Summary
Een λ-Rood-gemedieerd recombinatiesysteem werd gebruikt om een deletiemutant te maken van een kleine niet-coderende RNA-micC.
Abstract
Een niet-coderend klein RNA (sRNA) is een nieuwe factor om genexpressie op post-transcriptioneel niveau te reguleren. Een soort sRNA MicC, bekend in Escherichia coli en Salmonella Typhimurium, zou de expressie van buitenmembraaneiwitten kunnen onderdrukken. Om de regulatiefunctie van micC in Salmonella Enteritidis verder te onderzoeken, kloonden we het micC-gen in de Salmonella Enteritidis-stam 50336 en construeerden vervolgens de mutant 50336Δ micC door het op λ Red gebaseerde recombinatiesysteem en de aangevulde mutant 50336Δ micC / p micC met recombinant plasmide pBR322 die micC tot expressie brengt. qRT-PCR-resultaten toonden aan dat transcriptie van ompD in 50336Δ micC 1,3-voudig hoger was dan die in de wildtype stam, terwijl de transcriptie van ompA en ompC in 50336Δ micC 2,2-voudig en 3-voudig hoger was dan die in de wildtype stam. Deze gaven aan dat micC de expressie van ompA en ompC onderdrukt. In de volgende studie werd de pathogeniciteit van 50336ΔmicC gedetecteerd door zowel 6 weken oude Balb / c-muizen als 1-dag-oude kippen te infecteren. Het resultaat toonde aan dat de LD 50 van de wilde stam 50336, de mutanten 50336Δ micC en 50336ΔmicC/pmicC voor 6 weken oude Balb/c muizen respectievelijk 12,59 CFU, 5,01 CFU en 19,95 CFU waren. De LD 50 van de stammen voor 1-dag-oude kippen waren respectievelijk 1,13 x 109 CFU, 1,55 x 10 8 CFU en2,54 x 10 8 CFU. Het gaf aan dat deletie van micC de virulentie van S verhoogde. Enteritidis bij muizen en kippen door de expressie van buitenmembraaneiwitten te reguleren.
Introduction
Niet-coderende kleine RNA's (sRNA's) zijn 40-400 nucleotiden lang, die over het algemeen geen eiwitten coderen, maar onafhankelijk kunnen worden getranscribeerd in bacteriële chromosomen 1,2,3. De meeste sRNA's zijn gecodeerd in de intergene regio's (IGR's) tussen gencoderende regio's en interageren met doel-mRNA's door middel van base-pairing acties, en reguleren de expressie van doelgenen op het post-transcriptionele niveau 4,5. Ze spelen een belangrijke regulerende rol in het stofmetabolisme, de synthese van buitenmembraaneiwitten, quorumdetectie en virulentiegenexpressie5.
MicC is een 109-nucleotide klein RNA-transcript aanwezig in Escherichia coli en Salmonella enterica serovar Typhimurium, dat meerdere buitenmembraaneiwitexpressie zoals OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 en Omp36 6,7,8,9 zou kunnen reguleren. MicC reguleert de expressie van OmpC door ribosoombinding aan de ompC mRNA-leider in vitro te remmen en het vereist de Hfq RNA-chaperonne voor zijn functie in Escherichia coli6. In Salmonella Typhimurium legt MicC ompD-mRNA het zwijgen op via een ≤12-bp RNA-duplex binnen de coderende sequentie (codons 23-26) en destabiliseert vervolgens endonucleolytisch mRNA7. Dit regulatieproces wordt ondersteund door chaperonne-eiwit Hfq10. De OmpC is een overvloedig buitenmembraaneiwit waarvan werd gedacht dat het belangrijk was in omgevingen waar de concentraties voedingsstoffen en toxines hoog waren, zoals in de darm6. De OmpD porine is het meest voorkomende buitenmembraaneiwit in Salmonella Typhimurium en vertegenwoordigt ongeveer 1% van het totale celeiwit11. OmpD is betrokken bij de hechting aan menselijke macrofagen en darmepitheelcellen12. MicC onderdrukt ook de expressie van zowel OmpC- als OmpD-porines. Er wordt gedacht dat MicC virulentie kan reguleren. Om nieuwe doelgenen gereguleerd door MicC te onderzoeken en de virulentieregulatiefunctie van micC te bestuderen, kloonden we het micC-gen in de Salmonella Enteritidis (SE) stam 50336 en construeerden vervolgens de mutant 50336ΔmicC en de aangevulde mutant 50336ΔmicC / p micC. Nieuwe doelgenen werden gescreend door qRT-PCR. De virulentie van 50336ΔmicC werd gedetecteerd door muizen en kippeninfecties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren van de National Research Council. De dierverzorgings- en gebruikscommissie van de Yangzhou University keurde alle experimenten en procedures goed die op de dieren werden toegepast (SYXK2016-0020).
