Summary
Ein λ-Red-vermitteltes Rekombinationssystem wurde verwendet, um eine Deletionsmutante einer kleinen nicht-kodierenden RNA micC zu erzeugen.
Abstract
Eine nicht-kodierende kleine RNA (sRNA) ist ein neuer Faktor zur Regulierung der Genexpression auf posttranskriptioneller Ebene. Eine Art sRNA MicC, wie sie in Escherichia coli und Salmonella Typhimurium bekannt ist, könnte die Expression von Proteinen der äußeren Membran unterdrücken. Um die Regulationsfunktion von micC in Salmonella Enteritidis weiter zu untersuchen, klonierten wir das micC-Gen im Salmonella Enteritidis-Stamm 50336 und konstruierten dann die Mutante 50336Δ micC durch das λ Red-basierte Rekombinationssystem und die komplementäre Mutante 50336Δ micC/p micC, die das rekombinante Plasmid pBR322 trägt, das micC exprimiert. Die Ergebnisse der qRT-PCR zeigten, dass die Transkription von ompD in 50336Δ micC 1,3-fach höher war als die im Wildtyp-Stamm, während die Transkription von ompA und ompC in 50336ΔmicC 2,2-fach und 3-fach höher war als im Wildtyp-Stamm. Diese deuteten darauf hin, dass micC die Expression von ompA und ompC unterdrückt. In der folgenden Studie wurde die Pathogenität von 50336ΔmicC sowohl durch die Infektion von 6 Wochen alten Balb/c-Mäusen als auch durch 1 Tag alte Hühner nachgewiesen. Das Ergebnis zeigte, dass die LD 50 des Wildtyp-Stammes 50336, die Mutanten 50336Δ micC und 50336Δ micC/pmicC für 6 Wochen alte Balb/c-Mäuse 12,59 KBE, 5,01 KBE bzw. 19,95 KBE betrugen. Die LD 50 der Stämme für 1 Tag alte Hühner betrugen 1,13 x 109 KBE, 1,55 x 10 8 KBE bzw.2,54 x 10 8 KBE. Es zeigte sich, dass die Deletion von micC die Virulenz von S erhöht. Enteritidis bei Mäusen und Hühnern durch Regulierung der Expression von Proteinen der äußeren Membran.
Introduction
Nicht-kodierende kleine RNAs (sRNAs) sind 40-400 Nukleotide lang, die im Allgemeinen keine Proteine kodieren, aber unabhängig voneinander in bakteriellen Chromosomen transkribiert werden können 1,2,3. Die meisten sRNAs kodieren in den intergenen Regionen (IGRs) zwischen genkodierenden Regionen und interagieren mit Ziel-mRNAs durch Basenpaarungsaktionen und regulieren die Expression von Zielgenen auf posttranskriptioneller Ebene 4,5. Sie spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation des Stoffstoffwechsels, der Proteinsynthese der äußeren Membran, der Quorum-Sensing und der Virulenz-Genexpression5.
MicC ist ein kleines RNA-Transkript mit 109 Nukleotiden, das in Escherichia coli und Salmonella enterica serovar Typhimurium vorkommt und die Expression mehrerer Proteine der äußeren Membran wie OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 und Omp36 regulieren könnte 6,7,8,9. MicC reguliert die Expression von OmpC, indem es die Bindung des Ribosoms an den ompC-mRNA-Leader in vitro hemmt, und benötigt das Hfq-RNA-Chaperon für seine Funktion in Escherichia coli6. In Salmonella Typhimurium schaltet MicC ompD-mRNA über einen ≤12-bp-RNA-Duplex innerhalb der kodierenden Sequenz (Codons 23-26) aus und destabilisiert dann die endonukleolytische mRNA7. Dieser Regulationsprozess wird durch das Chaperonprotein Hfq10 unterstützt. Das OmpC ist ein reichlich vorhandenes äußeres Membranprotein, von dem angenommen wurde, dass es in Umgebungen mit hohen Nährstoff- und Toxinkonzentrationen, wie z. B. im Darm, wichtig ist6. Das OmpD-Porin ist das am häufigsten vorkommende äußere Membranprotein in Salmonella Typhimurium und macht etwa 1% des gesamten Zellproteins11 aus. OmpD ist an der Adhärenz an menschlichen Makrophagen und Darmepithelzellen beteiligt12. MicC unterdrückt auch die Expression von OmpC- und OmpD-Porinen. Es wird vermutet, dass MicC die Virulenz regulieren kann. Um neue Zielgene zu erforschen, die durch MicC reguliert werden, und um die Virulenzregulationsfunktion von micC zu untersuchen, klonierten wir das micC-Gen im Salmonella Enteritidis (SE)-Stamm 50336 und konstruierten dann die Mutante 50336ΔmicC und die komplementäre Mutante 50336ΔmicC/p micC. Neuartige Zielgene wurden mittels qRT-PCR gescreent. Die Virulenz von 50336ΔmicC wurde durch Mäuse- und Hühnerinfektionen nachgewiesen.
