Summary
Um sistema de recombinação mediado por λ-Red foi usado para criar um mutante de deleção de um pequeno micC de RNA não-codificante.
Abstract
Um pequeno RNA não codificante (sRNA) é um novo fator para regular a expressão gênica em nível pós-transcricional. Uma espécie de sRNA MicC, conhecido em Escherichia coli e Salmonella Typhimurium, poderia reprimir a expressão de proteínas da membrana externa. Para investigar melhor a função de regulação do micC em Salmonella Enteritidis, clonamos o gene micC na cepa 50336 de Salmonella Enteritidis e, em seguida, construímos o mutante 50336Δ micC pelo sistema de recombinação baseado em λ Red e o mutante complementado 50336Δ micC/p micC carregando plasmídeo recombinante pBR322 expressando micC. Os resultados da qRT-PCR demonstraram que a transcrição de ompD em 50336Δ micC foi 1,3 vezes maior do que na cepa selvagem, enquanto a transcrição de ompA e ompC em 50336ΔmicC foi 2,2 vezes maior e 3 vezes maior do que na cepa selvagem. Estes indicaram que micC reprime a expressão de ompA e ompC. No estudo seguinte, a patogenicidade de 50336ΔmicC foi detectada por camundongos Balb/c de 6 semanas de idade e galinhas de 1 dia de idade. O resultado mostrou que a DL 50 da linhagem selvagem 50336, os mutantes 50336Δ micC e 50336Δ micC/p micC para camundongos Balb/c com 6 semanas de idade foram 12,59 UFC, 5,01 UFC e 19,95 UFC, respectivamente. As DL 50 das cepas para frangos de 1 dia de idade foram 1,13 x 109 UFC, 1,55 x 10 8 UFC e2,54 x 10 8 UFC, respectivamente. Isso indicou que a deleção de micC aumentou a virulência de S. Enteritidis em camundongos e galinhas regulando a expressão de proteínas da membrana externa.
Introduction
Os pequenos RNAs não codificantes (sRNAs) têm 40-400 nucleotídeos de comprimento, que geralmente não codificam proteínas, mas podem ser transcritos independentemente em cromossomos bacterianos 1,2,3. A maioria dos sRNAs é codificada nas regiões intergênicas (IGRs) entre regiões codificadoras de genes e interage com mRNAs alvo por meio de ações de pareamento de bases e regula a expressão de genes-alvo em nível pós-transcricional 4,5. Desempenham importantes papéis de regulação no metabolismo de substâncias, síntese de proteínas de membrana externa, quorum sensing e expressão gênica de virulência5.
MicC é um transcrito de RNA pequeno de 109 nucleotídeos presente em Escherichia coli e Salmonella enterica sorovar Typhimurium, que poderia regular a expressão de múltiplas proteínas de membrana externa, como OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 e Omp36 6,7,8,9. O MicC regula a expressão de OmpC inibindo a ligação do ribossomo ao líder de mRNA ompC in vitro e requer a chaperona de RNA Hfq para sua função em Escherichia coli6. Em Salmonella Typhimurium, MicC silencia o mRNA ompD através de um duplex de RNA de ≤12 pb dentro da sequência codificadora (códons 23-26) e, em seguida, desestabiliza o mRNA endonucleolítico7. Este processo de regulação é assistido pela proteína chaperona Hfq10. A OmpC é uma proteína abundante da membrana externa que foi considerada importante em ambientes onde as concentrações de nutrientes e toxinas eram elevadas, como no intestino6. A porina OmpD é a proteína de membrana externa mais abundante em Salmonella Typhimurium e representa cerca de 1% da proteína celular total11. A OmpD está envolvida na aderência a macrófagos humanos e células epiteliais intestinais12. MicC também reprime a expressão de porinas OmpC e OmpD. Acredita-se que MicC pode regular a virulência. Para explorar novos genes-alvo regulados por MicC e estudar a função de regulação de virulência do micC, clonamos o gene micC na cepa 50336 de Salmonella Enteritidis (SE) e, em seguida, construímos o mutante 50336ΔmicC e o mutante complementado 50336ΔmicC/p micC. Novos genes-alvo foram rastreados por qRT-PCR. A virulência de 50336ΔmicC foi detectada por infecções em camundongos e galinhas.