1. Bacteriestammen, plasmiden en kweekomstandigheden
- Gebruik de bacteriën en plasmiden die in tabel 1 worden vermeld.
- Kweekbacteriën in LB-bouillon of op LB-agarplaten bij 37 °C, in aanwezigheid van 50 μg/ml ampicilline (Amp), indien van toepassing.
- Kweekstammen die temperatuurgevoelige plasmiden bevatten, worden gebruikt voor deletiemutantconstructie bij 30 °C.
2. Kloon micC gen van S. Enteritidis stam 50336
- Gebaseerd op de upstream en downstream sequentie van micC gen van S. Typhimurium stam SL1344, ontwerp primers vmicC-F en vmicC-R om een fragment met micC gen te versterken door PCR met behulp van SE50336 genomisch DNA als sjabloon.
- Meng 5 μL van 10x PCR-reactiebuffer, 2 μL dNTP-mengsel (2,5 mM), 1 μL vmicC-F- en vmicC-R-primers, respectievelijk, 5 μL sjabloon, 1 μL Taq DNA-polymerase en 35 μL ddH2O samen voor PCR.
- Gebruik de volgende PCR-reactieomstandigheden:pre-denaturatie bij 94 °C gedurende 4 minuten; 94 °C gedurende 30 s, 53 °C gedurende 1 min, 72 °C gedurende 1 min gedurende 25 cycli en verlenging bij 72 °C gedurende 10 minuten.
- Sequentieer het PCR-product om de micC-gensequentie te verkrijgen.
3. Constructie van de micC-deletiemutant
OPMERKING: De micC-negatieve mutant van Salmonella Enteritidis stam 50336 werd geconstrueerd met behulp van λ-Rood-gemedieerde recombinatie zoals eerder beschreven13,14. De gebruikte primers staan vermeld in tabel 2.
- Amplify chlooramfenicol cassette met homologie fragmenten van micC gen.
- Ontwerp micC-F en micC-R primers om de chlooramfenicol (Cm) cassette te versterken van plasmide pKD3, inclusief 50 bp homologie extensies van de 5' en 3' van het micC gen.
- Pak het pKD3-plasmide uit als de PCR-sjabloon.
- Meng 5 μL van 10x PCR reactiebuffer, 2 μL van dNTP mengsel (2,5 mM), 1 μL van micC-F en micC-R primers, respectievelijk, 5 μL van template, 1 μL van Taq DNA polymerase en 35 μL van ddH2O samen als PCR reactie mengsel
- Versterk de Cm-cassette met de volgende PCR-reactieomstandigheden: pre-denaturatie bij 94 °C gedurende 4 minuten; 94 °C gedurende 1 min, 52 °C gedurende 1 min, 72 °C gedurende 1 min gedurende 10 cycli; 94 °C gedurende 1 min, 63 °C gedurende 1 min, 72 °C gedurende 1 minuut gedurende 25 cycli en verlenging bij 72 °C gedurende 10 minuten.
- Detecteer de grootte van het PCR-product door agarosegel-elektroforese. Zuiver en herstel PCR-product met DNA-gelherstelkit en bepaal de concentratie van DNA met een spectrofotometer.
LET OP: PCR moet twee keer worden uitgevoerd. Het eerste PCR-product werd verdund in een verhouding van 1:200 en gebruikt als sjabloon voor de secundaire PCR, om de interferentie van verdere recombinatie door pKD3-plasmide te elimineren.
- Construct 1e recombinante stam 50336ΔmicC::cat
- Meng 100 μL SE50336 competente cellen met 5 μL pKD46 plasmide gelijkmatig en incubeer op ijs gedurende 30 minuten. Verhit het bovenstaande mengsel bij 42 °C gedurende 90 s en breng het mengsel snel over op ijs gedurende 2 minuten om het pKD46-plasmide om te zetten in SE50336. Zeef positieve kolonies door 's nachts bij 30 °C te kweken op een Amp (50 μg/ml) resistente plaat.
- Voeg 30 mM L-arabinose toe aan de SE50336/pKD46 vloeibare cultuur en induceer recombinase-expressie door een schudcultuur van 30 °C gedurende 1 uur. Bereid vervolgens competente cellen voor.
- Meng 100 ng gezuiverd PCR-product (stap 3.1) en 40 μL SE50336/pKD46-competente cellen in een elektrische schokbeker (bijv. Bio-Rad). Voer elektrische schoktransformatie uit met de parameters spanning 1,8 kV, puls 25 μF en weerstand 200 Ω.
- Breng na elektrotransformatie het mengsel over op 1 ml SOC-medium en een schudcultuur bij 150 tpm en 30 °C gedurende 1 uur. Smeer het mengsel vervolgens uit op een cm (34 μg / ml) resistente LB-plaat en kweek 's nachts bij 37 ° C om een positieve kolonie te screenen.
