Summary
Un système de recombinaison médiée par λ-Red a été utilisé pour créer un mutant de délétion d’un petit micC à ARN non codant.
Abstract
Un petit ARN non codant (ARNs) est un nouveau facteur pour réguler l’expression des gènes au niveau post-transcriptionnel. Une sorte d’ARNs MicC, connu chez Escherichia coli et Salmonella Typhimurium, pourrait réprimer l’expression des protéines de la membrane externe. Pour étudier plus avant la fonction de régulation du micC chez Salmonella Enteritidis, nous avons cloné le gène micC dans la souche 50336 de Salmonella Enteritidis, puis construit le mutant 50336Δ micC par le système de recombinaison à base de λ Red et le mutant 50336Δ micC/p micC complété portant le plasmide recombinant pBR322 exprimant micC. Les résultats de la qRT-PCR ont démontré que la transcription de l’ompD dans 50336Δ micC était 1,3 fois plus élevée que celle de la souche de type sauvage, tandis que la transcription de ompA et ompC dans 50336ΔmicC était 2,2 fois et 3 fois plus élevée que celles de la souche de type sauvage. Ceux-ci indiquent que micC réprime l’expression de ompA et ompC. Dans l’étude suivante, la pathogénicité de 50336ΔmicC a été détectée par des souris Balb/c âgées de 6 semaines et des poulets âgés de 1 jour. Le résultat a montré que la DL50 de la souche de type sauvage 50336, les mutants 50336Δ micC et 50336Δ micC/p micC pour les souris Balb/c âgées de 6 semaines étaient respectivement de 12,59UFC, 5,01 UFC et 19,95 UFC. La DL 50 des souches pour les poulets âgés de 1 jour était de 1,13 x 109 UFC, 1,55 x 10 8 UFC et2,54 x 10 8 UFC, respectivement. Il a indiqué que la délétion de micC améliorait la virulence de S. Enteritidis chez la souris et le poulet en régulant l’expression des protéines de la membrane externe.
Introduction
Les petits ARN non codants (ARNs) ont une longueur de 40 à 400 nucléotides, qui ne codent généralement pas pour des protéines mais pourraient être transcrits indépendamment dans les chromosomes bactériens 1,2,3. La plupart des ARNs sont codés dans les régions intergéniques (IGR) entre les régions codant pour les gènes et interagissent avec les ARNm cibles par des actions d’appariement de bases, et régulent l’expression des gènes cibles au niveau post-transcriptionnel 4,5. Ils jouent un rôle régulateur important dans le métabolisme des substances, la synthèse des protéines de la membrane externe, la détection du quorum et l’expression des gènes de virulence5.
MicC est un petit transcrit d’ARN de 109 nucléotides présent dans Escherichia coli et Salmonella enterica sérovar Typhimurium, qui pourrait réguler l’expression de plusieurs protéines de la membrane externe telles que OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 et Omp36 6,7,8,9. MicC régule l’expression de l’OmpC en inhibant la liaison du ribosome au leader de l’ARNm ompC in vitro et nécessite le chaperon d’ARN Hfq pour sa fonction chez Escherichia coli6. Chez Salmonella Typhimurium, MicC réduit au silence l’ARNm ompD via un duplex d’ARN ≤12-bp dans la séquence codante (codons 23-26) puis déstabilise l’ARNm endonucléolytique7. Ce processus de régulation est assisté par la protéine chaperonne Hfq10. L’OmpC est une protéine membranaire externe abondante que l’on croyait importante dans les environnements où les concentrations de nutriments et de toxines étaient élevées, comme dans l’intestin6. La porine OmpD est la protéine membranaire externe la plus abondante chez Salmonella Typhimurium et représente environ 1% de la protéine cellulaire totale11. L’OmpD est impliqué dans l’adhérence aux macrophages humains et aux cellules épithéliales intestinales12. MicC réprime également l’expression des porines OmpC et OmpD. On pense que MicC peut réguler la virulence. Pour explorer de nouveaux gènes cibles régulés par MicC et étudier la fonction de régulation de la virulence de micC, nous avons cloné le gène micC dans la souche 50336 de Salmonella Enteritidis (SE), puis construit le mutant 50336ΔmicC et le mutant complété 50336ΔmicC/p micC. De nouveaux gènes cibles ont été criblés par qRT-PCR. La virulence de 50336ΔmicC a été détectée par des souris et des infections de poulet.
