Summary
Et λ-Red-mediert rekombinasjonssystem ble brukt til å lage en delesjonsmutant av en liten ikke-kodende RNA-micC.
Abstract
Et ikke-kodende lite RNA (sRNA) er en ny faktor for å regulere genuttrykk på posttranskripsjonsnivå. En slags sRNA MicC, kjent i Escherichia coli og Salmonella Typhimurium, kunne undertrykke uttrykket av ytre membranproteiner. For ytterligere å undersøke reguleringsfunksjonen av micC i Salmonella Enteritidis, klonet vi micC-genet i Salmonella Enteritidis-stammen 50336, og konstruerte deretter mutanten 50336Δ micC ved λ Red-basert rekombinasjonssystem og det komplementerte muterte 50336Δ micCmicC som bærer rekombinant plasmid pBR322 som uttrykker micC. qRT-PCR-resultater viste at transkripsjon av ompD i 50336Δ micC var 1,3 ganger høyere enn i villtypestammen, mens transkripsjonen av ompA og ompC i 50336ΔmicC var 2,2 ganger og 3 ganger høyere enn de i villtypestammen. Disse indikerte at micC undertrykker uttrykket av ompA og ompC. I den følgende studien ble patogeniteten til 50336ΔmicC påvist av både infiserende 6 uker gamle Balb / c-mus og 1 dag gamle kyllinger. Resultatet viste at LD 50 av villtypestammen 50336, mutantene 50336Δ micC og 50336Δ micC/pmicC for 6 uker gamle Balb/c-mus var henholdsvis 12,59 CFU, 5,01 CFU og 19,95 CFU. LD50 av stammene for 1 dag gamle kyllinger var henholdsvis 1,13 x 109 CFU, 1,55 x 10 8 CFU og 2,54 x 108 CFU. Det indikerte at sletting av micC økte virulensen til S. Enteritidis hos mus og kyllinger ved å regulere ekspresjon av ytre membranproteiner.
Introduction
Ikke-kodende små RNA (sRNA) er 40-400 nukleotider i lengde, som vanligvis ikke koder for proteiner, men kan transkriberes uavhengig i bakterielle kromosomer 1,2,3. De fleste sRNA er kodet i de intergeniske regionene (IGRs) mellom genkodende regioner og interagerer med mål-mRNA gjennom baseparingshandlinger, og regulerer målgenuttrykk på posttranskripsjonsnivå 4,5. De spiller viktige reguleringsroller i stoffmetabolisme, ytre membranproteinsyntese, quorumsensing og virulensgenuttrykk5.
MicC er et 109-nukleotid lite RNA-transkript tilstede i Escherichia coli og Salmonella enterica serovar Typhimurium, som kan regulere flere ytre membranproteinuttrykk som OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 og Omp36 6,7,8,9. MicC regulerer uttrykket av OmpC ved å hemme ribosombinding til ompC mRNA-lederen in vitro, og det krever Hfq RNA-chaperone for sin funksjon i Escherichia coli6. I Salmonella Typhimurium slår MicC av ompD mRNA via en ≤12-bp RNA duplex i kodingssekvensen (kodon 23-26) og destabiliserer deretter endonukleolytisk mRNA7. Denne reguleringsprosessen er assistert av chaperone protein Hfq10. OmpC er et rikelig ytre membranprotein som ble antatt å være viktig i miljøer der nærings- og toksinkonsentrasjoner var høye, for eksempel i tarmen6. OmpD-porin er det mest tallrike ytre membranproteinet i Salmonella Typhimurium og representerer ca. 1% av totalt celleprotein11. OmpD er involvert i adherens til humane makrofager og tarmepitelceller12. MicC undertrykker også uttrykket til både OmpC- og OmpD-poriner. Det antas at MicC kan regulere virulens. For å utforske nye målgener regulert av MicC og studere virulensreguleringsfunksjonen til micC, klonet vi micC-genet i Salmonella Enteritidis (SE) stammen 50336, og konstruerte deretter mutanten 50336ΔmicC og den komplementerte mutanten 50336ΔmicC / p micC. Nye målgener ble screenet med qRT-PCR. Virulensen av 50336ΔmicC ble påvist av mus og kyllinginfeksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøkene ble utført i samsvar med Veiledning for omsorg og bruk av forsøksdyr fra Det nasjonale forskningsrådet. Dyrepleie- og brukskomiteen ved Yangzhou University godkjente alle eksperimenter og prosedyrer som ble brukt på dyrene (SYXK2016-0020).
1. Bakteriestammer, plasmider og kulturforhold
- Bruk bakteriene og plasmidene listet opp i tabell 1.