- Kweek de bovenstaande positieve kolonie bij 42 °C gedurende 2 uur. Screen de kolonie die gevoelig is voor Amp (50 μg/ml) maar resistent tegen Cm (34 μg/ml) bij 37 °C 's nachts om de 1e recombinante stam zonder pKD46 te verkrijgen.
- Identificeer de 1e recombinante stam 50336ΔmicC::Cat.
- Extract 50336ΔmicC::Cat genomisch DNA als de PCR-sjabloon. Gebruik dezelfde PCR-reactiecomponenten als in stap 2.1. Voer de PCR-reactie uit onder dezelfde omstandigheden als in stap 2.1.
- Detecteer de grootte van het PCR-product door agarosegel-elektroforese en sequentieer het PCR-product.
- Construct deletie mutant 50336ΔmicC.
- Elektroporaat 100 ng plasmide pCP20 in 40 μL van 50336ΔmicC::Cat competente cellen met de parameters van spanning 1,8 kV, puls 25 μF en weerstand 200 Ω, schermpositieve transformanten op zowel Amp (50 μg/ml) als Cm (34 μg/ml) resistente plaat bij 30 °C.
- Breng boven positieve transformanten over in niet-resistente LB en kweek ze 's nachts bij 42 °C en isoleer vervolgens enkele kolonies op een LB-plaat bij 37 °C. Selecteer de kolonie die gevoelig is voor zowel Amp als Cm. Deze mutant is de micC deletie mutant SE50336Δ micC.
- Controleer 50336ΔmicC met PCR.
- Extract 50336ΔmicC genomisch DNA als PCR-sjabloon. Meng 5 μLof 10x PCR-reactiebuffer, 2 μL dNTP-mengsel (2,5 mM), 1 μL primer vmicC-F, 1 μL primer vmicC-R, 5 μL sjabloon, 1 μL Taq DNA-polymerase en 35 μL ddH2O samen voor PCR.
- Gebruik de volgende PCR-reactieomstandigheden:pre-denaturatie bij 94 °C gedurende 4 minuten; 94 °C gedurende 30 s, 53 °C gedurende 1 min, 72 °C gedurende 1 min gedurende 25 cycli en verlenging bij 72 °C gedurende 10 minuten.
4. Constructie van de micC aangevulde stam
- Ontwerpprimers pBR-micC-F en pBR-micC-R met NheI- en SalI-beperkingsplaatsen.
- Amplify full-length micC gen met flanksequenties met behulp van PCR reactiemengsel dat 5 μL SE50336 genomisch DNA als sjabloon bevat, primers 1 μL pBR-micC-F en 1 μL pBR-micC-R als primers, 5 μLof 10x PCR reactiebuffer, 2 μL dNTP Mengsel (2,5 mM), 2 μL dNTP Mengsel (2,5 mM) en 35 μL ddH2O.
- Gebruik de volgende PCR-reactieomstandigheden: pre-denaturatie bij 94 °C gedurende 4 minuten; 94 °C gedurende 30 s, 52 °C gedurende 50 s, 72 °C gedurende 1 min gedurende 25 cycli en verlenging bij 72 °C gedurende 10 minuten. Zuiver en herstel PCR-product.
- Vergist PCR-product en plasmide pBR322 respectievelijk met behulp van restrictie-enzym NheI en SalI, en ligaat ze met behulp van T4-ligase bij 16 °C 's nachts om het plasmide pBR322-micC te verkrijgen.
- Transformeer pBR322-micC in de SE50336ΔmicC competente cellen en screen positieve transformant om de aangevulde stam SE50336ΔmicC/pmicC te verkrijgen. Extraheer plasmide pBR322-micC uit de aangevulde stam en verifieer het door restrictie-enzymvertering en sequencing.
5. RNA-isolatie en kwantitatieve real-time PCR
- Kweek SE50336, 50336ΔmicC en 50336ΔmicC/pmicC in LB medium 's nachts bij 24 °C met 180 rpm schud de teelt tot een OD600 van 2,0. Verzamel bacteriecultuur door centrifugeren bij 13000 rpm gedurende 2 minuten.
- Extraheer totaal RNA met behulp van TRIzol-reagens. Incubeer 50 μL geïsoleerd RNA met 2 μL DNaseI en 6 μL 10x buffer bij 37 °C gedurende 30 minuten om DNA te verwijderen. Bepaal de hoeveelheid RNA door 1 μL RNA-monster naar een microspectrofotometer te pipetteren.
- Synthese van cDNA
- Gebruik 1 μg totaal RNA voor cDNA-synthese in 20 μL van het reverse transcriptiereactiesysteem (4 μL van 5x buffer, 1 μL van RT Enzym mix, 1 μL van RT primer mix, 10 μL van totaal RNA, en 4 μL van ddH2O). Incubeer boven het reactiesysteem bij 37 °C gedurende 15 minuten en vervolgens bij 85 °C gedurende 5 s.
