Medición de distribuciones de cAMP tridimensionales en células vivas utilizando imágenes y análisis FRET hiperespectrales de 4 dimensiones (x, y, z y λ)
Summary
Debido a la baja relación señal-ruido (SNR) inherente de los sensores basados en transferencia de energía de resonancia Fӧrster (FRET), la medición de señales cAMP ha sido un desafío, especialmente en tres dimensiones espaciales. Aquí, describimos una metodología de imagen y análisis FRET hiperespectral que permite la medición de la distribución de cAMP en tres dimensiones espaciales.
Abstract
El AMP cíclico es un segundo mensajero que está involucrado en una amplia gama de actividades celulares y fisiológicas. Varios estudios sugieren que las señales cAMP están compartimentadas, y que la compartimentación contribuye a la especificidad de la señalización dentro de la vía de señalización cAMP. El desarrollo de biosensores basados en la transferencia de energía de resonancia de Fӧrster (FRET) ha potenciado la capacidad de medir y visualizar señales cAMP en las células. Sin embargo, estas mediciones a menudo se limitan a dos dimensiones espaciales, lo que puede dar lugar a una mala interpretación de los datos. Hasta la fecha, solo ha habido mediciones muy limitadas de señales cAMP en tres dimensiones espaciales (x, y y z), debido a las limitaciones técnicas en el uso de sensores FRET que inherentemente exhiben una baja relación señal-ruido (SNR). Además, los enfoques tradicionales de imágenes basadas en filtros a menudo son ineficaces para la medición precisa de señales cAMP en regiones subcelulares localizadas debido a una variedad de factores, incluida la diafonía espectral, la intensidad de señal limitada y la autofluorescencia. Para superar estas limitaciones y permitir que los biosensores basados en FRET se utilicen con múltiples fluoróforos, hemos desarrollado enfoques hiperespectrales de imágenes y análisis de FRET que proporcionan especificidad espectral para calcular las eficiencias de FRET y la capacidad de separar espectralmente las señales FRET de la autofluorescencia de confusión y / o señales de etiquetas fluorescentes adicionales. Aquí, presentamos la metodología para implementar imágenes FRET hiperespectrales, así como la necesidad de construir una biblioteca espectral apropiada que no esté ni submuestreada ni sobremuestreada para realizar la desmezcla espectral. Si bien presentamos esta metodología para la medición de distribuciones tridimensionales de cAMP en células endoteliales microvasculares pulmonares (PMVEC), esta metodología podría usarse para estudiar distribuciones espaciales de cAMP en una variedad de tipos de células.
Introduction
El monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) es un segundo mensajero involucrado en procesos celulares y fisiológicos clave, incluida la división celular, la afluencia de calcio, la transcripción de genes y la transducción de señales. Un creciente cuerpo de evidencia sugiere la existencia de compartimentos cAMP en la célula a través de los cuales se logra la especificidad de señalización1,2,3,4,5,6,7. Hasta hace poco, la compartimentación de cAMP se infería en función de distintos efectos fisiológicos o celulares inducidos por diferentes agonistas del receptor acoplado g8,9,10,11. Más recientemente, las sondas de imágenes de fluorescencia basadas en FRET han proporcionado nuevos enfoques para la medición directa y la observación de señales cAMP en una celda12,13,14.
La transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) es un fenómeno físico en el que la transferencia de energía se produce entre las moléculas donantes y aceptoras de una manera no radiativa cuando las moléculas están muy cerca15,16. Con el desarrollo de indicadores fluorescentes basados en FRET, este fenómeno físico se ha utilizado en aplicaciones biológicas para estudiar las interacciones proteína-proteína17,la colocalizaciónde proteínas 18,la señalización deCa+2 19,la expresióngénica 20,la división celular21 y la señalización de nucleótidos cíclicos. Los indicadores de cAMP basados en FRET generalmente consisten en un dominio de unión a cAMP, un fluoróforo de donante y un fluoróforoaceptor 22. Por ejemplo, el sensor H188 cAMP12,22 utilizado en esta metodología consiste en un dominio de unión cAMP obtenido de Epac, intercalado entre fluoróforos Turquesa (donante) y Venus (aceptor). En condiciones basales (sin consolidar), Turquesa y Venus están en una orientación tal que fret ocurre entre los fluoróforos. Al unirse el cAMP al dominio de unión, se produce un cambio conformacional tal que Turquesa y Venus se separan, lo que resulta en una disminución de FRET.
