Summary
Система рекомбинации, опосредованная λ-красным, была использована для создания мутанта делеции небольшой некодирующей РНК micC.
Abstract
Некодирующая малая РНК (сРНК) является новым фактором регуляции экспрессии генов на посттранскрипционном уровне. Разновидность sRNA MicC, известная в Escherichia coli и Salmonella Typhimurium, может подавлять экспрессию белков внешней мембраны. Для дальнейшего изучения функции регуляции micC в Salmonella Enteritidis мы клонировали ген micC в штамме Salmonella Enteritidis 50336, а затем сконструировали мутант 50336Δ micC с помощью системы рекомбинации на основе λ Red и комплементированного мутанта 50336Δ micC/p micC, несущего рекомбинантную плазмиду pBR322, экспрессирующую micC. Результаты qRT-ПЦР показали, что транскрипция ompD в 50336Δ micC была в 1,3 раза выше, чем у штамма дикого типа, в то время как транскрипция ompA и ompC у 50336ΔmicC была в 2,2 раза и 3 раза выше, чем у штамма дикого типа. Они указывали на то, что micC подавляет экспрессию ompA и ompC. В следующем исследовании патогенность 50336ΔmicC была обнаружена как у 6-недельных мышей Balb/c, так и у 1-дневных цыплят. Результат показал, что LD 50 штамма дикого типа 50336, мутанты 50336Δ micC и 50336Δ micC/pmicC для 6-недельных мышей Balb/c составляли 12,59 КОЕ, 5,01 КОЕ и 19,95 КОЕ соответственно. LD50 штаммов для 1-дневных цыплят составляли 1,13 x 109 КОЕ, 1,55 x 10 8 КОЕ и 2,54 x 108 КОЕ соответственно. Он указал, что удаление micC повышает вирулентность S. Энтеритидис у мышей и цыплят путем регулирования экспрессии белков наружной мембраны.
Introduction
Некодирующие малые РНК (сРНК) имеют длину 40-400 нуклеотидов, которые обычно не кодируют белки, но могут быть транскрибированы независимо в бактериальных хромосомах 1,2,3. Большинство мРНК кодируются в межгенных областях (IGR) между областями, кодирующими гены, и взаимодействуют с целевыми мРНК посредством действий спаривания оснований и регулируют экспрессию генов-мишеней на посттранскрипционном уровне 4,5. Они играют важную роль в регуляции метаболизма веществ, синтезе белка внешней мембраны, восприятии кворума и экспрессии гена вирулентности5.
MicC представляет собой 109-нуклеотидный малый транскрипт РНК, присутствующий в сероварах Escherichia coli и Salmonella enterica Typhimurium, который может регулировать экспрессию нескольких белков внешней мембраны, таких как OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 и Omp36 6,7,8,9. MicC регулирует экспрессию OmpC путем ингибирования связывания рибосом с лидером мРНК ompC in vitro, и для его функции в Escherichia coli6 требуется шаперон РНК HfQ. В Salmonella Typhimurium MicC подавляет мРНК ompD через дуплекс РНК ≤12.н. в кодирующей последовательности (кодоны 23-26), а затем дестабилизирует эндонуклеолитическую мРНК7. Этому процессу регуляции помогает белок шаперона Hfq10. OmpC представляет собой обильный белок внешней мембраны, который, как считалось, важен в средах с высокими концентрациями питательных веществ и токсинов, например, в кишечнике6. Порин OmpD является наиболее распространенным белком наружной мембраны Salmonella Typhimurium и составляет около 1% от общего количества клеточного белка11. OmpD участвует в адгезии к макрофагам человека и эпителиальным клеткам кишечника12. MicC также подавляет экспрессию пор как OmpC, так и OmpD. Считается, что MicC может регулировать вирулентность. Чтобы исследовать новые гены-мишени, регулируемые MicC, и изучить функцию регуляции вирулентности micC, мы клонировали ген micC в штамме Salmonella Enteritidis (SE) 50336, а затем сконструировали мутант 50336ΔmicC и дополненный мутант 50336ΔmicC/p micC. Новые гены-мишени были проверены с помощью qRT-PCR. Вирулентность 50336ΔmicC была обнаружена мышами и куриными инфекциями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Национального исследовательского совета. Комитет по уходу за животными и их использованию Университета Янчжоу одобрил все эксперименты и процедуры, применяемые к животным (SYXK2016-0020).
1. Бактериальные штаммы, плазмиды и условия культивирования
- Используйте бактерии и плазмиды, перечисленные в таблице 1.
- Культивируйте бактерии в бульоне LB или на планшетах с агаром LB при 37 ° C в присутствии 50 мкг / мл ампициллина (Amp), когда это необходимо.