- Ontwerp primers op basis van de sequentie van doelgenen ompA, ompC en ompD. Voer reverse transcriptie-PCR uit met behulp van een RT-reagenskit. De PCR-reactiecomponenten bevatten 2,5 μL 10x PCR-reactiebuffer, 1 μL dNTP-mengsel (2,5 mM), 1 μL doelgen (ompA, ompC of ompD) primers, 2,5 μL sjabloon, 0,5 μL Taq DNA-polymerase en 17,5 μL ddH2O.
- Gebruik de volgende PCR-reactieomstandigheden:pre-denaturatie bij 94 °C gedurende 4 minuten; 94 °C gedurende 30 s, 60 °C gedurende 1 min, 72 °C gedurende 1 min gedurende 25 cycli en verlenging bij 72 °C gedurende 10 minuten.
- Voer real-time PCR uit met behulp van SYBR groene RT-PCR-kit in een RT-PCT-instrument in drievoud.
- Gebruik de volgende PCR-reactiecomponenten: 10 μL 2x SYBR-buffer, 0,4 μLof forward primer en reverse primer respectievelijk, 0,4 μL RoxDye II, 2 μLof cDNA en 6,8 μL RNase-vrij H2O.
- Gebruik de volgende PCR-reactieomstandigheden:pre-denaturatie bij 95 °C gedurende 1 minuut gedurende één cyclus; 95 °C gedurende 5 s, 60 °C gedurende 34 s gedurende 40 cycli.
- Normaliseer alle gegevens naar het endogene referentiegen gyrA. Gebruik de 2-Δ Δ CT-methode voor gegevenskwantificering15.
6. Virulentietests
- Kweek SE50336, 50336ΔmicC en 50336ΔmicC/pmicC in LB medium tot vroege stationaire fase (OD600 van 2-3) bij 24 °C, oogst door centrifugatie en verdun tot geschikte CFU mL-1 in steriele PBS.
- Voor muizeninfecties verdunt u de gekweekte stammen tot 10 CFU/200 μL, 102 CFU/200 μL en 103 CFU/200 μL gradiëntresuspensies. Infecteer groepen van vijf 6-8 weken oude Balb/c muizen per stam door subcutane injectie. Injecteer de controlegroep met 200 μL fysiologische zoutoplossing.
- Voor kippeninfecties, verdun boven drie stammen tot 107 CFU/200 μL, 108 CFU/200 μL en 109 CFU/200 μL gradiënt resuspensies. Infecteer groepen van twintig kippen van 1 dag oud per stam door subcutane injectie.
- Controleer dagelijks tekenen van ziekte en sterfgevallen van proefdieren. Bereken de LD50 (mediane letale dosis) 14 d na infectie zoals eerder beschreven16. Verwerk de gegevens met behulp van data-analysesoftware.
- Verzamel in infectiegroepen het hart, de lever, de milt, de longen en de nieren van vers dode kuikens. Weeg 0,5 g van de bovenstaande weefsels afzonderlijk af en maal ze met steriele werking. Verdun de maalmonsters geleidelijk, verdeel ze op LB-plaat en kweek gedurende 8-10 uur bij 37 °C. Noteer de hoeveelheid Salmonella-stammen die in kuikenweefsels zijn gekoloniseerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Constructie van de mutant 50336Δ micC en de gecomplementeerde stam 50336Δ micC /p micC
Het resultaat van het micC-genkloon gaf aan dat dit gen was samengesteld uit 109 bp met 100% identiteit met dat van S. Tyfumurie. Op basis van de sequentiegegevens werden de deletiemutant 50336ΔmicC en de gecomplementeerde mutant 50336ΔmicC/pmicC met succes geconstrueerd. In detail toonden sequencingresultaten aan dat een weerstandscassette van 1,1 kb cm werd versterkt en gebruikt voor het construeren van de 1e recombinant. De 1e recombinant 50336ΔmicC::cat werd gevalideerd door PCR met behulp van primers vmicC-F en vmicC-R met een verwachte bandgrootte van ongeveer 1200 bp van PCR-producten met Cm-insertie vergeleken met 279 bp van PCR-producten in wildtype stam (figuur 1). Bij de tweede recombinatie werd de Cm-cassette geëlimineerd door pCP20. De PCR-resultaten in combinatie met sequencing bevestigden dat de isogene micC-mutant met succes werd geconstrueerd en benoemd als 50336ΔmicC (figuur 1).
