traditionelle filter-baserede FRET billeddannelse teknikker26. Her præsenterer vi en metode til udførelse af 4-dimensionelle (x, y, z og λ) hyperspektral FRET billeddannelse og analyse til at måle og visualisere cAMP fordelinger i tre rumlige dimensioner. Disse tilgange har gjort det muligt visualisering af agonistiske-inducerede cAMP rumlige gradienter i enkeltceller25. Interessant, afhængigt af agonist, cAMP gradienter kan være synlige i celler. Den metode, der præsenteres her, udnytter spektral blanding af ikke-ensartet baggrund og cellulær autofluorescence til at forbedre nøjagtigheden af FRET-målingerne. Mens denne metode er demonstreret i lungemikrovaskulære endotelceller (PMVECs) ved hjælp af en cAMP FRET biosensor, kan metoden let ændres til brug med alternative FRET-journalister eller alternative cellelinjer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokol følger procedurer godkendt af University of South Alabama Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Fremstilling af celler, prøver og reagenser til billeddannelse

  1. Isoler rottepulmonale mikrovaskulære endotelceller (PMVECs) som beskrevet tidligere35.
    BEMÆRK: Celler blev isoleret og kultiveret af Cell Culture Core ved University of South Alabama, Mobile, AL på 100 mm cellekultur retter.
  2. Frø isolerede PMVECs på 25 mm runde glasdæksler og lad dem vokse i inkubatoren ved 37 °C, indtil cellerne når mindst 80 % sammenløb (mindst 24 timer).
    BEMÆRK: Celler og celletype kan variere fra studie til undersøgelse, og derfor bør cellespecifikke cellekulturprocedurer følges til frø- og vækstceller. Cellen såning og dyrkning protokol, der anvendes i disse undersøgelser er tilgængelig som supplerende oplysninger i filen med navnet "Supplerende File_Cell kultur og transfection".
  3. Transfect PMVECs med fret biosensor og inkuberes i 48 timer ved 37 °C.
    BEMÆRK: Protokollen til transfect PMVECs er også beskrevet i den supplerende informationsfil med navnet "Supplerende File_Cell kultur og transfection".
  4. På billeddagen opvarmes Tyroders buffer til 37 °C i et vandbad.
    BEMÆRK: Tyroders buffer består af 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 10 mM HEPES, 10 mM Glukose, 1 mM MgCl2 og 1 mM CaCl2
  5. Monter en coverlip indeholdende transfected celler i et cellekammer og fastgør toppen med en monteringspakning for at forhindre lækage.
  6. Tør bunden af dækslet ved hjælp af en delikat opgavesletning for at rense overskydende medier eller klæbende celler.
  7. Der tilsættes 800 μL arbejdsbuffer og 4 μL 5 mM atometiket til cellekammeret og sten forsigtigt i 5 – 10 sekunder.
    BEMÆRK: Når du tilføjer buffer- eller reagensopløsninger til dæksler monteret i cellekammeret, skal du sørge for at tilføje opløsningen forsigtigt og ved siden af cellekammeret for ikke at løsne klæbende celler. Tilsætning af 4 μL på 5 mM atommærke til 800 μL buffer gør 25 μM endelig koncentration af atommærke. For løst klæbende celler såsom HEK293 celler, bland nukleare etiket og buffer i et hætteglas først og derefter tilføje til coverslips monteret i cellekammeret. Dette vil forhindre at løfte cellerne fra coverlip.
  8. Dæk cellekammeret med aluminiumsfolie for at beskytte mod lys og inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur.
  9. Reagenspræparat: Tilsæt 1 μL på 50 mM forskolin til 199 μL buffer. Dette vil give en endelig koncentration af forskolin på 50 μM, når de tilsættes celler, der er fremstillet med 800 μL buffer. 1 μL af DMSO i 199 μL buffer bør også være forberedt til at blive anvendt som køretøjskontrol.
    BEMÆRK: I disse undersøgelser anvendes forskolin som en adenylyl cyclase aktivator til at stimulere cAMP-produktionen. Hvis det ønskes, kan denne metode let ændres for at tillade behandling med alternative reagenser til stimulering eller hæmme adenylyl cyclase, fosfodiesteraser osv.