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Protocol
Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren des Nationalen Forschungsrats durchgeführt. Das Komitee für Tierpflege und -nutzung der Universität Yangzhou genehmigte alle Experimente und Verfahren, die an den Tieren angewendet wurden (SYXK2016-0020).
1. Bakterienstämme, Plasmide und Kulturbedingungen
- Verwenden Sie die in Tabelle 1 aufgeführten Bakterien und Plasmide.
- Kultivieren Sie Bakterien in LB-Bouillon oder auf LB-Agarplatten bei 37 °C, gegebenenfalls in Gegenwart von 50 μg/ml Ampicillin (Ampicillin).
- Kulturstämme, die temperaturempfindliche Plasmide enthalten, werden für die Konstruktion von Deletionsmutanten bei 30 °C verwendet.
2. Klonen Sie das micC-Gen von S. an . Enteritidis Stamm 50336
- Basierend auf der Upstream- und Downstream-Sequenz des micC-Gens von S. Der Typhimurium-Stamm SL1344 entwirft die Primer vmicC-F und vmicC-R, um ein Fragment, das das micC-Gen enthält, mittels PCR unter Verwendung der genomischen DNA SE50336 als Vorlage zu amplifizieren.
- Für die PCR werden 5 μl 10x PCR-Reaktionspuffer, 2 μl dNTP-Gemisch (2,5 mM), 1 μl vmicC-F- bzw. vmicC-R-Primer, 5 μl Template, 1 μl Taq-DNA-Polymerase und 35 μlddH2Omiteinander vermischt.
- Verwenden Sie die folgenden PCR-Reaktionsbedingungen: Vordenaturierung bei 94 °C für 4 min; 94 °C für 30 s, 53 °C für 1 min, 72 °C für 1 min für 25 Zyklen und Ausfahren bei 72 °C für 10 min.
- Sequenzieren Sie das PCR-Produkt, um die micC-Gensequenz zu erhalten.
3. Konstruktion der micC-Deletionsmutante
HINWEIS: Die micC-negative Mutante des Salmonella Enteritidis-Stammes 50336 wurde mittels λ-Red-vermittelter Rekombination konstruiert, wie zuvor beschrieben13,14. Die verwendeten Primer sind in Tabelle 2 aufgeführt.
- Amplifizieren Sie die Chloramphenicol-Kassette, die Homologiefragmente des micC-Gens enthält.
- Entwicklung von micC-F- und micC-R-Primern zur Amplifikation der Chloramphenicol (Cm)-Kassette aus dem Plasmid pKD3, einschließlich 50 bp Homologieverlängerungen aus dem 5' und 3' des micC-Gens .
- Extrahieren Sie das pKD3-Plasmid als PCR-Template.
- Mischen Sie 5 μl 10x PCR-Reaktionspuffer, 2 μl dNTP-Mischung (2,5 mM), 1 μl micC-F- und micC-R-Primer, jeweils 5 μl Template, 1 μl Taq-DNA-Polymerase und 35 μlddH2Oals PCR-Reaktionsgemisch zusammen
- Amplifizieren Sie die Cm-Kassette mit den folgenden PCR-Reaktionsbedingungen: Vordenaturierung bei 94 °C für 4 min; 94 °C für 1 min, 52 °C für 1 min, 72 °C für 1 min für 10 Zyklen; 94 °C für 1 min, 63 °C für 1 min, 72 °C für 1 min für 25 Zyklen und Verlängerung bei 72 °C für 10 min.
- Bestimmen Sie die Größe des PCR-Produkts durch Agarose-Gelelektrophorese. Reinigen und gewinnen Sie das PCR-Produkt mit dem DNA-Gel-Rückgewinnungskit zurück und bestimmen Sie die DNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer.
ACHTUNG: Die PCR muss zweimal durchgeführt werden. Das erste PCR-Produkt wurde im Verhältnis 1:200 verdünnt und als Template für die sekundäre PCR verwendet, um die Interferenz einer weiteren Rekombination durch pKD3-Plasmid zu eliminieren.