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Protocol
Toutes les expériences ont été menées conformément au Guide sur le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire du Conseil national de recherches. Le comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Yangzhou a approuvé toutes les expériences et procédures appliquées aux animaux (SYXK2016-0020).
1. Souches bactériennes, plasmides et conditions de culture
- Utilisez les bactéries et les plasmides énumérés dans le tableau 1.
- Culture de bactéries dans un bouillon LB ou sur des plaques de gélose LB à 37 °C, en présence de 50 μg/mL d’ampicilline (Amp), le cas échéant.
- Des souches de culture contenant des plasmides sensibles à la température sont utilisées pour la construction de mutants de délétion à 30 °C.
2. Cloner le gène micC de S. Souche 50336 d’Enteritidis
- Basé sur la séquence amont et aval du gène micC de S. La souche SL1344 de Typhimurium conçoit les amorces vmicC-F et vmicC-R pour amplifier un fragment contenant le gène micC par PCR en utilisant l’ADN génomique SE50336 comme modèle.
- Mélanger 5 μL de tampon réactionnel PCR 10x, 2 μL de mélange dNTP (2,5 mM), 1 μL d’amorces vmicC-F et vmicC-R, respectivement, 5 μL de matrice, 1 μL d’ADN polymérase Taq et 35 μL deddH2Oensemble pour la PCR.
- Utiliser les conditions de réaction PCR suivantes : prédénaturation à 94 °C pendant 4 min ; 94 °C pendant 30 s, 53 °C pendant 1 min, 72 °C pendant 1 min pendant 25 cycles, et extension à 72 °C pendant 10 min.
- Séquencer le produit PCR pour obtenir la séquence du gène micC .
3. Construction du mutant de délétion micC
NOTA : Le mutant micC-négatif de la souche 50336 de Salmonella Enteritidis a été construit en utilisant la recombinaison médiée par λ-Red comme décrit précédemment13,14. Les amorces utilisées sont énumérées dans le tableau 2.
- Amplifier la cassette de chloramphénicol contenant des fragments d’homologie du gène micC .
- Concevoir des amorces micC-F et micC-R pour amplifier la cassette de chloramphénicol (Cm) à partir du plasmide pKD3, y compris des extensions d’homologie de 50 pb à partir des 5' et 3' du gène micC .
- Extrayez le plasmide pKD3 comme modèle de PCR.
- Mélanger 5 μL de tampon réactionnel PCR 10x, 2 μL de mélange dNTP (2,5 mM), 1 μL d’amorces micC-F et micC-R, respectivement, 5 μL de matrice, 1 μL d’ADN polymérase Taq et 35 μL deddH2Oensemble comme mélange réactionnel PCR
- Amplifier la cassette Cm avec les conditions de réaction PCR suivantes : prédénaturation à 94 °C pendant 4 min ; 94 °C pendant 1 min, 52 °C pendant 1 min, 72 °C pendant 1 min pendant 10 cycles; 94 °C pendant 1 min, 63 °C pendant 1 min, 72 °C pendant 1 min pendant 25 cycles, et extension à 72 °C pendant 10 min.
- Détecter la taille du produit PCR par électrophorèse sur gel d’agarose. Purifier et récupérer le produit PCR avec le kit de récupération de gel d’ADN, et déterminer la concentration d’ADN par spectrophotomètre.
ATTENTION : La PCR doit être réalisée deux fois. Le premier produit de PCR a été dilué dans un rapport de 1:200 et utilisé comme matrice pour la PCR secondaire, afin d’éliminer l’interférence d’une recombinaison ultérieure par le plasmide pKD3.