2. Billedopkøb

  1. Brug et konfokalt mikroskop udstyret med en spektral detektor.
    BEMÆRK: Alle billede erhvervelse trin skitseret her blev udviklet ved hjælp af en kommercielt tilgængelige Nikon A1R mikroskop system. Det kan være nødvendigt at justere disse trin, hvis du bruger et alternativt spektralmikroskop. Sørg for, at alt udstyr er tændt mindst 30 minutter før forsøgets start for at opnå stabile driftsforhold.
  2. Vælg 60x vand nedsænkning mål og tilføje en dråbe vand til målet.
    BEMÆRK: Ved høj opløsning af livecellebilleddannelse anbefales det at bruge et mål for høj numerisk blænde. Der henvises til listen over materialer for at få oplysninger om det mål, der anvendes i disse undersøgelser.
  3. Placer det indlæste cellekammer (fra trin 1.7) på mikroskopstadiet.
  4. Vælg det DFT-filter (DAPI/FITC/TRITC), der er indstillet ved at indstille filterknappen i højre side af mikroskopet.
  5. Brug mikroskopet i fluorescens widefield-tilstand ved hjælp af okularerne til at vælge et synsfelt, der indeholder celler, der udtrykker cAMP FRET-sensoren.
    BEMÆRK: Sørg for, at den gennemsnitlige intensitet af FRET-signalet hos donoren eller acceptor emissionens spidsbølgelængde i den valgte celle er mindst 100 intensitetsenheder (A.U.) eller mindst 4X basissignalet i et område uden udtryksceller. Dette kan bekræftes ved hjælp af den spektrumprofilfremviser, der er tilgængelig i NIS Elements-software. Når man leder efter en celle med godt signal, er det tilrådeligt at kassere overdrevent lyse celler (de kan blive kompromitteret).
  6. Åbn NIS-software, skift til konfokal tilstand, lås laserlåsknappen op, og klik på Live.
  7. Brug fokusknappen til at fokusere på cellerne ved at se på forhåndsvisningen på skærmen.
  8. Konfigurer indstillinger for enhed, anskaffelse og z-stack i softwaren som beskrevet nedenfor.
  9. Indstillinger for anskaffelse:
    BEMÆRK: Indstillinger for anskaffelse af kamera og enheder kan anvendes ved hjælp af et tidligere erhvervet billede. Åbn billedet, højreklik, og vælg Genbrug kameraindstillinger.
    1. Åbn A1-indstillingsmenuen, markér felterne svarende til 405 nm og 561 nm laserlinjer, vælg SD til spektral detektor, vælg 10 for opløsning og 31 til kanaler.
      BEMÆRK: A1-indstillingsmenuen vises som et lille gearikon i øverste venstre hjørne af vinduet A1 Plus-indstillinger. 405 nm laser anvendes til donor excitation og 561 nm laser anvendes til nukleare etiket excitation.
    2. Indstil bølgelængdeområdet (410 – 730 nm) ved at vælge start- og slutbølgelængdeværdier.
    3. Klik på ikonet placering/spring over i menuen A1-indstillinger, og vælg den boks, der er nummereret 15, og klik derefter på OK i menuen A1-indstillinger.
      BEMÆRK: Dette er for at fjerne bølgelængdekanalen, der svarer til excitationslaseren på 561 nm (dette er typisk den 15. bølgelængdekanal). Det er vigtigt ikke at bruge dette bølgelængdebånd for at undgå et kunstigt lavt signal, som kan skabe en spektral artefakt. Signalet er lavere i dette bånd på grund af den mekaniske finger, der dækker detektorelementet for at beskytte det mod laserskader.
    4. Indstil laserintensiteterne til 8% og 2% for henholdsvis 405 nm og 561 nm lasere, Si Hv (detektor gain) ved 149 og en pinhole radius på 2,4 luftige diskenheder (AU).
      BEMÆRK: Laserintensiteter skal muligvis justeres afhængigt af instrumentets alder og lasernes tilstand. Hvis laserintensiteter justeres mellem forskellige prøver eller forsøgsgrupper, er det vigtigt at opretholde det samme forhold mellem laserintensiteter (f.eks. 8:2). Derudover er det vigtigt at vælge en laserintensitet, der ikke er så lys, at der oprettes hurtig fotografering. Detektorgevinsten skal justeres for at maksimere signalintensiteten, samtidig med at detektorstøj minimeres. Til disse undersøgelser blev der anvendt en gevinst på 149. En pinhole størrelse på 2,4 AU blev valgt som en balance mellem at erhverve billeder med tilstrækkeligt signal til støj ratio (SNR) og opretholde optisk sektion (confocality). En stigning i pinhole størrelse øger SNR, men reducerer confocality.
    5. Indstil scanningshastigheden til 0,25 spektralrammer i sekundet, vælg det ikon, der svarer til ensrettet scanningsretning, indtast 4 for optællingen, og angiv 1024 x 1024 for scanningsstørrelse.
      BEMÆRK: FRET-signaler er svage, og der kræves ofte en langsom scanningshastighed. Ved hjælp af scanningshastighed på 0,25 er erhvervelsen af en spektral z-stack afsluttet på ~ 3 minutter. Scanningshastigheden kan øges eller sænkes afhængigt af de anvendte fluorheste. For eksempel kan der anvendes hurtigere scanningshastighed (2 billeder/sekund) for lysere fluorophorer som eGFP. Det indtastede antal svarer til en ramme i gennemsnit på 4, hvilket hjælper med støjreduktion under billedopsamling. For meget stabile prøver, og hvor tiden ikke er en begrænsning, kan højere gennemsnitsværdier (op til 16) bruges til at opnå billeder med forbedret SNR.
  10. Definer parametre for anskaffelse af z-stack:
    BEMÆRK: De værdier, der er angivet i trin 2.10, skal muligvis justeres for at imødekomme ændringer i fluorescerende etiketbinding eller -koncentration, etikettype, antal anvendte etiketter, cellelinje og andre ændringer i prøveforberedelsen, der kan påvirke cellemærkningstætheden og/eller cellulær autofluorescence. Ved justering af anskaffelsesparametre skal man være forsigtig med at opnå en tilstrækkelig SNR, samtidig med at der minimeres fotobleaching. Derudover skal der ved konfigurationen af en spektral FRET-analyse udvises forsigtighed for at sikre, at parametre fungerer godt på tværs af alle behandlingsgrupper. Det er tilrådeligt at køre et forsøg med hver behandlingsgruppe med de foreslåede parameterindstillinger for at sikre, at SNR er tilstrækkelig, og fotografering minimeres.
    1. Åbn vinduet ND-anskaffelse ved at klikke på vis → anskaffelseskontrol → ND-anskaffelse.
    2. Angiv stien/destinationen og et filnavn for at gemme ND-filen i pop op-vinduet.
    3. Markér det afkrydsningsfelt, der svarer til z-serien.
    4. Klik på live i vinduet A1 Plus-indstillinger. Dette åbner et live visningsvindue.
    5. Juster fokusknappen på mikroskopet for at markere toppen af cellen, og klik på Øverst i vinduet ND-anskaffelse for at angive den aktuelle placering som øverst.
      BEMÆRK: Det foreslås at fokusere lidt over toppen af cellen for at sikre, at hele cellen er udtaget prøver i z-serien.
    6. Juster fokusknappen på mikroskopet for at markere bunden af cellen, og klik nederst i vinduet ND-anskaffelse for at angive den aktuelle position som bund.
      BEMÆRK: Fokuser lidt under bunden af cellen for at sikre, at der udtages prøver af hele cellen.
    7. Indtast 1 μm for trinstørrelse, vælg top-bottom for z-scan retning og klik køre på ND Acquisition vinduet for at erhverve en z-stack.
      BEMÆRK: Trinstørrelse bestemmer antallet af z-skiver, der vil blive erhvervet afhængigt af top- og bundplaceringer (dvs. den tilbagelagte afstand). En 1 μm trinstørrelse blev valgt som et kompromis mellem billedhastighed, z-akse prøveudtagning og fotobleaching. Ved hjælp af den confocal pinhole diameter på 2,4 AU og 60x vand nedsænkning mål resulterede i optisk sektion tykkelse på 1,73 μm. Derfor er en 1 μm trinstørrelse lidt under Nyquist-prøveudtagningskriterierne, men dette er et kompromis, der blev lavet for at reducere den tid, der er nødvendig for at erhverve en z-stack. For meget stabile prøver, for hvilke hastigheden ikke er kritisk, kan der anvendes et mindre z-aksetrin og muligvis en mindre konfokal pinhole diameter til at øge z-akseopløsningen. Bottom-top bør give lignende resultater og kan bruges til at evaluere eventuelle virkninger af photobleaching, der kan opstå under z scanning.
  11. Konfigurer PFS (Perfect Focus System), hvis det er tilgængeligt:
    BEMÆRK: PFS gør det muligt for systemet at kompensere for udsving i fokusdybden under billedopkøb. Følgende trin kan bruges til at konfigurere PFS, og disse trin kan variere en smule afhængigt af versionen af Nikon A1R og den anvendte version af NIS-elementer.
    1. Fremhæv symmetrisk tilstand, der er defineret af områdeikonet i vinduet til anskaffelse af ND.
    2. Tænd PFS-knappen på mikroskopets forside (sørg for, at den dichroiske spejlknap, der er placeret på afsnittet under prøvestadiet, er 'in').
    3. Omdefiner toppen (roter mod uret) og bunden (roter med uret) ved hjælp af knappen på forsiden af PFS-forskydningscontrolleren.
    4. Definer en relativ z-position/z-dybde ved at klikke på 'relativ' i vinduet ND-anskaffelse.
    5. Klik på hukommelsen på forsiden af mikroskopet, så softwaren husker den relative z-dybde udenad.
  12. Når z-stack erhvervelsen er færdig, tilsæt forsigtigt det ønskede reagens (forskolin eller køretøjskontrol) ved hjælp af en pipette og vent i 10 minutter.
    BEMÆRK: Tilsæt reagenset meget forsigtigt for ikke at forstyrre cellerne eller flytte cellekammerets position inden for mikroskop XY-stadiet; Det er nyttigt at kontrollere i en efterfølgende livevisning eller et efterfølgende billede, at synsfeltet ikke er flyttet under tilføjelsen af reagens. Ventetiden på 10 minutter er, at forskolin-behandlingen træder i kraft. Hvis der anvendes en alternativ behandling, skal ventetiden muligvis justeres.
  13. Efter 10 minutter skal du ændre filnavnet og klikke på kør i vinduet ND-anskaffelse.
  14. Gentag trin 2.11 – 2.13 som beskrevet ovenfor for mindst 5 coverslips for at opnå tilstrækkelige resultater til statistisk analyse (n=5 for hver behandlingsgruppe – forskolin og køretøjskontrol).
  15. Forbered eksempler og prøveemner til at konstruere spektralbiblioteket og erhverve spektralbilleder ved hjælp af lignende anskaffelsesindstillinger som beskrevet i trin 2.9 og 2.10.

3. Billedanalyse

BEMÆRK: Disse billeder vil blive brugt til at konstruere et spektralbibliotek, der indeholder det rene spektre af alle individuelle slutmedlemmer, der er til stede i undersøgelsen. Slutmedlemmerne i spektralbiblioteket kan variere fra studie til undersøgelse, hvis der anvendes forskellige fluorheste. En detaljeret procedure for opførelse af spektralbiblioteket findes i en supplerende informationsfil med navnet "Supplerende File_Spectral Bibliotek". Her beskriver vi eksport af data til .tiff filer, lineær spektral ub blanding, FRET-effektivitetsmålinger, tredimensionel rekonstruktion og cAMP-niveauer estimering. Billedanalyse kan udføres ved hjælp af forskellige billedanalyse- og programmeringsplatforme som ImageJ, Python, MATLAB eller CellProfiler. I disse undersøgelser blev MATLAB-scripts brugt.

