Summary
Küçük bir kodlamayan RNA micC'nin delesyon mutantını oluşturmak için λ-Kırmızı aracılı bir rekombinasyon sistemi kullanıldı.
Abstract
Kodlamayan küçük RNA (sRNA), transkripsiyon sonrası düzeyde gen ekspresyonunu düzenlemek için yeni bir faktördür. Escherichia coli ve Salmonella Typhimurium'da bilinen bir tür sRNA MicC, dış zar proteinlerinin ekspresyonunu baskılayabilir. Salmonella Enteritidis'te micC'nin regülasyon fonksiyonunu daha fazla araştırmak için, Salmonella Enteritidis suşu 50336'daki micC genini klonladık ve daha sonra λ Kırmızı bazlı rekombinasyon sistemi ve mikC eksprese eden rekombinant plazmid pBR322 taşıyan tamamlanmış mutant 50336Δ micC / p micC ile mutant 50336Δ micC / p micC oluşturduk. qRT-PCR sonuçları, 50336Δ micC'de ompD'nin transkripsiyonunun vahşi tip suşa göre 1.3 kat daha yüksek olduğunu, 50336Δ micC'de ompA ve ompC'nin transkripsiyonunun ise vahşi tip suştakilere göre 2.2 kat ve 3 kat daha yüksek olduğunu göstermiştir. Bunlar, micC'nin ompA ve ompC ekspresyonunu bastırdığını göstermiştir. Aşağıdaki çalışmada, 50336ΔmicC'nin patojenitesi, hem 6 haftalık Balb / c farelerini hem de 1 günlük tavukları enfekte ederek tespit edildi. Sonuç, 6 haftalık Balb / c fareler için vahşi tip suş 50336'nın LD 50'sinin, mutantların 50336ΔmicC ve 50336Δ micC / pmicC'nin sırasıyla 12.59 CFU, 5.01 CFU ve 19.95 CFU olduğunu göstermiştir. 1 günlük tavuklar için suşların LD 50'si sırasıyla 1.13 x 109 CFU, 1.55 x 10 8 CFU ve2.54 x 10 8 CFU idi. MicC'nin silinmesinin S'nin virülansını arttırdığını göstermiştir.Enteritidis, farelerde ve tavuklarda dış zar proteinlerinin ekspresyonunu düzenleyerek.
Introduction
Kodlamayan küçük RNA'lar (sRNA'lar), genellikle proteinleri kodlamayan, ancak bakteri kromozomları 1,2,3'te bağımsız olarak kopyalanabilen 40-400 nükleotid uzunluğundadır. Çoğu sRNA, gen kodlayan bölgeler arasındaki intergenik bölgelerde (IGR'ler) kodlanır ve baz eşleştirme eylemleri yoluyla hedef mRNA'larla etkileşime girer ve hedef genlerin ekspresyonunu transkripsiyon sonrasıseviye 4,5'te düzenler. Madde metabolizmasında, dış membran protein sentezinde, çekirdek algılamada ve virülans gen ekspresyonunda önemli regülasyon rolleri oynarlar5.
MicC, Escherichia coli ve Salmonella enterica serovar Typhimurium'da bulunan ve OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 ve Omp36 6,7,8,9 gibi çoklu dış zar protein ekspresyonunu düzenleyebilen 109 nükleotid küçük RNA transkriptidir. MicC, in vitro ompC mRNA liderine ribozom bağlanmasını inhibe ederek OmpC ekspresyonunu düzenler ve Escherichia coli6'daki işlevi için Hfq RNA şaperonunu gerektirir. Salmonella Typhimurium'da MicC, ompD mRNA'yı kodlama dizisi içinde bir ≤12-bp RNA dubleks aracılığıyla susturur (kodonlar 23-26) ve daha sonra endonükleolitik mRNA7'nin dengesini bozar. Bu düzenleme süreci şaperon proteini Hfq10 tarafından desteklenir. OmpC, bağırsakta olduğu gibi besin ve toksin konsantrasyonlarının yüksek olduğu ortamlarda önemli olduğu düşünülen bol miktarda bir dış zar proteinidir6. OmpD porin, Salmonella Typhimurium'daki en bol dış zar proteinidir ve toplam hücre proteini11'in yaklaşık% 1'ini temsil eder. OmpD, insan makrofajlarına ve bağırsak epitel hücrelerine yapışmada rol oynar12. MicC ayrıca hem OmpC hem de OmpD porinlerinin ifadesini bastırır. MicC'nin virülansı düzenleyebileceği düşünülmektedir. MicC tarafından düzenlenen yeni hedef genleri keşfetmek ve micC'nin virülans düzenleme fonksiyonunu incelemek için, micC genini Salmonella Enteritidis (SE) suşu 50336'da klonladık ve daha sonra mutant 50336ΔmicC ve tamamlanmış mutant 50336ΔmicC / p micC'yi inşa ettik. Yeni hedef genler qRT-PCR ile tarandı. 50336ΔmicC'nin virülansı fareler ve tavuk enfeksiyonları tarafından tespit edildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneyler, Ulusal Araştırma Konseyi'nin Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak gerçekleştirildi. Yangzhou Üniversitesi hayvan bakımı ve kullanımı komitesi, hayvanlar üzerinde uygulanan tüm deney ve prosedürleri onayladı (SYXK2016-0020).