MicC reguleert de genexpressie van ompA, ompC en ompD
Om de doelen van MicC te bepalen, werd de expressie van ompA-, ompC- en ompD-genen in SE-stammen 50336, 50336ΔmicC en 50336ΔmicC / p micC geanalyseerd door real-time kwantitatieve PCR met behulp van gyrA als de normaliserende interne standaard. De resultaten toonden aan dat de transcriptie van ompA en ompC in 50336ΔmicC ongeveer 2,2-voudig en 3-voudig toenam dan die in de wild-type stam, terwijl ompD in 50336ΔmicC iets was verhoogd (1,3-voudig) dan die in wild type stam (figuur 2). Het gaf aan dat micC de expressie van ompA, ompC en ompD kon onderdrukken. OmpA was waarschijnlijk een potentieel nieuw doelgen dat rechtstreeks door micC werd gereguleerd.
Het verwijderen van micC verbetert S. Enteritidis-virulentie bij muizen en kippen
We hebben LD50-testen uitgevoerd om de impact van het verwijderen van micC op S te kwantificeren. Enteritidis-virulentie bij muizen en kippen. Na het infecteren van 6-8 weken oude Balb / c-muizen met 103 CFU van elk van de drie stammen, zagen we dat de meeste muizen geïnfecteerd door 50336ΔmicC 48 uur na infectie lassitude, onappetijtigheid of diarree vertoonden en 96 uur na infectie achtereenvolgens leken te sterven. Terwijl de muizen geïnfecteerd door WT-stam en 50336ΔmicC / pmicC de bovenstaande symptomen vertoonden 72 h na infectie en 120 uur na infectie dood waren. De LD50s werden 7 d na infectie berekend. De resultaten toonden aan dat de LD50 van de WT-stam 50336, 50336ΔmicC en 50336ΔmicC/pmicC voor muizen respectievelijk 12,59, 5,01 en 19,95 CFU waren. Het gaf aan dat de virulentie van de mutant 50336ΔmicC 2,5-voudig verbeterde in vergelijking met WT bij muizen (tabel 3). Na het infecteren van 1 dag oude kippen met 109 CFU van elk van de drie stammen, vertoonden de meeste kippen intestinale hyperemie en diarree 10 h na infectie. Bij infectie met 108 CFU vertoonden de kippen die besmet waren met 50336ΔmicC een hogere mortaliteit, in vergelijking met WT-stam en 50336ΔmicC / pmicC. De LD50s werden berekend voor 14 d post-infectie. De resultaten toonden aan dat de LD 50 van de WT-stam 50336, 50336ΔmicC en 50336ΔmicC/pmicC voor kippen respectievelijk 1,13×109, 1,55×10 8 en2,54×10 8 CFU waren. Het gaf aan dat deletie van micC ook de virulentie van S verhoogde. Enteritidis bij kippen. Alle drie de stammen van S. Enteritidis werden teruggevonden uit de lever, milt en caecum van de geïnfecteerde kippen.
Figuur 1: PCR-verificatie van de 50336ΔmicC-mutanten met primers vmicC-F en vmicC-R. Een 280 bp PCR-product werd verkregen toen het wild-type 50336 genoom als sjabloon (baan 1). Toen het Cm-cassettegen werd ingebracht in het genoom van S. Enteritidis, de 1e recombinant 50336Δmic::cat werd geverifieerd door PCR en een 1100 bp PCR product werd verkregen (baan 2). Het Cm-cassettegen van 50336Δmic::cat werd weggesneden door de FLP-recombinase-expresserende vector pCP20 te introduceren en de2e recombinant 50336Δ-microfoon werd verkregen en geverifieerd door PCR (baan 3). M: moleculaire massamarker. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Vouwveranderingen van ompA-, ompC- en ompD-genen mRNA-niveau werden bepaald in de mutant 50336 Δ-microfoon en vulden stam 50336Δmic/p-microfoon aan met kwantitatieve RT-PCR in vergelijking met de wildtypestam. Assays werden in drievoud uitgevoerd. Voor de kwantificering van gegevens werd de 2-ΔΔCT-methode gebruikt. *Geeft een statistisch significant verschil aan ten opzichte van de wildsoort (p<0,05) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Stammen/plasmiden | Kenmerken | Verwijzingen |
| Stammen | ||
| CMCC(B)50336 | Salmonella enterica serovar Enteritidis wild-type | NICPBP, China |
| 50336ΔmicC | micC-deficiënte mutant | Deze studie |
| 50336ΔmicC/pmicC | 50336Δ micC met pBR-micC (Ampr) | Deze studie |
| Plasmiden: | ||
| pKD3 | Cmr; Cm cassette teplaat | [13] |
| pKD46 | Ampèrer, λRode recombinase expressie | [13] |
| pCP20 | Ampère r, Cmr; Flp-recombinase-expressie | [13] |
| pBR-micC | pBR322 met het volledige micC-gen (Ampr) | Deze studie |
| pGEM-T gemakkelijk | klonen vector, Ampr | Takara |
| pMD19 T-eenvoudig | klonen vector, Ampr | Takara |
Tabel 1. Bacteriestammen en plasmiden die in deze studie worden gebruikt.