  1. Eksporter billeddata:
    1. Opret nye mapper med det samme filnavn, der svarer til de spektrale z-stack-billeder, der er anskaffet i trin 2.13 og 2.14.
      BEMÆRK: Følgende trin, der er skitseret for eksportdata, er specifikke for NIS Elements AR version 4.30.01. Disse trin kan variere en smule afhængigt af versionen af softwaren.
    2. Klik på Filer, som åbner et filvindue. Gennemse og vælg den spektrale billedfil, der blev anskaffet i trin 2.12 , og klik på Åbn.
    3. Når filen er indlæst, skal du klikke på Filer→ Importér/eksporter→ Eksporter ND-dokument.
    4. I pop op-vinduet: Gennemse og vælg den mappe, der blev oprettet i trin 3.1.1, vælg TIF (Tagged Image Format) for filtype, og vælg derefter Mono-billede for hver kanal og Bevar bitdybde.
      BEMÆRK: Filpræfikset vil blive forhåndsgenereret. ændre denne værdi for nemheds skyld. Indeksrækkefølgen ændres afhængigt af de valgte kanaler og skal vise "z, c" til indeksering i henhold til z-slice placering først og bølgelængdebånd nummer sekund. Kontroller, at de bokse, der svarer til Anvend LUTs eller Indsæt overlejringer eller Brug punktnavne, ikke er markeret.
    5. Klik på Eksporter for at eksportere tiff-filerne til en destinationsmappe som individuelle tiff-filer.
    6. Gentag trin 3.1.2 – 3.1.5 for at eksportere spektrale billedfiler, der blev anskaffet i trin 2.13.
  2. Lineær spektral ublandet:
    1. Åbn programmeringssoftwaren.
      BEMÆRK: Specialudviklet programmering script til at mix rå spektrale billeder er fastsat på University of South Alabama BioImaging og BioSystems hjemmeside, under fanen Ressourcer (https://www.southalabama.edu/centers/bioimaging/resources.html).
    2. Åbn filen med navnet "Lineær blanding.m", og klik på knappen Kør på værktøjslinjen i editoren.
    3. Gennemse og vælg den mappe, der indeholder den eksporterede *.tif filsekvens, der genereres af NIS Elements-softwaren.
    4. Klik på OK for at fortsætte, som åbner et nyt vindue kaldet Wavelength og Z-Slice.
    5. Kopier filnavnet på den første fil (uden z-slice og kanalnummer) i den mappe, der blev valgt i trin 3.2.4, og indsæt den i det første trin i dialogboksen med navnet "Enter the Image Name".
    6. Angiv antallet af kanaler i det andet trin med navnet "Angiv antallet af bølgelængdebånd", antal z-udsnit i tredje trin med navnet "Angiv antallet af Z-udsnit", og klik på OK.
      BEMÆRK: Antallet af bølgelængdebånd kan ændre sig, hvis der foretages ændringer i anskaffelsesindstillingerne, f.eks. Antallet af Z-udsnit kan også ændre sig afhængigt af cellens højde.
    7. Gennemse og vælg bølgelængdefilen kaldet "Wavelength.mat" i pop op-vinduet med navnet "Vælg bølgelængdeoplysningsfilen", og klik på åbn.
    8. Gennemse og vælg filen "Library.mat" i det nye pop op-vindue med navnet "Vælg spektralbiblioteksfilen", klik på åbn og vent, indtil blandingen af udsnitdene er færdig.
      BEMÆRK: Library.mat fil er en fil, der indeholder ren spektre for hver endmember fluorophore sammen med celle autofluorescence og baggrund spektrale signaturer. I dette tilfælde omfatter endmember fluorophores turkis, Venus og DRAQ5. Baggrund spektrale signaturer omfatter cellulære eller matrix autofluorescence, coverslip fluorescens, og coverslip diffraktion. Wavelength.mat fil er en fil, der indeholder bølgelængde kanal oplysninger, der anvendes til at erhverve det spektrale billede. Et eksempel på biblioteksfil og bølgelængdefil er tilgængelige på Bioimaging- og Biosystems' websted (se noten under 3.2.1). Du kan finde flere oplysninger om, hvordan du genererer spektralbiblioteks- og bølgelængdefiler, i supplerende informationsfil med navnet "Supplerende File_Spectral Library". Ikke-brændte billeder, der svarer til hvert z-udsnit, gemmes i mappen "Unmixed", der oprettes under blandingsprocessen i den mappe, der blev valgt i trin 3.2.3.
  3. FRET-effektivitetsberegning:
    1. Åbn programmeringsscriptet "multiFRRCF.m", og klik på kør.
      BEMÆRK: Denne programmeringsfil er tilgængelig på University of South Alabama Bioimaging and Biosystems hjemmeside (se note under trin 3.2.1).
    2. Angiv antallet af eksperimentelle forsøg, der skal analyseres i pop op-dialogboksen , der kaldes "hvor mange mapper der skal reslice", og klik på OK.
      BEMÆRK: Billeddata fra hvert eksperiment skal gemmes i en separat ublandet billedmappe. Dette trin gør det simpelthen muligt for analysekoden at sløjfe over mange mapper som et tidsbesparende trin.
    3. Gennemse og vælg de ikke-mixede mapper, og klik på OK.
      BEMÆRK: Det antal gange, pop op-vinduet "Søg efter mappe" åbnes, afhænger af det antal, der er angivet i dialogboksen "Hvor mange mapper der skal reslice" i forrige trin. Gennemse og vælg mapperne efter hinanden.
    4. I det nye popup-vindue skal du indtaste følgende oplysninger i de respektive bokse: skaleringsfaktoren er 12.4, Threshold er 5.6, X, Y og Z Frequency er henholdsvis 5, 5 og 1, og udjævningsalgoritmen er gaussisk.
      BEMÆRK: Skaleringsfaktoren er en værdi i pixel/μm og vil blive brugt til at skalere Z-retningsprøvetagningen til XY-retningen. Skaleringsfaktoren hentes fra billedets pixelstørrelse, som normalt leveres som metadata i billedet for de fleste konfokale mikroskopsystemer. Hvis billedet f.eks. er erhvervet med 0,08 μm/pixelafstand, skal skaleringsfaktoren være 12,5 pixel/μm. Tærskelværdien bruges til at tærskel billederne og generere en binær maske af cellen. Vi har lavet en liste over optimale værdier baseret på billedet donor + acceptor intensitet. Brug 4,5 som en for tærskelværdi, hvis billedet har lys donor+acceptorintensitet og lav baggrund, en værdi mellem 5,6 og 6,5 for billeder, der kun har moderat donor+acceptorintensitet og/eller højere baggrund, og en værdi på 7,5 og derover for billeder med en donor+acceptorintensitet, der er lavere end baggrunden. Frekvensværdien svarer til intervallet i antal pixel, hvor udskæringen udføres i de efterfølgende trin. Hvis cellens Z-dybde f.eks. er 17 μm med en 1 μm trinstørrelse, og der anvendes en skaleringsfaktor på 12,5 pixel/μm i XY-retningen, vil dybden af det 3-dimensionelle billeddatasæt blive resampled ved 212 pixels (Z-retning). Baseret på den indtastede Z-frekvensværdi (f.eks. 1 pixel) vil det 3-dimensionelle billeddatasæt blive skåret op igen, der begynder øverst i billeddatasættet og derefter flyttes i intervaller på 1 pixel nedad. Dette resulterer i 212 resliced billeder. Hvis der blev angivet et større frekvensværdiinterval for Z Frequency, genereres der færre resliced-billeder. Resliced billeder gemmes i efterfølgende trin.
    5. Klik på Kør og vent, indtil alle FRET-målinger og reslicing udføres.
      BEMÆRK: Der oprettes en separat mappe i den overordnede mappe, hvor der gemmes resliced gråtoneskala FRET-effektivitetsbilleder og farvede (et farvekort anvendt) FRET-effektivitetsbilleder. Alle fret-billeder med gråtoner og farvekort, der er resliced i X-retningen (YZ-plan), gemmes Resliced_XFRET f.eks.
    6. Gentag analysen med lignende indstillinger for alle eksperimenterne – før og efter forskolin behandlinger og køretøjskontroller.
      BEMÆRK: Trin, der er nævnt i afsnit 3.3, beskriver de værdier, der skal indtastes for det brugerdefinerede FRET-analyseprogrammeringsscript til generering af 3-dimensionelle FRET-billeddata. Dette script udfører dog flere handlinger under kørsel, herunder: indlæsning af billeddata, oprettelse af billedstakke, udjævning, FRET-effektivitetsberegninger, oprettelse og anvendelse af en cellekantmaske, 3-dimensionel billedrekonstruktion, udskæring af 3-dimensionelle billeder med bestemte intervaller (frekvenser), anvendelse af et farvekort til visualisering af FRET-ændringer og lagring af reslicerede billeddata i den samme mappe. Yderligere oplysninger er medtaget som kommentarer i programscriptet.

4. Kortlægning af FRET-effektivitet til cAMP-niveauer

  1. Åbn programmeringsfilen med navnet 'Mapping_FRET Efficiency_to_cAMP_concentration.m', og klik på kør i hovedvinduet.
    BEMÆRK: Filen er tilgængelig på BioImaging- og BioSystems' websted (se note under 3.2.1). Denne fil læser gråtoneskala FRET effektivitet billeder og konverterer dem til cAMP niveauer baseret på en karakteristisk kurve. Denne karakteristiske kurve bruger en cAMP-til-FRET forhold dokumenteret i litteratur15,36, der er beskrevet af Hill ligning (den tredje ligning vist nedenfor). Men Kd af sonden i intakte celler er vanskeligt at vurdere, og vi har antaget, at det er 1 μM i vores beregninger. Derfor vises resultaterne som en funktion af Kd. (dvs. [cAMP] = x* Kd). Ligninger, der bruges til at måle FRET-effektivitet og kortlægge FRET til cAMP-niveauer, er vist nedenfor:
    Equation 1
    Hvor E er FRET effektivitet, og entilsyneladende og dtilsyneladende er ublandet pixel intensiteter af acceptor og donor billeder, henholdsvis.
    QA og Qd er kvante udbytter af acceptor og donor. Bemærk, at Qa og Qd annullere, når ligningen for kλ er indarbejdet i FRET effektivitet ligning, kλ er en korrektion faktor:
    Equation 2
    Equation 3 og Equation 4 er udryddelseskoefficienter af donor og acceptor på donor excitation bølgelængde, i (405nm).
    Equation 5
    E er FRET-effektivitet og KD = Dissociationskonstant = 1 μM.
  2. Naviger og vælg det første FRET-billede med grå skala (gemt i trin 3.3.5), og klik på OK.
  3. Åbn FRET/cAMP-billederne for at inspicere fordelingen af cAMP-signaler i tre dimensioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokol beskriver brugen af hyperspektrale FRET-billed- og analysemetoder til måling af cAMP-gradienter i tre rumlige dimensioner i levende celler. Der er flere vigtige trin involveret i at generere disse resultater, for hvilke der kræves omhyggelig opmærksomhed, mens du analyserer og kvantificerer dataene. Disse vigtige trin omfatter opførelse af et passende spektralbibliotek, baggrundsspektral spektral ub blanding, tærskeling for at identificere cellekanter og FRET-effektivitetsberegninger. Figur 1 illustrerer den skematiske strøm af alle de trin, der er involveret i målingen af FRET-effektivitet og cAMP-niveauer i levende celler. Når disse billed- og analysetrin udføres korrekt, vil det gøre det muligt at måle FRET-effektivitet og estimering af rumlige cAMP-gradienter i 3 dimensioner i en celle, samtidig med at der tages højde for ikke-ensartede baggrundssignaler.