- Dyrkningsbakterier i LB-buljong eller på LB-agarplater ved 37 °C, i nærvær av 50 μg/ml ampicillin (Amp) når det er hensiktsmessig.
- Dyrkningsstammer som inneholder temperaturfølsomme plasmider brukes til delesjonsmutantkonstruksjon ved 30 °C.
2. Klone micC genet av S. Enteritidis stamme 50336
- Basert på oppstrøms og nedstrøms sekvens av micC-genet av S. Typhimurium stamme SL1344, design primere vmicC-F og vmicC-R for å amplifisere et fragment som inneholder micC gen ved PCR ved bruk av SE50336 genomisk DNA som mal.
- Bland 5 μL 10x PCR-reaksjonsbuffer, 2 μL dNTP-blanding (2,5 mM), 1 μL vmicC-F og vmicC-R primere, henholdsvis 5 μL mal, 1 μL Taq DNA-polymerase og 35 μL ddH2O sammen for PCR.
- Bruk følgende PCR-reaksjonsbetingelser:pre-denaturering ved 94 ° C i 4 minutter; 94 °C i 30 s, 53 °C i 1 min, 72 °C i 1 minutt i 25 sykluser, og forlengelse ved 72 °C i 10 minutter.
- Sekvenser PCR-produktet for å oppnå micC-gensekvensen .
3. Konstruksjon av micC-delesjonsmutanten
MERK: Den micC-negative mutanten av Salmonella Enteritidis stamme 50336 ble konstruert ved bruk av λ-Red-mediert rekombinasjon som beskrevet tidligere13,14. Primerne som brukes er listet opp i tabell 2.
- Forsterke kloramfenikol kassett som inneholder homologiske fragmenter av micC-genet .
- Design micC-F og micC-R primere for å forsterke kloramfenikol (Cm) kassett fra plasmid pKD3, inkludert 50 bp homologi utvidelser fra 5 'og 3' av micC genet.
- Pakk ut pKD3-plasmidet som PCR-malen.
- Bland 5 μL 10x PCR-reaksjonsbuffer, 2 μL dNTP-blanding (2,5 mM), 1 μL micC-F og micC-R primere, henholdsvis 5 μL mal, 1 μL Taq DNA-polymerase og 35 μL ddH2O sammen som PCR-reaksjonsblanding
- Forsterk Cm-kassetten med følgende PCR-reaksjonsbetingelser: pre-denaturering ved 94 °C i 4 minutter; 94 °C i 1 min, 52 °C i 1 min, 72 °C i 1 minutt i 10 sykluser; 94 °C i 1 min, 63 °C i 1 min, 72 °C i 1 minutt i 25 sykluser og forlengelse ved 72 °C i 10 minutter.
- Oppdag størrelsen på PCR-produktet ved agarosegelelektroforese. Rens og gjenopprett PCR-produktet med DNA-gelgjenopprettingssett, og bestem konsentrasjonen av DNA ved spektrofotometer.
FORSIKTIG: PCR må utføres to ganger. Det første PCR-produktet ble fortynnet i forholdet 1:200 og brukt som mal for sekundær PCR, for å eliminere interferensen av ytterligere rekombinasjon av pKD3-plasmid.
- Konstruer 1st rekombinant stamme 50336ΔmicC:: cat
- Bland 100 μL SE50336 kompetente celler med 5 μL pKD46-plasmid jevnt og inkuber på is i 30 minutter. Varm sjokk over blandingen ovenfor ved 42 °C i 90 s, og overfør blandingen raskt til is i 2 minutter for å omdanne pKD46-plasmidet til SE50336. Kontroller positive kolonier ved å dyrke over natten ved 30 °C på en amp-plate (50 μg/ml).
- Tilsett 30 mM L-arabinose til SE50336/pKD46 væskekultur, og indusere rekombinaseuttrykk ved en 30 °C ristekultur i 1 time. Forbered deretter kompetente celler.
- Bland 100 ng renset PCR-produkt (trinn 3.1) og 40 μl SE50336/pKD46 kompetente celler i en elektrisk støtkopp (f.eks. Bio-Rad). Utfør elektrisk støttransformasjon med parametrene spenning 1,8 kV, puls 25 μF og motstand 200 Ω.
- Etter elektrotransformasjon, overfør blandingen til 1 ml SOC-medium og en ristekultur ved 150 rpm og 30 °C i 1 time. Smør deretter blandingen på en Cm (34 μg / ml) motstandsdyktig LB-plate og kultur ved 37 ° C over natten for å skjerme positiv koloni.