- Konstruieren Sie 1. rekombinante Dehnung 50336ΔmicC::cat
- Mischen Sie 100 μl SE50336-kompetente Zellen mit 5 μl pKD46-Plasmid gleichmäßig und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang auf Eis. Das obige Gemisch wird 90 s lang bei 42 °C durch einen Hitzeschock versetzt und 2 Minuten lang schnell in Eis überführt, um das pKD46-Plasmid in SE50336 umzuwandeln. Screenen Sie positive Kolonien durch Kultivierung über Nacht bei 30 °C auf einer Amp (50 μg/mL) resistenten Platte.
- 30 mM L-Arabinose in die SE50336/pKD46-Flüssigkultur geben und die Rekombinaseexpression durch eine 30 °C-Schüttelkultur für 1 h induzieren. Bereiten Sie dann kompetente Zellen vor.
- Mischen Sie 100 ng gereinigtes PCR-Produkt (Schritt 3.1) und 40 μl SE50336/pKD46-kompetente Zellen in einen Elektroschockbecher (z. B. Bio-Rad). Führen Sie eine elektrische Schlagumwandlung mit den Parametern Spannung 1,8 kV, Impuls 25 μF und Widerstand 200 Ω durch.
- Nach der Elektrotransformation wird das Gemisch in 1 ml SOC-Medium und eine Schüttelkultur bei 150 U/min und 30 °C für 1 h überführt. Anschließend wird die Mischung auf eine Cm-resistente LB-Platte (34 μg/ml) gestrichen und über Nacht bei 37 °C kultiviert, um eine positive Kolonie zu screenen.
- Kultivieren Sie die obige positive Kolonie bei 42 °C für 2 h. Screenen Sie die Kolonie, die empfindlich auf Amp (50 μg/ml), aber resistent auf Cm (34 μg/ml) ist, bei 37 °C über Nacht, um den 1. rekombinanten Stamm ohne pKD46 zu erhalten.
- Identifizieren Sie den 1. rekombinanten Stamm 50336ΔmicC::Cat.
- Extrakt 50336ΔmicC::Katzengenomische DNA als PCR-Template. Verwenden Sie die gleichen PCR-Reaktionskomponenten wie in Schritt 2.1. Führen Sie die PCR-Reaktion unter den gleichen Bedingungen wie in Schritt 2.1 durch.
- Bestimmen Sie die Größe des PCR-Produkts durch Agarose-Gelelektrophorese und sequenzieren Sie das PCR-Produkt.
- Konstruktieren Sie die Deletionsmutante 50336ΔmicC.
- Elektroporat 100 ng Plasmid pCP20 in 40 μL 50336ΔmicC::Cat-kompetente Zellen mit den Parametern Spannung 1,8 kV, Puls 25 μF und Widerstand 200 Ω, schirmen positive Transformatoren sowohl auf Amp (50 μg/mL) als auch auf Cm (34 μg/mL) resistente Platte bei 30 °C ab.
- Übertragen Sie die oben genannten positiven Transformanten in nicht-resistente LB und kultivieren Sie sie über Nacht bei 42 °C, und isolieren Sie dann einzelne Kolonien auf einer LB-Platte bei 37 °C. Wählen Sie die Kolonie aus, die sowohl für Amp als auch für Cm empfindlich ist. Bei dieser Mutante handelt es sich um die micC-Deletionsmutante SE50336ΔmicC.
- 50336ΔmicC mittels PCR verifizieren.
- Extraktion der genomischen DNA 50336ΔmicC als PCR-Template. Mischen Sie 5 μl 10x PCR-Reaktionspuffer, 2 μl dNTP-Mischung (2,5 mM), 1 μl Primer vmicC-F, 1 μl Primer vmicC-R, 5 μl Template, 1 μl Taq-DNA-Polymerase und 35 μlddH2Ofür die PCR zusammen.
- Verwenden Sie die folgenden PCR-Reaktionsbedingungen: Vordenaturierung bei 94 °C für 4 min; 94 °C für 30 s, 53 °C für 1 min, 72 °C für 1 min für 25 Zyklen und Verlängerung bei 72 °C für 10 min.
4. Aufbau des micC-komplementären Stammes
- Designprimer pBR-micC-F und pBR-micC-R mit NheI- und SalI-Restriktionsstellen.