Figur 2 viser 3-dimensionelle visninger af falskfarvede rå hyperspektrale billeddata, der er erhvervet ved hjælp af et Nikon A1R-konfokalt mikroskop ved baselinebetingelser (Figur 2A) og 10 minutter efter (Figur 2B) tilskolinbehandling. Bemærk, at lignende detektor- og systemparametre blev brugt til at erhverve før og efter behandlingsbilledstakke for at opretholde konsistens til kvantitativ analyse. Bemærk også, at ændringer i FRET ikke er indlysende i dette billede, da dette udelukkende er en visualisering af rådata, før du beregner FRET-effektiviteten.

Et spektralbibliotek med rent spektre af alle slutmedlemmer er nødvendigt for yderligere at analysere rå spektrale billeddata. Opbygning af et passende spektralbibliotek er et af de vigtigste trin for at sikre passende målinger af FRET-effektivitet. Figur 3 viser opførelsen af et spektralbibliotek, der indeholder slutmedlemmernes rene spektre (i disse aktuelle undersøgelser er slutmedlemmerne turkis, Venus og DRAQ5). For at måle FRET-effektivitet er det vigtigt at opnå spektret af turkis og venus ved hjælp af en prøve med 1:1 stoichimetri. Her har vi givet en tilgang, hvor acceptor fluorophore er helt fotodestrueret, så spektrale signaturer af donor og acceptor med 1:1 stoichiometri, der skal opnås (Figur 3A-F). Derudover blev lineære effektrelationer mellem laserne (supplerende figur 1) anvendt til at beregne acceptorspektret med en intensitet, der ville forventes, hvis det var begejstret ved hjælp af donor excitation laser, i dette tilfælde 405 nm for turkis (Figur 3G). Dette sikrer, at ublandet donor- og acceptorsignaler er sammenlignelige i absolut intensitet, når FRET er begejstret med en enkelt 405 nm laserlinje. Ikke-transfected celler mærket med det nukleare farvestof, DRAQ5 (Figur 3H) blev udnyttet til at opnå det rene spektrum af DRAQ5 (figur 3I). Ved at kombinere donorens spektre , Turkis (Figur 3F), acceptor, Venus (Figur 3G) og DRAQ5 (Figur 3I), blev der oprettet et 3-komponentbibliotek (Figur 3J).

Signaler fra andre kilder end fluorescerende etiketter kan også være til stede i en prøve. For at tage højde for disse blev tre forskellige spektrale signaturer med toppe, der forekommer ved 424 nm, 504 nm og 574 nm, identificeret i umærkede cellulære prøver. Vi mener, at disse spektrale signaturer svarer til coverslip reflektion og celle matrix eller cellulær autofluorescence. Figur 4 skildrer kilderne til disse tre baggrundsspektrale signaturer. Det er vigtigt at bemærke, at disse signaler distribueres ikke-ensartet i prøven og derfor ikke blot kan trækkes ud. Men at tilføje de spektrale signaturer af disse signaler til spektralbiblioteket og bruge lineær ubblanding til at adskille signalerne præsenterer en tilgang til at fjerne disse forvirrende signaler fra donoren og acceptorsignalerne, før der beregnes FRET-effektivitet. For at opnå dette blev de tre baggrundsspektrale signaturer føjet til 3-komponentspektralbiblioteket og dannede et nyt 6-komponentbibliotek bestående af donor (turkis), acceptor (Venus), DRAQ5 og tre baggrundsspektrale signaturer.

Et brugerdefineret programmeringsscript blev skrevet for at løsne de spektrale billeddata i individuelle slutmedlemmer, og der blev skrevet et separat script til at udføre efterfølgende FRET-effektivitetsberegninger. Lineær spektral ub blanding (illustreret i figur 5) blev udført ved hjælp af 6-komponent spektralbiblioteket. Ublandet blev udført for hvert udsnit i den aksiale billedstak, også kaldet z-stack (se den 3-dimensionelle visualisering af rå spektrale billeddata i figur 5A). Dette resulterede i separate ublandet billeder for hvert slutmedlem, for hver z-skive i z-stack (Figur 5C-E, baggrund ublandet billeder er ikke vist). Hvis det ønskes, kan de ublandet signaler være falskfarvede til visualisering med en anden farve, der er tildelt hvert ublandet signal (Figur 5F-H).

Figur 6 illustrerer de trin, der er involveret i FRET-effektivitetsberegningerne, samt trinnene til kortlægning af FRET-effektivitet til cAMP-niveauer. En FRET effektivitet billede blev genereret ved hjælp af glattet ublandet donor og acceptor billeder. Et binært maskebillede blev opnået ved hjælp af ublandet donor, acceptor og nukleare billeder. Masken blev anvendt på FRET effektivitet billede for at fjerne bidrag fra pixels uden for cellen. Selvom ublandet billeder fra enkelte z-skiver blev brugt til billedlig demonstration af FRET-effektivitetsmålinger, blev disse beregninger udført på hvert udsnit i den 3-dimensionelle billedstak. Det 3-dimensionelle FRET-billeddatasæt blev derefter resliced i tre ortogonale planer for at visualisere rumlige gradienter af cAMP-signaler i forskellige retninger.

Visualisering af agonistiske ændringer i FRET-effektivitet og cAMP-niveauer
De trin, der er beskrevet ovenfor, giver en metode til beregning af FRET-effektivitet og cAMP-niveauer fra hyperspektrale billeddata i tre rumlige dimensioner. Disse trin kan anvendes på cellulære præparater før og efter behandling med forbindelser, der fremkalder en cAMP respons, såsom forskolin. Her giver vi et eksempel på at bruge denne tilgang til at observere ændringer i FRET og cAMP distribution i PMVECs efter behandling med 50 μM forskolin. Figur 7 illustrerer ændringerne i FRET-effektivitet og cAMP-niveauer i forskellige XY-planskiver (z skiver), fra apikale til basale, hvilket gør det muligt at sammenligne baseline-tilstande (før forskolinbehandling) og 10 minutter efter behandlingen. I dette illustrative eksempel faldt FRET-effektiviteten (kolonne 1 og 3 i figur 7) ved forskolinbehandling, hvilket korrelerede med en stigning i cAMP-niveauerne (kolonne 2 og 4 i figur 7). Der blev observeret minimal rumlig variation af cAMP i et enkelt XY-plan. Imidlertid blev aksiale (apikale til basal) cAMP rumlige gradienter observeret, som det kan antages ved at bemærke, at den apikale skive har en dybere rød farve (angiver højere cAMP-niveauer gennem farveopslagstabellen, der blev anvendt) end den basale skive efter forskolinbehandling (kolonne 4 i figur 7). Axial FRET eller cAMP fordelinger kan ofte bedre visualiseres ved hjælp af billeder fra de to ortogonale rumlige planer: Figur 8 skildrer FRET effektivitet og cAMP niveauer i YZ flyet ved baseline (kolonne 1 og 2) og 10 minutter efter forskolin behandling (kolonne 3 og 4), mens supplerende figur 2 skildrer FRET effektivitet og cAMP niveau ændringer i XZ flyet. Disse resultater viser, at det er muligt at måle FRET og estimere cAMP-niveauer fra 3-dimensionelle hyperspektrale billeddata og viser også vigtigheden af at visualisere aksiale fordelinger af FRET eller cAMP. Mens uden for rammerne af denne metodiske papir, kan det være, at aksiale rumlige fordelinger af cykliske nukleotider bidrage til specificitet inden for cyklisk nukleotid signalering veje.

Når du udfører de metoder, der er beskrevet ovenfor, er det vigtigt at omhyggeligt kontrollere nøjagtigheden af trinene og køre passende eksperimentelle og køretøjskontroller for at sikre, at ændringer i FRET (og tilsvarende cAMP) skyldes faktiske ændringer i donor- og acceptorsignaler og ikke billedbehandlingsartefakter. Vigtige skridt, der skal overvejes, omfatter f.eks.:

Brug af et passende spektralbibliotek, der indeholder alle de nødvendige spektralkomponenter
Som nævnt kan der være et betydeligt bidrag af baggrundssignaler fra cellulær autofluorescence, deponeret matrix eller reflekteret lys fra dækslet (excitation-emission bleed through). Figur 9 repræsenterer et eksempeldatasæt, der illustrerer, at baggrundssignalet blev bevaret i billederne, da et 3-komponents bibliotek (turkis, Venus og DRAQ5) blev brugt til at afmikse de spektrale data. I modsætning hertil blev baggrundssignalet effektivt fjernet, når der blev brugt et mere komplet (og passende) spektralbibliotek med 6 komponenter.

Bruge en optimal tærskelværdi til at generere en cellemaske
I mange af de eksperimenter, vi har udført, er baggrundssignalintensiteten ca. 50-60% af FRET-signalintensiteten, der er til stede i de rå spektrale billeddata (dvs. når man visualiserer uforarbejdede spektrale billeddata, er toppen af FRET-signalet kun ~ 2X højere end det omgivende baggrundssignal). Således adskillelse af baggrundssignal fra forgrundssignal ved hjælp af en tærskelværdi for at opnå en binær maske er et følsomt skridt og skal udføres omhyggeligt for at undgå analyse artefakter. Figur 10 illustrerer effekten af forskellige tærskelværdier, der anvendes til cellesegmentering for at oprette en binær maske af cellen. En lav tærskelværdi kan omfatte baggrundssignal som en del af den udtrykkende celle. På den anden side kan en alt for høj tærskelværdi udelukke måling af FRET i lavhæmte celler eller områder i en celle med lavt donor+acceptorsignal (enten meget tynde dele af cellen eller dele, der kan have en lavere regional koncentration af FRET-sonden).