- Культуральные штаммы, содержащие чувствительные к температуре плазмиды, используются для построения делеционных мутантов при 30 ° C.
2. Клон гена micC S. Штамм Enteritidis 50336
- На основе восходящей и нисходящей последовательности гена micC S. Штамм Typhimurium SL1344, разрабатывает праймеры vmicC-F и vmicC-R для амплификации фрагмента, содержащего ген micC, методом ПЦР с использованием геномной ДНК SE50336 в качестве матрицы.
- Смешайте 5 мкл 10-кратного реакционного буфера ПЦР, 2 мкл смеси dNTP (2,5 мМ), 1 мкл праймеров vmicC-F и vmicC-R соответственно, 5 мкл шаблона, 1 мкл ДНК-полимеразы Taq и 35 мкл ddH2O вместе для ПЦР.
- Используйте следующие условия реакции ПЦР: предварительная денатурация при 94 °C в течение 4 мин; 94 °C в течение 30 с, 53 °C в течение 1 мин, 72 °C в течение 1 мин в течение 25 циклов и продление при 72 °C в течение 10 мин.
- Секвенируйте продукт ПЦР, чтобы получить последовательность гена micC .
3. Построение мутанта делеции micC
ПРИМЕЧАНИЕ: micC-отрицательный мутант штамма Salmonella Enteritidis 50336 был построен с использованием λ-красной опосредованной рекомбинации, как описано ранее13,14. Используемые грунтовки перечислены в таблице 2.
- Амплификация хлорамфеникола кассетой, содержащей фрагменты гомологии гена micC .
- Разработка праймеров micC-F и micC-R для амплификации кассеты хлорамфеникола (Cm) из плазмиды pKD3, включая расширения гомологии на 50.н. из 5' и 3' гена micC .
- Извлеките плазмиду pKD3 в качестве шаблона ПЦР.
- Смешайте 5 мкл 10-кратного реакционного буфера для ПЦР, 2 мкл смеси dNTP (2,5 мМ), 1 мкл праймеров micC-F и micC-R, соответственно, 5 мкл шаблона, 1 мкл ДНК-полимеразы Taq и 35 мкл ddH2O вместе в качестве реакционной смеси ПЦР
- Амплифицируют кассету Cm при следующих условиях реакции ПЦР: предварительная денатурация при 94 °C в течение 4 мин; 94 °C в течение 1 мин, 52 °C в течение 1 мин, 72 °C в течение 1 мин в течение 10 циклов; 94 °C в течение 1 мин, 63 °C в течение 1 мин, 72 °C в течение 1 мин в течение 25 циклов и продление при 72 °C в течение 10 мин.
- Определите размер продукта ПЦР с помощью электрофореза в агарозном геле. Очистите и восстановите продукт ПЦР с помощью набора для восстановления геля ДНК и определите концентрацию ДНК с помощью спектрофотометра.
ВНИМАНИЕ: ПЦР необходимо проводить дважды. Первый продукт ПЦР разбавляли в соотношении 1:200 и использовали в качестве матрицы для вторичной ПЦР, чтобы исключить интерференцию дальнейшей рекомбинации плазмидой pKD3.
- Конструкция1-го рекомбинантного штамма 50336ΔmicC::cat
- Равномерно смешайте 100 мкл компетентных клеток SE50336 с 5 мкл плазмиды pKD46 и инкубируйте на льду в течение 30 мин. Тепловой шок вышеуказанной смеси при 42 ° C в течение 90 с и быстрый перенос смеси на лед в течение 2 мин для превращения плазмиды pKD46 в SE50336. Скрининг положительных колоний путем культивирования в течение ночи при 30 ° C на планшете, устойчивом к амперу (50 мкг / мл).
- Добавьте 30 мМ L-арабинозы в жидкую культуру SE50336/pKD46 и индуцируйте экспрессию рекомбиназы с помощью встряхивающей культуры при 30 °C в течение 1 часа. Затем подготовьте грамотные клетки.
- Смешайте 100 нг очищенного продукта ПЦР (этап 3.1) и 40 мкл компетентных клеток SE50336/pKD46 в чашку для электрошока (например, Bio-Rad). Осуществляют электрошоковое преобразование с параметрами напряжения 1,8 кВ, импульса 25 мкФ и сопротивления 200 Ω.
- После электропревращения смесь переносят в 1 мл среды SOC и встряхивают культуру при 150 об/мин и 30 °C в течение 1 ч. Затем намажьте смесь на планшет LB, резистентный к см (34 мкг / мл), и культивируйте при 37 ° C в течение ночи для скрининга положительной колонии.