Los enfoques de imágenes basados en FRET ofrecen una herramienta prometedora para investigar y visualizar señales de cAMP dentro de una célula. Sin embargo, las técnicas actuales de imágenes microscópicas basadas en FRET a menudo solo tienen un éxito parcial en el logro de la intensidad de señal suficiente para medir FRET con claridad espacial subcelular. Esto se debe a varios factores, incluida la intensidad de señal limitada de muchos reporteros FRET, el alto nivel de precisión requerido para cuantificar con precisión los cambios en la eficiencia fret y la presencia de factores de confusión, como la autofluorescencia celular23,24. El resultado es a menudo una imagen FRET que está plagada de SNR débil, lo que hace que la visualización de los cambios subcelulares en FRET sea muy difícil. Además, la investigación de señales cAMP localizadas espacialmente se ha realizado casi exclusivamente en solo dos dimensiones espaciales y la distribución axial cAMP rara vez se ha considerado25. Esto es probable porque el SNR bajo impidió la capacidad de medir y visualizar gradientes cAMP en tres dimensiones espaciales. Para superar las limitaciones del uso de sensores FRET con SNR bajo, hemos implementado enfoques de imágenes y análisis hiperespectrales para medir FRET en células individuales25,26,27.
Los enfoques de imágenes hiperespectrales fueron desarrollados por la NASA para diferenciar los objetos terrestres presentes en las imágenessatelitales28,29. Desde entonces, estas técnicas se han traducido al campo de la microscopía de fluorescencia30,con varios sistemas comerciales de microscopio confocal que ofrecen detectores espectrales. En las imágenes de fluorescencia tradicionales (no espectrales), la muestra se excita utilizando un filtro de paso de banda o una línea láser, y la emisión se recoge utilizando un segundo filtro de paso de banda, a menudo seleccionado para que coincida con la longitud de onda de emisión máxima del fluoróforo (s). Por el contrario, los enfoques de imágenes hiperespectrales buscan muestrear un perfil espectral completo de la emisión de fluorescencia26,31,32 o la excitación33,34 a intervalos de longitud de onda específicos. En nuestros estudios previos, demostramos que los enfoques de imágenes y análisis hiperespectrales pueden ofrecer una mejor cuantificación de las señales FRET en las células en comparación con las técnicas tradicionales de imágenes FRET basadas en filtros26. Aquí, presentamos una metodología para realizar imágenes y análisis FRET hiperespectrales de 4 dimensiones (x, y, z y λ) para medir y visualizar distribuciones de cAMP en tres dimensiones espaciales. Estos enfoques han permitido la visualización de gradientes espaciales cAMP inducidos por agonistas en celdas individuales25. Curiosamente, dependiendo del agonista, los gradientes de cAMP pueden ser evidentes en las células. La metodología presentada aquí utiliza la desmezcla espectral de fondo no uniforme y autofluorescencia celular para mejorar la precisión de las mediciones FRET. Si bien esta metodología se demuestra en células endoteliales microvasculares pulmonares (PMVEC) utilizando un biosensor cAMP FRET, la metodología podría modificarse fácilmente para su uso con reporteros FRET alternativos o líneas celulares alternativas.
Protocol
Representative Results
Discussion
El desarrollo de biosensores FRET ha permitido la medición y visualización de señales de nucleótidos cíclicos en células individuales, y existe una gran promesa para visualizar eventos de señalización subcelular13,22,37,38. Sin embargo, el uso de biosensores FRET presenta varias limitaciones, incluyendo las características de baja señal a ruido de muchos reporteros FRET basados en pro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer al Dr. Kees Jalink (Instituto del Cáncer de los Países Bajos y centro van Leeuwenhoek de Microscopía Avanzada, Ámsterdam, Países Bajos) por proporcionarnos el biosensor H188 cAMP FRET y a Kenny Trinh (Facultad de Ingeniería, Universidad del Sur de Alabama) por su ayuda técnica para reducir el tiempo necesario para ejecutar nuestros scripts de programación desarrollados a medida.