- Dyrk ovennevnte positive koloni ved 42 ° C i 2 timer. Screene kolonien som er følsom for Amp (50 μg / ml), men motstandsdyktig mot Cm (34 μg / ml) ved 37 ° C over natten for å oppnå den første rekombinante stammen uten pKD46.
- Identifiser den første rekombinante stammen 50336ΔmicC::Cat.
- Pakk ut 50336ΔmicC::Cat genomic DNA som PCR-mal. Bruk de samme PCR-reaksjonskomponentene som i trinn 2.1. Gjennomfør PCR-reaksjonen med samme betingelser som i trinn 2.1.
- Oppdag størrelsen på PCR-produktet ved agarosegelelektroforese og sekvenser PCR-produktet.
- Konstruer slettingsmutant 50336ΔmicC.
- Elektroporat 100 ng plasmid pCP20 til 40 μL av 50336ΔmicC:: Cat kompetente celler med parametrene spenning 1,8 kV, puls 25 μF og motstand 200 Ω, skjerm positive transformanter på både Amp (50 μg / ml) og Cm (34 μg / ml) motstandsdyktig plate ved 30 ° C.
- Overfør over positive transformanter til ikke-resistent LB og dyrk dem over natten ved 42 °C, og isoler deretter enkeltkolonier på en LB-plate ved 37 °C. Velg kolonien som er følsom for både Amp og Cm. Denne mutanten er micC-delesjonsmutanten SE50336ΔmicC.
- Bekreft 50336ΔmicC ved PCR.
- Trekk ut 50336ΔmicC genomisk DNA som PCR-mal. Bland 5 μLof 10x PCR-reaksjonsbuffer, 2 μL dNTP-blanding (2,5 mM), 1 μL primer vmicC-F, 1 μL primer vmicC-R, 5 μL mal, 1 μL Taq DNA-polymerase og 35 μL ddH2O sammen for PCR.
- Bruk følgende PCR-reaksjonsbetingelser:pre-denaturering ved 94 ° C i 4 minutter; 94 °C i 30 s, 53 °C i 1 min, 72 °C i 1 minutt i 25 sykluser, og forlengelse ved 72 °C i 10 minutter.
4. Konstruksjon av micC-komplementert stamme
- Design primere pBR-micC-F og pBR-micC-R med NheI og SalI restriksjonssteder.
- Forsterke micC-genet i full lengde med flankesekvenser ved bruk av PCR-reaksjonsblanding som inneholder 5 μL SE50336 genomisk DNA som mal, primere 1 μL pBR-micC-F og 1 μL pBR-micC-R som primere, 5 μLof 10x PCR-reaksjonsbuffer, 2 μL dNTP-blanding (2,5 mM), 2 μL dNTP-blanding (2,5 mM) og 35 μL ddH2O.
- Bruk følgende PCR-reaksjonsbetingelser: predenaturering ved 94 °C i 4 minutter; 94 °C i 30 s, 52 °C i 50 s, 72 °C i 1 minutt i 25 sykluser og forlengelse ved 72 °C i 10 minutter. Rens og gjenopprett PCR-produktet.
- Fordøy henholdsvis PCR-produkt og plasmid pBR322 ved bruk av restriksjonsenzymet NheI og SalI, og liger dem ved bruk av T4-ligase ved 16 °C over natten for å oppnå plasmidet pBR322-micC.
- Transformer pBR322-micC til SE50336ΔmicC kompetente celler, og skjerm positiv transformant for å oppnå den komplementerte stammen SE50336ΔmicC / pmicC. Trekk ut plasmid pBR322-micC fra komplementert stamme og verifiser det ved restriksjonsenzymfordøyelse og sekvensering.
5. RNA-isolasjon og kvantitativ sanntids-PCR
- Dyrkning SE50336, 50336ΔmicC og 50336ΔmicC/pmicC i LB medium over natten ved 24 °C med 180 rpm ristedyrking til en OD600 på 2,0. Samle bakteriekultur ved sentrifugering ved 13000 o / min i 2 minutter.
- Trekk ut totalt RNA ved hjelp av TRIzol reagens. Inkuber 50 μL isolert RNA med 2 μL DNaseI og 6 μL 10x buffer ved 37 °C i 30 minutter for å fjerne DNA. Bestem RNA-mengde ved å pipetere 1 μL RNA-prøve til et mikrospektrofotometer.
- Syntese av cDNA
- Bruk 1 μg totalt RNA for cDNA-syntese i 20 μL revers transkripsjonsreaksjonssystem (4 μL 5x buffer, 1 μL RT-enzymblanding, 1 μL RT-primerblanding, 10 μL totalt RNA og 4 μLddH2O). Inkuber reaksjonssystemet over ved 37 °C i 15 minutter og deretter ved 85 °C i 5 s.