- Культивируют вышеуказанную положительную колонию при 42 °C в течение 2 ч. Просейте колонию, чувствительную к Amp (50 мкг / мл), но устойчивую к Cm (34 мкг / мл) при 37 ° C в течение ночи, чтобы получить 1-й рекомбинантный штамм без pKD46.
- Определите 1-й рекомбинантный штамм 50336ΔmicC::Cat.
- Экстракт 50336ΔmicC::Геномная ДНК кошки в качестве шаблона ПЦР. Используйте те же компоненты реакции ПЦР, что и на шаге 2.1. Проведите ПЦР-реакцию в тех же условиях, что и на шаге 2.1.
- Определите размер продукта ПЦР с помощью электрофореза в агарозном геле и секвенируйте продукт ПЦР.
- Сконструируйте делеционный мутант 50336ΔmicC.
- Электропорат 100 нг плазмиды pCP20 в 40 мкл 50336ΔmicC::Cat компетентные ячейки с параметрами напряжения 1,8 кВ, импульса 25 мкФ и сопротивления 200 Ω, экранные положительные трансформаторы на пластинах, устойчивых к амперу (50 мкг/мл), и см (34 мкг/мл) при 30 °C.
- Переносят вышеположительные превращения в нерезистентные LB и культивируют их в течение ночи при 42 ° C, а затем изолируют отдельные колонии на пластине LB при 37 ° C. Выберите колонию, чувствительную как к Amp, так и к Cm. Этот мутант является мутантом делеции micC SE50336Δ micC.
- Проверьте 50336ΔmicC с помощью ПЦР.
- Экстракт геномной ДНК 50336ΔmicC в качестве ПЦР-матрицы. Смешайте 5 мкл 10-кратного реакционного буфера для ПЦР, 2 мкл смеси dNTP (2,5 мМ), 1 мкл праймера vmicC-F, 1 мкл праймера vmicC-R, 5 мкл шаблона, 1 мкл ДНК-полимеразы Taq и 35 мкл ddH2O для ПЦР.
- Используйте следующие условия реакции ПЦР: предварительная денатурация при 94 °C в течение 4 мин; 94 °C в течение 30 с, 53 °C в течение 1 мин, 72 °C в течение 1 мин в течение 25 циклов и продление при 72 °C в течение 10 мин.
4. Конструкция дополненного штамма micC
- Дизайн праймеров pBR-micC-F и pBR-micC-R с рестрикционными сайтами NheI и SalI.
- Амплификация полноразмерного гена micC с боковыми последовательностями с использованием реакционной смеси ПЦР, содержащей 5 мкл геномной ДНК SE50336 в качестве матрицы, праймеры 1 мкл pBR-micC-F и 1 мкл pBR-micC-R в качестве праймеров, 5 мкл 10-кратного реакционного буфера для ПЦР, 2 мкл смеси dNTP (2,5 мМ), 2 мкл смеси dNTP (2,5 мМ) и 35 мкл ddH2O.
- Используйте следующие условия реакции ПЦР: предварительная денатурация при 94 °C в течение 4 мин; 94 °C в течение 30 с, 52 °C в течение 50 с, 72 °C в течение 1 мин в течение 25 циклов и продление при 72 °C в течение 10 мин. Очистите и восстановите продукт ПЦР.
- Переваривают продукт ПЦР и плазмиду pBR322 соответственно с использованием рестрикционных ферментов NheI и SalI и лигируют их с помощью Т4-лигазы при 16 ° C в течение ночи для получения плазмиды pBR322-micC.
- Преобразуйте pBR322-micC в компетентные ячейки SE50336ΔmicC и просеивайте положительный преобразователь для получения дополненного штамма SE50336ΔmicC/pmicC. Извлеките плазмиду pBR322-micC из комплементарного штамма и проверьте ее с помощью рестрикционного фермента, расщепления и секвенирования.
5. Выделение РНК и количественная ПЦР в реальном времени
- Культивирование SE50336, 50336ΔmicC и 50336ΔmicC/pmicC в среде LB в течение ночи при 24 °C с 180 об/мин встряхивают культивирование до OD600 2,0. Собирают бактериальный посев центрифугированием при 13000 об/мин в течение 2 мин.
- Извлеките общую РНК с помощью реагента TRIzol. Инкубируют 50 мкл изолированной РНК с 2 мкл ДНКазы I и 6 мкл 10-кратного буфера при 37 ° C в течение 30 мин для удаления ДНК. Определите количество РНК путем пипетирования 1 мкл образца РНК на микроспектрофотометр.
- Синтез кДНК
- Используйте 1 мкг общей РНК для синтеза кДНК в 20 мкл реакционной системы обратной транскрипции (4 мкл 5-кратного буфера, 1 мкл смеси фермента RT, 1 мкл смеси праймеров RT, 10 мкл общей РНК и 4 мкл ddH2O). Инкубировать над реакционной системой при 37 °C в течение 15 мин, а затем при 85 °C в течение 5 с.