1. Bakteriyel suşlar, plazmidler ve kültür koşulları
- Tablo 1'de listelenen bakteri ve plazmidleri kullanın.
- LB suyunda veya LB agar plakalarında 37 °C'de, uygun olduğunda 50 μg / mL ampisilin (Amp) varlığında kültür bakterileri.
- Sıcaklığa duyarlı plazmidler içeren kültür suşları, 30 °C'de mutant yapımının silinmesi için kullanılır.
2. S'nin klon micC geni. Enteritidis suşu 50336
- S'nin micC geninin yukarı ve aşağı akış dizisine dayanır.Typhimurium suşu SL1344, SE50336 genomik DNA'yı şablon olarak kullanarak PCR ile micC geni içeren bir parçayı büyütmek için vmicC-F ve vmicC-R primerlerini tasarlar.
- PCR için sırasıyla 5 μL 10x PCR reaksiyon tamponu, 2 μL dNTP karışımı (2,5 mM), 1 μL vmicC-F ve vmicC-R primerleri, 5 μL şablon, 1 μL Taq DNA polimeraz ve 35 μLddH2O karıştırın.
- Aşağıdaki PCR reaksiyon koşullarını kullanın: 4 dakika boyunca 94 ° C'de ön denatürasyon; 30 s için 94 °C, 1 dakika için 53 °C, 25 döngü için 1 dakika boyunca 72 °C ve 10 dakika boyunca 72 °C'de uzatma.
- MicC gen dizisini elde etmek için PCR ürününü dizileyin.
3. MicC silme mutantının yapımı
NOT: Salmonella Enteritidis suşu 50336'nın micC-negatif mutantı, daha önce 13,14'te tarif edildiği gibi λ-Kırmızı aracılı rekombinasyon kullanılarak oluşturulmuştur. Kullanılan astarlar Tablo 2'de listelenmiştir.
- MicC geninin homoloji parçalarını içeren kloramfenikol kasetini güçlendirin.
- micC geninin 5' ve 3' lerinden 50 bp homoloji uzantıları da dahil olmak üzere plazmid pKD3'ten kloramfenikol (Cm) kasetini yükseltmek için micC-F ve micC-R primerlerini tasarlayın.
- pKD3 plazmidini PCR şablonu olarak ayıklayın.
- PCR reaksiyon karışımı olarak sırasıyla 5 μL 10x PCR reaksiyon tamponu, 2 μL dNTP Karışımı (2,5 mM), 1 μL micC-F ve micC-R primerleri, 5 μL şablon, 1 μL Taq DNA polimeraz ve 35 μLddH2O karıştırın
- Cm kasetini aşağıdaki PCR reaksiyon koşullarıyla güçlendirin: 4 dakika boyunca 94 ° C'de ön denatürasyon; 1 dakika boyunca 94 °C, 1 dakika boyunca 52 °C, 10 döngü için 1 dakika boyunca 72 °C; 1 dakika boyunca 94 °C, 1 dakika boyunca 63 °C, 25 döngü için 1 dakika boyunca 72 °C ve 10 dakika boyunca 72 °C'de uzatma.
- Agaroz jel elektroforezi ile PCR ürününün boyutunu tespit edin. DNA jel geri kazanım kiti ile PCR ürününü saflaştırın ve geri kazanın ve spektrofotometre ile DNA konsantrasyonunu belirleyin.
DİKKAT: PCR iki kez yapılmalıdır. İlk PCR ürünü 1:200 oranında seyreltildi ve pKD3 plazmid tarafından daha fazla rekombinasyonun girişimini ortadan kaldırmak için ikincil PCR için bir şablon olarak kullanıldı.
- Yapı 1st rekombinant gerinim 50336ΔmicC::cat
- 100 μL SE50336 yetkin hücreleri 5 μL pKD46 plazmid ile eşit şekilde karıştırın ve buz üzerinde 30 dakika boyunca inkübe edin. Yukarıdaki karışımı 42 ° C'de 90 s boyunca ısıtın ve pKD46 plazmidini SE50336'ya dönüştürmek için karışımı 2 dakika boyunca hızla buza aktarın. Pozitif kolonileri, Amper (50 μg / mL) dirençli bir plaka üzerinde 30 ° C'de gece boyunca kültürleyerek tarayın.
- SE50336/pKD46 sıvı kültürüne 30 mM L-arabinoz ekleyin ve 1 saat boyunca 30 °C'lik bir çalkalama kültürü ile rekombinaz ekspresyonunu indükleyin. Sonra yetkili hücreler hazırlayın.
- 100 ng saflaştırılmış PCR ürünü (adım 3.1) ve 40 μL SE50336/pKD46 yetkin hücreleri bir elektrik çarpması kabına (örneğin, Bio-Rad) karıştırın. Voltaj 1.8 kV, darbe 25 μF ve direnç 200 Ω parametreleri ile elektrik şoku dönüşümü gerçekleştirin.
- Elektrotransformasyondan sonra, karışımı 1 mL SOC ortamına ve 1 saat boyunca 150 rpm ve 30 ° C'de bir sallama kültürüne aktarın. Daha sonra pozitif koloni taramak için karışımı Cm (34 μg / mL) dirençli bir LB plakasına ve kültürüne gece boyunca 37 ° C'de sürün.