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Protocol
Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com o Guide for the Care and Use of Laboratory Animals do Conselho Nacional de Pesquisa. O comitê de cuidados e uso de animais da Universidade de Yangzhou aprovou todos os experimentos e procedimentos aplicados nos animais (SYXK2016-0020).
1. Cepas bacterianas, plasmídeos e condições de cultura
- Utilizar as bactérias e plasmídeos listados na Tabela 1.
- Cultivar bactérias em caldo LB ou em placas de ágar LB a 37 °C, na presença de 50 μg/mL de ampicilina (Amp), quando apropriado.
- Cepas de cultura contendo plasmídeos sensíveis à temperatura são usadas para a construção de mutantes de deleção a 30 °C.
2. Clone gene micC de S. Enteritidis cepa 50336
- Baseado na sequência a montante e a jusante do gene micC de S. Typhimurium cepa SL1344, projetam primers vmicC-F e vmicC-R para amplificar um fragmento contendo o gene micC por PCR usando SE50336 genomic DNA como modelo.
- Misturar 5 μL de tampão de reação de PCR 10x, 2 μL de mistura de dNTP (2,5 mM), 1 μL de primers vmicC-F e vmicC-R, respectivamente, 5 μL de template, 1 μL de Taq DNA polimerase e 35 μL de ddH2O juntos para PCR.
- Use as seguintes condições de reação de PCR: pré-desnaturação a 94 °C por 4 min; 94 °C por 30 s, 53 °C por 1 min, 72 °C por 1 min por 25 ciclos e extensão a 72 °C por 10 min.
- Sequenciar o produto da PCR para obter a sequência do gene micC .
3. Construção do mutante de deleção micC
NOTA: O mutante micC negativo da cepa 50336 de Salmonella Enteritidis foi construído usando recombinação mediada por λ-vermelho, conforme descrito anteriormente13,14. Os primers utilizados estão listados na Tabela 2.
- Amplificar de cloranfenicol contendo fragmentos de homologia do gene micC .
- Projetar primers micC-F e micC-R para amplificar o de cloranfenicol (Cm) do plasmídeo pKD3, incluindo extensões de homologia de 50 pb do gene 5' e 3' do gene micC .
- Extraia o plasmídeo pKD3 como o modelo de PCR.
- Mistura de 5 μL de tampão de reação de PCR 10x, 2 μL de mistura de dNTP (2,5 mM), 1 μL de primers micC-F e micC-R, respectivamente, 5 μL de molde, 1 μL de Taq DNA polimerase e 35 μL de ddH2O juntos como mistura de reação de PCR
- Amplificar o de Cm com as seguintes condições de reação de PCR: pré-desnaturação a 94 °C por 4 min; 94 °C por 1 min, 52 °C por 1 min, 72 °C por 1 min por 10 ciclos; 94 °C por 1 min, 63 °C por 1 min, 72 °C por 1 min por 25 ciclos e extensão a 72 °C por 10 min.
- Detectar o tamanho do produto da PCR por eletroforese em gel de agarose. Purificar e recuperar o produto da PCR com kit de recuperação de gel de DNA, e determinar a concentração de DNA por espectrofotômetro.
CUIDADO: A PCR deve ser realizada duas vezes. O primeiro produto da PCR foi diluído na proporção de 1:200 e usado como molde para a PCR secundária, para eliminar a interferência de recombinação adicional pelo plasmídeo pKD3.
- Construa1ª cepa recombinante 50336ΔmicC::cat
- Misturar 100 μL de células competentes SE50336 com 5 μL de plasmídeo pKD46 uniformemente e incubar no gelo por 30 min. Choque térmico da mistura acima a 42 °C por 90 s e transfira rapidamente a mistura para gelo por 2 min para transformar o plasmídeo pKD46 em SE50336. Selecionar colônias positivas cultivando durante a noite a 30 °C em uma placa resistente a Amp (50 μg/mL).
- Adicionar 30 mM de L-arabinose à cultura líquida SE50336/pKD46 e induzir a expressão da recombinase através de uma cultura de agitação a 30 °C durante 1 h. Em seguida, prepare células competentes.
- Misturar 100 ng de produto de PCR purificado (passo 3.1) e 40 μL de células competentes SE50336/pKD46 num copo de choque eléctrico (por exemplo, Bio-Rad). Realizar transformação de choque elétrico com os parâmetros de tensão 1,8 kV, pulso 25 μF e resistência 200 Ω.