- Construire la 1èresouche recombinante 50336ΔmicC::cat
- Mélanger uniformément 100 μL de cellules compétentes SE50336 avec 5 μL de plasmide pKD46 et incuber sur de la glace pendant 30 min. Choc thermique du mélange ci-dessus à 42 °C pendant 90 s et transfert rapide du mélange dans la glace pendant 2 min pour transformer le plasmide pKD46 en SE50336. Cribler les colonies positives en les cultivant pendant la nuit à 30 °C sur une plaque résistante à l’ampère (50 μg/mL).
- Ajouter 30 mM de L-arabinose à la culture liquide SE50336/pKD46 et induire l’expression de la recombinase par une culture d’agitation à 30 °C pendant 1 h. Ensuite, préparez les cellules compétentes.
- Mélanger 100 ng de produit PCR purifié (étape 3.1) et 40 μL de cellules compétentes SE50336/pKD46 dans une coupelle à chocs électriques (p. ex., Bio-Rad). Effectuer la transformation des chocs électriques avec les paramètres de tension 1,8 kV, impulsion 25 μF et résistance 200 Ω.
- Après électrotransformation, transférer le mélange dans 1 mL de milieu SOC et une culture d’agitation à 150 rpm et 30 °C pendant 1 h. Ensuite, étaler le mélange sur une plaque LB résistante à Cm (34 μg/mL) et la cultiver à 37 °C pendant la nuit pour dépister la colonie positive.
- Culture de la colonie positive ci-dessus à 42 °C pendant 2 h. Cribler la colonie sensible à l’Amp (50 μg/mL) mais résistante au Cm (34 μg/mL) à 37 °C pendant la nuit pour obtenir la 1ère souche recombinante sans pKD46.
- Identifier la 1ère souche recombinante 50336ΔmicC::Cat.
- Extraire l’ADN génomique 50336ΔmicC::Cat comme modèle de PCR. Utiliser les mêmes composants de réaction PCR qu’à l’étape 2.1. Effectuer la réaction PCR dans les mêmes conditions qu’à l’étape 2.1.
- Détecter la taille du produit PCR par électrophorèse sur gel d’agarose et séquencer le produit PCR.
- Construire le mutant de suppression 50336ΔmicC.
- Électroporate 100 ng de plasmide pCP20 dans 40 μL de cellules compétentes 50336ΔmicC::Cat avec les paramètres de tension 1,8 kV, impulsion 25 μF et résistance 200 Ω, transformants positifs sur écran sur plaque résistante à l’amplificateur (50 μg/mL) et au Cm (34 μg/mL) à 30 °C.
- Transférer au-dessus des transformants positifs en LB non résistants et les cultiver pendant une nuit à 42 °C, puis isoler les colonies individuelles sur une plaque LB à 37 °C. Sélectionnez la colonie sensible à la fois à Amp et à Cm. Ce mutant est le mutant de délétion micC SE50336ΔmicC.
- Vérifiez 50336ΔmicC par PCR.
- Extraire l’ADN génomiquemicC 50336Δ comme modèle de PCR. Mélanger 5 μLof 10x tampon réactionnel PCR, 2 μL de mélange dNTP (2,5 mM), 1 μL d’amorce vmicC-F, 1 μL d’amorce vmicC-R, 5 μL de matrice, 1 μL d’ADN polymérase Taq et 35 μL deddH2Oensemble pour la PCR.
- Utiliser les conditions de réaction PCR suivantes : prédénaturation à 94 °C pendant 4 min ; 94 °C pendant 30 s, 53 °C pendant 1 min, 72 °C pendant 1 min pendant 25 cycles, et extension à 72 °C pendant 10min.
4. Construction de la souche complétée par le micC
- Concevoir des amorces pBR-micC-F et pBR-micC-R avec des sites de restriction NheI et SalI.