| Abc | Volgorde (5'-3') | Productgrootte (bp) | ||||||
| micC-F | TGTCAGGAAAGACCTAAAAAAGAGATGTTACCGTTTAATTCAATAATTAATTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG | 1114 | ||||||
| micC -R | TGGAAATAAAAAAAGCCCGAACATCCGTTCGGGCTTGTCAATTTATACCATATGAATATCCTCCTTAG | |||||||
| vmicC -F | AGCGAGTTGACGTTAAAACGTTAT | 279/140 | ||||||
| vmicC -R | TTCGTTCGGGCTTGTCAATTTATA | |||||||
| pBR-micC-F | CAGGCTAGCCACTTTATGTACAATGACATACGTCAC | 434 | ||||||
| pBR-micC-R | CAGGTCGACAAATATTCTAAGGATTAACCTGGAAAC | |||||||
| ompA-F | ACTGAACGCCCTGAGCTTTA | 177 | ||||||
| ompA-R | ACACCGGCTTCATTCACAAT | |||||||
| ompC-F | AAAGTTCTGCGCTTTGTTGG | 187 | ||||||
| ompC-R | CGCTGACGAACACCTGTATG | |||||||
| ompD-F | ACGGTCAGACTTCGCATAGG | 184 | ||||||
| ompD-R | TGTTGCCACCTACCGTAACA | |||||||
| gyrA-F | GCATGACTTCGTCAGAACCA | 278 | ||||||
| gyrA-R | GGTCTATCAGTTGCCGGAAG | |||||||
Tabel 2. Primers gebruikt in deze studie
| Stammen | LD50 voor muizen (CFU) | Vouwverbetering | LD50 voor kippen (CFU) | Vouwverbetering |
| S. Enteritidis 50336 | 12.59 | 1 | 1.13×109 | 1 |
| 50336ΔmicC | 5.01 | 2.51 | 1.55×108 | 7.29 |
| 50336Δ micC/pmicC | 19.95 | 0.63 | 2.54×108 | 4.45 |
| Negatieve controle | 0 | / | 0 | / |
Tabel 3. Virulentie-eigenschappen van S. Enteritidis 50336 stammen bij muizen en kippen
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
S. Enteritidis is een belangrijke facultatieve intracellulaire ziekteverwekker die jonge kippen kan infecteren en symptomen veroorzaakt van enteritis tot systemische infectie en overlijden17,18. Bovendien veroorzaakt S. Enteritidis latente infecties bij volwassen kippen en chronische dragers besmetten pluimveeproducten, wat resulteert in door voedsel overgedragen infecties bij mensen19. Het pathogene mechanisme van S. Enteritidis moet nog verder worden onderzocht. Tot op heden is gebleken dat sommige sRNA's zoals IsrJ, SroA en IsrM de salmonellavirulentie beïnvloeden 20,21,22,23. Het niet-coderende kleine RNA micC-gen werd geïdentificeerd in veel Enterobacteria zoals Escherichia coli, Salmonella Typhimurium, Salmonella Bongori en Shigella flexneri 6,7,24. Hier vonden we dat de volgorde van micC in S. Enteritidis 50336 was hetzelfde als die in S. Tyfumurie. Het geeft aan dat MicC een conservatief sRNA is in Enterobacteria.
Om te onderzoeken of MicC virulentie in S. bemiddelt. Enteritidis voor dieren en identificeren MicC-doelen, we construeerden de deletiemutant 50336ΔmicC en de aangevulde mutant 50336ΔmicC / p micC diemicC met succes tot expressie bracht. De resultaten van qRT-PCR gaven aan dat micC de expressie van ompA en ompC kon onderdrukken. OmpA is waarschijnlijk een potentieel nieuw doelwit van MicC. Het sRNA RybB zou de synthese van OmpA kunnen onderdrukken door base-pairing met de 5' onvertaalde gebieden (5' UTR's) van target ompA mRNA25. Het MicA-sRNA vergemakkelijkt ook een snel verval van het ompA-mRNA door antisense-paring op dezelfde manier als RybB25,26. Of MicC het vergelijkbare regulatiemechanisme gebruikt om ompA te reguleren, is niet bekend en moet in de nabije toekomst nog worden bestudeerd. Bij E. coli verhoogde de deletie van MicC de expressie van ompC 1,5- tot 2-voudig. Verder onderzoek toonde aan dat MicC de ribosoombinding aan de ompC mRNA 5'-leider6 remt. Bovendien ontdekte Pfeiffer dat OmpC het belangrijkste doelwit van MicC7 was. Er wordt verondersteld dat MicC ompC reguleert in een vergelijkbaar mechanisme in S. Enteritidis met dat in E. coli en S. Tyfumurie. Naast OmpA en OmpC kon MicC ook de expressie van OmpD onderdrukken. Het resultaat toonde aan dat de transcriptie van ompD in 50336ΔmicC iets verhoogd was (1,3-voudig) dan die in wild type stam. Op basis van de bovenstaande resultaten toonde het aan dat MicC de transcriptie van meerdere doel-mRNA's (ompA, ompC en ompD) in S kon onderdrukken. Enteritidis. MicC is niet het enige sRNA dat meerdere doelwitten kan reguleren. Sommige sRNA's zoals RybB, DsrA, GcvB, RNAIII en RyhB werken ook op meerdere doelen 25,27,28,29,30,31. Omdat sRNA's doelen reguleren door middel van base-pairing mechanisme om sRNA-target interacties te bereiken32, is het mogelijk dat geconserveerde subregio's of domeinen van sRNA's kunnen binden aan verschillende doelen.