- Amplifizieren Sie das micC-Gen in voller Länge mit Flankensequenzen unter Verwendung einer PCR-Reaktionsmischung, die 5 μl genomische DNA SE50336 als Matrize, Primer 1 μl pBR-micC-F und 1 μl pBR-micC-R als Primer, 5 μl 10x PCR-Reaktionspuffer, 2 μl dNTP-Gemisch (2,5 mM), 2 μl dNTP-Gemisch (2,5 mM) und 35 μlddH2Oenthält.
- Verwenden Sie die folgenden PCR-Reaktionsbedingungen: Vordenaturierung bei 94 °C für 4 min; 94 °C für 30 s, 52 °C für 50 s, 72 °C für 1 min für 25 Zyklen und Ausfahren bei 72 °C für 10 min. Reinigen und gewinnen Sie das PCR-Produkt zurück.
- Das PCR-Produkt bzw. das Plasmid pBR322 werden unter Verwendung des Restriktionsenzyms NheI und SalI aufgeschlossen und unter Verwendung der T4-Ligase bei 16 °C über Nacht ligiert, um das Plasmid pBR322-micC zu erhalten.
- Transformieren Sie pBR322-micC in die SE50336ΔmicC-kompetenten Zellen und screenen Sie die positive Transformante, um den komplementären Stamm SE50336ΔmicC/pmicC zu erhalten. Extraktion des Plasmids pBR322-micC aus komplementärem Stamm und Verifizierung durch Restriktionsenzymaufschluss und Sequenzierung.
5. RNA-Isolierung und quantitative real-time PCR
- Kultur SE50336, 50336ΔmicC und 50336ΔmicC/pmicC in LB-Medium über Nacht bei 24 °C mit 180 U/min Schüttelkultivierung auf einen OD600 von 2,0. Sammeln Sie die Bakterienkultur durch Zentrifugation bei 13000 U/min für 2 min.
- Extrahieren Sie die Gesamt-RNA mit dem TRIzol-Reagenz. Inkubieren Sie 50 μl isolierte RNA mit 2 μl DNaseI und 6 μl 10x Puffer bei 37 °C für 30 min, um die DNA zu entfernen. Bestimmen Sie die RNA-Menge, indem Sie 1 μl RNA-Probe in ein Mikrospektralphotometer pipettieren.
- Synthese von cDNA
- Verwenden Sie 1 μg Gesamt-RNA für die cDNA-Synthese in 20 μl des reversen Transkriptionsreaktionssystems (4 μl 5x-Puffer, 1 μl RT-Enzymmischung, 1 μl RT-Primermischung, 10 μl Gesamt-RNA und 4 μlddH2O). Über dem Reaktionssystem bei 37 °C für 15 min und dann bei 85 °C für 5 s inkubieren.
- Design-Primer basierend auf der Sequenz der Zielgene ompA, ompC und ompD. Führen Sie eine reverse Transkriptions-PCR mit einem RT-Reagenz-Kit durch. Die PCR-Reaktionskomponenten enthalten 2,5 μL 10x PCR-Reaktionspuffer, 1 μL dNTP-Gemisch (2,5 mM), 1 μL Zielgen-Primer (ompA, ompC oder ompD), 2,5 μL Template, 0,5 μL Taq-DNA-Polymerase und 17,5 μL ddH2O.
- Verwenden Sie die folgenden PCR-Reaktionsbedingungen: Vordenaturierung bei 94 °C für 4 min; 94 °C für 30 s, 60 °C für 1 min, 72 °C für 1 min für 25 Zyklen und Verlängerung bei 72 °C für 10 min.
- Führen Sie eine real-time PCR mit dem SYBR green RT-PCR Kit in einem RT-PCT-Gerät in dreifacher Ausführung durch.
- Verwenden Sie die folgenden PCR-Reaktionskomponenten: 10 μL 2x SYBR-Puffer, 0,4 μL Forward-Primer bzw. Reverse-Primer, 0,4 μL RoxDye II, 2 μL cDNA und 6,8 μL RNase-freiesH2O.
- Verwenden Sie die folgenden PCR-Reaktionsbedingungen:Vordenaturierung bei 95 °C für 1 min für einen Zyklus; 95 °C für 5 s, 60 °C für 34 s für 40 Zyklen.
- Normalisieren Sie alle Daten auf das endogene Referenzgen gyrA. Verwenden Sie die 2-Δ Δ CT-Methode zur Datenquantifizierung15.