- Design primere basert på sekvensen av målgener ompA, ompC og ompD. Utfør revers transkripsjon-PCR ved hjelp av et RT-reagenssett. PCR-reaksjonskomponentene inneholder 2,5 μLof 10x PCR-reaksjonsbuffer, 1 μL dNTP-blanding (2,5 mM), 1 μL målgen (ompA, ompC eller ompD) primere, 2,5 μL mal, 0,5 μL Taq DNA-polymerase og 17,5 μL ddH2O.
- Bruk følgende PCR-reaksjonsbetingelser:pre-denaturering ved 94 ° C i 4 minutter; 94 °C i 30 s, 60 °C i 1 min, 72 °C i 1 minutt i 25 sykluser og forlengelse ved 72 °C i 10 minutter.
- Utfør sanntids PCR ved hjelp av SYBR grønt RT-PCR-sett i et RT-PCT-instrument i triplikater.
- Bruk følgende PCR-reaksjonskomponenter: 10 μL 2x SYBR-buffer, henholdsvis 0,4 μLof fremoverprimer og reversprimer, 0,4 μL RoxDye II, 2 μLof cDNA og 6,8 μL RNase-friH2O.
- Bruk følgende PCR-reaksjonsbetingelser:pre-denaturering ved 95 ° C i 1 min i en syklus; 95 °C i 5 s, 60 °C i 34 s i 40 sykluser.
- Normaliser alle data til det endogene referansegenet gyrA. Bruk 2-Δ ΔCT-metoden for datakvantifisering15.
6. Virulens analyser
- Dyrkning SE50336, 50336ΔmicC og 50336ΔmicC/pmicC i LB medium til tidlig stasjonær fase (OD600 av 2-3) ved 24 °C, høsting ved sentrifugering og fortynnet til passende CFU mL-1 i steril PBS.
- For musinfeksjoner, fortynn de dyrkede stammene til 10 CFU / 200 μL, 102 CFU / 200 μL og 103 CFU / 200 μL gradientresuspensjoner. Infiser grupper på fem 6-8 uker gamle Balb / c mus per stamme ved subkutan injeksjon. Injiser kontrollgruppen med 200 μL fysiologisk saltvann.
- For kyllinginfeksjoner, fortynn over tre stammer til 107 CFU / 200 μL, 108 CFU / 200 μL og 109 CFU / 200 μL gradientresuspensjoner. Infiser grupper av tjue1 dager gamle kyllinger per stamme ved subkutan injeksjon.
- Overvåk tegn på sykdom og dødsfall hos forsøksdyr daglig. Beregn LD50 (median dødelig dose) 14 d etter infeksjon som beskrevet tidligere16. Behandle dataene ved hjelp av dataanalyseprogramvare.
- I infeksjonsgrupper samler du hjerte, lever, milt, lunge og nyre av ferske døde kyllinger. Vei 0,5 g av de ovennevnte vevene separat og slip dem med steril drift. Fortynn slipeprøvene gradvis, spre dem på LB-plate og kultur i 8-10 timer ved 37 °C. Registrer mengden Salmonella-stammer kolonisert i kyllingvev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Konstruksjon av mutanten 50336Δ micC og komplementert stamme 50336Δ micC / p micC
micC-genklonresultatet indikerte at dette genet var sammensatt av 109 bp som viste 100% identitet med S. Typhimurium. Basert på sekvensdataene ble delesjonsmutanten 50336ΔmicC og den komplementerte mutanten 50336ΔmicC/pmicC konstruert vellykket. I detalj viste sekvenseringsresultatene at en motstandskassett på 1,1 kb Cm ble forsterket og brukt til å konstruere 1st rekombinant. 1. rekombinant 50336ΔmicC::cat ble validert ved PCR ved bruk av primere vmicC-F og vmicC-R med en forventet båndstørrelse på ca. 1200 bp PCR-produkter med Cm-innsetting sammenlignet med 279 bp PCR-produkter i villtypestamme (figur 1). I den andre rekombinasjonen ble Cm-kassett eliminert av pCP20. PCR-resultatene kombinert med sekvensering bekreftet at den isogene micC-mutanten ble konstruert vellykket og navngitt som 50336ΔmicC (figur 1).