- Amplifier le gène micC pleine longueur avec des séquences de flanc en utilisant un mélange réactionnel PCR contenant 5 μL d’ADN génomique SE50336 comme matrice, des amorces 1 μL de pBR-micC-F et 1 μL de pBR-micC-R comme amorces, 5 μL de tampon de réaction PCR 10x, 2 μL de mélange dNTP (2,5 mM), 2 μL de mélange dNTP (2,5 mM) et 35 μL de ddH2O.
- Utiliser les conditions de réaction PCR suivantes : prédénaturation à 94 °C pendant 4 min ; 94 °C pendant 30 s, 52 °C pendant 50 s, 72 °C pendant 1 min pendant 25 cycles et extension à 72 °C pendant 10 min. Purifier et récupérer le produit PCR.
- Digérer le produit PCR et le plasmide pBR322 respectivement en utilisant l’enzyme de restriction NheI et SalI, et les ligaturer en utilisant la T4 ligase à 16 °C pendant la nuit pour obtenir le plasmide pBR322-micC.
- Transformer pBR322-micC en cellules compétentes SE50336ΔmicC et cribler le transformant positif pour obtenir la souche complémentaire SE50336ΔmicC/pmicC. Extraire le plasmide pBR322-micC de la souche complétée et le vérifier par digestion et séquençage des enzymes de restriction.
5. Isolement de l’ARN et PCR quantitative en temps réel
- Culture SE50336, 50336ΔmicC et 50336ΔmicC/pmicC en milieu LB pendant une nuit à 24 °C avec culture sous agitation de 180 rpm jusqu’à une DO600 de 2,0. Recueillir la culture bactérienne par centrifugation à 13000 rpm pendant 2 min.
- Extraire l’ARN total à l’aide du réactif TRIzol. Incuber 50 μL d’ARN isolé avec 2 μL de DNaseI et 6 μL de tampon 10x à 37 °C pendant 30 min pour éliminer l’ADN. Déterminer la quantité d’ARN en pipetant 1 μL d’échantillon d’ARN vers un micro-spectrophotomètre.
- Synthèse de l’ADNc
- Utiliser 1 μg d’ARN total pour la synthèse de l’ADNc dans 20 μL de système de réaction de transcription inverse (4 μL de tampon 5x, 1 μL de mélange d’enzymes RT, 1 μL de mélange d’amorces RT, 10 μL d’ARN total et 4 μL deddH2O). Incuber au-dessus du système réactionnel à 37 °C pendant 15 min, puis à 85 °C pendant 5 s.
- Concevoir des amorces basées sur la séquence des gènes cibles ompA, ompC et ompD. Effectuez une PCR de transcription inverse à l’aide d’un kit de réactif RT. Les composants de réaction PCR contiennent 2,5 μL de tampon réactionnel PCR 10x, 1 μL de mélange dNTP (2,5 mM), 1 μL d’amorces du gène cible (ompA, ompC ou ompD), 2,5 μL de matrice, 0,5 μL d’ADN polymérase Taq et 17,5 μL de ddH2O.
- Utiliser les conditions de réaction PCR suivantes : prédénaturation à 94 °C pendant 4 min ; 94 °C pendant 30 s, 60 °C pendant 1 min, 72 °C pendant 1 min pendant 25 cycles, et extension à 72 °C pendant 10min.
- Effectuez une PCR en temps réel à l’aide du kit RT-PCR vert SYBR dans un instrument RT-PCT en trois exemplaires.
- Utilisez les composants de réaction PCR suivants : 10 μL de tampon SYBR 2x, 0,4 μLof d’amorce directe et d’amorce inverse respectivement, 0,4 μL de RoxDye II, 2 μLd d’ADNc et 6,8 μL de H2O libre de RNase.
- Utiliser les conditions de réaction PCR suivantes : prédénaturation à 95 °C pendant 1 min pendant un cycle; 95 °C pendant 5 s, 60 °C pendant 34 s pendant 40 cycles.
- Normaliser toutes les données du gène de référence endogène gyrA. Utiliser la méthode 2-Δ ΔCT pour la quantification des données15.