- Дизайн праймеров основан на последовательности генов-мишеней ompA, ompC и ompD. Проведите ПЦР с обратной транскрипцией с использованием набора реагентов ЛТ. Компоненты реакции ПЦР содержат 2,5 мкл 10-кратного реакционного буфера ПЦР, 1 мкл смеси dNTP (2,5 мМ), 1 мкл праймеров гена-мишени (ompA, ompC или ompD), 2,5 мкл матрицы, 0,5 мкл ДНК-полимеразы Taq и 17,5 мкл ddH2O.
- Используйте следующие условия реакции ПЦР: предварительная денатурация при 94 °C в течение 4 мин; 94 °C в течение 30 с, 60 °C в течение 1 мин, 72 °C в течение 1 мин в течение 25 циклов и продление при 72 °C в течение 10 мин.
- Проведите ПЦР в режиме реального времени с использованием зеленого набора ОТ-ПЦР SYBR в приборе ОТ-РСТ в трех экземплярах.
- Используйте следующие компоненты реакции ПЦР: 10 мкл 2x буфера SYBR, 0,4 мкл прямого праймера и обратного праймера соответственно, 0,4 мкл RoxDye II, 2 мкл кДНК и 6,8 мкл свободного РНКазы H2O.
- Используйте следующие условия реакции ПЦР: предварительная денатурация при 95 °C в течение 1 мин в течение одного цикла; 95 °C в течение 5 с, 60 °C в течение 34 с в течение 40 циклов.
- Нормализуйте все данные к эндогенному эталонному гену gyrA. Используйте метод 2-ΔΔCT для количественной оценки данных15.
6. Анализы на вирулентность
- Культивируют SE50336, 50336ΔmicC и 50336ΔmicC/pmicC в средней и ранней стационарной фазе LB (OD600 из 2-3) при 24 °C, собирают центрифугированием и разбавляют до соответствующего КОЕ мл-1 в стерильном PBS.
- При мышиных инфекциях разбавляйте культивируемые штаммы до 10 КОЕ/200 мкл, 102 КОЕ/200 мкл и 103 КОЕ/200 мкл градиентной ресуспензии. Инфицируйте группы из пяти 6-8-недельных мышей Balb/c на штамм путем подкожной инъекции. Введите контрольной группе 200 мкл физиологического раствора.
- При куриных инфекциях разбавьте более трех штаммов до 107 КОЕ / 200 мкл, 108 КОЕ / 200 мкл и 109 КОЕ / 200 мкл градиентной ресуспензии. Заражают группы из двадцати 1-дневных цыплят на штамм путем подкожной инъекции.
- Ежедневно следите за признаками болезни и падежа подопытных животных. РассчитайтеLD 50 (средняя смертельная доза) через 14 дней после заражения, как описано ранее16. Обработайте данные с помощью программного обеспечения для анализа данных.
- В инфекционных группах собирают сердце, печень, селезенку, легкие и почки только что умерших цыплят. Отдельно взвесьте 0,5 г вышеперечисленных тканей и измельчите их стерильной операцией. Постепенно разбавляйте измельченные образцы, распределяйте их на пластине LB и культивируйте в течение 8-10 ч при 37 °C. Запишите количество штаммов сальмонеллы, колонизированных в тканях цыплят.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Построение мутанта 50336Δ micC и дополненного штамма 50336Δ micC /p micC
Результат клонирования гена micC показал, что этот ген состоял из 109.н., демонстрируя 100% идентичность с геном S. Тифимурий. На основе данных последовательности были успешно построены делеционный мутант 50336ΔmicC и дополненный мутант 50336ΔmicC/pmicC . В частности, результаты секвенирования показали, что кассета сопротивления 1,1 кб см была усилена и использована для построения1-го рекомбинанта. 1-й рекомбинантный 50336ΔmicC::cat был валидирован методом ПЦР с использованием праймеров vmicC-F и vmicC-R с ожидаемым размером полосы около 1200.н. продуктов ПЦР с вставкой Cm по сравнению с 279.н. продуктов ПЦР в штамме дикого типа (рис. 1). Во второй рекомбинации кассета Cm была устранена pCP20. Результаты ПЦР в сочетании с секвенированием подтвердили, что изогенный мутант micC был успешно сконструирован и назван как 50336ΔmicC (рис. 1).