- Yukarıdaki pozitif koloni 2 saat boyunca 42 ° C'de kültürlendirin. Amp'ye (50 μg/mL) duyarlı, ancak Cm'ye (34 μg/mL) dirençli koloniyi, pKD46 olmadan 1. rekombinant suşu elde etmek için gece boyunca 37 °C'de tarayın.
- 1. rekombinant suşu 50336ΔmicC::Cat'i tanımlayın.
- PCR şablonu olarak 50336ΔmicC::Cat genomik DNA'sını ayıklayın. Adım 2.1'deki PCR reaksiyonu bileşenlerinin aynısını kullanın. PCR reaksiyonunu adım 2.1'deki gibi aynı koşullarla gerçekleştirin.
- Agaroz jel elektroforezi ile PCR ürününün boyutunu tespit edin ve PCR ürününü sıralayın.
- Yapı silme mutantı 50336ΔmicC.
- 100 ng plazmid pCP20'yi 40 μL'lik 50336ΔmicC::Cat yetkili hücrelerine 1,8 kV gerilim, darbe 25 μF ve direnç 200 Ω parametrelerine sahip hücreler, 30 °C'de hem Amper (50 μg/mL) hem de Cm (34 μg/mL) dirençli plaka üzerinde pozitif transformantları elekler.
- Pozitif transformantların üzerinde dirençli olmayan LB'ye aktarın ve gece boyunca 42 ° C'de kültüre alın ve daha sonra 37 ° C'de bir LB plakası üzerindeki tek kolonileri izole edin. Hem Amp hem de Cm'ye duyarlı olan koloni seçin. Bu mutant, micC silme mutantı SE50336Δ micC'dir.
- 50336ΔmicC'yi PCR ile doğrulayın.
- 50336ΔmicC genomik DNA'yı PCR şablonu olarak ayıklayın. PCR için 5 μL 10x PCR reaksiyon tamponu, 2 μL dNTP Karışımı (2,5 mM), 1 μL primer vmicC-F, 1 μL primer vmicC-R, 5 μL şablon, 1 μL Taq DNA polimeraz ve 35 μL ddH2O karıştırın.
- Aşağıdaki PCR reaksiyon koşullarını kullanın: 4 dakika boyunca 94 ° C'de ön denatürasyon; 30 sn için 94 °C, 1 dakika için 53 °C, 25 döngü için 1 dakika boyunca 72 °C ve 10 dakika boyunca 72 °C'de uzatma.
4. MicC kompleman geriniminin yapımı
- NheI ve SalI kısıtlama bölgelerine sahip pBR-micC-F ve pBR-micC-R astarları tasarlayın.
- Şablon olarak 5 μL SE50336 genomik DNA, primer olarak 1 μL pBR-micC-F ve 1 μL pBR-micC-R, 5 μL 10x PCR reaksiyon tamponu, 2 μL dNTP Karışımı (2.5 mM), 2 μL dNTP Karışımı (2.5 mM) ve 35 μL ddH2O içeren PCR reaksiyon karışımını kullanarak tam uzunlukta micC genini yan dizilerle güçlendirin.
- Aşağıdaki PCR reaksiyon koşullarını kullanın: 4 dakika boyunca 94 ° C'de ön denatürasyon; 30 s için 94 °C, 50 s için 52 °C, 25 döngü için 1 dakika boyunca 72 °C ve 10 dakika boyunca 72 °C'de uzatma. PCR ürününü saflaştırın ve geri kazanın.
- Kısıtlama enzimi NheI ve SalI kullanarak sırasıyla PCR ürününü ve plazmid pBR322'yi sindirin ve plazmid pBR322-micC'yi elde etmek için gece boyunca 16 ° C'de T4 ligaz kullanarak bunları bağlayın.
- pBR322-micC'yi SE50336ΔmicC yetkin hücrelerine dönüştürün ve tamamlanmış SE50336ΔmicC/pmicC suşunu elde etmek için pozitif dönüştürücüyü elin. Plazmid pBR322-micC'yi tamamlanmış suştan çıkarın ve kısıtlama enzimi sindirimi ve dizilimi ile doğrulayın.
5. RNA izolasyonu ve kantitatif gerçek zamanlı PCR
- Kültür SE50336, 50336ΔmicC ve 50336ΔmicC / pmicC , LB ortamında gece boyunca 24 ° C'de 180 rpm ile 2.0'lık bir OD600'e kadar sallanır. 2 dakika boyunca 13000 rpm'de santrifüjleme yoluyla bakteri kültürü toplayın.
- TRIzol reaktifini kullanarak toplam RNA'yı ekstrakte edin. DNA'yı çıkarmak için 30 dakika boyunca 37 ° C'de 2 μL DNaseI ve 6 μL 10x tampon ile 50 μL izole RNA'yı inkübe edin. 1 μL RNA örneğini bir mikro spektrofotometreye pipetleyerek RNA miktarını belirleyin.