MicC regulerer ompA, ompC og ompD genuttrykk
For å bestemme målene for MicC ble uttrykket av ompA-, ompC- og ompD-gener i SE-stammene 50336, 50336ΔmicC og 50336ΔmicC/p micC analysert ved sanntids kvantitativ PCR ved bruk av gyrA som normaliserende intern standard. Resultatene viste at transkripsjon av ompA og ompC i 50336ΔmicC økte omtrent 2,2 ganger og 3 ganger enn de i villtypestammen, mens ompD i 50336ΔmicC var økt litt (1,3 ganger) enn i villtypestamme (figur 2). Det indikerte at micC kunne undertrykke uttrykket av ompA, ompC og ompD. OmpA var sannsynligvis et potensielt nytt målgen regulert av micC direkte.
Sletting av micC forbedrer S. Enteritidisvirulens hos mus og kyllinger
Vi utførte LD50-analyser for å kvantifisere effekten av å slette mikrofon på S. Enteritidis virulens hos mus og kyllinger. Etter å ha infisert 6-8 uker gamle Balb / c mus med 103 CFU av hver av de tre stammene, observerte vi at de fleste musene infisert av 50336ΔmicC viste lassitude, inappetence eller diaré 48 timer etter infeksjon, og syntes å dø etter hverandre 96 timer etter infeksjon. Mens musene smittet av WT-stamme og 50336ΔmicC / pmicC viste symptomene ovenfor 72 timer etter infeksjon, og var døde 120 timer etter infeksjon. LD50s ble beregnet 7 d etter infeksjon. Resultatene viste at LD50 av WT-stammen 50336, 50336ΔmicC og 50336ΔmicC/pmicC for mus var henholdsvis 12,59, 5,01 og 19,95 CFU. Det indikerte at virulensen til mutanten 50336ΔmicC økte 2,5 ganger sammenlignet med WT hos mus (tabell 3). Etter å ha smittet 1 dag gamle kyllinger med 109 CFU av hver av de tre stammene, viste de fleste kyllinger tarmhyperemi og diaré 10 timer etter infeksjon. Ved smitte med 108 CFU viste kyllingene infisert med 50336ΔmicC høyere dødelighet, sammenlignet med WT-stamme og 50336ΔmicC/pmicC. LD50s ble beregnet for 14 d etter infeksjon. Resultatene viste at LD 50 av WT-stammen 50336, 50336ΔmicC og 50336ΔmicC/pmicC for kyllinger var henholdsvis 1,13×109, 1,55×108 og2,54×10 8 CFU. Det indikerte at sletting av micC også økte virulensen til S. Enteritidis hos kyllinger. Alle tre stammer av S. enteritidis ble gjenvunnet fra leveren, milten og caecum av de smittede kyllingene.
Figur 1:PCR-verifisering av 50336ΔmicC-mutantene med primere vmicC-F og vmicC-R. Et 280 bp PCR-produkt ble oppnådd når villtype 50336-genomet som mal (bane 1). Når Cm-kassettgenet ble satt inn i genomet til S. Enteritidis, 1st rekombinant 50336Δmic::cat ble verifisert ved PCR og et 1100 bp PCR-produkt ble oppnådd (bane 2). Cm-kassettgenet på 50336Δ mic::cat ble skåret ut ved å introdusere FLP rekombinase-uttrykkende vektor pCP20 og 2nd rekombinant 50336Δmic ble oppnådd og verifisert ved PCR (lane 3). M: molekylær massemarkør. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Fold endringer av ompA, ompC og ompD gener mRNA-nivå ble bestemt i mutert 50336 Δ mic og komplementert stamme 50336Δ mic / pmic ved kvantitativ RT-PCR sammenlignet med villtypestammen. Analyser ble utført i tre eksemplarer. 2-ΔΔCT-metoden ble brukt til datakvantifisering. *Indikerer statistisk signifikant forskjell sammenlignet med villtypestammen (s<0,05) Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Stammer/plasmider | Egenskaper | Referanser |
| Stammer | ||
| CMCC(B)50336 | Salmonella enterica serovar Enteritidis villtype | NICPBP, Kina |
| 50336ΔmicC | micC mangelfull mutant | Denne studien |
| 50336ΔmicC/pmicC | 50336Δ micC som bærer pBR-micC (Ampr) | Denne studien |
| Plasmider: | ||
| pKD3 | Cmr; Cm kassett teplate | [13] |
| pKD46 | Ampr, λRødt rekombinaseuttrykk | [13] |
| pCP20 | Amp r, Cmr; Flp rekombinase-uttrykk | [13] |
| pBR-micC | pBR322 som bærer hele micC-genet (Ampr) | Denne studien |
| pGEM-T Enkelt | kloning vektor, Ampr | Takara |
| pMD19 T-enkel | kloning vektor, Ampr | Takara |
Tabell 1. Bakteriestammer og plasmider brukt i denne studien.