MicC регулирует экспрессию генов ompA, ompC и ompD
Для определения мишеней MicC экспрессию генов ompA, ompC и ompD в штаммах SE 50336, 50336ΔmicC и 50336ΔmicC/p micC анализировали методом количественной ПЦР в реальном времени с использованием gyrA в качестве нормализующего внутреннего стандарта. Результаты показали, что транскрипция ompA и ompC в 50336ΔmicC увеличилась примерно в 2,2 раза и в 3 раза по сравнению с таковой в штамме дикого типа, в то время как ompD в 50336ΔmicC была увеличена немного (в 1,3 раза), чем в штамме дикого типа (рис. 2). Она указала, что micC может подавлять экспрессию ompA, ompC и ompD. OmpA, вероятно, был потенциальным новым геном-мишенью, регулируемым непосредственно micC.
Удаление micC усиливает S. Вирулентность энтеритидисау мышей и цыплят
Мы провели анализы LD50 для количественной оценки влияния удаления micC на S. Вирулентность энтеритидиса у мышей и цыплят. После инфицирования 6-8-недельных мышей Balb/c 103 КОЕ каждого из трех штаммов мы наблюдали, что большинство мышей, инфицированных 50336ΔmicC, проявляли усталость, отсутствие аппетита или диарею через 48 часов после заражения и, по-видимому, умирали последовательно через 96 часов после заражения. В то время как мыши, инфицированные штаммом WT и 50336ΔmicC/pmicC, проявили вышеуказанные симптомы через 72 часа после заражения и были мертвы через 120 часов после заражения. ЛД50с были рассчитаны на 7 дней после заражения. Результаты показали, что LD50 штамма WT 50336, 50336ΔmicC и 50336ΔmicC/pmicC для мышей составляли 12,59, 5,01 и 19,95 КОЕ соответственно. Это показало, что вирулентность мутанта 50336ΔmicC увеличилась в 2,5 раза по сравнению с WT у мышей (табл. 3). После заражения 1-дневных цыплят 109 КОЕ каждого из трех штаммов у большинства цыплят наблюдалась гиперемия кишечника и диарея через 10 часов после заражения. При инфицировании 108 КОЕ цыплята, инфицированные 50336ΔmicC, показали более высокую смертность по сравнению со штаммом WT и 50336ΔmicC/pmicC. ЛД50с были рассчитаны для 14 дней после заражения. Результаты показали, что LD 50 штамма WT 50336, 50336ΔmicC и 50336ΔmicC/pmicC для цыплят составляли 1,13×109, 1,55×10 8 и2,54×10 8 КОЕ соответственно. Он указал, что удаление micC также усиливает вирулентность S. Энтеритидис у цыплят. Все три штамма S. Enteritidis были извлечены из печени, селезенки и слепой кишки инфицированных цыплят.
Рисунок 1: ПЦР-проверка мутантов 50336ΔmicC с помощью праймеров vmicC-F и vmicC-R. Продукт ПЦР 280.н. был получен при использовании генома 50336 дикого типа в качестве матрицы (полоса 1). Когда ген кассеты Cm был вставлен в геном S. Enteritidis,1-й рекомбинантный 50336Δmic::cat был верифицирован методом ПЦР и получен продукт ПЦР 1100.н. (полоса 2). Кассетный ген Cm 50336Δmic::cat был удален путем введения вектора pCP20, экспрессирующего рекомбиназу FLP, и2-й рекомбинантныймикро 50336Δ был получен и верифицирован методом ПЦР (полоса 3). M: молекулярный маркер массы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Кратные изменения уровня мРНК генов ompA, ompC и ompD определяли у мутанта 50336 Δ mic и комплементарного штамма 50336Δ mic/pmic с помощью количественной ОТ-ПЦР по сравнению со штаммом дикого типа. Анализы проводились в трех экземплярах. Для количественной оценки данных использовался метод 2-ΔΔCT. *Указывает на статистически значимую разницу по сравнению со штаммом дикого типа (p<0,05) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Штаммы/плазмиды | Характеристики | Ссылки |
| Штаммов | ||
| КМКК(Б)50336 | Salmonella enterica serovar Enteritidis дикого типа | NICPBP, Китай |
| 50336ΔмкК | мутант с дефицитом micC | Это исследование |
| 50336ΔмкС/пмиК | 50336Δ micC, несущий pBR-micC (Ampr) | Это исследование |
| Плазмиды: | ||
| пКД3 | Смр; Кассетная пластина см | [13] |
| пКД46 | Ampr, экспрессия λКрасной рекомбиназы | [13] |
| pCP20 | Ампер r, смr; Экспрессия рекомбиназы Flp | [13] |
| pBR-micC | pBR322, несущий полный ген micC (Ampr) | Это исследование |
| pGEM-T Легко | вектор клонирования, Ampr | Такара |
| pMD19 T-простой | вектор клонирования, Ampr | Такара |
Таблица 1. Бактериальные штаммы и плазмиды, использованные в этом исследовании.