6. Virulenz-Assays
- Kultur SE50336, 50336ΔmicC und 50336ΔmicC/pmicC in LB mittlerer bis früher stationärer Phase (OD600 von 2-3) bei 24 °C, Ernte durch Zentrifugation und Verdünnung auf geeignete KBE mL-1 in sterilem PBS.
- Bei Mäuseinfektionen werden die kultivierten Stämme auf 10 KBE/200 μl, 102 KBE/200 μl und 103 KBE/200 μl Gradientenresuspensionen verdünnt. Infizieren Sie Gruppen von fünf 6-8 Wochen alten Balb/c-Mäusen pro Stamm durch subkutane Injektion. Injizieren Sie der Kontrollgruppe 200 μl physiologische Kochsalzlösung.
- Bei Hühnerinfektionen werden mehr als drei Stämme auf 107 KBE/200 μl, 108 KBE/200 μl und 109 KBE/200 μl Gradientenresuspensionen verdünnt. Infizieren Sie Gruppen von zwanzig 1 Tag alten Hühnern pro Stamm durch subkutane Injektion.
- Überwachen Sie täglich Anzeichen von Krankheiten und Todesfällen von Versuchstieren. Berechnen Sie die LD50 (mediane letale Dosis) 14 Tage nach der Infektion, wie zuvor beschrieben16. Verarbeiten Sie die Daten mit einer Datenanalysesoftware.
- Sammeln Sie in Infektionsgruppen das Herz, die Leber, die Milz, die Lunge und die Niere von frisch verstorbenen Küken. Wiegen Sie 0,5 g der oben genannten Tücher separat ab und mahlen Sie sie steril. Mahlproben nach und nach verdünnen, auf LB-Platte verteilen und 8-10 h bei 37 °C kultivieren. Notieren Sie die Menge der Salmonella-Stämme , die im Kükengewebe besiedelt sind.
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Representative Results
Konstruktion der Mutante 50336Δ micC und des komplementären Stammes 50336Δ micC /p micC
Das Ergebnis des micC-Genklons zeigte, dass dieses Gen aus 109 bp besteht und zu 100% mit dem von S identisch ist . Typhimurium. Basierend auf den Sequenzdaten konnten die Deletionsmutante 50336ΔmicC und die komplementäre Mutante 50336ΔmicC/pmicC erfolgreich konstruiert werden. Im Detail zeigten die Sequenzierungsergebnisse, dass eine 1,1 kb cm Widerstandskassette amplifiziert und für die Konstruktion der 1. Rekombinante verwendet wurde. Die 1. rekombinante 50336ΔmicC::cat wurde mittels PCR unter Verwendung der Primer vmicC-F und vmicC-R mit einer erwarteten Bandengröße von etwa 1200 bp PCR-Produkten mit Cm-Insertion im Vergleich zu 279 bp PCR-Produkten im Wildtypstamm validiert (Abbildung 1). In der zweiten Rekombination wurde die Cm-Kassette durch pCP20 eliminiert. Die PCR-Ergebnisse in Kombination mit der Sequenzierung bestätigten, dass die isogene micC-Mutante erfolgreich konstruiert und als 50336ΔmicC benannt wurde (Abbildung 1).
MicC reguliert die Expression von ompA-, ompC- und ompD-Genen
Um die Zielstrukturen von MicC zu bestimmen, wurde die Expression der ompA-, ompC- und ompD-Gene in den SE-Stämmen 50336, 50336ΔmicC und 50336ΔmicC/p micC mittels quantitativer Echtzeit-PCR unter Verwendung von gyrA als normalisierendem internen Standard analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass die Transkription von ompA und ompC in 50336ΔmicC etwa um das 2,2- und 3-fache im Vergleich zum Wildtyp-Stamm zunahm, während die ompD in 50336ΔmicC leicht (1,3-fach) erhöht war als im Wildtyp-Stamm (Abbildung 2). Es zeigte sich, dass micC die Expression von ompA, ompC und ompD unterdrücken kann. OmpA war wahrscheinlich ein potenziell neues Zielgen, das direkt von micC reguliert wird.