Valg af en transfected celle med donor+acceptor signalintensitet ≥ baggrundssignal
Figur 11 illustrerer et eksempeldatasæt, hvor FRET-effektivitet og tilsvarende niveauer blev målt fra ublandet billeder, der blev opnået ved hjælp af et spektralbibliotek med 6 komponenter til lineær spektral ublandet. På trods af at du brugte 6-komponent biblioteket til at løsne spektrale billeddata og vælge en høj tærskel for oprettelse af celle kant og nukleare maske, FRET effektivitet billeder var stadig tilbøjelige til høj baggrundsstøj signal nær den basale side af cellen. I dette tilfælde skyldtes tilstedeværelsen af baggrundsstøj valg af en celle, der kun svagt udtrykte FRET-sonden, og donor+acceptorsignalstyrken var omtrent lig med baggrundssignalstyrken, selv efter blanding. Ud over at anvende de sofistikerede analysetrin, der er beskrevet ovenfor, er det således også vigtigt at vælge en celle med tilstrækkeligt udtryk for FRET-sonden og tilsvarende tilstrækkeligt FRET-signal (donor- og acceptorsignal, der mindst er lig med eller over støjsignalet) under erhvervelsen for at sikre resultater af høj kvalitet.

Figure 1
Figur 1: Rutediagram, der skildrer de trin, der er involveret i FRET-effektivitet og niveaumålinger i tre rumlige dimensioner ved hjælp af hyperspektral FRET-billeddannelse og -analyse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: En 3-dimensionel visualisering af en celle, der udtrykker cAMP FRET reporter (grøn) og kerner fra cellen og de omkringliggende ikke-udtrykkende celler (rød). Rå spektrale billeddata erhvervet ved hjælp af et Nikon A1R spektrale konfokale mikroskop er blevet falsk farvet i henhold til bølgelængde og visualiseret i 3 dimensioner ved hjælp af NIS Elements software. A) 3-dimensionelle billeddata ved baseline og B) 10 minutter efter 50 μM forskolinbehandling. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Opførelse af et spektralbibliotek, der indeholder det rene spektre af fluorescerende etiketter i undersøgelsen (benævnt slutmedlemmer af telemålingsfeltet). A) Et falsk farvet billede af celler, der udtrykker FRET biosensor erhvervet ved 405 nm excitation (donor excitation). B) Spektrum svarende til FRET signal: 4 forskellige regioner af interesse (ROI) blev tegnet på billede A vist af røde, gule, blå og grønne rektangler. Gennemsnitlig intensitet ved hver bølgelængde for hvert valgte investeringsafkast blev eksporteret. Den gennemsnitlige intensitet fra disse 4 ROI'er blev afbildet ved hver emissionsbølgelængde. Emissionen toppe af spektret svarer til både donor (turkis) og acceptor (Venus) fluorophores. C) Et falsk farvet billede af celler, der udtrykker FRET biosensor erhvervet ved 488 nm excitation (acceptor excitation). D) Det gennemsnitlige spektrum blev anslået som forklaret i B fra flere investeringsafkast i C (de samme regioner som i A) med emissionstop kun på grund af acceptoren. E) Et falsk farvet billede af celler, der udtrykker FRET biosensor erhvervet ved 405 nm excitation efter foto-ødelæggelse af acceptor fluorophore med 514 nm bestråling. F) Det gennemsnitlige spektrum blev anslået som forklaret i B fra flere investeringsafkast i E (de samme regioner som A) med emissionstop, der kun skyldes donoren. BEMÆRK, at donorintensiteten øges i F sammenlignet med den oprindelige FRET-signal, hvilket indikerer, at donor excitation efter fotografering af acceptoren fører til direkte donorudslip. G) Acceptorspektret, som man kunne forvente, hvis det opnås ved hjælp af 405 nm excitation. Dette blev anslået ved at udnytte de faktiske omstændigheder, at 405 nm og 488 nm excitation lasere har en lineær reaktion, som kan karakteriseres ved hjælp af et spektrometer og integrere kugle (supplerende figur 1) og bølgelængde-afhængige udryddelse koefficient af Venus. Derfor kan Venus spektrum opnået på 488 nm excitation omdannes til Venus spektrum, der ville forventes, hvis de opnås ved 405 nm excitation H) En falsk-farvet billede af celler mærket med den nukleare etiket, DRAQ5. I) Det gennemsnitlige spektrum fra flere interesseområder i H.J) Det resulterende spektralbibliotek, der indeholder donorens og DRAQ5's normaliserede rene spektrespektre og det excitationsbølgelængdekorrigerede spektrum af acceptoren. Bemærk, at turkis og Venus spektre blev normaliseret til den maksimale værdi af kombinerede turkis + Venus spektrale data, mens DRAQ5 simpelthen blev normaliseret til enhed ved værdien af peak emission bølgelængde. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Baggrundsspektrale signaturer blev identificeret og medtaget i spektralbiblioteket for at tage højde for baggrundslysstofscenssignaler under blandingsprocessen. A, B) Der blev observeret to baggrundslyscensspektrale signaturer, når der blev karakteriseret en prøve blank (umærket coverlip). Disse spektrale signaturer blev navngivet baseret på deres peak bølgelængder - en på 424 nm (fra coverslip fluorescens) og den anden på 504 nm (sandsynligvis fra reflektion eller tilbage scatter). C) En tredje baggrund spektral signatur blev observeret med en peak emission bølgelængde på 574 nm, når ikke-mærkede celler blev analyseret, potentielt fra cellulære autofluorescence eller fluorescens af den underliggende matrix. D) Baggrundsspektre udtrukket fra billeder A, B og C. Disse tre baggrundsspektre blev føjet til det eksisterende 3-komponentbibliotek (Figur 3J) for at udvikle et spektralbibliotek med 6 komponenter. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Lineær spektral ublandet blanding ved hjælp af et spektralbibliotek med 6 komponenter, der tegner sig for baggrundssignaler. A) Rå spektrale billeddata, der er erhvervet som en aksial z-stack. B) 6-komponent spektralbibliotek bruges til lineært at løsne rå spektrale data. C, D og E) Gråskala ublandet billeder af DRAQ5, Turkis, og Venus, henholdsvis skyldes lineær spektral utilblanding. F, G og H) Falske ublandet billeder af henholdsvis DRAQ5, Turkis og Venus. Der blev også beregnet ublandet billeder af baggrundssignaler (data, der ikke vises her, da kun de fluorescerende etiketter er interessante for denne metode – se figur 4 i Annamdevula, et al. for eksempler på ublandet baggrundssignaler25). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Rutediagram, der skildrer de trin, der er involveret i beregning af FRET- og cAMP-niveauer fra ublandet spektrale billeddata. A) Repræsentativt ublandet billede af donor, turkis. B) Repræsentativt ublandet billede af acceptor, Venus. C) Repræsentativt ublandet billede af kerner, DRAQ5. D) Binær cellemaske genereres ved at tærskel ublandet donor+acceptor opsummeret billede. E) En tærskel anvendes på det nukleare billede for at skabe en binær maske af kernen. F) Pixel klog FRET effektivitet blev beregnet fra ublandet donor og acceptor billeder. G) En sammensat binær maske blev oprettet fra cellekant og nukleare masker. H) Maskeret FRET effektivitet billede: sammensat celle maske blev anvendt til FRET effektivitet billede for at udelukke ikke-specifikke FRET signaler uden for cellen og i kernen. I) Et colormap blev anvendt på det maskerede FRET-effektivitetsbillede for bedre at visualisere rumlige ændringer i FRET. J) Den cAMP niveauer billede, der blev anslået fra FRET effektivitet billede. K) Colormap blev anvendt til bedre at visualisere rumlige ændringer i cAMP. Farvebjælker vist på højre side blev brugt til at visualisere FRET effektivitet (øverste panel) og cAMP niveauer (nederste panel). Billeder, der vises i denne figur, er repræsentative for en enkelt aksial z-skive, men den analysehandling, der er beskrevet i denne figur, udføres på hele den aksiale z-stak. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Forskolin-induceret FRET-effektivitet og cAMP rumlige gradienter visualiseret i PMVECs. XY planbilleder blev genereret ved at reslicere 3-dimensionelle rekonstruerede FRET- og cAMP-billeddata i den aksiale (Z) retning fra den apikale til den basale side af cellen. Der vises fem sammenhængende XY-skiver. Kolonne 1 og 3 repræsenterer FRET-effektiviteten ved baseline og 10 minutter efter behandlingen med henholdsvis 50 μM forskolin. Kolonne 2 og 4 angiver niveauerne ved baseline og 10 minutter efter forskolin behandling. Farvebjælkerne blev brugt til at relatere ændringer i farvekortet til FRET-effektivitetsniveauerne (øverst) og cAMP-niveauet (nederst). Hvide linjer, der vises på billeder i kolonne 2 og kolonne 4, bruges til at generere intensitetsprofilen (linjescanningsprofilen) af cAMP-signaler på tværs af denne valgte linje. Intensitet profil plot opnået fra midten af skive af cellen ved baseline (blå profil) og efter forskolin behandling (grøn profil) viser den rumlige fordeling af cAMP signaler på tværs af linjen scanning. Skalalinjen angiver 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: Forskolin-induceret FRET-effektivitet og cAMP rumlige gradienter visualiseret i aksial retning. YZ-planbilleder blev genereret ved at omskæring af 3-dimensionelle rekonstruerede FRET- og cAMP-billeddata i den laterale (X) retning (fra venstre mod højre side af cellen). Kolonne 1 og 3 repræsenterer FRET-effektiviteten ved baseline og efter henholdsvis 10 minutter efter 50 μM forskolinbehandling. Kolonne 2 og 4 repræsenterer cAMP-niveauerne ved baseline og 10 minutter efter forskolinbehandling. Farvebjælkerne til højre blev brugt til at relatere ændringer i farvekortet til FRET-effektivitet (øverst) og cAMP-niveauer (nederst). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9: En sammenligning af effektiviteten af at bruge enten en 3-komponent eller et spektralbibliotek med 6 komponenter til beregning af FRET- og cAMP-niveauer. Uspecifikke baggrundssignaler blev observeret i billeder beregnet ved hjælp af et 3-komponent bibliotek, som ikke tegnede sig for baggrundsspektrale signaturer. Dette gjaldt især for billeder nær den basale side af cellen efter 50 μM forskolin behandling (kolonne 2). I modsætning hertil blev baggrundssignalartefakter effektivt fjernet, når du brugte et 6-komponentbibliotek, der omfattede baggrundsspektrale signaturer, hvilket forbedrede muligheden for at segmentere cellen og analysere FRET- og cAMP-signaler. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 10
Figur 10: Billedanalyseartefakter kan indføres, hvis der ikke vælges en passende tærskelværdi til afgrænsning af cellen og de nukleare kanter. Ublandet donor- og acceptorbilleder blev brugt til at oprette en maske med tre forskellige tærskelværdier: 0,35 (kolonne 1 som 2), 0,65 (kolonne 3 og 4) og 0,9 (kolonne 5 og 6). Kolonne 1, 3 og 5 viser FRET-effektiviteten ved baseline. Kolonne 2, 4 og 6 viser FRET-effektiviteten 10 minutter efter 50 μM tilskolinbehandling. Hvis du valgte en tærskel, der var for lav, resulterede dele af baggrunden eller det ekstracellulære område i cellen til analyse, mens valg af en tærskel, der er for høj, resulterede i tab af en del af cellen (se det apikale udsnit i kolonne 4-5 sammenlignet med kolonne 3-4). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 11
Figur 11: Baggrundssignalartefakter kan stadig fortsætte, selv efter at baggrunden er blevet ublandet og valgt en passende tærskel under oprettelsen af en binær maske. Kolonne 1 viser repræsentative apikale, midterste og basale skiver ved baseline, og kolonne 2 viser det samme 10 minutter efter 50 μM tilskolinbehandling. På trods af at bruge en 6-komponent bibliotek til ublandet, der tegnede sig for baggrundssignaler og udnytte en højere tærskel på 0,85 for binær maske generation, baggrund regioner blev stadig identificeret som værende en del af cellen, især efter behandling med forskolin. Hvis dette sker, kan en mulig forklaring være, at en celle med svagt udtryk for FRET-reporteren blev valgt til billedbehandling. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 1: Målinger af laserlinjeintensitet som funktion af laserindstilling i softwaren. En fiber-koblet spektrometer og integrere kugle blev kalibreret til en NIST-sporbar lampe til at måle laser intensitet for både 405 nm laser linje og 488 nm laser linje. A) Samlet antal fotoner målt i mikroskopstadiet svarende til forskellige laserintensiteter i 405 nm laseren. B) Samlet antal fotoner målt i mikroskopstadiet svarende til forskellige laserintensiteter på 488 nm laser. Lineær respons i laserintensitet blev observeret for begge lasere målt på mikroskopstadiet. En lineær trendline var fit og trendline ligning for hver laser linje blev brugt til at beregne acceptor spektrum, der ville forventes, hvis ophidset med 405nm laser linje (donor excitation). Klik her for at downloade dette tal.