| Букварь | Последовательность (5'-3') | Размер продукта (b.p.) | ||||||
| micC-F | TGTCAGGAAGACCTAAAAAGAGATGTTACCGTTTAATTCAATAATTAATTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG | 1114 | ||||||
| micC -R | TGGAAATAAAAAAAGCCCGAACATCCGTTCGGGCTTGTCAATTTATACCATATGAATATCCTCCTTAG | |||||||
| vmicC -F | AGCGAGTTGACGTTAAAACGTTAT | 279/140 | ||||||
| vmicC -R | TTCGTTCGGGCTTGTCAATTTATA | |||||||
| pBR-micC-F | CAGGCTAGCCACTTTATGTACAATGACATACGTCAC | 434 | ||||||
| pBR-micC-R | CAGGTCGACAAATATTCTAAGGATTAACCTGGAAAC | |||||||
| ompA-F | ACTGAACGCCCTGAGCTTTA | 177 | ||||||
| ompA-R | ACACCGGCTTCATTCACAAT | |||||||
| ompC-F | AAAGTTCTGCGCTTTTTGTTGG | 187 | ||||||
| ompC-R | CGCTGACGAACACCTGTATG | |||||||
| ompD-F | ACGGTCAGACTTCGCATAGG | 184 | ||||||
| ompD-R | TGTTGCCACCTACCGTAACA | |||||||
| гирА-Ф | GCATGACTTCGTCAGAACCA | 278 | ||||||
| gyrA-R | GGTCTATCAGTTGCCGGAAG | |||||||
Таблица 2. Грунтовки, использованные в этом исследовании
| Штаммов | LD50 для мышей (КОЕ) | Увеличение сгиба | LD50 для цыплят (КОЕ) | Увеличение сгиба |
| S. enteritidis 50336 | 12.59 | 1 | 1.13×109 | 1 |
| 50336ΔмкК | 5.01 | 2.51 | 1.55×108 | 7.29 |
| 50336ΔмкС/рмикК | 19.95 | 0.63 | 2.54×108 | 4.45 |
| Отрицательный контроль | 0 | / | 0 | / |
Таблица 3. Вирулентные свойства S. Штаммы Enteritidis 50336 у мышей и цыплят
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
С. Энтеритидис является важным факультативным внутриклеточным патогеном, который может инфицировать молодых цыплят и вызывает симптомы от энтерита до системной инфекции и смерти17,18. Кроме того, S. Enteritidis вызывает латентные инфекции у взрослых цыплят, а хронические носители загрязняют продукты птицеводства, что приводит к инфекциям пищевого происхождения у людей19. Патогенный механизм S. Enteritidis еще предстоит изучить. На сегодняшний день было обнаружено, что некоторые сРНК, такие как IsrJ, SroA и IsrM, влияют на вирулентность сальмонеллы 20,21,22,23. Некодирующий ген малой РНК micC был идентифицирован у многих энтеробактерий, таких как Escherichia coli, Salmonella Typhimurium, Salmonella Bongori и Shigella flexneri6,7,24. Здесь мы обнаружили, что последовательность micC в S. Enteritidis 50336 был таким же, как и у S. Тифимурий. Это указывает на то, что MicC является консервативной сРНК энтеробактерий.
Чтобы выяснить, опосредует ли MicC вирулентность в S. Энтеритидис для животных и идентификация мишеней MicC, мы построили делеционный мутант 50336ΔmicC и дополненный мутант 50336ΔmicC/p micC, успешно экспрессирующийmicC. Результаты qRT-PCR показали, что micC может подавлять экспрессию ompA и ompC. OmpA, вероятно, является потенциальной новой целью MicC. РНК RybB может подавлять синтез OmpA путем спаривания оснований с 5'-нетранслируемыми областями (5' UTR) целевой мРНК ompA 25. МРНК MicA также способствует быстрому распаду мРНК ompA путем антисмыслового спаривания, аналогично RybB25,26. Использует ли MicC аналогичный механизм регулирования для регулирования ompA, неизвестно и еще предстоит изучить в ближайшем будущем. У E. coli делеция MicC увеличила экспрессию ompC в 1,5-2 раза. Дальнейшее исследование показало, что MicC ингибирует связывание рибосом с лидером6 мРНК 5' ompC. Кроме того, Пфайффер обнаружил, что OmpC был основной целью MicC7. Предполагается, что MicC регулирует ompC по аналогичному механизму в S. Энтеритиди с таковой у E. coli и S. Тифимурий. Помимо OmpA и OmpC, MicC также может подавлять выражение OmpD. Результат показал, что транскрипция ompD в 50336ΔmicC была увеличена несколько (в 1,3 раза), чем в штамме дикого типа. Основываясь на приведенных выше результатах, было продемонстрировано, что MicC может подавлять транскрипцию нескольких мРНК-мишеней (ompA, ompC и ompD) в S. Энтеритидис. MicC — не единственная рРНК, которая может регулировать несколько мишеней. Некоторые рРНК, такие как RybB, DsrA, GcvB, RNAIII и RyhB, также действуют на несколько мишеней 25,27,28,29,30,31. Поскольку мРНК регулируют мишени с помощью механизма спаривания оснований для выполнения взаимодействий32 сРНК-мишени, возможно, что консервативные субрегионы или домены мРНК могут связываться с различными мишенями.