Durch das Löschen von micC wird S verbessert. Enteritidis-Virulenz bei Mäusen und Hühnern
Wir führten LD50 Assays durch, um den Einfluss der Deletion von micC auf S zu quantifizieren. Enteritidis-Virulenz bei Mäusen und Hühnern. Nachdem wir 6-8 Wochen alte Balb/c-Mäuse mit 103 KBE von jedem der drei Stämme infiziert hatten, beobachteten wir, dass die meisten Mäuse, die mit 50336ΔmicC infiziert waren, 48 Stunden nach der Infektion Müdigkeit, Appetitlosigkeit oder Durchfall zeigten und 96 Stunden nach der Infektion nacheinander zu sterben schienen. Während die Mäuse, die mit dem WT-Stamm und 50336ΔmicC/pmicC infiziert waren, 72 Stunden nach der Infektion die oben genannten Symptome zeigten und 120 Stunden nach der Infektion tot waren. Die LD50s wurden 7 Tage nach der Infektion berechnet. Die Ergebnisse zeigten, dass die LD50 des WT-Stammes 50336, 50336ΔmicC und 50336ΔmicC/pmicC für Mäuse 12,59, 5,01 bzw. 19,95 KBE betrug. Es zeigte sich, dass sich die Virulenz der Mutante 50336ΔmicC im Vergleich zu WT in Mäusen um das 2,5-fache erhöhte (Tabelle 3). Nach der Infektion von 1 Tag alten Hühnern mit 109 KBE jedes der drei Stämme zeigten die meisten Hühner 10 Stunden nach der Infektion eine intestinale Hyperämie und Durchfall. Bei einer Infektion mit 108 KBE zeigten die mit 50336ΔmicC infizierten Hühner eine höhere Mortalität im Vergleich zum WT-Stamm und 50336ΔmicC/pmicC. Die LD50s wurden für 14 Tage nach der Infektion berechnet. Die Ergebnisse zeigten, dass die LD 50 der WT-Stämme 50336, 50336ΔmicC und 50336ΔmicC/pmicC für Hühner 1,13×109, 1,55×10 8 bzw.2,54×10 8 KBE betrugen. Es zeigte sich, dass die Deletion von micC auch die Virulenz von S erhöhte. Enteritidis bei Hühnern. Alle drei Stämme von S. Enteritidis wurden aus Leber, Milz und Blinddarm der infizierten Hühner gewonnen.
Abbildung 1: PCR-Verifikation der 50336ΔmicC-Mutanten mit den Primern vmicC-F und vmicC-R. Ein 280 bp PCR-Produkt wurde erhalten, wenn das Wildtyp-Genom 50336 als Vorlage diente (Spur 1). Wenn das Cm-Kassettengen in das Genom von S. eingefügt wurde. Enteritidis, die 1. rekombinante 50336Δmic::cat wurde mittels PCR verifiziert und ein 1100 bp PCR-Produkt erhalten (Spur 2). Das Cm-Kassettengen von 50336Δ mic::cat wurde durch Einführung des FLP-Rekombinase-exprimierenden Vektors pCP20 herausgeschnitten und das 2. rekombinante 50336Δ-mic wurde mittels PCR (Spur 3) erhalten und verifiziert. M: molekularer Massenmarker. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Faltungsänderungen des mRNA-Niveaus der ompA-, ompC- und ompD-Gene wurden in der Mutante 50336 Δ mic und dem komplementären Stamm 50336Δ mic/pmic mittels quantitativer RT-PCR im Vergleich zum Wildtypstamm bestimmt. Die Untersuchungsergebnisse wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt. Für die Datenquantifizierung wurde die 2-ΔΔCT-Methode verwendet. *Zeigt einen statistisch signifikanten Unterschied zum Wildtyp-Stamm an (p<0,05) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Stämme/Plasmide | Charaktereigenschaften | Referenzen |
| Stämme | ||
| CMCC(B)50336 | Salmonella enterica serovar Enteritidis Wildtyp | NICPBP, China |
| 50336ΔmicC | micC-defiziente Mutante | Diese Studie |
| 50336ΔmicC/pmicC | 50336Δ micC mit pBR-micC (Ampr) | Diese Studie |
| Plasmide: | ||
| pKD3 | cmr; Cm-Kassettenplatte | [13] |
| pKD46 | Ampr, λExpression der Rekombinase | [13] |
| pCP20 | Amp r, Cmr; Flp-Rekombinase-Expression | [13] |
| pBR-micC | pBR322 trägt das vollständige micC-Gen (Ampr) | Diese Studie |
| pGEM-T Einfach | Klon-Vektor, Ampr | Takara |
| pMD19 T-einfach | Klon-Vektor, Ampr | Takara |
Tabelle 1. Bakterienstämme und Plasmide, die in dieser Studie verwendet wurden.