Supplerende figur 2: Forskolin-induceret FRET effektivitet og cAMP rumlige gradienter visualiseret i den aksiale retning. XZ-planbilleder blev genereret ved at reslicere 3-dimensionelle rekonstruerede FRET- og cAMP-billeddata i den laterale (Y) retning (fra forsiden til bagsiden af cellen). Kolonne 1 og 3 repræsenterer FRET-effektiviteten ved baseline og efter henholdsvis 10 minutter efter 50 μM forskolinbehandling. Kolonne 2 og 4 repræsenterer cAMP-niveauerne ved baseline og 10 minutter efter forskolinbehandling. Farvebjælkerne til højre blev brugt til at relatere ændringer i farvekortet til FRET-effektivitet (øverst) og cAMP-niveauer (nederst). Svarende til de resultater, der er vist for YZ-planerne (figur 8), kan apikale til basal rumlige gradienter i FRET-effektivitet og cAMP-niveauer visualiseres som farveændringer fra toppen til bunden af en enkelt YZ-skive, både ved baselinebetingelser (en given skive i kolonne 1-2) og efter 50 μM tilskolinbehandling (kolonne 3-4). Klik her for at downloade dette tal.

Supplerende filer. Klik her for at downloade disse filer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Udviklingen af FRET biosensorer har gjort det muligt at måle og visualisere cykliske nukleotidsignaler i enkelte celler, og der er store løfter om at visualisere subcellulære signalhændelser13,22,37,38. Brugen af FRET biosensorer præsenterer imidlertid flere begrænsninger, herunder de lave signal-til-støj-egenskaber hos mange fluorescerende proteinbaserede FRET-reportere og FRET-journalisternes svage transfection- eller udtrykseffektivitet (dette kan være særligt udfordrende i visse cellelinjer, såsom PMVECs)23,24. Billeddannelse af svagt udtrykte fluorescerende proteiner kombineret med ratiometriske FRET-beregninger resulterer ofte i en høj grad af usikkerhed eller udsving i den beregnede FRET-effektivitet. I et forsøg på at forbedre pålideligheden af FRET målinger, vi og andre har tidligere vist brugen af hyperspektral billeddannelse og analyse til at måle FRET signaler og til at reducere krydstale eller blødning gennem fluorescens signaler mellem fluorescence signaler mellem fluorescerende etiketter og autofluorescence effekter26,31,32,39. På grund af begrænsninger i signalstyrken var disse spektrale FRET-undersøgelser begrænset til to (X og Y) rumlige dimensioner indtil for ganske nylig. Derfor gav de en enkelt-udsnit visning af FRET ændringer i en celle.

I de seneste undersøgelser bemærkede vi, at FRET (og tilsvarende cAMP-niveauer) syntes at være rumligt fordelt ikke kun i XY-flyet, men også på tværs af XZ- og YZ-flyene25. Den hyperspektrale FRET-billeddannelsesmetode, der er beskrevet her, udvider vores evne til at visualisere og måle FRET- og cyklisk nukleotid (cAMP) ændringer i tre rumlige dimensioner, hvilket åbner nye muligheder for at vurdere signalopskelalisering. Denne 4-dimensionelle (X, Y, Z og λ) hyperspektral billeddannelse og analyse tilgang gør det muligt at måle og visualisering af cAMP gradienter i tre rumlige dimensioner, mens der tegner sig for ikke-ensartede baggrundssignaler. Her har vi vist, hvordan man implementerer denne tilgang gennem eksemplet med forskolin-inducerede cAMP rumlige gradienter. I billeddataene efter behandlingen kan der observeres rumlige cAMP-gradienter fra den apikale til den basale side af cellen (Figur 7 og Figur 8). Den cAMP, der blev fremstillet ved behandling med forskolin, syntes ikke at nå cellecelleknudepunkter (figur 7 og figur 8).