Внешняя мембрана грамотрицательных бактерий является ключевым интерфейсом во взаимодействиях хозяина и патогена. OmpA, OmpC и OmpD являются важными и распространенными белками внешней мембраны. OmpC играет важную роль в отвратительной среде, например, в кишечнике6. OmpD участвует в адгезии к макрофагам человека и эпителиальным клеткам кишечника12. Считалось, что изменение экспрессии OMP, вызванное делецией MicC, может влиять на вирулентность S. Энтеритид и MicC, накопленные в клетках стационарной фазы и особенно в условиях роста, индуцировали гены вирулентности сальмонеллы SPI-1 и SPI-27. Считается, что MicC связан с вирулентностью сальмонеллы, в то время как эксперименты по инфекциям животных были проведены для выявления вирулентности MicC. Результаты показали, что LD50 мутантов 50336ΔmicC для 1-дневных цыплят и 6-недельных мышей Balb/c были снижены, очевидно, по сравнению со штаммом дикого типа. Он указал, что удаление micC повышает вирулентность S. Энтеритидис у мышей и цыплят. Предполагается, что увеличение экспрессии OmpA, OmpC и OmpD, вызванное делецией MicC, приводит к усилению вирулентности в S. Энтеритидис.
MicC отрицательно регулирует S. Вирулентность энтеритидиса у мышей и цыплят, вероятно, путем подавления экспрессии основных белков внешней мембраны OmpA и OmpC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам раскрывать нечего.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантами Китайского национального научного фонда (No 31972651 и 31101826), Научного фонда высшего образования провинции Цзянсу (No 14KJB230002), Государственной ключевой лаборатории ветеринарной биотехнологии (No SKLVBF201509), гранта Фонда естественных наук Янчжоу (No YZ2014019), проекта, финансируемого Приоритетной академической программой развития высших учебных заведений провинции Цзянсу (PAPD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| dextrose | Sangon Biotech | A610219 | for broth preparation |
| DNA purification kit | TIANGEN | DP214 | for DNA purification |
| Ex Taq | TaKaRa | RR01A | PCR |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017608 | for broth preparation |
| K2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 20032116 | for broth preparation |
| L-Arabinose | Sangon Biotech | A610071 | λ-Red recombination |
| Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP106 | plasmid extraction |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | for broth preparation |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | for broth preparation |
| PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser | TaKaRa | RR047 | qRT-PCR |
| SYBRR Premix Ex Taq II | TaKaRa | RR820 | qRT-PCR |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202 | Ligation |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | for broth preparation |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | for broth preparation |
| centrifuge | Eppendorf | 5418 | centrifugation |
| Electrophoresis apparatus | Bio-Rad | 164-5050 | Electrophoresis |
| Electroporation System | Bio-Rad | 165-2100 | for bacterial transformation |
| Spectrophotometer | BioTek | Epoch | Absorbance detection |
| Real-Time PCR system | Applied Biosystems | 7500 system | qRT-PCR |
References
- Jørgensen, M. G., Pettersen, J. S., Kallipolitis, B. H. sRNA-mediated control in bacteria: An increasing diversity of regulatory mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta-Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), 194504 (2020).
- Wagner, E. G. H., Romby, P. Small RNAs in bacteria and archaea: who they are, what they do, and how they do it. Advances In Genetics. 90, 133-208 (2015).
- Vogel, J. A rough guide to the non-coding RNA world of Salmonella. Molecular Microbiology. 71 (1), 1-11 (2009).
- Dutta, T., Srivastava, S. Small RNA-mediated regulation in bacteria: A growing palette of diverse mechanisms. Gene. 656, 60-72 (2018).
- Waters, L. S., Storz, G.
- Chen, S., Zhang, A., Blyn, L. B., Storz, G. MicC, a second small-RNA regulator of Omp protein expression in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 186 (20), 6689-6697 (2004).