| Grunning | Sekvens (5'-3') | Produktstørrelse (bp) | ||||||
| micC-F | TGTCAGGAAAGACCTAAAAGAGATGTTACCGTTTAATTCAATAATTAATTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG | 1114 | ||||||
| micC -R | TGGAAATAAAAAAAAGCCCGAACATCCGTTCGGGCTTGTCAATTTATACCATATGAATATCCTCCTTAG | |||||||
| vmicC -F | AGCGAGTTGACGTTAAAACGTTAT | 279/140 | ||||||
| vmicC -R | TTCGTTCGGGCTTGTCAATTTATA | |||||||
| pBR-micC-F | CAGGCTAGCCACTTTATGTACAATGACATACGTCAC | 434 | ||||||
| pBR-micC-R | CAGGTCGACAAATATTCTAAGGATTAACCTGGAAAC | |||||||
| ompA-F | ACTGAACGCCCTGAGCTTTA | 177 | ||||||
| ompA-R | ACACCGGCTTCATTCAAT | |||||||
| ompC-F | AAAGTTCTGCGCTTTTTTTGG | 187 | ||||||
| ompC-R | CGCTGACGAACACCTGTATG | |||||||
| ompD-F | ACGGTCAGACTTCGCATAGG | 184 | ||||||
| ompD-R | TGTTGCCACCTACCGTAACA | |||||||
| gyrA-F | GCATGACTTCGTCAGAACCA | 278 | ||||||
| gyrA-R | GGTCTATCAGTTGCCGGAAG | |||||||
Tabell 2. Primere brukt i denne studien
| Stammer | LD50 for mus (CFU) | Forbedring av brett | LD50 for kyllinger (CFU) | Forbedring av brett |
| S. Enteritidis 50336 | 12.59 | 1 | 1.13×109 | 1 |
| 50336ΔmicC | 5.01 | 2.51 | 1.55×108 | 7.29 |
| 50336Δ micC/pmicC | 19.95 | 0.63 | 2.54×108 | 4.45 |
| Negativ kontroll | 0 | / | 0 | / |
Tabell 3. Virulens egenskaper av S. Enteritidis 50336 stammer hos mus og kyllinger
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
S. Enteritidis er et viktig fakultativt intracellulært patogen som kan infisere unge kyllinger og produserer symptomer fra enteritt til systemisk infeksjon og død17,18. I tillegg forårsaker S. Enteritidis latente infeksjoner hos voksne kyllinger og kroniske bærere forurenser fjærfeprodukter, noe som resulterer i matbårne infeksjoner hos mennesker19. Den patogene mekanismen til S. Enteritidis gjenstår å bli ytterligere undersøkt. Til dags dato har noen sRNA som IsrJ, SroA og IsrM blitt funnet å påvirke Salmonella virulens20,21,22,23. Det ikke-kodende lille RNA micC-genet ble identifisert i mange enterobakterier som Escherichia coli, Salmonella Typhimurium, Salmonella Bongori og Shigella flexneri 6,7,24. Her fant vi at sekvensen av micC i S. Enteritidis 50336 var den samme som i S. Typhimurium. Det indikerer at MicC er et konservativt sRNA i enterobakterier.
For å undersøke om MicC medierer virulens i S. Enteritidis for dyr og identifisere MicC-mål, konstruerte vi delesjonsmutanten 50336ΔmicC og den komplementerte mutanten 50336ΔmicC/p micC som uttrykkermicC vellykket. Resultatene av qRT-PCR indikerte at micC kunne undertrykke uttrykket av ompA og ompC. OmpA er sannsynligvis et potensielt nytt mål for MicC. sRNA RybB kunne undertrykke syntesen av OmpA ved baseparring med 5' uoversatte regioner (5' UTR) av målompA mRNA25. MicA sRNA muliggjør også rask forfall av ompA mRNA ved antisenseparing på samme måte som RybB25,26. Hvorvidt MicC bruker den lignende reguleringsmekanismen for å regulere ompA er ikke kjent og gjenstår å bli studert i nær fremtid. I E. coli økte delesjonen av MicC uttrykket av ompC 1,5- til 2 ganger. Videre studier viste at MicC ble vist å hemme ribosombinding til ompC mRNA 5' leder6. I tillegg fant Pfeiffer at OmpC var hovedmålene for MicC7. Det antas at MicC regulerer ompC i en lignende mekanisme i S. Enteritidis med det i E. coli og S. Typhimurium. I tillegg til OmpA og OmpC kunne MicC også undertrykke uttrykket til OmpD. Resultatet viste at transkripsjonen av ompD i 50336ΔmicC ble økt litt (1,3 ganger) enn i villtypestamme. Basert på resultatene ovenfor viste det at MicC kunne undertrykke transkripsjonen av flere mål-mRNA (ompA, ompC og ompD) i S. Enteritidis. MicC er ikke det eneste sRNA som kan regulere flere mål. Noen sRNA som RybB, DsrA, GcvB, RNAIII og RyhB handler også på flere mål 25,27,28,29,30,31. Fordi sRNA regulerer mål ved baseparingsmekanisme for å oppnå sRNA-målinteraksjoner32, er det mulig at bevarte underregioner eller domener av sRNA kan binde seg til forskjellige mål.