- cDNA sentezi
- 20 μL ters transkripsiyon reaksiyon sisteminde cDNA sentezi için 1 μg toplam RNA kullanın (4 μL 5x tampon, 1 μL RT Enzim karışımı, 1 μL RT primer karışımı, 10 μL toplam RNA ve 4 μL ddH2O). Reaksiyon sisteminin üzerinde 37 ° C'de 15 dakika ve daha sonra 85 ° C'de 5 s boyunca inkübe edin.
- Hedef genlerin ompA, ompC ve ompD dizisine dayalı primerler tasarlayın. Bir RT reaktif kiti kullanarak ters transkripsiyon-PCR gerçekleştirin. PCR reaksiyon bileşenleri 2.5 μLof 10x PCR reaksiyon tamponu, 1 μL dNTP karışımı (2.5 mM), 1 μL hedef gen (ompA, ompC veya ompD) primerleri, 2.5 μL şablon, 0.5 μL Taq DNA polimeraz ve 17.5 μL ddH2O içerir.
- Aşağıdaki PCR reaksiyon koşullarını kullanın: 4 dakika boyunca 94 ° C'de ön denatürasyon; 30 sn için 94 °C, 1 dakika boyunca 60 °C, 25 döngü için 1 dakika boyunca 72 °C ve 10 dakika boyunca 72 °C'de uzatma.
- Üçlü bir RT-PCT cihazında SYBR yeşil RT-PCR kitini kullanarak gerçek zamanlı PCR gerçekleştirin.
- Aşağıdaki PCR reaksiyon bileşenlerini kullanın: sırasıyla 10 μL 2x SYBR tamponu, 0.4 μLof ileri astar ve ters astar, 0.4 μL RoxDye II, 2 μLof cDNA ve 6.8 μL RNaz içermeyenH2O.
- Aşağıdaki PCR reaksiyon koşullarını kullanın: bir döngü için 1 dakika boyunca 95 ° C'de ön denatürasyon; 5 s için 95 °C, 40 döngü için 34 s için 60 °C.
- Tüm verileri endojen referans geni gyrA'ya normalleştirin. Veri ölçümü için 2-ΔΔCT yöntemini kullanın15.
6. Virülans tahlilleri
- Kültür SE50336, 50336ΔmicC ve 50336ΔmicC / pmicC, 24 ° C'de LB orta ila erken sabit fazda (2-3'ün OD600'ü), santrifüjleme ile hasat edilir ve steril PBS'de uygun CFU mL-1'e seyreltilir.
- Fare enfeksiyonları için, kültürlenmiş suşları 10 CFU / 200 μL, 102 CFU / 200 μL ve 103 CFU / 200 μL gradyan süspansiyonlarına seyreltin. Subkutan enjeksiyon ile suş başına beş 6-8 haftalık Balb / c fareden oluşan grupları enfekte edin. Kontrol grubuna 200 μL fizyolojik salin enjekte edin.
- Tavuk enfeksiyonları için, üç suşun üzerinde 107 CFU / 200 μL, 108 CFU / 200 μL ve 109 CFU / 200 μL gradyan süspansiyonlarına seyreltin. Subkutan enjeksiyon ile suş başına yirmi 1 günlük tavuk gruplarını enfekte edin.
- Hastalık belirtilerini ve deney hayvanlarının ölümlerini günlük olarak izleyin. LD50 (medyan ölümcül doz) 14 d enfeksiyon sonrasını daha önce tarif edildiği gibi hesaplayın16. Veri analiz yazılımını kullanarak verileri işleyin.
- Enfeksiyon gruplarında, taze ölü civcivlerin kalbini, karaciğerini, dalağı, akciğerini ve böbreğini toplayın. Yukarıdaki dokuların 0,5 g'ını ayrı ayrı tartın ve steril işlemle öğütün. Öğütme numunelerini kademeli olarak seyreltin, LB plakasına ve kültürüne 37 ° C'de 8-10 saat yayın. Civciv dokularında kolonize edilen Salmonella suşlarının miktarını kaydedin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mutant 50336Δ micC ve tamamlanmış gerinim 50336Δ micC /p micC'nin yapımı
MicC gen klonu sonucu, bu genin S'ninkiyle %100 özdeşleştiğini gösteren 109 bp'den oluştuğunu gösterdi. Typhimurium. Sekans verilerine dayanarak, silme mutantı 50336ΔmicC ve tamamlanmış mutant 50336ΔmicC / pmicC başarıyla inşa edildi. Ayrıntılı olarak, sıralama sonuçları, 1.1 kb Cm'lik bir direnç kasetinin güçlendirildiğini ve 1. rekombinantın yapımında kullanıldığını göstermiştir. 1. rekombinant 50336ΔmicC::cat, vahşi tip suşta 279 bp PCR ürününe kıyasla, Cm yerleştirmeli yaklaşık 1200 bp PCR ürününün beklenen bant boyutuna sahip vmicC-F ve vmicC-R primerleri kullanılarak PCR ile doğrulanmıştır (Şekil 1). İkinci rekombinasyonda, Cm kaseti pCP20 tarafından elimine edildi. Dizileme ile birleştirilen PCR sonuçları, izojenik micC mutantının başarıyla inşa edildiğini ve 50336ΔmicC olarak adlandırıldığını doğruladı (Şekil 1).