| Fibel | Sequenz (5'-3') | Produktgröße (bp) | ||||||
| micC-F | TGTCAGGAAAGACCTAAAAAGAGATGTTACCGTTTAATTCAATAATTAATTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG | 1114 | ||||||
| micC -R | TGGAAATAAAAAAAGCCCGAACATCCGTTCGGGCTTGTCAATTTATACCATATGAATATCCTCCTTAG | |||||||
| vmicC -F | AGCGAGTTGACGTTAAAACGTTAT | 279/140 | ||||||
| vmicC -R | TTCGTTCGGGCTTGTCAATTTATA | |||||||
| pBR-micC-F | CAGGCTAGCCACTTTATGTACAATGACATACGTCAC | 434 | ||||||
| pBR-micC-R | CAGGTCGACAAATATTCTAAGGATTAACCTGGAAAC | |||||||
| ompA-F | ACTGAACGCCCTGAGCTTTA | 177 | ||||||
| ompA-R | ACACCGGCTTCATTCACAAT | |||||||
| ompC-F | AAAGTTCTGCGCTTTGTTGG | 187 | ||||||
| ompC-R | CGCTGACGAACACCTGTATG | |||||||
| ompD-F | ACGGTCAGACTTCGCATAGG | 184 | ||||||
| ompD-R | TGTTGCCACCTACCGTAACA | |||||||
| gyrA-F | GCATGACTTCGTCAGAACCA | 278 | ||||||
| gyrA-R | GGTCTATCAGTTGCCGGAAG | |||||||
Tabelle 2. In dieser Studie verwendete Primer
| Stämme | LD50 für Mäuse (KBE) | Falzverstärkung | LD50 für Hühner (KBE) | Falzverstärkung |
| S. enteritidis 50336 | 12.59 | 1 | 1.13×109 | 1 |
| 50336ΔmicC | 5.01 | 2.51 | 1.55×108 | 7.29 |
| 50336Δ micC/pmicC | 19.95 | 0.63 | 2.54×108 | 4.45 |
| Negativkontrolle | 0 | / | 0 | / |
Tabelle 3. Virulenzeigenschaften von S. Enteritidis 50336-Stämme bei Mäusen und Hühnern
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Discussion
S. Enteritidis ist ein wichtiger fakultativer intrazellulärer Erreger, der junge Hühner infizieren kann und Symptome von Enteritis bis hin zu systemischer Infektion und Tod hervorruft17,18. Darüber hinaus verursacht S. Enteritidis latente Infektionen bei erwachsenen Hühnern, und chronische Träger kontaminieren Geflügelprodukte, was beim Menschen zu lebensmittelbedingten Infektionen führt19. Der pathogene Mechanismus von S. Enteritidis muss noch weiter erforscht werden. Bisher wurde festgestellt, dass einige sRNAs wie IsrJ, SroA und IsrM die Virulenz von Salmonellen beeinflussen 20,21,22,23. Das nicht-kodierende kleine RNA micC-Gen wurde in vielen Enterobakterien wie Escherichia coli, Salmonella Typhimurium, Salmonella Bongori und Shigella flexneri identifiziert 6,7,24. Hier fanden wir heraus, dass die Sequenz von micC in S. Enteritidis 50336 war derselbe wie der in S. Typhimurium. Dies deutet darauf hin, dass MicC eine konservative sRNA in Enterobakterien ist.
Es sollte untersucht werden, ob MicC die Virulenz in S. Enteritidis für Tiere und die Identifizierung von MicC-Targets haben wir die Deletionsmutante 50336ΔmicC und die komplementäre Mutante 50336ΔmicC/p micC konstruiert, diemicC erfolgreich exprimieren. Die Ergebnisse der qRT-PCR deuten darauf hin, dass micC die Expression von ompA und ompC unterdrücken kann. OmpA ist wahrscheinlich ein potenzielles neues Ziel von MicC. Die sRNA RybB konnte die Synthese von OmpA durch Basenpaarung mit den 5'-untranslatierten Regionen (5'-UTRs) der Ziel-ompA-mRNA 25 unterdrücken. Die MicA-sRNA ermöglicht auch den schnellen Zerfall der ompA-mRNA durch Antisense-Paarung, ähnlich wie RybB25,26. Ob MicC den ähnlichen Regulationsmechanismus zur Regulierung von ompA nutzt, ist nicht bekannt und muss in naher Zukunft untersucht werden. In E. coli erhöhte die Deletion von MicC die Expression von ompC um das 1,5- bis 2-fache. Weitere Studien zeigten, dass MicC die Bindung des Ribosoms an die ompC mRNA 5' leader6 hemmt. Darüber hinaus stellte Pfeiffer fest, dass OmpC die Hauptziele von MicC7 waren. Es wird angenommen, dass MicC ompC in einem ähnlichen Mechanismus in S reguliert. Enteritidis mit dem in E. coli und S. Typhimurium. Neben OmpA und OmpC konnte MicC auch die Expression von OmpD unterdrücken. Das Ergebnis zeigte, dass die Transkription von ompD in 50336ΔmicC leicht (1,3-fach) erhöht war als im Wildtyp-Stamm. Basierend auf den oben genannten Ergebnissen konnte gezeigt werden, dass MicC die Transkription mehrerer Ziel-mRNAs (ompA, ompC und ompD) in S unterdrücken kann. Enteritidis. MicC ist nicht die einzige sRNA, die mehrere Ziele regulieren kann. Einige sRNAs wie RybB, DsrA, GcvB, RNAIII und RyhB wirken auch auf mehrere Ziele 25,27,28,29,30,31. Da sRNAs Targets durch einen Basenpaarungsmechanismus regulieren, um sRNA-Target-Interaktionenzu erreichen 32, ist es möglich, dass konservierte Subregionen oder Domänen von sRNAs an verschiedene Targets binden können.