Den ytre membranen til gramnegative bakterier er et sentralt grensesnitt i vertspatogeninteraksjoner. OmpA, OmpC og OmpD er alle viktige og rikelig ytre membranproteiner. OmpC spiller en viktig rolle i avskyelig miljø som i tarmen6. OmpD er involvert i adherens til humane makrofager og tarmepitelceller12. Det ble antatt at endringen av OMPs uttrykk forårsaket av MicC-sletting kunne påvirke virulensen til S. Enteritidis og MicC akkumulert i stasjonære faseceller og spesielt under vekstbetingelser induserte Salmonella SPI-1 og SPI-2 virulensgener7. Det antas at MicC er relatert til virulens i Salmonella, mens dyreinfeksjonsforsøk ble utført for å oppdage virulens av MicC. Resultatene viste at LD50 av mutantene 50336ΔmicC for 1 dag gamle kyllinger og 6 uker gamle Balb / c-mus begge ble avvist, åpenbart sammenlignet med den ville typestammen. Det indikerte at sletting av micC økte virulensen til S. Enteritidis hos mus og kyllinger. Det antas at økningen av OmpA, OmpC og OmpD-uttrykk, som skyldes MicC-sletting, fører til virulensforbedring i S. Enteritidis.
MicC regulerer S negativt. Enteritidis virulens hos mus og kylling sannsynligvis ved å nedregulere ekspresjon av de viktigste ytre membranproteinene OmpA og OmpC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av tilskudd fra Chinese National Science Foundation (nr. 31972651 og 31101826), Jiangsu High Education Science Foundation (No.14KJB230002), State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology (No.SKLVBF201509), Nature Science Foundation Grant of Yangzhou (No.YZ2014019), et prosjekt finansiert av Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| dextrose | Sangon Biotech | A610219 | for broth preparation |
| DNA purification kit | TIANGEN | DP214 | for DNA purification |
| Ex Taq | TaKaRa | RR01A | PCR |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017608 | for broth preparation |
| K2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 20032116 | for broth preparation |
| L-Arabinose | Sangon Biotech | A610071 | λ-Red recombination |
| Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP106 | plasmid extraction |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | for broth preparation |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | for broth preparation |
| PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser | TaKaRa | RR047 | qRT-PCR |
| SYBRR Premix Ex Taq II | TaKaRa | RR820 | qRT-PCR |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202 | Ligation |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | for broth preparation |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | for broth preparation |
| centrifuge | Eppendorf | 5418 | centrifugation |
| Electrophoresis apparatus | Bio-Rad | 164-5050 | Electrophoresis |
| Electroporation System | Bio-Rad | 165-2100 | for bacterial transformation |
| Spectrophotometer | BioTek | Epoch | Absorbance detection |
| Real-Time PCR system | Applied Biosystems | 7500 system | qRT-PCR |
References
- Jørgensen, M. G., Pettersen, J. S., Kallipolitis, B. H. sRNA-mediated control in bacteria: An increasing diversity of regulatory mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta-Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), 194504 (2020).
- Wagner, E. G. H., Romby, P. Small RNAs in bacteria and archaea: who they are, what they do, and how they do it. Advances In Genetics. 90, 133-208 (2015).
- Vogel, J. A rough guide to the non-coding RNA world of Salmonella. Molecular Microbiology. 71 (1), 1-11 (2009).
- Dutta, T., Srivastava, S. Small RNA-mediated regulation in bacteria: A growing palette of diverse mechanisms. Gene. 656, 60-72 (2018).
- Waters, L. S., Storz, G. Regulatory RNAs in bacteria. Cell. 136 (4), 615-628 (2009).
- Chen, S., Zhang, A., Blyn, L. B., Storz, G. MicC, a second small-RNA regulator of Omp protein expression in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 186 (20), 6689-6697 (2004).
- Pfeiffer, V., Papenfort, K., Lucchini, S., Hinton, J. C., Vogel, J. Coding sequence targeting by MicC RNA reveals bacterial mRNA silencing downstream of translational initiation. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (8), 840-846 (2009).