MicC, ompA, ompC ve ompD gen ekspresyonunu düzenler
MicC'nin hedeflerini belirlemek için, SE suşları 50336, 50336ΔmicC ve 50336ΔmicC / p micC'deki ompA, ompC ve ompD genlerinin ekspresyonu, normalleştirici iç standart olarak gyrA kullanılarak gerçek zamanlı kantitatif PCR ile analiz edildi. Sonuçlar, 50336ΔmicC'deki ompA ve ompC'nin transkripsiyonunun vahşi tip suştakilere göre yaklaşık 2.2 kat ve 3 kat arttığını, 50336ΔmicC'deki ompD'nin ise vahşi tip suşa göre biraz (1.3 kat) arttığını göstermiştir (Şekil 2). MicC'nin ompA, ompC ve ompD ekspresyonunu baskılayabileceğini gösterdi. OmpA muhtemelen doğrudan micC tarafından düzenlenen potansiyel bir yeni hedef gendi.
micC'nin silinmesi S'yi geliştirir. Farelerde ve tavuklarda enteritidis virülansı
MicC silmenin S üzerindeki etkisini ölçmek için LD50 testleri yaptık. Farelerde ve tavuklarda Enteritidis virülansı. 6-8 haftalık Balb / c farelerini üç suşun her birinden 103 CFU ile enfekte ettikten sonra, 50336ΔmicC ile enfekte olan en fazla farenin enfeksiyondan 48 saat sonra gevşeklik, iştahsızlık veya ishal gösterdiğini ve enfeksiyondan 96 saat sonra art arda öldüğünü gözlemledik. WT suşu ve 50336ΔmicC / pmicC ile enfekte olan fareler, enfeksiyondan 72 saat sonra yukarıdaki semptomları gösterirken, enfeksiyondan 120 saat sonra öldüler. LD50s enfeksiyon sonrası 7 d olarak hesaplandı. Sonuçlar, fareler için WT suşu 5050, 50336ΔmicC ve 50336ΔmicC / pmicC'nin sırasıyla 12.59, 5.01 ve 19.95 CFU olduğunu göstermiştir. Mutant 50336ΔmicC'nin virülansının farelerde WT ile karşılaştırıldığında 2.5 kat arttığını göstermiştir (Tablo 3). 1 günlük tavuklara üç suşun her birinin 109 CFU'su bulaştırdıktan sonra, çoğu tavuk enfeksiyondan 10 saat sonra bağırsak hiperemi ve ishal gösterdi. 108 CFU ile enfekte olduğunda, 50336ΔmicC ile enfekte olan tavuklar, WT suşu ve 50336ΔmicC / pmicC ile karşılaştırıldığında daha yüksek mortalite göstermiştir. LD50s, enfeksiyon sonrası 14 d için hesaplandı. Sonuçlar, WT suşu 50'nin LD 50'sinin 50336, 50336ΔmicC ve tavuklar için 50336ΔmicC / pmicC'nin sırasıyla 1.13×109, 1.55×10 8 ve2.54×10 8 CFU olduğunu göstermiştir. MicC'nin silinmesinin de S'nin virülansını arttırdığını göstermiştir.Tavuklarda enteritidis. S. Enteritidis'in üç suşu da enfekte tavukların karaciğer, dalak ve caecum'undan kurtarıldı.
Şekil 1: 50336ΔmicC mutantlarının vmicC-F ve vmicC-R primerleri ile PCR doğrulaması. 280 bp PCR ürünü, vahşi tip 50336 genomu şablon olarak (şerit 1) elde edildiğinde elde edildi. Cm kaset geni S'nin genomuna eklendiğinde.Enteritidis, 1. rekombinant 50336Δmic::cat PCR ile doğrulandı ve 1100 bp PCR ürünü elde edildi (şerit 2). 50336Δmic::cat'in Cm kaset geni, FLP rekombinaz eksprese eden vektör pCP20 tanıtılarak eksize edildi ve 2. rekombinant 50336Δmikrofon PCR (şerit 3) ile elde edildi ve doğrulandı. M: moleküler kütle belirteci. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Mutant 50336 Δ mikrofonda ompA, ompC ve ompD genlerinin mRNA düzeyindeki kıvrım değişiklikleri belirlendi ve 50336Δ mikrofon/pmikrofon suşu kantitatif RT-PCR ile vahşi tip suşa kıyasla tamamlanmıştır. Tahliller üçlü olarak yapıldı. Veri niceliği için 2-ΔΔCT yöntemi kullanıldı. *Vahşi tip suşu ile karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı farkı gösterir (p<0.05) Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Suşlar/plazmidler | Özellik -lerini | Başvuru |
| Suş | ||
| CMCC(B)50336 | Salmonella enterica serovar Enteritidis vahşi tip | NICPBP, Çin |
| 50336ΔmicC | micC eksik mutant | Bu çalışma |
| 50336ΔmicC/pmicC | 50336Δ micC taşıma pBR-micC (Ampr) | Bu çalışma |
| Plazmid: | ||
| pKD3 | Cmr; Cm kaset teplate | [13] |
| pKD46 | Ampr, λKırmızı rekombinaz ifadesi | [13] |
| pCP20 | Amfi r, Cmr; Flp rekombinaz ifadesi | [13] |
| pBR-micC | pBR322 tam micC genini (Amperr) taşır | Bu çalışma |
| pGEM-T Kolay | klonlama vektörü, Ampr | Takara |
| pMD19 T-basit | klonlama vektörü, Ampr | Takara |
Tablo 1. Bu çalışmada kullanılan bakteri suşları ve plazmidler.