Die äußere Membran gramnegativer Bakterien ist eine wichtige Schnittstelle in der Interaktion zwischen Wirt und Krankheitserreger. OmpA, OmpC und OmpD sind wichtige und reichlich vorhandene Proteine der äußeren Membran. OmpC spielt eine wichtige Rolle in abscheulichen Umgebungen, wie z.B. im Darm6. OmpD ist an der Adhärenz an menschlichen Makrophagen und Darmepithelzellen beteiligt12. Es wurde angenommen, dass die durch die MicC-Deletion verursachte Veränderung der OMP-Expression die Virulenz von S beeinflussen könnte . Enteritidis und MicC akkumulierten in stationären Zellen und induzierten insbesondere unter Wachstumsbedingungen die Virulenzgene Salmonella SPI-1 und SPI-27. Es wird angenommen, dass MicC mit der Virulenz von Salmonellen zusammenhängt, während Experimente mit Tierinfektionen durchgeführt wurden, um die Virulenz von MicC nachzuweisen. Die Ergebnisse zeigten, dass die LD50 der Mutanten 50336ΔmicC für 1 Tag alte Hühner und 6 Wochen alte Balb/c-Mäuse im Vergleich zum Wildtyp-Stamm deutlich degressiv waren. Es zeigte sich, dass die Deletion von micC die Virulenz von S erhöhte. Enteritidis bei Mäusen und Hühnern. Es wird angenommen, dass die Erhöhung der OmpA-, OmpC- und OmpD-Expression, die durch die MicC-Deletion hervorgerufen wird, zu einer Virulenzverstärkung in S führt. Enteritidis.
MicC reguliert S negativ. Die Virulenz von Enteritidis in Mäusen und Hühnern beruht wahrscheinlich auf einer Herunterregulierung der Expression der wichtigsten äußeren Membranproteine OmpA und OmpC.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Studie wurde durch Zuschüsse der Chinese National Science Foundation (Nr. 31972651 und 31101826), der Jiangsu High Education Science Foundation (Nr. 14KJB230002), des State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology (Nr. SKLVBF201509) und des Nature Science Foundation Grant of Yangzhou (Nr. YZ2014019) unterstützt, einem Projekt, das durch die Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD) finanziert wird.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| dextrose | Sangon Biotech | A610219 | for broth preparation |
| DNA purification kit | TIANGEN | DP214 | for DNA purification |
| Ex Taq | TaKaRa | RR01A | PCR |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017608 | for broth preparation |
| K2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 20032116 | for broth preparation |
| L-Arabinose | Sangon Biotech | A610071 | λ-Red recombination |
| Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP106 | plasmid extraction |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | for broth preparation |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | for broth preparation |
| PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser | TaKaRa | RR047 | qRT-PCR |
| SYBRR Premix Ex Taq II | TaKaRa | RR820 | qRT-PCR |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202 | Ligation |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | for broth preparation |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | for broth preparation |
| centrifuge | Eppendorf | 5418 | centrifugation |
| Electrophoresis apparatus | Bio-Rad | 164-5050 | Electrophoresis |
| Electroporation System | Bio-Rad | 165-2100 | for bacterial transformation |
| Spectrophotometer | BioTek | Epoch | Absorbance detection |
| Real-Time PCR system | Applied Biosystems | 7500 system | qRT-PCR |
References
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