- Após a eletrotransformação, transferir a mistura para 1 mL de meio SOC e uma cultura de agitação a 150 rpm e 30 °C por 1 h. Em seguida, esfregar a mistura em uma placa LB resistente a Cm (34 μg/mL) e cultivar a 37 °C durante a noite para rastrear colônia positiva.
- Cultivar a colônia positiva acima a 42 °C por 2 h. Selecionar a colônia sensível a Amp (50 μg/mL), mas resistente a Cm (34 μg/mL) a 37 °C durante a noite para obter a 1ª cepa recombinante sem pKD46.
- Identificar a 1ª cepa recombinante 50336ΔmicC::Cat.
- Extrato 50336ΔmicC::DNA genômico do gato como o modelo de PCR. Use os mesmos componentes de reação de PCR da etapa 2.1. Realizar a reação de PCR com as mesmas condições da etapa 2.1.
- Detectar o tamanho do produto da PCR por eletroforese em gel de agarose e sequenciar o produto da PCR.
- Construa o mutante de deleção 50336ΔmicC.
- Eletroporato 100 ng de pCP20 plasmidial em 40 μL de 50336ΔmicC::Células competentes do gato com os parâmetros de tensão 1,8 kV, pulso 25 μF e resistência 200 Ω, transformadores positivos de tela em placa resistente a Amp (50 μg/mL) e Cm (34 μg/mL) a 30 °C.
- Transferir acima dos transformadores positivos para LB não resistentes e cultivá-los durante a noite a 42 °C e, em seguida, isolar colônias únicas em uma placa LB a 37 °C. Selecione a colônia que é sensível a Amp e Cm. Este mutante é o mutante de deleção micC SE50336ΔmicC.
- Verificar 50336ΔmicC por PCR.
- Extrato 50336ΔmicC genomic DNA como modelo de PCR. Misturar 5 μL de tampão de reação de PCR 10x, 2 μL de mistura de dNTP (2,5 mM), 1 μL de primer vmicC-F, 1 μL de primer vmicC-R, 5 μL de template, 1 μL de Taq DNA polimerase e 35 μL de ddH2O juntos para PCR.
- Use as seguintes condições de reação de PCR: pré-desnaturação a 94 °C por 4 min; 94 °C por 30 s, 53 °C por 1 min, 72 °C por 1 min por 25 ciclos e extensão a 72 °C por 10min.
4. Construção da cepa micC complementada
- Projetam primers pBR-micC-F e pBR-micC-R com sítios de restrição NheI e SalI.
- Amplificar o gene micC completo com sequências de flanco usando mistura de reação de PCR que contém 5 μL de DNA genômico SE50336 como modelo, primers 1 μL de pBR-micC-F e 1 μL de pBR-micC-R como primers, 5 μL de tampão de reação de PCR 10x, 2 μL de mistura de dNTP (2,5 mM), 2 μL de mistura de dNTP (2,5 mM) e 35 μL de ddH2O.
- Use as seguintes condições de reação de PCR: pré-desnaturação a 94 °C por 4 min; 94 °C por 30 s, 52 °C por 50 s, 72 °C por 1 min por 25 ciclos e extensão a 72 °C por 10 min. Purificar e recuperar produto PCR.
- Digerir o produto da PCR e o plasmídeo pBR322, respectivamente, usando a enzima de restrição NheI e SalI, e ligá-los usando T4 ligase a 16 °C durante a noite para obter o plasmídeo pBR322-micC.
- Transformar pBR322-micC em células competentes SE50336ΔmicC e selecionar transformador positivo para obter a cepa complementada SE50336ΔmicC/pmicC. Extrair o plasmídeo pBR322-micC da cepa complementada e verificá-lo por digestão e sequenciamento da enzima de restrição.
5. Isolamento de RNA e PCR quantitativo em tempo real
- Cultura SE50336, 50336ΔmicC e 50336ΔmicC/pmicC em meio LB durante a noite a 24 °C com cultivo de 180 rpm a um OD600 de 2,0. Coletar cultura bacteriana por centrifugação a 13000 rpm por 2 min.
- Extrair RNA total usando o reagente TRIzol. Incubar 50 μL de RNA isolado com 2 μL de DNaseI e 6 μL de tampão 10x a 37 °C por 30 min para remover o DNA. Determinar a quantidade de RNA pipetando 1 μL de amostra de RNA para um microespectrofotômetro.