6. Tests de virulence
- Culture SE50336, 50336ΔmicC et 50336ΔmicC/pmicC en phase stationnaire LB moyenne à précoce (OD600 de 2-3) à 24 °C, récolte par centrifugation et dilution à l’UFC appropriée mL-1 dans du PBS stérile.
- Pour les infections chez les souris, diluer les souches cultivées à 10 UFC/200 μL, 102 UFC/200 μL et 103 UFC/200 μL en suspension. Infecter des groupes de cinq souris Balb/c âgées de 6 à 8 semaines par souche par injection sous-cutanée. Injectez au groupe témoin 200 μL de solution saline physiologique.
- Pour les infections chez le poulet, diluer au-dessus de trois souches à 107 UFC/200 μL, 108 UFC/200 μL et 109 UFC/200 μL en suspension. Infecter des groupes de vingt poulets âgés de 1 jour par souche par injection sous-cutanée.
- Surveiller quotidiennement les signes de maladie et de décès d’animaux de laboratoire. Calculer la DL50 (dose létale médiane) 14 jours après l’infection comme décrit précédemment16. Traiter les données à l’aide d’un logiciel d’analyse de données.
- Dans les groupes infectés, prélever le cœur, le foie, la rate, les poumons et les reins des poussins fraîchement morts. Pesez 0,5 g des tissus ci-dessus séparément et broyez-les avec une opération stérile. Diluer progressivement les échantillons, les étaler sur une plaque LB et les cultiver pendant 8-10 h à 37 °C. Noter la quantité de souches de Salmonella colonisées dans les tissus des poussins.
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Representative Results
Construction du micC mutant 50336Δ et de la souche 50336Δ micC /p micC
Le résultat du clone du gène micC indiquait que ce gène était composé de 109 pb montrant une identité de 100% avec celle de S. Typhimurium. Sur la base des données de séquence, le mutant de délétion 50336ΔmicC et le mutant complété 50336ΔmicC/pmicC ont été construits avec succès. En détail, les résultats du séquençage ont montré qu’une cassette de résistance de 1,1 kb Cm a été amplifiée et utilisée pour construire le 1er recombinant. Le 1er 50336ΔmicC::cat recombinant a été validé par PCR à l’aide des amorces vmicC-F et vmicC-R avec une taille de bande attendue d’environ 1200 pb de produits PCR avec insertion de Cm contre 279 pb de produits de PCR dans la souche de type sauvage (Figure 1). Dans la deuxième recombinaison, la cassette Cm a été éliminée par pCP20. Les résultats de la PCR combinés au séquençage ont confirmé que le mutant micC isogénique a été construit avec succès et nommé 50336ΔmicC (Figure 1).
MicC régule l’expression des gènes ompA, ompC et ompD
Pour déterminer les cibles de MicC, l’expression des gènes ompA, ompC et ompD dans les souches SE 50336, 50336ΔmicC et 50336ΔmicC/p micC ont été analysées par PCR quantitative en temps réel en utilisant gyrA comme étalon interne normalisant. Les résultats ont montré que la transcription d’ompA et d’ompC dans 50336ΔmicC a augmenté d’environ 2,2 fois et 3 fois par rapport à celles de la souche de type sauvage, tandis que ompD dans 50336ΔmicC a été légèrement augmentée (1,3 fois) que celle de type sauvage (Figure 2). Il indiquait que micC pouvait réprimer l’expression de ompA, ompC et ompD. OmpA était probablement un nouveau gène cible potentiel régulé directement par micC.