- Dam, S., Pagès, J. M., Masi, M. Dual Regulation of the Small RNA MicC and the Quiescent Porin OmpN in Response to Antibiotic Stress in Escherichia coli. Antibiotics (Basel). 6 (4), 33 (2017).
- Hao, M., et al. Porin Deficiency in Carbapenem-Resistant Enterobacter aerogenes Strains. Microbial Drug Resistance. 24 (9), 1277-1283 (2018).
- Wroblewska, Z., Olejniczak, M. Hfq assists small RNAs in binding to the coding sequence of ompD mRNA and in rearranging its structure. RNA. 22 (7), 979-994 (2016).
- Santiviago, C. A., Toro, C. S., Hidalgo, A. A., Youderian, P., Mora, G. C. Global regulation of the Salmonella enterica serovar typhimurium major porin, OmpD. Journal of Bacteriology. 185 (19), 5901-5905 (2003).
- Hara-Kaonga, B., Pistole, T. G. OmpD but not OmpC is involved in adherence of Salmonella enterica serovar typhimurium to human cells. Canadian Journal of Microbiology. 50 (9), 719-727 (2004).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).
- Meng, X., et al. The RNA chaperone Hfq regulates expression of fimbrial-related genes and virulence of Salmonella enterica serovar Enteritidis. FEMS Microbiology Letters. 346 (2), 90-96 (2013).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Vander Velden, A. W., Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Heffron, F. Multiple fimbrial adhesins are required for full virulence of Salmonella typhimurium in mice. Infection and Immunity. 66 (6), 2803-2808 (1998).
- Prescott, J. F. Salmonella enterica serovar enteritidis in humans and animals: Epidemiology, pathogenesis, and control. Canadian Veterinary Journal La Revue Veterinaire Canadienne. 40 (10), 736 (1999).
- Balasubramanian, R., et al. The global burden and epidemiology of invasive non-typhoidal. Hum Vaccin Immunother. 15 (6), 1421-1426 (2019).
- De Buck, J., Van Immerseel, F., Haesebrouck, F., Ducatelle, R. Colonization of the chicken reproductive tract and egg contamination by Salmonella. Journal of General and Applied Microbiology. 97 (2), 233-245 (2004).
- Padalon-Brauch, G., et al. Small RNAs encoded within genetic islands of Salmonella typhimurium show host-induced expression and role in virulence. Nucleic Acids Research. 36 (6), 1913-1927 (2008).
- Santiviago, C. A., et al. Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice. PLoS Pathogens. 5 (7), 1000477 (2009).
- Gong, H., et al. A Salmonella small non-coding RNA facilitates bacterial invasion and intracellular replication by modulating the expression of virulence factors. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002120 (2011).
- Hébrard, M., et al. sRNAs and the virulence of Salmonella enterica serovar Typhimurium. RNA Biology. 9 (4), 437-445 (2012).
- Vogel, J., Papenfort, K. Small non-coding RNAs and the bacterial outer membrane. Current Opinion in Microbiology. 9 (6), 605-611 (2006).
- Papenfort, K., et al. SigmaE-dependent small RNAs of Salmonella respond to membrane stress by accelerating global omp mRNA decay. Molecular Microbiology. 62 (6), 1674-1688 (2006).
- Udekwu, K. I., et al. Hfq-dependent regulation of OmpA synthesis is mediated by an antisense RNA. Genes and Development. 19 (19), 2355-2366 (2005).
- Papenfort, K., Vogel, J. Multiple target regulation by small noncoding RNAs rewires gene expression at the post-transcriptional level. Research in Microbiology. 160 (4), 278-287 (2009).
- Lease, R. A., Cusick, M. E., Belfort, M. Riboregulation in Escherichia coli: DsrA RNA acts by RNA:RNA interactions at multiple loci. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (21), 12456-12461 (1998).
- Sharma, C. M., Darfeuille, F., Plantinga, T. H., Vogel, J. A small RNA regulates multiple ABC transporter mRNAs by targeting C/A-rich elements inside and upstream of ribosome-binding sites. Genes and Development. 21 (21), 2804-2817 (2007).
- Boisset, S., et al. Staphylococcus aureus RNAIII coordinately represses the synthesis of virulence factors and the transcription regulator Rot by an antisense mechanism. Genes and Development. 21 (11), 1353-1366 (2007).
- Massé, E., Vanderpool, C. K., Gottesman, S. Effect of RyhB small RNA on global iron use in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 187 (20), 6962-6971 (2005).
- Papenfort, K., Vogel, J. Regulatory RNA in bacterial pathogens. Cell Host & Microbe. 8 (1), 116-127 (2010).