| Astar | Sıra (5'-3') | Ürün boyutu (bp) | ||||||
| micC-F | TGTCAGGAAAGACCTAAAAAGAGATGTTACCGTTTAATTCAATAATTAATTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG | 1114 | ||||||
| micC -R | TGGAAATAAAAAAAGCCCGAACATCCGTTCGGGCTTGTCAATTTATACCATATGAATATCCTCCTTAG | |||||||
| vmicC -F | AGCGAGTTGACGTTAAAACGTTAT | 279/140 | ||||||
| vmicC -R | TTCGTTCGGGCTTGTCAATTTATA | |||||||
| pBR-micC-F | ÇAĞGCTAGCKAKTTATGTACAATGACATACGTCAC | 434 | ||||||
| pBR-micC-R | CAGGTCGACAAATATTCTAAGGATTAACCTGGAAAC | |||||||
| ompA-F | ACTGAACGCCCTGAGCTTTA | 177 | ||||||
| ompA-R | ACACCGGCTTCATTCACAAT | |||||||
| ompC-F | AAAGTTCTGCGCTTTGTTGG | 187 | ||||||
| ompC-R | CGCTGACGAACACCTGTATG | |||||||
| ompD-F | ACGGTCAGACTTCGCATAGG | 184 | ||||||
| ompD-R | TGTTGCCACCTACCGTAACA | |||||||
| gyrA-F | GCATGACTTCGTCAGAACCA | 278 | ||||||
| gyrA-R | GGTCTATCAGTTGCCGGAAG | |||||||
Tablo 2. Bu çalışmada kullanılan astarlar
| Suş | Fareler için LD50 (CFU) | Katlama iyileştirmesi | Tavuklar için LD50 (CFU) | Katlama iyileştirmesi |
| S. Enteritidis 50336 · | 12.59 | 1 | 1.13×109 | 1 |
| 50336ΔmicC | 5.01 | 2.51 | 1.55×108 | 7.29 |
| 50336Δ micC/pmicC | 19.95 | 0.63 | 2.54×108 | 4.45 |
| Negatif kontrol | 0 | / | 0 | / |
Tablo 3. S.'nin virülans özellikleri Enteritidis 50336 farelerde ve tavuklarda suşlar
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
S. Enteritidis, genç tavukları enfekte edebilen ve enteritten sistemik enfeksiyona ve ölüme kadar semptomlar üreten önemli bir fakültatif hücre içi patojendir17,18. Ek olarak, S. Enteritidis yetişkin tavuklarda gizli enfeksiyonlara neden olur ve kronik taşıyıcılar kümes hayvanı ürünlerini kirleterek insanlarda gıda kaynaklı enfeksiyonlara neden olur19. S. Enteritidis'in patojenik mekanizması daha fazla araştırılmaya devam etmektedir. Bugüne kadar, IsrJ, SroA ve IsrM gibi bazı sRNA'ların Salmonella virülansını 20,21,22,23 etkilediği bulunmuştur. Kodlamayan küçük RNA micC geni, Escherichia coli, Salmonella Typhimurium, Salmonella Bongori ve Shigella flexneri 6,7,24 gibi birçok Enterobakteride tanımlanmıştır. Burada, micC dizisinin S'de olduğunu bulduk.Enteritidis 50336, S'dekiyle aynıydı. Typhimurium. MicC'nin Enterobakterilerde konservatif bir sRNA olduğunu gösterir.
MicC'nin S'de virülansa aracılık edip etmediğini araştırmak. Hayvanlar için enteritidis ve MicC hedeflerini tanımlayarak, micc'yi başarıyla ifade eden delesyon mutantı 50336ΔmicC ve tamamlanmış mutant 50336ΔmicC / pmicC'yi oluşturduk. qRT-PCR sonuçları, micC'nin ompA ve ompC ekspresyonunu baskılayabileceğini göstermiştir. OmpA muhtemelen MicC'nin potansiyel bir yeni hedefidir. sRNA RybB, hedef ompA mRNA25'in 5' çevrilmemiş bölgeleri (5' UTR'ler) ile baz eşleştirmesi yaparak OmpA sentezini baskılayabilir. MicA sRNA ayrıca RybB25,26'ya benzer şekilde antisens eşleştirmesi ile ompA mRNA'nın hızlı bozunmasını kolaylaştırır. MicC'nin ompA'yı düzenlemek için benzer düzenleme mekanizmasını kullanıp kullanmadığı bilinmemektedir ve yakın gelecekte araştırılmaya devam etmektedir. E. coli'de, MicC'nin silinmesi, ompC ekspresyonunu 1.5 ila 2 kat arttırdı. Daha ileri çalışmalar, MicC'nin ompC mRNA 5' lider6'ya ribozom bağlanmasını inhibe ettiğini göstermiştir. Buna ek olarak, Pfeiffer, OmpC'nin MicC7'nin ana hedefleri olduğunu buldu. MicC'nin ompC'yi S'deki benzer bir mekanizmada düzenlediği varsayılmaktadır.Enteritidis, E. coli ve S'de bununla birlikte. Typhimurium. OmpA ve OmpC'nin yanı sıra, MicC de OmpD ifadesini bastırabilir. Sonuç, ompD'nin 50336ΔmicC'deki transkripsiyonunun, vahşi tip suştan biraz daha fazla (1.3 kat) arttığını göstermiştir. Yukarıdaki sonuçlara dayanarak, MicC'nin S'deki çoklu hedef mRNA'ların (ompA, ompC ve ompD) transkripsiyonunu baskılayabileceğini göstermiştir. Enteritidis. MicC, birden fazla hedefi düzenleyebilen tek sRNA değildir. RybB, DsrA, GcvB, RNAIII ve RyhB gibi bazı sRNA'lar da 25,27,28,29,30,31 gibi birden fazla hedefe etki eder. sRNA'lar, sRNA-hedef etkileşimlerini gerçekleştirmek için baz eşleştirme mekanizması ile hedefleri düzenlediğinden, sRNA'ların korunmuş alt bölgelerinin veya alanlarının farklı hedeflere bağlanması mümkündür.