Het buitenmembraan van Gram-negatieve bacteriën is een belangrijke interface in gastheer-pathogeen interacties. OmpA, OmpC en OmpD zijn allemaal belangrijke en overvloedige buitenmembraaneiwitten. OmpC speelt een belangrijke rol in abominabele omgevingen zoals in de darm6. OmpD is betrokken bij de hechting aan menselijke macrofagen en darmepitheelcellen12. Er werd gedacht dat de verandering van OMP-expressie veroorzaakt door MicC-deletie de virulentie van S zou kunnen beïnvloeden . Enteritidis en MicC verzamelden zich in stationaire fasecellen en induceerden vooral onder groeiomstandigheden de Salmonella SPI-1 en SPI-2 virulentiegenen7. Er wordt gedacht dat MicC gerelateerd is aan virulentie in Salmonella, terwijl dierinfecties experimenten werden uitgevoerd om virulentie van MicC te detecteren. De resultaten toonden aan dat de LD50 van de mutanten 50336ΔmicC voor 1-dag-oude kippen en 6-weken-oude Balb / c-muizen beide duidelijk waren afgenomen in vergelijking met de wildtype-stam. Het gaf aan dat de deletie van micC de virulentie van S. Enteritidis bij muizen en kippen. Er wordt verondersteld dat de toename van OmpA, OmpC en OmpD-expressie, die wordt veroorzaakt door MicC-deletie, leidt tot virulentieverbetering in S. Enteritidis.
MicC reguleert S negatief. Enteritidis-virulentie bij muizen en kippen waarschijnlijk door downregulatie van de expressie van de belangrijkste buitenmembraaneiwitten OmpA en OmpC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door subsidies van de Chinese National Science Foundation (nrs. 31972651 en 31101826), Jiangsu High Education Science Foundation (No.14KJB230002), State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology (No.SKLVBF201509), Nature Science Foundation Grant of Yangzhou (No.YZ2014019), een project gefinancierd door de Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| dextrose | Sangon Biotech | A610219 | for broth preparation |
| DNA purification kit | TIANGEN | DP214 | for DNA purification |
| Ex Taq | TaKaRa | RR01A | PCR |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017608 | for broth preparation |
| K2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 20032116 | for broth preparation |
| L-Arabinose | Sangon Biotech | A610071 | λ-Red recombination |
| Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP106 | plasmid extraction |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | for broth preparation |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | for broth preparation |
| PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser | TaKaRa | RR047 | qRT-PCR |
| SYBRR Premix Ex Taq II | TaKaRa | RR820 | qRT-PCR |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202 | Ligation |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | for broth preparation |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | for broth preparation |
| centrifuge | Eppendorf | 5418 | centrifugation |
| Electrophoresis apparatus | Bio-Rad | 164-5050 | Electrophoresis |
| Electroporation System | Bio-Rad | 165-2100 | for bacterial transformation |
| Spectrophotometer | BioTek | Epoch | Absorbance detection |
| Real-Time PCR system | Applied Biosystems | 7500 system | qRT-PCR |
References
- Jørgensen, M. G., Pettersen, J. S., Kallipolitis, B. H. sRNA-mediated control in bacteria: An increasing diversity of regulatory mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta-Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), 194504 (2020).
- Wagner, E. G. H., Romby, P. Small RNAs in bacteria and archaea: who they are, what they do, and how they do it. Advances In Genetics. 90, 133-208 (2015).
- Vogel, J. A rough guide to the non-coding RNA world of Salmonella. Molecular Microbiology. 71 (1), 1-11 (2009).
- Dutta, T., Srivastava, S. Small RNA-mediated regulation in bacteria: A growing palette of diverse mechanisms. Gene. 656, 60-72 (2018).
- Waters, L. S., Storz, G.
- Chen, S., Zhang, A., Blyn, L. B., Storz, G. MicC, a second small-RNA regulator of Omp protein expression in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 186 (20), 6689-6697 (2004).