Los autores desean reconocer las fuentes de financiación: American Heart Association (16PRE27130004), National Science Foundation; (1725937) NIH, S100D020149, S10RR027535, R01HL058506, P01HL066299).
Materials
| Attofluor Cell Chamber | Invitrogen | A7816 | Attofluor contains steel cell chambers and a rubber O-ring. Cell chamber holds the coverslip and O-ring provides a lock in mechanism to hold the buffer in cell chamber with out leakage |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | Solvent used to prepare stock solution forskolin. |
| DRAQ5 Fluoroscent Probe Solution | Thermo Scientific | 62252 | Nuclear label |
| Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | Contains nutrients and growth factors for the cells to grow and divide in the culture dishes. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F6178 | Growth factor suppliment that is added to culture medium, DMEM |
| Forskolin | Sigma | F3917 | Adenyly cyclase activator. |
| H188 Cyclic AMP FRET biosensor | Netherland Cancer Institute, Dr. K. Jalink | Gift | Plasmid encoding Turquoise (donor fluorophore), Venus (acceptor fluorophore), and binding domain obtained from Epac. |
| Image J | image.net | Free download | Another image processing platform used to extact spectral information and image processing. |
| Integrating Sphere | Ocean Optics | FOIS-1 | Used to measure illumination intensity of the laser line at different laser intensities (?). |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Invitrogen | 23017-015 | Coverslips are coated with laminin and this helps in cell attachment, growth and motility of the cell. |
| Lipofectamine 3000 Transfection Kit | Invitrogen | L3000-015 | Transfection reagent used to transfect cells with H188 FRET biosensor |
| MATLAB | Mathworks | R2019a | Image processing operations (linear unmixing and FRET efficiency calculations) are performed by writing custom programs in MATLAB programming environment |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon Instruments | Nikon A1R | Spectral image acquisition is performed using confocal microscope. |
| Nikon Elements Software | Nikon Instruments | Software dongle | used to export and handle nd2 image files (multidimensional image files) that are aquired using Nikon A1R |
| NIST-Traceable Calibration Lamp | Ocean Optics | LS-1-CAL-INT | A lamp with a known spectrum for use as a standard |
| PBS pH 7.4 (1X) | Gibco | 10010-023 | coomonly used buffer suring cell culture |
| Pulmonary Microvascular Endothelial Cells (PMVECs) | In house – Cell culture core, Univeristy of South Alabama | Isolated from Rat pulmonary microvasculature | PMVECs form inner lining of a blood vessel. |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco | 15140-122 | antibiotics are added to culture medum to prevent contamination of the cells. |
| Pre-Cleaned Gold Seal Micro Slides | Clay Adams | 3010 | Microscope slides used for cell fixation |
| ProLong Diamond Antifade Mounting Media | Invitrogen | P36961 | If samples are fixed using antifade mountant, then the later protects fluoroscent dyes and chromophores from fading. |
| Spectrometer | Ocean Optics | QE65000 | Used to measure spectral response of the light source (?) |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 | Digests the protein-protein bond between the cell and cell matrix and helps to disscociate and lift the cells during cell plating. |
| Tyrodes Buffer | Made in-house | Made in-house | Tyrodes buffer is used to make working solutions and to maintain cells in aqueous solution during image acquisition. |
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3506 | Laminin coated coverslips are placed in 6-well culture dish (one coverlisps/well). Cells along with medium is added into each well. |
| 25 mm Round Microscope Cover Slips | Fisher Scientific | 12545102 | Cells were grown on round glass coverslips |
| 60X Ojective | Nikon Instruments | Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 | water immersion and commonly used objective for cells |
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