Gram-negatif bakterilerin dış zarı, konakçı-patojen etkileşimlerinde anahtar bir arayüzdür. OmpA, OmpC ve OmpD, hepsi önemli ve bol miktarda dış zar proteinleridir. OmpC, bağırsakta olduğu gibi ortamlarda önemli bir rol oynar6. OmpD, insan makrofajlarına ve bağırsak epitel hücrelerine yapışmada rol oynar12. MicC delesyonunun neden olduğu OMP ekspresyonundaki değişimin S'nin virülansını etkileyebileceği düşünülmüştür.Durağan faz hücrelerinde ve özellikle büyüme koşulları altında biriken enteritidis ve MicC, Salmonella SPI-1 ve SPI-2 virülansgenlerini 7 indükledi. MicC'nin Salmonella'daki virülans ile ilişkili olduğu düşünülürken, MicC'nin virülansını saptamak için hayvan enfeksiyonları deneyleri yapılmıştır. Sonuçlar, 1 günlük tavuklar ve 6 haftalık Balb / c fareleri için mutant50 50'nin her ikisinin de vahşi tip suşla karşılaştırıldığında açıkça azaldığını gösterdi. MicC'nin silinmesinin S'nin virülansını arttırdığını göstermiştir.Farelerde ve tavuklarda enteritidis. MicC delesyonunun neden olduğu OmpA, OmpC ve OmpD ekspresyonunun artışının S'de virülans artışına yol açtığı varsayılmaktadır.Enteritidis.
MicC, S'yi negatif olarak düzenler. Farelerde ve tavuklarda enteritidis virülansı, muhtemelen ana dış zar proteinleri OmpA ve OmpC'nin ekspresyonunu aşağı regüle ederek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Ulusal Bilim Vakfı (No. 31972651 ve 31101826), Jiangsu Yüksek Öğretim Bilim Vakfı (No.14KJB230002), Veteriner Biyoteknoloji Devlet Anahtar Laboratuvarı (No.SKLVBF201509), Yangzhou Doğa Bilimleri Vakfı Hibesi (No.YZ2014019), Jiangsu Yüksek Öğretim Kurumlarının Öncelikli Akademik Program Geliştirme (PAPD) tarafından finanse edilen bir proje tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| dextrose | Sangon Biotech | A610219 | for broth preparation |
| DNA purification kit | TIANGEN | DP214 | for DNA purification |
| Ex Taq | TaKaRa | RR01A | PCR |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017608 | for broth preparation |
| K2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 20032116 | for broth preparation |
| L-Arabinose | Sangon Biotech | A610071 | λ-Red recombination |
| Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP106 | plasmid extraction |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | for broth preparation |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | for broth preparation |
| PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser | TaKaRa | RR047 | qRT-PCR |
| SYBRR Premix Ex Taq II | TaKaRa | RR820 | qRT-PCR |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202 | Ligation |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | for broth preparation |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | for broth preparation |
| centrifuge | Eppendorf | 5418 | centrifugation |
| Electrophoresis apparatus | Bio-Rad | 164-5050 | Electrophoresis |
| Electroporation System | Bio-Rad | 165-2100 | for bacterial transformation |
| Spectrophotometer | BioTek | Epoch | Absorbance detection |
| Real-Time PCR system | Applied Biosystems | 7500 system | qRT-PCR |
References
- Jørgensen, M. G., Pettersen, J. S., Kallipolitis, B. H. sRNA-mediated control in bacteria: An increasing diversity of regulatory mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta-Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), 194504 (2020).
- Wagner, E. G. H., Romby, P. Small RNAs in bacteria and archaea: who they are, what they do, and how they do it. Advances In Genetics. 90, 133-208 (2015).
- Vogel, J. A rough guide to the non-coding RNA world of Salmonella. Molecular Microbiology. 71 (1), 1-11 (2009).
- Dutta, T., Srivastava, S. Small RNA-mediated regulation in bacteria: A growing palette of diverse mechanisms. Gene. 656, 60-72 (2018).