- Síntese de cDNA
- Use 1 μg de RNA total para síntese de cDNA em 20 μL do sistema de reação de transcrição reversa (4 μL de tampão 5x, 1 μL de mistura de enzimas RT, 1 μL de mistura de primers RT, 10 μL de RNA total e 4 μL de ddH2O). Incubar acima do sistema de reacção a 37 °C durante 15 min e depois a 85 °C durante 5 s.
- Projetar primers baseados na sequência dos genes-alvo ompA, ompC e ompD. Realizar transcrição reversa-PCR usando um kit de reagentes RT. Os componentes da reação de PCR contêm 2,5 μL de tampão de reação de PCR 10x, 1 μL de mistura de dNTP (2,5 mM), 1 μL de primers do gene alvo (ompA, ompC ou ompD), 2,5 μL de template, 0,5 μL de Taq DNA polimerase e 17,5 μL de ddH2O.
- Use as seguintes condições de reação de PCR: pré-desnaturação a 94 °C por 4 min; 94 °C por 30 s, 60 °C por 1 min, 72 °C por 1 min por 25 ciclos e extensão a 72 °C por 10min.
- Realizar PCR em tempo real utilizando kit RT-PCR verde SYBR em instrumento RT-PCT em triplicatas.
- Utilizar os seguintes componentes da reação de PCR: 10 μL de tampão SYBR 2x, 0,4 μL de primer forward e primer reverso respectivamente, 0,4 μL de RoxDye II, 2 μL de cDNA e 6,8 μL de RNase free H2O.
- Use as seguintes condições de reação de PCR: pré-desnaturação a 95 °C por 1 min por um ciclo; 95 °C por 5 s, 60 °C por 34 s por 40 ciclos.
- Normalizar todos os dados para o giro gênico de referência endógeno. Utilizar o método 2-Δ ΔCT para quantificação dos dados15.
6. Ensaios de virulência
- Culturas SE50336, 50336ΔmicC e 50336ΔmicC/pmicC em LB de meio a início de fase estacionária (OD600 de 2-3) a 24 °C, colher por centrifugação e diluir para CFU mL-1 apropriado em PBS estéril.
- Para infecções em camundongos, diluir as cepas cultivadas para 10 UFC/200 μL, 102 UFC/200 μL e 103 UFC/200 μL gradientes ressuspensions. Infectar grupos de cinco camundongos Balb/c de 6-8 semanas de idade por cepa por injeção subcutânea. Injetar no grupo controle 200 μL de solução salina fisiológica.
- Para infecções em frangos, diluir acima de três cepas para 107 UFC/200 μL, 108 UFC/200 μL e 109 UFC/200 μL gradientes ressuspensions. Infectar grupos de vinte galinhas de 1 dia de idade por cepa por injeção subcutânea.
- Monitorar sinais de doenças e mortes de animais experimentais diariamente. Calcular a DL50 (dose letal mediana) 14 d pós-infecção, conforme descrito anteriormente16. Processar os dados usando um software de análise de dados.
- Em grupos de infecção, colete o coração, fígado, baço, pulmão e rim de pintinhos recém-mortos. Pesar 0,5 g dos tecidos acima separadamente e triturá-los com operação estéril. Diluir as amostras de moagem gradualmente, espalhar-as em placa LB e cultivar por 8-10 h a 37 °C. Registrar a quantidade de cepas de Salmonella colonizadas em tecidos de pintinhos.
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Representative Results
Construção do mutante 50336Δ micC e linhagem complementada 50336Δ micC /p micC
O resultado do clone do gene micC indicou que este gene era composto por 109 pb mostrando 100% de identidade com o de S. Typhimurium. Com base nos dados de sequência, o mutante de deleção 50336ΔmicC e o mutante complementado 50336ΔmicC/pmicC foram construídos com sucesso. Em detalhes, os resultados do sequenciamento mostraram que um de resistência de 1,1 kb Cm foi amplificado e usado para a construção do1º recombinante. O 1ºrecombinante 50336ΔmicC::cat foi validado por PCR usando os primers vmicC-F e vmicC-R com um tamanho de banda esperado de cerca de 1200 pb de produtos de PCR com inserção de Cm em comparação com 279 pb de produtos de PCR em cepa selvagem (Figura 1). Na segunda recombinação, o Cm foi eliminado pelo pCP20. Os resultados da PCR combinados com o sequenciamento confirmaram que o mutante isogênico micC foi construído com sucesso e nomeado como 50336ΔmicC (Figura 1).