La suppression de micC améliore S. Virulence d’Enteritidischez la souris et le poulet
Nous avons effectué des tests DL50 pour quantifier l’impact de la suppression de micC sur S. Enteritidis virulence chez la souris et le poulet. Après avoir infecté des souris Balb/c âgées de 6 à 8 semaines avec 10à 3 UFC de chacune des trois souches, nous avons observé que la plupart des souris infectées par 50336ΔmicC présentaient une lassitude, une inappétence ou une diarrhée 48 h après l’infection et semblaient mourir successivement 96 h après l’infection. Alors que les souris infectées par la souche WT et 50336ΔmicC / pmicC ont présenté les symptômes ci-dessus 72 h après l’infection et étaient mortes 120 heures après l’infection. Les DL50ont été calculées 7 j après l’infection. Les résultats ont montré que la DL50 de la souche WT 50336, 50336ΔmicC et 50336ΔmicC/p micC pour les souris était respectivement de 12,59, 5,01 et 19,95UFC. Il a indiqué que la virulence du mutant 50336ΔmicC était multipliée par 2,5 par rapport à WT chez la souris (tableau 3). Après avoir infecté des poulets âgés de 1 jour avec 10à 9 UFC de chacune des trois souches, la plupart des poulets présentaient une hyperémie intestinale et une diarrhée 10 h après l’infection. Lorsqu’ils étaient infectés par 108 UFC, les poulets infectés par 50336ΔmicC présentaient une mortalité plus élevée que la souche WT et 50336ΔmicC/pmicC. Les DL50s ont été calculées pour 14 jours post-infection. Les résultats ont montré que les DL 50 de la souche WT 50336, 50336ΔmicC et 50336ΔmicC/pmicC pour les poulets étaient respectivement de 1,13×109, 1,55×10 8 et2,54×10 8 UFC. Il a indiqué que la délétion de micC augmentait également la virulence de S. Enteritidis chez les poulets. Les trois souches de S. Enteritidis ont été récupérées dans le foie, la rate et le cæcum des poulets infectés.
Figure 1 : Vérification par PCR des mutants 50336ΔmicC avec amorces vmicC-F et vmicC-R. Un produit PCR de 280 pb a été obtenu lorsque le génome de type sauvage 50336 a servi de modèle (voie 1). Lorsque le gène de la cassette Cm a été inséré dans le génome de S. Enteritidis, le 1er 50336Δrecombinant mic::cat a été vérifié par PCR et un produit PCR de 1100 pb a été obtenu (lane 2). Le gène de la cassette Cm de 50336Δmic::cat a été excisé en introduisant le vecteur exprimant la recombinaison FLP pCP20 et le 2emicro recombinant 50336Δ a été obtenu et vérifié par PCR (voie 3). M : marqueur de masse moléculaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Les changements de pli des gènes ompA, ompC et ompD Le niveau d’ARNm a été déterminé dans le micro mutant 50336 Δ et a complété la souche 50336Δ mic/pmic par RT-PCR quantitative par rapport à la souche de type sauvage. Les essais ont été effectués en trois exemplaires. La méthode 2-ΔΔCT a été utilisée pour la quantification des données. *Indique une différence statistiquement significative par rapport à la souche de type sauvage (p<0,05) Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Déformations/plasmides | Caractéristiques | Références |
| Souches | ||
| CMCC(B)50336 | Salmonella enterica sérovar Enteritidis de type sauvage | NICPBP, Chine |
| 50336ΔmicC | mutant déficient en micC | Cette étude |
| 50336ΔmicC/pmicC | 50336Δ micC porteur pBR-micC (Ampr) | Cette étude |
| Plasmides: | ||
| pKD3 | Cmr; Cm cassette teplate | [13] |
| pKD46 | Ampr, expression λRed recombinase | [13] |
| pCP20 | Amp r, Cmr; Expression de la recombinase Flp | [13] |
| pBR-micC | pBR322 portant le gène micC complet (Ampr) | Cette étude |
| pGEM-T Facile | vecteur de clonage, Ampr | Takara |
| pMD19 T-simple | vecteur de clonage, Ampr | Takara |
Tableau 1. Souches bactériennes et plasmides utilisés dans cette étude.