- Pfeiffer, V., Papenfort, K., Lucchini, S., Hinton, J. C., Vogel, J. Coding sequence targeting by MicC RNA reveals bacterial mRNA silencing downstream of translational initiation. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (8), 840-846 (2009).
- Dam, S., Pagès, J. M., Masi, M. Dual Regulation of the Small RNA MicC and the Quiescent Porin OmpN in Response to Antibiotic Stress in Escherichia coli. Antibiotics (Basel). 6 (4), 33 (2017).
- Hao, M., et al. Porin Deficiency in Carbapenem-Resistant Enterobacter aerogenes Strains. Microbial Drug Resistance. 24 (9), 1277-1283 (2018).
- Wroblewska, Z., Olejniczak, M. Hfq assists small RNAs in binding to the coding sequence of ompD mRNA and in rearranging its structure. RNA. 22 (7), 979-994 (2016).
- Santiviago, C. A., Toro, C. S., Hidalgo, A. A., Youderian, P., Mora, G. C. Global regulation of the Salmonella enterica serovar typhimurium major porin, OmpD. Journal of Bacteriology. 185 (19), 5901-5905 (2003).
- Hara-Kaonga, B., Pistole, T. G. OmpD but not OmpC is involved in adherence of Salmonella enterica serovar typhimurium to human cells. Canadian Journal of Microbiology. 50 (9), 719-727 (2004).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).
- Meng, X., et al. The RNA chaperone Hfq regulates expression of fimbrial-related genes and virulence of Salmonella enterica serovar Enteritidis. FEMS Microbiology Letters. 346 (2), 90-96 (2013).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Vander Velden, A. W., Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Heffron, F. Multiple fimbrial adhesins are required for full virulence of Salmonella typhimurium in mice. Infection and Immunity. 66 (6), 2803-2808 (1998).
- Prescott, J. F. Salmonella enterica serovar enteritidis in humans and animals: Epidemiology, pathogenesis, and control. Canadian Veterinary Journal La Revue Veterinaire Canadienne. 40 (10), 736 (1999).
- Balasubramanian, R., et al. The global burden and epidemiology of invasive non-typhoidal. Hum Vaccin Immunother. 15 (6), 1421-1426 (2019).
- De Buck, J., Van Immerseel, F., Haesebrouck, F., Ducatelle, R. Colonization of the chicken reproductive tract and egg contamination by Salmonella. Journal of General and Applied Microbiology. 97 (2), 233-245 (2004).
- Padalon-Brauch, G., et al. Small RNAs encoded within genetic islands of Salmonella typhimurium show host-induced expression and role in virulence. Nucleic Acids Research. 36 (6), 1913-1927 (2008).
- Santiviago, C. A., et al. Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice. PLoS Pathogens. 5 (7), 1000477 (2009).
- Gong, H., et al. A Salmonella small non-coding RNA facilitates bacterial invasion and intracellular replication by modulating the expression of virulence factors. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002120 (2011).
- Hébrard, M., et al. sRNAs and the virulence of Salmonella enterica serovar Typhimurium. RNA Biology. 9 (4), 437-445 (2012).
- Vogel, J., Papenfort, K. Small non-coding RNAs and the bacterial outer membrane. Current Opinion in Microbiology. 9 (6), 605-611 (2006).
- Papenfort, K., et al. SigmaE-dependent small RNAs of Salmonella respond to membrane stress by accelerating global omp mRNA decay. Molecular Microbiology. 62 (6), 1674-1688 (2006).
- Udekwu, K. I., et al. Hfq-dependent regulation of OmpA synthesis is mediated by an antisense RNA. Genes and Development. 19 (19), 2355-2366 (2005).
- Papenfort, K., Vogel, J. Multiple target regulation by small noncoding RNAs rewires gene expression at the post-transcriptional level. Research in Microbiology. 160 (4), 278-287 (2009).
- Lease, R. A., Cusick, M. E., Belfort, M. Riboregulation in Escherichia coli: DsrA RNA acts by RNA:RNA interactions at multiple loci. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (21), 12456-12461 (1998).
- Sharma, C. M., Darfeuille, F., Plantinga, T. H., Vogel, J. A small RNA regulates multiple ABC transporter mRNAs by targeting C/A-rich elements inside and upstream of ribosome-binding sites. Genes and Development. 21 (21), 2804-2817 (2007).
- Boisset, S., et al. Staphylococcus aureus RNAIII coordinately represses the synthesis of virulence factors and the transcription regulator Rot by an antisense mechanism. Genes and Development. 21 (11), 1353-1366 (2007).
- Massé, E., Vanderpool, C. K., Gottesman, S. Effect of RyhB small RNA on global iron use in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 187 (20), 6962-6971 (2005).
- Papenfort, K., Vogel, J.