MicC regula a expressão gênica ompA, ompC e ompD
Para determinar os alvos de MicC, a expressão dos genes ompA, ompC e ompD nas linhagens SE 50336, 50336ΔmicC e 50336ΔmicC/p micC foram analisadas por PCR quantitativo em tempo real usando gyrA como padrão interno normalizador. Os resultados mostraram que a transcrição de ompA e ompC em 50336ΔmicC aumentou cerca de 2,2 vezes e 3 vezes do que na cepa selvagem, enquanto ompD em 50336ΔmicC aumentou ligeiramente (1,3 vezes) do que na cepa selvagem (Figura 2). Indicou que micC poderia reprimir a expressão de ompA, ompC e ompD. OmpA foi provavelmente um potencial novo gene alvo regulado por micC diretamente.
A exclusão do micC melhora o S. Virulência de enteritidisem camundongos e galinhas
Realizamos ensaios LD50 para quantificar o impacto da exclusão de micC em S. Virulência de enteritidis em camundongos e galinhas. Depois de infectar camundongos Balb/c de 6-8 semanas de idade com 10 a 3 UFC de cada uma das três cepas, observamos que a maioria dos camundongos infectados por 50336ΔmicC apresentou lassidão, inapetência ou diarreia 48 h após a infecção e pareceu morrer sucessivamente 96 h apósa infecção. Enquanto os camundongos infectados pela cepa WT e 50336ΔmicC/pmicC apresentaram os sintomas acima 72 h após a infecção, e morreram 120 h após a infecção. Os DL50s foram calculados 7 d pós-infecção. Os resultados mostraram que a DL50 da linhagem WT 50336, 50336ΔmicC e 50336ΔmicC/p micC para camundongos foi de 12,59, 5,01 e 19,95UFC, respectivamente. Isso indicou que a virulência do mutante 50336ΔmicC aumentou 2,5 vezes em comparação com o WT em camundongos (Tabela 3). Após infectar frangos de 1 dia de idade com 10 a9 UFC de cada uma das três cepas, a maioria das galinhas apresentou hiperemia intestinal e diarreia 10 h após a infecção. Quando infectadas com 108 UFC, as galinhas infectadas com 50336ΔmicC apresentaram maior mortalidade, quando comparadas com a cepa WT e 50336ΔmicC/pmicC. Os DL50s foram calculados para 14 d pós-infecção. Os resultados mostraram que as DL 50 da linhagem WT 50336, 50336ΔmicC e 50336ΔmicC/pmicC para frangos foram 1,13×109, 1,55×10 8 e2,54×10 8 UFC, respectivamente. Isso indicou que a deleção de micC também aumentou a virulência de S. Enteritidis em galinhas. Todas as três cepas de S. Enteritidis foram recuperadas do fígado, baço e ceco das galinhas infectadas.
Figura 1: Verificação por PCR dos mutantes 50336ΔmicC com os primers vmicC-F e vmicC-R. Um produto de PCR de 280 pb foi obtido quando o genoma selvagem 50336 foi molde (faixa 1). Quando o gene do Cm foi inserido no genoma de S. Enteritidis, o1º recombinante 50336Δmic::cat foi verificado por PCR e um produto de PCR de 1100 pb foi obtido (raia 2). O gene do Cm de 50336Δmic::cat foi excisado pela introdução do vetor pCP20 que expressa recombinase de FLP e o2º camundongo recombinante 50336Δ foi obtido e verificado por PCR (raia 3). M: marcador de massa molecular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Alterações de dobras do nível de mRNA dos genes ompA, ompC e ompD foram determinadas no mic mutante 50336 Δ e complementado com a cepa 50336Δmic/p por RT-PCR quantitativo em comparação com a cepa selvagem. Os ensaios foram realizados em triplicata. O método 2-ΔΔCT foi utilizado para a quantificação dos dados. *Indica diferença estatisticamente significativa em relação à cepa selvagem (p<0,05) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Cepas/plasmídeos | Características | Referências |
| Cepas | ||
| CMCC(B)50336 | Salmonella enterica sorovar Enteritidis selvagem-tipo | NICPBP, China |
| 50336ΔmicC | micC mutante deficiente | Este estudo |
| 50336ΔmicC/pmicC | 50336Δ micC carregando pBR-micC (Ampr) | Este estudo |
| Plasmídeo: | ||
| pKD3 | Cm; Cm teplate | [13] |
| pKD46 | Ampr, expressão da recombinase λRed | [13] |
| pCP20 | Ampère r, Cmr; Expressão da flp recombinase | [13] |
| pBR-micC | pBR322 carregando o gene micC completo (Ampr) | Este estudo |
| pGEM-T Fácil | vetor de clonagem, Ampr | Takara |
| pMD19 T-simples | vetor de clonagem, Ampr | Takara |
Tabela 1. Cepas bacterianas e plasmídeos utilizados neste estudo.