| Amorce | Séquence (5'-3') | Taille du produit (pb) | ||||||
| micC-F | TGTCAGGAAAGACCTAAAAAGAGATGTTACCGTTTAATTCAATAATTAATTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG | 1114 | ||||||
| micC -R | TGGAAATAAAAAAAGCCCGAACATCCGTTCGGGCTTGTCAATTTATACCATATGAATATCCTCCTTAG | |||||||
| vmicC -F | AGCGAGTTGACGTTAAAACGTTAT | 279/140 | ||||||
| vmicC -R | TTCGTTCGGGCTTGTCAATTTATA | |||||||
| pBR-micC-F | CAGGCTAGCCACTTTATGTACAATGACATACGTCAC | 434 | ||||||
| pBR-micC-R | CAGGTCGACAAATATTCTAAGGATTAACCTGGAAAC | |||||||
| ompA-F | ACTGAACGCCCTGAGCTTTA | 177 | ||||||
| ompA-R | ACACCGGCTTCATTCAAT | |||||||
| ompC-F | AAAGTTCTGCTTTGTTGG | 187 | ||||||
| ompC-R | CGCTGACGAACACCTGTATG | |||||||
| ompD-F | ACGGTCAGACTTCGCATAGG | 184 | ||||||
| ompD-R | TGTTGCCACCTACCGTAACA | |||||||
| gyrA-F | GCATGACTTCGTCAGAACCA | 278 | ||||||
| gyrA-R | GGTCTATCAGTTGCCGGAAG | |||||||
Tableau 2. Amorces utilisées dans cette étude
| Souches | DL50 pour les souris (UFC) | Amélioration du pli | DL50 pour les poulets (UFC) | Amélioration du pli |
| S. Enteritidis 50336 | 12.59 | 1 | 1,13×109 | 1 |
| 50336ΔmicC | 5.01 | 2.51 | 1,55×108 | 7.29 |
| 50336Δ micC/pmicC | 19.95 | 0.63 | 2,54×108 | 4.45 |
| Contrôle négatif | 0 | / | 0 | / |
Tableau 3. Propriétés de virulence de S. Souches d’Enteritidis 50336 chez la souris et le poulet
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Discussion
L. Enteritidis est un important agent pathogène intracellulaire facultatif qui peut infecter les jeunes poulets et produire des symptômes allant de l’entérite à l’infection systémique et à la mort17,18. De plus, S. Enteritidis provoque des infections latentes chez les poulets adultes et les porteurs chroniques contaminent les produits avicoles, ce qui entraîne des infections d’origine alimentaire chez les humains19. Le mécanisme pathogène de S. Enteritidis doit encore être étudié. À ce jour, certains ARNs tels que IsrJ, SroA et IsrM ont été trouvés pour affecter la virulence de Salmonella 20,21,22,23. Le gène micC à petit ARN non codant a été identifié chez de nombreuses entérobactéries telles que Escherichia coli, Salmonella Typhimurium, Salmonella Bongori et Shigella flexneri 6,7,24. Ici, nous avons constaté que la séquence de micC dans S. Enteritidis 50336 était le même que celui de S. Typhimurium. Il indique que MicC est un ARNs conservateur chez les entérobactéries.
Déterminer si MicC médie la virulence chez S. Enteritidis pour les animaux et identifier les cibles MicC, nous avons construit le mutant de délétion 50336ΔmicC et le mutant complété 50336ΔmicC/p micC exprimant micC avec succès. Les résultats de la qRT-PCR ont indiqué que micC pouvait réprimer l’expression de ompA et ompC. OmpA est probablement une nouvelle cible potentielle de MicC. L’ARNsn RybB pourrait réprimer la synthèse d’OmpA par appariement de bases avec les régions 5' non traduites (5' UTR) de l’ARNm ompA cible 25. L’ARNs MicA facilite également la désintégration rapide de l’ARNm ompA par appariement antisens similaire à RybB25,26. On ne sait pas si MicC utilise le mécanisme de régulation similaire pour réguler l’ompA et reste à étudier dans un proche avenir. Chez E. coli, la délétion de MicC a augmenté l’expression de l’ompC de 1,5 à 2 fois. D’autres études ont montré que MicC inhibait la liaison du ribosome à l’ARNm ompC 5' leader6. En outre, Pfeiffer a constaté que l’OmpC était la cible principale de MicC7. On suppose que MicC régule ompC dans un mécanisme similaire en S. Enteritidis avec celui de E. coli et S. Typhimurium. Outre OmpA et OmpC, MicC pourrait également réprimer l’expression de OmpD. Le résultat a montré que la transcription de ompD dans 50336ΔmicC a été légèrement augmentée (1,3 fois) par rapport à celle de la souche de type sauvage. Sur la base des résultats ci-dessus, il a démontré que MicC pouvait réprimer la transcription de plusieurs ARNm cibles (ompA, ompC et ompD) dans S. Enteritidis. MicC n’est pas le seul ARNs capable de réguler plusieurs cibles. Certains ARNs tels que RybB, DsrA, GcvB, RNAIII et RyhB agissent également sur plusieurs cibles 25,27,28,29,30,31. Étant donné que les ARNs régulent les cibles par un mécanisme d’appariement de bases pour accomplir les interactions ARNs-cible32, il est possible que des sous-régions ou des domaines d’ARNs conservés puissent se lier à différentes cibles.