Ved at udnytte den metode, der er beskrevet her, var det vigtigt at tage højde for forskellige kilder til baggrunds- og autofluorescencesignaler for at muliggøre nøjagtig vurdering af FRET-effektivitet. Lineær ublandeting giver en potentiel mulighed for at tage højde for unikke baggrundsspektre, hvis deres underskrifter er forskellige end de fluorescerende sonder af interesse. Især lineær ublandet er bedre egnet til at adskille baggrunds- og autofluorescencesignaler end standard baggrundsfratrækning. 40,41,42 I eksemplet vist her blev tre forskellige spektrale signaturer målt og tildelt et navn baseret på signaturens maksimale emissionsbølgelængde: 424 nm baggrundsspektret (muligvis fra coverlip fluorescens), 504 nm baggrundsspektret (sandsynligvis på grund af reflekteret eller tilbage-spredt lys) og 574 nm baggrundsspektret (muligvis på grund af celle- eller cellulær matrix autofluorescence). For at illustrere virkningerne af ikke at tage højde for disse underskrifter blev der oprettet to spektralbiblioteker, og ublandet billeder blev sammenlignet. Først blev der oprettet et spektralbibliotek, der kun indeholdt fluorescerende etiketter i prøven, Turkis, Venus og DRAQ5, og mærket 3-komponentbiblioteket. For det andet blev der oprettet et spektralbibliotek, der desuden indeholdt de tre baggrundsspektrale signaturer, og mærket 6-komponentbiblioteket. Som vist ovenfor gjorde blanding med 6-komponentbiblioteket (baggrundsblanding) det muligt at fjerne baggrundssignaler, mens blanding med 3-komponentbiblioteket ikke (Figur 9). I tidligere arbejde har vi vist, at den gennemsnitlige kvadrerede fejl (RMSE), der er forbundet med lineær ubblanding, reduceres, når du bruger et spektralbibliotek, der tegner sig for både fluorescerende etiketter og baggrundssignaturer. Det skal bemærkes, at den aksiale fordeling af baggrundsfluescens ofte er ikke-ensartet, og derfor vil en simpel baggrunds subtraktion ikke fungere til at korrigere billeddataene. Således er den spektrale blandingsmetode nødvendig for at give nøjagtig baggrundsfjernelse og pålidelige FRET-målinger.

Det er vigtigt at optimere systemparametrene for at vælge de bedst mulige system- og kameraindstillinger, når du erhverver spektrale billeder. Det overordnede mål bør være at optimere SNR og samtidig minimere anskaffelsestiden og forhindre fotografering. 43 Når man optimerer et billedsystem, er der således ofte behov for et kompromis mellem rumlige, tidsmæssige og spektrale opløsninger. I disse undersøgelser blev der valgt optimale værdier for system- og kameraindstillingerne, herunder pinhole-størrelse, lasereffekt, scanningshastighed, scanningsstørrelse og ramme gennemsnit som beskrevet i protokolafsnittet. Ved hjælp af disse indstillinger opnås den rumlige prøveudtagning på 80 nm/pixel, tidsmæssig prøvetagning på ~ 3 minutter pr. spektral z-stack (~ 10 sekunder / XY-billede) og spektral prøveudtagning på 10 nm interval med ubetydelig eller minimal fotografering.

For at sikre nøjagtige skøn over FRET-effektivitet er det nødvendigt at måle donor- og acceptorspektre, som de ville forventes med 1:1 stoichimetri og identiske excitationsbølgelængder (Figur 3). Turkis og Venus spektre blev normaliseret med hensyn til den turkise peak emission bølgelængde. Fret-effektiviteten, der blev anslået ved hjælp af dette spektralbibliotek, producerede værdier svarende til dem, der er rapporteret ilitteraturen 12,22. Typisk er endmember spektre i biblioteket normaliseret til enhed. For nøjagtigt at beregne FRET-effektiviteten skal acceptorspektret dog erhverves med hensyn til donorspektret (dvs. ved ækvimolarkoncentration eller 1:1 stoichimetri og refereres til den samme excitationsbølgelængde). Ud over brugen af et korrekt konstrueret bibliotek er flere trin involveret i passende vurdering af FRET-effektivitet og undgåelse af analyseartefakter. Disse omfatter valg af en udtrykkecelle med tilstrækkelig signalintensitet (Figur 11), udjævning af ublandet billeder, før der estimeres FRET-effektivitet (Gaussisk sløring blev anvendt i dette eksempel), ved hjælp af en passende tærskelværdi til at oprette masken (Figur 10) og estimering af en korrektionsfaktor ved hjælp af udryddelseskoefficienter for donor og acceptor (supplerende File_Spectral Library). Når disse trin følges, kan 3-dimensionelle fordelinger af FRET-effektivitet og underliggende cAMP-niveauer visualiseres nøjagtigt i enkelte celler.

Lokaliserede cAMP-signaler er blevet estimeret i 2-rumlige dimensioner ved hjælp af målrettede FRET biosensorer13,37. Men, målretning FRET sonder til specifikke subcellulære rum (for eksempel plasmamembran eller lipid flåder) typisk resulterer i en øget lokal koncentration af sonde. Dette kan resultere i måling artefakter indført på grund af intermolekylær eller bimolekylær FRET. Derudover viser de resultater, der præsenteres her og i Annamdevula et.al., 2018, Cytometri A25 vigtigheden af 3-dimensionelle målinger af FRET fra enten opløselige eller målrettede sonder.

På trods af vigtigheden af at måle cAMP-signaler i tre rumlige dimensioner er der også begrænsninger for denne tilgang. Den mest restriktive begrænsning er de lange anskaffelsestider, der kræves - ca. 3 minutter pr. spektral z-stack. Denne erhvervelse sats udelukker at bruge denne tilgang til at opdage andet end kvasi - steady state cAMP distributioner i celler. Når det er sagt, viser de præsenterede resultater vigtigheden af at inkludere kvasi - steady state 3-dimensionelle (x, y, z) cAMP målinger som kritiske supplementer til standard 2-dimensionelle (x, y) målinger. I fremtiden vil det være interessant at indarbejde mærkede proteiner og cellulære strukturer i det eksperimentelle design. Et omhyggeligt valg af fluorophorer, der anvendes til at mærke proteiner (og/eller strukturer), vil gøre det muligt at vurdere de 3-dimensionelle fordelinger af de mærkede proteiner og FRET uden yderligere tab af anskaffelseshastighed. Dette vil igen gøre det muligt at måle lokaliserede cAMP-signaler og cAMP-signaler i nærheden af de mærkede proteiner i tre rumlige dimensioner, hvilket giver et vigtigt eksperimentelt supplement til målrettede cAMP-sonder og yderligere udvidelse af nytten af hyperspektrale målinger af 3-dimensionelle cAMP-fordelinger i levende celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Drs. Leavesley og Rich afslører økonomisk interesse i et opstartsfirma, SpectraCyte, LLC, der blev dannet for at kommercialisere spektrale billedbehandlingsteknologier. Alle procedurer, der er beskrevet i denne protokol, blev dog udført ved hjælp af kommercielt tilgængelige produkter, der ikke er forbundet med SpectraCyte, LLC.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne anerkende Dr. Kees Jalink (The Netherlands Cancer Institute og van Leeuwenhoek Center for Advanced Microscopy, Amsterdam, Holland) for at give os H188 cAMP FRET biosensor og Kenny Trinh (College of Engineering, University of South Alabama) for teknisk hjælp til at reducere den tid, det tog at køre vores specialudviklede programmering scripts.