| Cartilha | Sequência (5'-3') | Tamanho do produto (bp) | ||||||
| micC-F | TGTCAGGAAAGACCTAAAAAGAGATGTTACCGTTTAATTCAATAATTAATTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG | 1114 | ||||||
| micC -R | TGGAAATAAAAAAAGCCCGAACATCCGTTCGGGCTTGTCAATTTATACCATATGAATATCCTCCTTAG | |||||||
| vmicC -F | AGCGAGTTGACGTTAAAACGTTAT | 279/140 | ||||||
| vmicC -R | TTCGTTCGGGCTTGTCAATTTATA | |||||||
| pBR-micC-F | CAGGCTAGCCACTTTATGTACAATGACATACGTCAC | 434 | ||||||
| pBR-micC-R | CAGGTCGACAAATATTCTAAGGATTAACCTGGAAAC | |||||||
| ompA-F | ACTGAACGCCCTGAGCTTTA | 177 | ||||||
| ompA-R | ACACCGGCTTCATTCACAAT | |||||||
| ompC-F | AAAGTTCTGCGCTTTGTTGG | 187 | ||||||
| ompC-R | CGCTGACGAACACCTGTATG | |||||||
| ompD-F | ACGGTCAGACTTCGCATAGG | 184 | ||||||
| ompD-R | TGTTGCCACCTACCGTAACA | |||||||
| giroA-F | GCATGACTTCGTCAGAACCA | 278 | ||||||
| giroA-R | GGTCTATCAGTTGCCGGAAG | |||||||
Tabela 2. Primers utilizados neste estudo
| Cepas | LD50 para camundongos (CFU) | Aprimoramento de dobras | LD50 para frangos (CFU) | Aprimoramento de dobras |
| S. Enteritidis 50336 | 12.59 | 1 | 1.13×109 | 1 |
| 50336ΔmicC | 5.01 | 2.51 | 1,55×108 | 7.29 |
| 50336Δ micC/pmicC | 19.95 | 0.63 | 2,54×108 | 4.45 |
| Controle negativo | 0 | / | 0 | / |
Tabela 3. Propriedades de virulência de S. Enteritidis 50336 cepas em camundongos e galinhas
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Discussion
S. A enteritidis é um importante patógeno intracelular facultativo que pode infectar galinhas jovens e produzir sintomas desde enterite até infecção sistêmica e morte17,18. Além disso, S. Enteritidis causa infecções latentes em frangos adultos e portadores crônicos contaminam produtos avícolas, resultando em infecções transmitidas por alimentos em humanos19. O mecanismo patogênico de S. Enteritidis ainda precisa ser investigado. Até o momento, alguns sRNAs como IsrJ, SroA e IsrM afetam a virulência de Salmonella 20,21,22,23. O gene RNA micC pequeno não codificante foi identificado em muitas enterobactérias como Escherichia coli, Salmonella Typhimurium, Salmonella Bongori e Shigella flexneri 6,7,24. Aqui, descobrimos que a sequência de micC em S. Enteritidis 50336 foi o mesmo que em S. Typhimurium. Isso indica que MicC é um sRNA conservador em enterobactérias.