- Pfeiffer, V., Papenfort, K., Lucchini, S., Hinton, J. C., Vogel, J. Coding sequence targeting by MicC RNA reveals bacterial mRNA silencing downstream of translational initiation. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (8), 840-846 (2009).
- Dam, S., Pagès, J. M., Masi, M. Dual Regulation of the Small RNA MicC and the Quiescent Porin OmpN in Response to Antibiotic Stress in Escherichia coli. Antibiotics (Basel). 6 (4), 33 (2017).
- Hao, M., et al. Porin Deficiency in Carbapenem-Resistant Enterobacter aerogenes Strains. Microbial Drug Resistance. 24 (9), 1277-1283 (2018).
- Wroblewska, Z., Olejniczak, M. Hfq assists small RNAs in binding to the coding sequence of ompD mRNA and in rearranging its structure. RNA. 22 (7), 979-994 (2016).
- Santiviago, C. A., Toro, C. S., Hidalgo, A. A., Youderian, P., Mora, G. C. Global regulation of the Salmonella enterica serovar typhimurium major porin, OmpD. Journal of Bacteriology. 185 (19), 5901-5905 (2003).
- Hara-Kaonga, B., Pistole, T. G. OmpD but not OmpC is involved in adherence of Salmonella enterica serovar typhimurium to human cells. Canadian Journal of Microbiology. 50 (9), 719-727 (2004).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).
- Meng, X., et al. The RNA chaperone Hfq regulates expression of fimbrial-related genes and virulence of Salmonella enterica serovar Enteritidis. FEMS Microbiology Letters. 346 (2), 90-96 (2013).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Vander Velden, A. W., Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Heffron, F. Multiple fimbrial adhesins are required for full virulence of Salmonella typhimurium in mice. Infection and Immunity. 66 (6), 2803-2808 (1998).
- Prescott, J. F. Salmonella enterica serovar enteritidis in humans and animals: Epidemiology, pathogenesis, and control. Canadian Veterinary Journal La Revue Veterinaire Canadienne. 40 (10), 736 (1999).
- Balasubramanian, R., et al. The global burden and epidemiology of invasive non-typhoidal. Hum Vaccin Immunother. 15 (6), 1421-1426 (2019).
- De Buck, J., Van Immerseel, F., Haesebrouck, F., Ducatelle, R. Colonization of the chicken reproductive tract and egg contamination by Salmonella. Journal of General and Applied Microbiology. 97 (2), 233-245 (2004).
- Padalon-Brauch, G., et al. Small RNAs encoded within genetic islands of Salmonella typhimurium show host-induced expression and role in virulence. Nucleic Acids Research. 36 (6), 1913-1927 (2008).
- Santiviago, C. A., et al. Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice. PLoS Pathogens. 5 (7), 1000477 (2009).
- Gong, H., et al. A Salmonella small non-coding RNA facilitates bacterial invasion and intracellular replication by modulating the expression of virulence factors. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002120 (2011).
- Hébrard, M., et al. sRNAs and the virulence of Salmonella enterica serovar Typhimurium. RNA Biology. 9 (4), 437-445 (2012).
- Vogel, J., Papenfort, K. Small non-coding RNAs and the bacterial outer membrane. Current Opinion in Microbiology. 9 (6), 605-611 (2006).
- Papenfort, K., et al. SigmaE-dependent small RNAs of Salmonella respond to membrane stress by accelerating global omp mRNA decay. Molecular Microbiology. 62 (6), 1674-1688 (2006).
- Udekwu, K. I., et al. Hfq-dependent regulation of OmpA synthesis is mediated by an antisense RNA. Genes and Development. 19 (19), 2355-2366 (2005).
- Papenfort, K., Vogel, J. Multiple target regulation by small noncoding RNAs rewires gene expression at the post-transcriptional level. Research in Microbiology. 160 (4), 278-287 (2009).
- Lease, R. A., Cusick, M. E., Belfort, M. Riboregulation in Escherichia coli: DsrA RNA acts by RNA:RNA interactions at multiple loci. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (21), 12456-12461 (1998).
- Sharma, C. M., Darfeuille, F., Plantinga, T. H., Vogel, J. A small RNA regulates multiple ABC transporter mRNAs by targeting C/A-rich elements inside and upstream of ribosome-binding sites. Genes and Development. 21 (21), 2804-2817 (2007).
- Boisset, S., et al. Staphylococcus aureus RNAIII coordinately represses the synthesis of virulence factors and the transcription regulator Rot by an antisense mechanism. Genes and Development. 21 (11), 1353-1366 (2007).
- Massé, E., Vanderpool, C. K., Gottesman, S. Effect of RyhB small RNA on global iron use in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 187 (20), 6962-6971 (2005).
- Papenfort, K., Vogel, J.