La membrane externe des bactéries à Gram négatif est une interface clé dans les interactions hôte-pathogène. OmpA, OmpC et OmpD sont toutes des protéines membranaires externes importantes et abondantes. L’OmpC joue un rôle important dans un environnement abominable comme dans l’intestin6. L’OmpD est impliqué dans l’adhérence aux macrophages humains et aux cellules épithéliales intestinales12. On pensait que le changement d’expression des OMP causé par la délétion de MicC pourrait influencer la virulence de S. Enteritidis et MicC accumulés dans les cellules en phase stationnaire et surtout dans des conditions de croissance ont induit les gènes de virulence Salmonella SPI-1 et SPI-27. On pense que MicC est lié à la virulence chez Salmonella, tandis que des expériences sur les infections animales ont été effectuées pour détecter la virulence de MicC. Les résultats ont montré que la DL50 des mutants 50336ΔmicC pour les poulets âgés de 1 jour et les souris Balb/c âgées de 6 semaines était évidemment déclinée par rapport à la souche de type sauvage. Il a indiqué que la suppression de micC améliorait la virulence de S. Enteritidis chez la souris et le poulet. On suppose que l’augmentation de l’expression d’OmpA, OmpC et OmpD, qui est causée par la délétion de MicC, conduit à une amélioration de la virulence dans S. Enteritidis.
MicC régule négativement S. Virulence d’Enteritidis chez la souris et le poulet probablement par régulation négative de l’expression des principales protéines de la membrane externe OmpA et OmpC.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette étude a été financée par des subventions de la Fondation nationale chinoise des sciences (n° 31972651 et 31101826), de la Fondation scientifique du lycée du Jiangsu (n ° 14KJB230002), du Laboratoire clé d’État de biotechnologie vétérinaire (n ° SKLVBF201509), de la subvention de la Fondation des sciences de la nature de Yangzhou (n ° YZ2014019), un projet financé par le développement de programmes académiques prioritaires des établissements d’enseignement supérieur du Jiangsu (PAPD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| dextrose | Sangon Biotech | A610219 | for broth preparation |
| DNA purification kit | TIANGEN | DP214 | for DNA purification |
| Ex Taq | TaKaRa | RR01A | PCR |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017608 | for broth preparation |
| K2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 20032116 | for broth preparation |
| L-Arabinose | Sangon Biotech | A610071 | λ-Red recombination |
| Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP106 | plasmid extraction |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | for broth preparation |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | for broth preparation |
| PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser | TaKaRa | RR047 | qRT-PCR |
| SYBRR Premix Ex Taq II | TaKaRa | RR820 | qRT-PCR |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202 | Ligation |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | for broth preparation |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | for broth preparation |
| centrifuge | Eppendorf | 5418 | centrifugation |
| Electrophoresis apparatus | Bio-Rad | 164-5050 | Electrophoresis |
| Electroporation System | Bio-Rad | 165-2100 | for bacterial transformation |
| Spectrophotometer | BioTek | Epoch | Absorbance detection |
| Real-Time PCR system | Applied Biosystems | 7500 system | qRT-PCR |
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