Investigar se MicC medeia virulência em S. Enteritidis para animais e identificar alvos MicC, construímos o mutante de deleção 50336ΔmicC e o mutante complementado 50336ΔmicC/p micC expressandomicC com sucesso. Os resultados da qRT-PCR indicaram que micC poderia reprimir a expressão de ompA e ompC. OmpA é provavelmente um potencial novo alvo do MicC. O sRNA RybB foi capaz de reprimir a síntese de OmpA por pareamento de bases com as 5' regiões não traduzidas (5' UTRs) do mRNA alvo do ompA 25. O sRNA de MicA também facilita o rápido decaimento do mRNA de ompA por pareamento antisenso semelhante ao RybB25,26. Se o MicC usa o mecanismo de regulação semelhante para regular ompA não é conhecido e ainda precisa ser estudado em um futuro próximo. Em E. coli, a deleção de MicC aumentou a expressão de ompC de 1,5 a 2 vezes. Um estudo mais aprofundado mostrou que o MicC demonstrou inibir a ligação do ribossomo ao líder do mRNA 5' do ompC 6. Além disso, Pfeiffer descobriu que a OmpC era o principal alvo do MicC7. Supõe-se que MicC regula ompC em um mecanismo semelhante em S. Enteritidis com isso em E. coli e S. Typhimurium. Além de OmpA e OmpC, MicC também poderia reprimir a expressão de OmpD. O resultado mostrou que a transcrição de ompD em 50336ΔmicC foi ligeiramente aumentada (1,3 vezes) do que na cepa selvagem. Com base nos resultados acima, demonstrou que o MicC pode reprimir a transcrição de múltiplos mRNAs alvo (ompA, ompC e ompD) em S. Enteritidis. O MicC não é o único sRNA que pode regular múltiplos alvos. Alguns sRNAs como RybB, DsrA, GcvB, RNAIII e RyhB também atuam sobre múltiplos alvos 25,27,28,29,30,31. Como os sRNAs regulam alvos por mecanismo de pareamento de bases para realizar interações sRNA-alvo32, é possível que sub-regiões conservadas ou domínios de sRNAs possam se ligar a diferentes alvos.
A membrana externa de bactérias Gram-negativas é uma interface chave nas interações patógeno-hospedeiro. OmpA, OmpC e OmpD são proteínas importantes e abundantes da membrana externa. OmpC desempenha um papel importante em ambientes abomináveis como no intestino6. A OmpD está envolvida na aderência a macrófagos humanos e células epiteliais intestinais12. Pensou-se que a mudança na expressão de OMPs causada pela deleção de MicC poderia influenciar a virulência de S. Enteritidis e MicC acumulados em células de fase estacionária e especialmente sob condições de crescimento induziram os genes de virulência de Salmonella SPI-1 e SPI-27. Acredita-se que o MicC esteja relacionado à virulência em Salmonella, enquanto experimentos de infecções animais foram realizados para detectar a virulência de MicC. Os resultados mostraram que a DL50 dos mutantes 50336ΔmicC para galinhas de 1 dia e camundongos Balb/c de 6 semanas de idade foram ambas declinadas obviamente em comparação com a cepa selvagem. Isso indicou que a deleção de micC aumentou a virulência de S. Enteritidis em camundongos e galinhas. Supõe-se que o aumento da expressão de OmpA, OmpC e OmpD, que é causado pela deleção de MicC, leve ao aumento da virulência em S. Enteritidis.
MicC regula negativamente S. Virulência de enteritidis em camundongos e galinhas, provavelmente por downregulation da expressão das principais proteínas da membrana externa OmpA e OmpC.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado por subsídios da Fundação Nacional de Ciência da China (Nos. 31972651 e 31101826), Jiangsu High Education Science Foundation (No.14KJB230002), State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology (No.SKLVBF201509), Nature Science Foundation Grant of Yangzhou (No.YZ2014019), Um Projeto Financiado pelo Programa Acadêmico Prioritário de Desenvolvimento de Instituições de Ensino Superior de Jiangsu (PAPD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| dextrose | Sangon Biotech | A610219 | for broth preparation |
| DNA purification kit | TIANGEN | DP214 | for DNA purification |
| Ex Taq | TaKaRa | RR01A | PCR |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017608 | for broth preparation |
| K2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 20032116 | for broth preparation |
| L-Arabinose | Sangon Biotech | A610071 | λ-Red recombination |
| Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP106 | plasmid extraction |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | for broth preparation |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | for broth preparation |
| PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser | TaKaRa | RR047 | qRT-PCR |
| SYBRR Premix Ex Taq II | TaKaRa | RR820 | qRT-PCR |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202 | Ligation |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | for broth preparation |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | for broth preparation |
| centrifuge | Eppendorf | 5418 | centrifugation |
| Electrophoresis apparatus | Bio-Rad | 164-5050 | Electrophoresis |
| Electroporation System | Bio-Rad | 165-2100 | for bacterial transformation |
| Spectrophotometer | BioTek | Epoch | Absorbance detection |
| Real-Time PCR system | Applied Biosystems | 7500 system | qRT-PCR |
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