- Waters, L. S., Storz, G. Regulatory RNAs in bacteria. Cell. 136 (4), 615-628 (2009).
- Chen, S., Zhang, A., Blyn, L. B., Storz, G. MicC, a second small-RNA regulator of Omp protein expression in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 186 (20), 6689-6697 (2004).
- Pfeiffer, V., Papenfort, K., Lucchini, S., Hinton, J. C., Vogel, J. Coding sequence targeting by MicC RNA reveals bacterial mRNA silencing downstream of translational initiation. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (8), 840-846 (2009).
- Dam, S., Pagès, J. M., Masi, M. Dual Regulation of the Small RNA MicC and the Quiescent Porin OmpN in Response to Antibiotic Stress in Escherichia coli. Antibiotics (Basel). 6 (4), 33 (2017).
- Hao, M., et al. Porin Deficiency in Carbapenem-Resistant Enterobacter aerogenes Strains. Microbial Drug Resistance. 24 (9), 1277-1283 (2018).
- Wroblewska, Z., Olejniczak, M. Hfq assists small RNAs in binding to the coding sequence of ompD mRNA and in rearranging its structure. RNA. 22 (7), 979-994 (2016).
- Santiviago, C. A., Toro, C. S., Hidalgo, A. A., Youderian, P., Mora, G. C. Global regulation of the Salmonella enterica serovar typhimurium major porin, OmpD. Journal of Bacteriology. 185 (19), 5901-5905 (2003).
- Hara-Kaonga, B., Pistole, T. G. OmpD but not OmpC is involved in adherence of Salmonella enterica serovar typhimurium to human cells. Canadian Journal of Microbiology. 50 (9), 719-727 (2004).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).
- Meng, X., et al. The RNA chaperone Hfq regulates expression of fimbrial-related genes and virulence of Salmonella enterica serovar Enteritidis. FEMS Microbiology Letters. 346 (2), 90-96 (2013).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Vander Velden, A. W., Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Heffron, F. Multiple fimbrial adhesins are required for full virulence of Salmonella typhimurium in mice. Infection and Immunity. 66 (6), 2803-2808 (1998).
- Prescott, J. F. Salmonella enterica serovar enteritidis in humans and animals: Epidemiology, pathogenesis, and control. Canadian Veterinary Journal La Revue Veterinaire Canadienne. 40 (10), 736 (1999).
- Balasubramanian, R., et al. The global burden and epidemiology of invasive non-typhoidal. Hum Vaccin Immunother. 15 (6), 1421-1426 (2019).
- De Buck, J., Van Immerseel, F., Haesebrouck, F., Ducatelle, R. Colonization of the chicken reproductive tract and egg contamination by Salmonella. Journal of General and Applied Microbiology. 97 (2), 233-245 (2004).
- Padalon-Brauch, G., et al. Small RNAs encoded within genetic islands of Salmonella typhimurium show host-induced expression and role in virulence. Nucleic Acids Research. 36 (6), 1913-1927 (2008).
- Santiviago, C. A., et al. Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice. PLoS Pathogens. 5 (7), 1000477 (2009).
- Gong, H., et al. A Salmonella small non-coding RNA facilitates bacterial invasion and intracellular replication by modulating the expression of virulence factors. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002120 (2011).
- Hébrard, M., et al. sRNAs and the virulence of Salmonella enterica serovar Typhimurium. RNA Biology. 9 (4), 437-445 (2012).
- Vogel, J., Papenfort, K. Small non-coding RNAs and the bacterial outer membrane. Current Opinion in Microbiology. 9 (6), 605-611 (2006).
- Papenfort, K., et al. SigmaE-dependent small RNAs of Salmonella respond to membrane stress by accelerating global omp mRNA decay. Molecular Microbiology. 62 (6), 1674-1688 (2006).
- Udekwu, K. I., et al. Hfq-dependent regulation of OmpA synthesis is mediated by an antisense RNA. Genes and Development. 19 (19), 2355-2366 (2005).
- Papenfort, K., Vogel, J. Multiple target regulation by small noncoding RNAs rewires gene expression at the post-transcriptional level. Research in Microbiology. 160 (4), 278-287 (2009).
- Lease, R. A., Cusick, M. E., Belfort, M. Riboregulation in Escherichia coli: DsrA RNA acts by RNA:RNA interactions at multiple loci. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (21), 12456-12461 (1998).
- Sharma, C. M., Darfeuille, F., Plantinga, T. H., Vogel, J. A small RNA regulates multiple ABC transporter mRNAs by targeting C/A-rich elements inside and upstream of ribosome-binding sites. Genes and Development. 21 (21), 2804-2817 (2007).
- Boisset, S., et al. Staphylococcus aureus RNAIII coordinately represses the synthesis of virulence factors and the transcription regulator Rot by an antisense mechanism. Genes and Development. 21 (11), 1353-1366 (2007).
- Massé, E., Vanderpool, C. K., Gottesman, S. Effect of RyhB small RNA on global iron use in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 187 (20), 6962-6971 (2005).
- Papenfort, K., Vogel, J. Regulatory RNA in bacterial pathogens. Cell Host & Microbe. 8 (1), 116-127 (2010).