Forfatterne vil gerne anerkende finansieringskilderne: American Heart Association (16PRE27130004), National Science Foundation; (1725937) NIH, S100D020149, S10RR027535, R01HL058506, P01HL066299).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Attofluor Cell Chamber Invitrogen A7816 Attofluor contains steel cell chambers and a rubber O-ring. Cell chamber holds the coverslip and O-ring provides a lock in mechanism to hold the buffer in cell chamber with out leakage
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific BP231-100 Solvent used to prepare stock solution forskolin.
DRAQ5 Fluoroscent Probe Solution Thermo Scientific 62252 Nuclear label
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11965-092 Contains nutrients and growth factors for the cells to grow and divide in the culture dishes.
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F6178 Growth factor suppliment that is added to culture medium, DMEM
Forskolin Sigma F3917 Adenyly cyclase activator.
H188 Cyclic AMP FRET biosensor Netherland Cancer Institute, Dr. K. Jalink Gift Plasmid encoding Turquoise (donor fluorophore), Venus (acceptor fluorophore), and binding domain obtained from Epac.
Image J image.net Free download Another image processing platform used to extact spectral information and image processing.
Integrating Sphere Ocean Optics FOIS-1 Used to measure illumination intensity of the laser line at different laser intensities (?).
Laminin Mouse Protein, Natural Invitrogen 23017-015 Coverslips are coated with laminin and this helps in cell attachment, growth and motility of the cell.
Lipofectamine 3000 Transfection Kit Invitrogen L3000-015 Transfection reagent used to transfect cells with H188 FRET biosensor
MATLAB Mathworks R2019a Image processing operations (linear unmixing and FRET efficiency calculations) are performed by writing custom programs in MATLAB programming environment
Nikon A1R confocal microscope Nikon Instruments Nikon A1R Spectral image acquisition is performed using confocal microscope.
Nikon Elements Software Nikon Instruments Software dongle used to export and handle nd2 image files (multidimensional image files) that are aquired using Nikon A1R
NIST-Traceable Calibration Lamp Ocean Optics LS-1-CAL-INT A lamp with a known spectrum for use as a standard
PBS pH 7.4 (1X) Gibco 10010-023 coomonly used buffer suring cell culture
Pulmonary Microvascular Endothelial Cells (PMVECs) In house - Cell culture core, Univeristy of South Alabama Isolated from Rat pulmonary microvasculature PMVECs form inner lining of a blood vessel.
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Gibco 15140-122 antibiotics are added to culture medum to prevent contamination of the cells.
Pre-Cleaned Gold Seal Micro Slides Clay Adams 3010 Microscope slides used for cell fixation
ProLong Diamond Antifade Mounting Media Invitrogen P36961 If samples are fixed using antifade mountant, then the later protects fluoroscent dyes and chromophores from fading.
Spectrometer Ocean Optics QE65000 Used to measure spectral response of the light source (?)
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200-056 Digests the protein-protein bond between the cell and cell matrix and helps to disscociate and lift the cells during cell plating.
Tyrodes Buffer Made in-house Made in-house Tyrodes buffer is used to make working solutions and to maintain cells in aqueous solution during image acquisition.
6 Well Cell Culture Plate Corning 3506 Laminin coated coverslips are placed in 6-well culture dish (one coverlisps/well). Cells along with medium is added into each well.
25 mm Round Microscope Cover Slips Fisher Scientific 12545102 Cells were grown on round glass coverslips
60X Ojective Nikon Instruments Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 water immersion and commonly used objective for cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Corbin, J. D., Sugden, P. H., Lincoln, T. M., Keely, S. L. Compartmentalization of adenosine 3':5'-monophosphate and adenosine 3':5'-monophosphate-dependent protein kinase in heart tissue. The Journal of Biological Chemistry. 252, 3854-3861 (1977).
  2. Terrin, A., et al. PGE1 stimulation of HEK293 cells generates multiple contiguous domains with different [cAMP]: role of compartmentalized phosphodiesterases. The Journal of Cell Biology. 175, 441-451 (2006).
  3. Bacskai, B. J., et al. Spatially resolved dynamics of cAMP and protein kinase A subunits in Aplysia sensory neurons. Science. 260, 222-226 (1993).
  4. Iancu, R. V., Ramamurthy, G., Harvey, R. D. Spatial and temporal aspects of cAMP signalling in cardiac myocytes. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 35, 1343-1348 (2008).
  5. Brunton, L. L., Hayes, J. S., Mayer, S. E. Functional compartmentation of cyclic AMP and protein kinase in heart. Advances in Cyclic Nucleotide Research. 14, 391-397 (1981).
  6. Hohl, C. M., Li, Q. Compartmentation of cAMP in adult canine ventricular myocytes. Relation to single-cell free Ca2+ transients. Circulation Research. 69, 1369-1379 (1991).
  7. Rich, T. C., et al. A uniform extracellular stimulus triggers distinct cAMP signals in different compartments of a simple cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 13049-13054 (2001).
  8. Sayner, S. L., Alexeyev, M., Dessauer, C. W., Stevens, T. Soluble adenylyl cyclase reveals the significance of cAMP compartmentation on pulmonary microvascular endothelial cell barrier. Circulation Research. 98, 675-681 (2006).
  9. Rich, T. C., Tse, T. E., Rohan, J. G., Schaack, J., Karpen, J. W. In vivo assessment of local phosphodiesterase activity using tailored cyclic nucleotide-gated channels as cAMP sensors. The Journal of General Physiology. 118, 63-78 (2001).
  10. Blackman, B. E., et al. PDE4D and PDE4B function in distinct subcellular compartments in mouse embryonic fibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 286, 12590-12601 (2011).
  11. Sayner, S. L., et al. Paradoxical cAMP-induced lung endothelial hyperpermeability revealed by Pseudomonas aeruginosa ExoY. Circulation Research. 95, 196-203 (2004).
  12. Klarenbeek, J., Jalink, K. Detecting cAMP with an EPAC-based FRET sensor in single living cells. Methods in Molecular Biology. 1071, 49-58 (2014).
  13. Surdo, N. C., et al. FRET biosensor uncovers cAMP nano-domains at β-adrenergic targets that dictate precise tuning of cardiac contractility. Nature Communications. 8, 15031 (2017).
  14. Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. EMBO Reports. 5, 1176-1180 (2004).
  15. Vogel, S. S., Thaler, C., Koushik, S. V. Fanciful FRET. Science's STKE. 2006, (2006).
  16. Clegg, R. M. The History of FRET: From conception through the labors of birth. Reviews in Fluorescence. 3, (2006).
  17. Giepmans, B. N. G., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312, 217-224 (2006).
  18. Manzella-Lapeira, J., Brzostowski, J. A. Imaging protein-protein interactions by Förster resonance energy transfer (FRET) microscopy in live cells. Current Protocols in Protein Science. 93, 58 (2018).
  19. Cooper, D. M. F., Mons, N., Karpen, J. W. Adenylyl cyclases and the interaction between calcium and cAMP signalling. Nature. 374, 421-424 (1995).
  20. Sassone-Corsi, P. Coupling gene expression to cAMP signalling: role of CREB and CREM. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 30, 27-38 (1998).
  21. Rebhun, L. I. Cyclic nucleotides, calcium, and cell division. International Review of Cytology. 49, 1-54 (1977).
  22. Klarenbeek, J., Goedhart, J., Van Batenburg, A., Groenewald, D., Jalink, K. Fourth-generation Epac-based FRET sensors for cAMP feature exceptional brightness, photostability and dynamic range: characterization of dedicated sensors for FLIM, for ratiometry and with high affinity. PLOS ONE. 10, 0122513 (2015).
  23. Leavesley, S. J., Rich, T. C. FRET: signals hidden within the noise. Cytometry Part A. 85, 918-920 (2014).
  24. Rich, T. C., Webb, K. J., Leavesley, S. J. Can we decipher the information content contained within cyclic nucleotide signals. The Journal of General Physiology. 143, 17-27 (2014).
  25. Annamdevula, N. S., et al. Spectral imaging of FRET-based sensors reveals sustained cAMP gradients in three spatial dimensions. Cytometry Part A. 93 (10), 1029-1038 (2018).
  26. Leavesley, S. J., Britain, A. L., Cichon, L. K., Nikolaev, V. O., Rich, T. C. Assessing FRET using spectral techniques. Cytometry Part A. 83, 898-912 (2013).
  27. Leavesley, S. J., Rich, T. C. Overcoming limitations of FRET measurements. Cytometry Part A. 89, 325-327 (2016).
  28. Fink, D. J. Monitoring Earcths Resources from Space. Technology Review. 75, 32-41 (1973).
  29. Goetz, A. F. H., Vane, G., Solomon, J. E., Rock, B. N. Imaging Spectrometry for Earth Remote Sensing. Science. 228, 1147-1153 (1985).
  30. Bücherl, C. A., Bader, A., Westphal, A. H., Laptenok, S. P., Borst, J. W. FRET-FLIM applications in plant systems. Protoplasma. 251, 383-394 (2014).
  31. Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions. Journal of Microscopy. 228, 139-152 (2007).
  32. Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair. FEBS Letters. 531, 245-249 (2002).
  33. Griswold, J. R., Annamdevula, N., Deal, J., Rich, T., Leavesley, S. Estimating FRET Efficiency using Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging. Biophysical Journal. 112, 586 (2017).
  34. Favreau, P. F., et al. Excitation-scanning hyperspectral imaging microscope. Journal of Biomedical Optics. 19, 046010 (2014).
  35. King, J., et al. Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes. Microvascular Research. 67, 139-151 (2004).
  36. Thaler, C., Koushik, S. V., Blank, P. S., Vogel, S. S. Quantitative multiphoton spectral imaging and its use for measuring resonance energy transfer. Biophysical Journal. 89, 2736-2749 (2005).
  37. Agarwal, S. R., et al. Compartmentalized cAMP signaling associated with lipid raft and non-raft membrane domains in adult ventricular myocytes. Frontiers in Pharmacology. 9, 332 (2018).
  38. Johnstone, T. B., Agarwal, S. R., Harvey, R. D., Ostrom, R. S. cAMP signaling compartmentation: Adenylyl cyclases as anchors of dynamic signaling complexes. Mol Pharmacol. , (2017).
  39. Zhang, J., Li, H., Chai, L., Zhang, L., Qu, J., Chen, T. Quantitative FRET measurement using emission-spectral unmixing with independent excitation crosstalk correction. Journal of Microscopy. 257, 104-116 (2015).
  40. Zhang, J., Lin, F., Chai, L., Wei, L., Chen, T. IIem-spFRET: improved Iem-spFRET method for robust FRET measurement. Journal of Biomedical Optics. 21, 105003 (2016).
  41. Levy, S., et al. SpRET: highly sensitive and reliable spectral measurement of absolute FRET efficiency. Microscopy and Microanalysis. 17, 176-190 (2011).
  42. West, S. J., et al. Hyperspectral Measurements Allow Separation of FRET Signals from Non-Uniform Background Fluorescence. Biophysical Journal. 112, 453 (2017).
  43. Annamdevula, N. S., et al. An approach for characterizing and comparing hyperspectral microscopy systems. Sensors. 13, Basel. 9267-9293 (2013).

Tags

Biologi Udgave 164 Cyklisk AMP rumlig FRET hyperspektral mikroskopi spektral FRET
Måling af 3-dimensionelle cAMP-fordelinger i levende celler ved hjælp af 4-dimensionelle (x, y, z og λ) Hyperspektral FRET Imaging and Analysis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Annamdevula, N. S., Sweat, R., Gunn, … More

Annamdevula, N. S., Sweat, R., Gunn, H., Griswold, J. R., Britain, A. L., Rich, T. C., Leavesley, S. J. Measurement of 3-Dimensional cAMP Distributions in Living Cells using 4-Dimensional (x, y, z, and λ) Hyperspectral FRET Imaging and Analysis. J. Vis. Exp. (164), e61720, doi:10.3791/61720 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter