Summary
λ-적색 매개 재조합 시스템을 사용하여 작은 비암호화 RNA micC의 결실 돌연변이를 생성했습니다.
Abstract
비코딩 소형 RNA(sRNA)는 전사 후 수준에서 유전자 발현을 조절하는 새로운 인자입니다. 대장균(Escherichia coli)과 살모넬라 티피무리움(Salmonella Typhimurium)에 알려진 일종의 sRNA MicC는 외막 단백질의 발현을 억제할 수 있습니다. 살모넬라 엔테리티디스에서 micC의 조절 기능을 추가로 조사하기 위해, 우리는 살모넬라 엔테리티디스 균주 50336에서 micC 유전자를 클로닝한 다음, λ 적색 기반 재조합 시스템에 의해 돌연변이 50336Δ micC를 구성하고 micC를 발현하는 재조합 플라스미드 pBR322를 운반하는 보완된 돌연변이 50336Δ micC/p micC를 구성했습니다. qRT-PCR 결과는 50336Δ micC에서 ompD의 전사가 야생형 균주보다 1.3배 더 높은 반면, 50336ΔmicC에서 ompA 및 ompC의 전사 는 야생형 균주보다 2.2배 및 3배 더 높았다. 이들은 micC가 ompA 및 ompC의 발현을 억제한다는 것을 나타내었다. 다음 연구에서, 50336ΔmicC의 병원성은 6주령의 Balb/c 마우스와 1일령의 닭 모두를 감염시켜 검출되었다. 그 결과, 6주령 Balb/c 마우스에 대한 야생형 균주 50336의LD50, 돌연변이체 50336ΔmicC 및 50336Δ micC/pmicC가 각각 12.59 CFU, 5.01 CFU 및 19.95 CFU인 것으로 나타났다. 1 일 된 닭에 대한 균주의LD50은 각각 1.13 x 109 CFU, 1.55 x 10 8 CFU 및 2.54 x 108 CFU였다. micC의 결실이 S의 독성을 증가시킨다는 것을 나타내었다. Enteritidis는 외막 단백질의 발현을 조절하여 생쥐와 닭에서 발생합니다.
Introduction
비암호화 소형 RNA(sRNA)는 길이가 40-400 뉴클레오티드로, 일반적으로 단백질을 암호화하지 않지만 박테리아 염색체 1,2,3에서 독립적으로 전사될 수 있습니다. 대부분의 sRNA는 유전자 코딩 영역 사이의 유전자 간 영역(IGR)에 암호화되어 염기쌍 작용을 통해 표적 mRNA와 상호 작용하고 전사 후 수준에서 표적 유전자 발현을 조절합니다 4,5. 물질 대사, 외막 단백질 합성, 정족수 감지 및 독성 유전자 발현에서 중요한 조절 역할을 한다5.
MicC는 대장균 및 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피무리움에 존재하는 109-뉴클레오티드 소RNA 전사체로, OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 및 Omp36 6,7,8,9와 같은 다중 외막 단백질 발현을 조절할 수 있습니다. MicC는 시험관 내에서 ompC mRNA 리더에 대한 리보솜 결합을 억제하여 OmpC의 발현을 조절하며 대장균6에서 기능을 위해 Hfq RNA 샤페론이 필요합니다. 살모넬라 티피무리움(Salmonella Typhimurium)에서 MicC는 코딩 서열(코돈 23-26) 내의 ≤12-bp RNA 이중체를 통해 ompD mRNA를 침묵시킨 다음 내핵분해 mRNA7을 불안정화시킵니다. 이 조절 과정은 샤페론 단백질 Hfq10에 의해 지원됩니다. OmpC는 장과 같이 영양소와 독소 농도가 높은 환경에서 중요하다고 생각되는 풍부한 외막 단백질입니다6. OmpD 포린은 살모넬라 티피무리움에서 가장 풍부한 외막 단백질이며 전체 세포 단백질11의 약 1%를 차지합니다. OmpD는 인간 대식세포와 장 상피세포에 대한 순응에 관여한다12. MicC는 또한 OmpC 및 OmpD 포린 모두의 발현을 억제합니다. MicC는 독성을 조절할 수 있다고 생각됩니다. MicC에 의해 조절되는 새로운 표적 유전자를 탐색하고 micC의 독성 조절 기능을 연구하기 위해 살모넬라 엔테리티디스(SE) 균주 50336에서 micC 유전자를 복제한 다음 돌연변이 50336ΔmicC와 보완된 돌연변이 50336ΔmicC/p micC를 구성했습니다. 새로운 표적 유전자를 qRT-PCR로 스크리닝하였다. 50336ΔmicC의 독성은 생쥐 및 닭 감염에 의해 검출되었다.
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Protocol
모든 실험은 국립연구위원회(National Research Council)의 실험동물 관리 및 사용 가이드(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에 따라 수행되었다. Yangzhou University의 동물 관리 및 사용위원회는 동물에 적용된 모든 실험 및 절차를 승인했습니다 (SYXK2016-0020).
1. 박테리아 균주, 플라스미드 및 배양 조건
- 표 1에 열거된 박테리아 및 플라스미드를 사용한다.
- 적절한 경우 50μg/mL 암피실린(Amp)이 있는 상태에서 37°C의 LB 배지 또는 LB 한천 플레이트에서 박테리아를 배양합니다.
- 온도에 민감한 플라스미드를 함유하는 배양 균주는 30°C에서 결실 돌연변이체 구축을 위해 사용된다.
2. S 의 micC 유전자 복제 Enteritidis 균주 50336
- S의 micC 유전자의 상류 및 하류 서열에 기초한다 . 티피무리움 균주 SL1344, 디자인 프라이머 vmicC-F 및 vmicC-R se50336 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 PCR로 micC 유전자를 포함하는 단편을 증폭하였다.
- PCR을 위해 5 μL의 10x PCR 반응 완충액, 2 μL의 dNTP 혼합물 (2.5 mM), 1 μL의 vmicC-F 및 vmicC-R 프라이머, 5 μL의 주형, 1 μL의 Taq DNA 중합효소 및 35 μL의ddH2O를 함께 혼합한다.
- 다음 PCR 반응 조건을 사용하십시오 : 94 °C에서 4 분 동안 사전 변성; 94°C에서 30초, 53°C에서 1분, 72°C에서 1분간 25사이클, 72°C에서 10분 동안 연장.
- PCR 산물을 염기서열 분석하여 micC 유전자 염기서열을 얻었다.
3. micC 결실 돌연변이체의 구성
참고: 살모넬라 엔테리티디스 균주 50336의 micC-음성 돌연변이는 이전에 설명한 바와 같이 λ-적색 매개 재조합을 사용하여 구성되었습니다13,14. 사용된 프라이머는 표 2에 열거되어 있다.
- micC 유전자의 상동성 단편을 포함하는 클로람페니콜 카세트를 증폭합니다.
- micC 유전자의 5' 및 3'로부터의 50 bp 상동성 확장을 포함하여, 플라스미드 pKD3으로부터 클로람페니콜 (Cm) 카세트를 증폭하기 위해 micC-F 및 micC-R 프라이머를 설계한다.
- PCR 주형으로 pKD3 플라스미드를 추출합니다.
- PCR 반응 혼합물로서 10x PCR 반응 완충액 5 μL, dNTP 혼합물 (2.5 mM) 2 μL, micC-F 및 micC-R 프라이머 각각 1 μL, 템플릿 5 μL, Taq DNA 중합효소 1 μL 및 ddH2O35 μL를 함께 혼합한다
- 다음 PCR 반응 조건으로 Cm 카세트를 증폭한다: 94°C에서 4분 동안 예비변성; 1 분 동안 94 °C, 1 분 동안 52 °C, 10 사이클 동안 1 분 동안 72 °C; 94°C에서 1분, 63°C에서 1분, 72°C에서 1분, 25사이클, 72°C에서 10분 연장.
- PCR 산물의 크기를 아가로스 겔 전기영동으로 검출합니다. DNA 젤 회수 키트로 PCR 산물을 정제 및 회수하고 분광 광도계로 DNA 농도를 결정합니다.
주의: PCR은 두 번 수행해야 합니다. 첫 번째 PCR 산물을 1:200의 비율로 희석하여 pKD3 플라스미드에 의한 추가 재조합의 간섭을 제거하기 위해 2차 PCR의 주형으로 사용했습니다.
- 1차 재조합 균주 50336ΔmicC::cat 구축
- 100μL의 SE50336 컴피턴트 세포와 5μL의 pKD46 플라스미드를 균일하게 혼합하고 30분 동안 얼음에서 배양합니다. 상기 혼합물을 42°C에서 90초 동안 열 충격하고, 혼합물을 2분 동안 얼음으로 빠르게 옮겨 pKD46 플라스미드를 SE50336으로 변형시켰다. Amp(50μg/mL) 내성 플레이트에서 30°C에서 밤새 배양하여 양성 콜로니를 스크리닝합니다.
- SE50336/pKD46 액체 배양액에 30mM L-아라비노스를 첨가하고, 30°C에서 1시간 동안 진탕 배양하여 재조합효소 발현을 유도한다. 그런 다음 유능한 세포를 준비하십시오.
- 정제된 PCR 산물 100ng(단계 3.1)과 SE50336/pKD46 컴피턴트 세포 40μL를 전기 충격 컵(예: Bio-Rad)에 혼합합니다. 전압 1.8 kV, 펄스 25 μF 및 저항 200 Ω의 매개 변수로 감전 변환을 수행하십시오.
- 전기변환 후, 혼합물을 1 mL의 SOC 배지로 옮기고, 150 rpm 및 30°C에서 1시간 동안 진탕 배양한다. 그런 다음 혼합물을 Cm(34μg/mL) 내성 LB 플레이트에 바르고 37°C에서 밤새 배양하여 양성 콜로니를 스크리닝합니다.
- 위의 양성 콜로니를 42°C에서 2시간 동안 배양합니다. Amp(50μg/mL)에 민감하지만 Cm(34μg/mL)에 내성이 있는 콜로니를 37°C에서 하룻밤 동안 스크리닝하여 pKD46이 없는 1차 재조합 균주를 얻었습니다.
- 1차 재조합 균주 50336ΔmicC::Cat을 식별합니다.
- PCR 템플릿으로 50336ΔmicC::Cat 게놈 DNA를 추출합니다. 단계 2.1에서와 동일한 PCR 반응 성분을 사용한다. 단계 2.1과 동일한 조건으로 PCR 반응을 수행한다.
- 아가로스 겔 전기영동에 의해 PCR 산물의 크기를 검출하고 PCR 산물을 시퀀싱합니다.
- 결실 돌연변이체 50336ΔmicC를 구축한다.
- 플라스미드 pCP20 100ng을 전압 1.8kV, 펄스 25μF 및 저항 200 Ω의 매개변수로 50336ΔmicC::Cat competent 세포 40μL에 전기증착하여 Amp(50μg/mL) 및 Cm(34μg/mL) 30°C에서 내성 플레이트 모두에서 양성 형질전환체를 스크리닝합니다.
- 위의 양성 형질전환체를 비내성 LB로 옮기고 42°C에서 밤새 배양한 다음, 37°C에서 LB 플레이트 상에서 단일 콜로니를 분리합니다. Amp와 Cm 모두에 민감한 콜로니를 선택합니다. 이 변이체는 micC 결실 변이체 SE50336ΔmicC이다.
- PCR로 50336ΔmicC 를 확인합니다.
- PCR 주형으로 50336ΔmicC 게놈 DNA를 추출합니다. 5 μL의 10x PCR 반응 완충액, 2 μL의 dNTP 혼합물 (2.5 mM), 1 μL의 프라이머 vmicC-F, 1 μL의 프라이머 vmicC-R, 5 μL의 주형, 1 μL의 Taq DNA 중합효소 및 35 μL의ddH2O를 함께 혼합합니다.
- 다음 PCR 반응 조건을 사용하십시오 : 94 °C에서 4 분 동안 사전 변성; 94°C에서 30초, 53°C에서 1분, 72°C에서 1분, 25사이클, 72°C에서 10분 연장.
4. micC 보완 변형의 구성
- NheI 및 SalI 제한 부위가 있는 pBR-micC-F 및 pBR-micC-R 프라이머를 설계합니다.
- 5 μL의 SE50336 게놈 DNA를 주형으로, 프라이머 1 μL의 pBR-micC-F 및 1 μL의 pBR-micC-R을 프라이머로 포함하는 PCR 반응 혼합물, 5 μL의 10x PCR 반응 완충액, 2 μL의 dNTP 혼합물 (2.5 mM), 2 μL의 dNTP 혼합물 (2.5 mM) 및 35 μL의ddH2O를 포함하는 PCR 반응 혼합물을 사용하여 플랭크 서열로 전장 micC 유전자를 증폭합니다.
- 다음의 PCR 반응 조건을 사용하십시오: 94°C에서 4분 동안 예비변성; 94°C에서 30초, 52°C에서 50초, 72°C에서 1분 동안 25사이클, 72°C에서 10분 동안 연장. PCR 산물을 정제하고 회수합니다.
- PCR 산물 및 플라스미드 pBR322를 각각 제한효소 NheI 및 SalI를 사용하여 분해하고, 이를 T4 리가제를 사용하여 하룻밤 동안 16°C에서 라이게이팅하여 플라스미드 pBR322-micC를 얻었다.
- pBR322-micC를 SE50336ΔmicC 컴피턴트 세포로 형질전환하고, 양성 형질전환체를 스크리닝하여 보완된 균주 SE50336ΔmicC/pmicC를 얻었다. 보완된 균주에서 플라스미드 pBR322-micC를 추출하고 제한 효소 분해 및 시퀀싱으로 확인합니다.
5. RNA 분리 및 정량적 Real-Time PCR
- SE50336, 50336ΔmicC, 및 50336ΔmicC/pmicC 를 LB 배지에서 24°C에서 하룻밤 동안 180rpm으로 진탕 배양하여OD600 2.0으로 배양하였다. 13000rpm에서 2분 동안 원심분리하여 세균 배양액을 수집합니다.
- TRIzol 시약을 사용하여 전체 RNA를 추출합니다. 분리된 RNA 50μL와 DNaseI 2μL 및 10x 완충액 6μL를 37°C에서 30분 동안 배양하여 DNA를 제거합니다. 1 μL의 RNA 시료를 마이크로 분광 광도계에 피펫팅하여 RNA 양을 측정합니다.
- cDNA의 합성
- 20μL의 역전사 반응 시스템(4μL의 5x 완충액, 1μL의 RT 효소 혼합물, 1μL의 RT 프라이머 혼합물, 1μL의 총 RNA 및 4μL의ddH2O)에서 cDNA 합성을 위해 총 RNA 1μg을 사용합니다. 37°C에서 15분 동안 상기 반응계를 배양한 다음 85°C에서 5초 동안 배양합니다.
- 표적 유전자 ompA, ompC 및 ompD의 서열을 기반으로 프라이머를 설계합니다. RT 시약 키트를 사용하여 역전사-PCR을 수행합니다. PCR 반응 성분은 2.5 μL의 10x PCR 반응 완충액, 1 μL의 dNTP 혼합물 (2.5 mM), 1 μL의 표적 유전자 (ompA, ompC 또는 ompD) 프라이머, 2.5 μL의 주형, 0.5 μL의 Taq DNA 중합효소 및 17.5 μL의 ddH2O를 함유한다.
- 다음 PCR 반응 조건을 사용하십시오 : 94 °C에서 4 분 동안 사전 변성; 94°C에서 30초, 60°C에서 1분, 72°C에서 1분 동안 25사이클, 72°C에서 10분 동안 연장.
- RT-PCT 기기에서 SYBR green RT-PCR 키트를 사용하여 Real-Time PCR을 3회 수행합니다.
- 다음의 PCR 반응 성분을 사용하십시오: 10 μL의 2x SYBR 완충액, 0.4 μL의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머, 0.4 μL의 RoxDye II, 2 μL의 cDNA 및 6.8 μL의 RNase 유리H2O.
- 다음의 PCR 반응 조건을 사용하십시오: 1 사이클 동안 95°C에서 1분 동안 예비변성; 95 °C에서 5 초, 60 °C에서 34 초 동안 40 사이클.
- 모든 데이터를 내인성 참조 유전자 gyrA로 정규화합니다. 데이터 정량화를 위해 2-Δ ΔCT 방법을 사용합니다15.
6. 독성 분석
- SE50336, 50336ΔmicC 및 50336ΔmicC/pmicC 를 24°C에서 LB 배지 내지 초기 정지기(OD600 중 2-3)에서 배양하고, 원심분리에 의해 수확하고, 멸균 PBS에서 적절한 CFU mL-1 로 희석한다.
- 마우스 감염의 경우 배양된 균주를 10 CFU/200 μL, 102 CFU/200 μL 및 103 CFU/200 μL 그래디언트 재현탁으로 희석합니다. 균주당 5마리의 6-8주령 Balb/c 마우스 그룹을 피하 주사로 감염시킵니다. 대조군에 생리식염수 200μL를 주입합니다.
- 닭 감염의 경우, 위의 세 가지 균주를 107 CFU/200 μL, 10 8 CFU/200 μL 및 109 CFU/200 μL 그래디언트 재현탁액으로 희석합니다. 균주 당 20 마리의 1 일 된 닭 그룹을 피하 주사로 감염시킵니다.
- 매일 실험 동물의 질병 및 사망 징후를 모니터링하십시오. 앞서 설명한 바와 같이 감염 후LD50 (치사량 중앙값) 14 d를 계산한다16. 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 처리합니다.
- 감염 그룹에서 갓 죽은 병아리의 심장, 간, 비장, 폐 및 신장을 수집합니다. 위의 조직 0.5g을 따로 따로 달아 멸균 작업으로 분쇄하십시오. 분쇄 샘플을 서서히 희석하고 LB 플레이트에 펴고 37°C에서 8-10시간 동안 배양합니다. 병아리 조직에 서식하는 살모넬라 균주의 양을 기록하십시오.
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Representative Results
돌연변이 50336Δ micC 및 보완 균주 50336Δ micC /pmicC의 구성
micC 유전자 클론 결과는 이 유전자가 109 bp로 구성되어 S의 유전자와 100% 동일함을 나타내는 것으로 나타났다. 티피무리움. 서열 데이터를 기반으로 결실 돌연변이 50336ΔmicC와 보완된 돌연변이 50336ΔmicC/pmicC가 성공적으로 구성되었습니다. 구체적으로, 시퀀싱 결과는 1.1 kb Cm 저항 카세트가 증폭되어 1차 재조합체를 구성하는데 사용되었음을 보여주었다. 1차 재조합 50336ΔmicC::cat은 야생형 균주에서 PCR 산물의 279 bp와 비교하여 Cm 삽입이 있는 PCR 산물의 예상 밴드 크기가 약 1200 bp인 프라이머 vmicC-F 및 vmicC-R을 사용하여 PCR에 의해 검증되었습니다(그림 1). 두 번째 재조합에서, Cm 카세트는 pCP20에 의해 제거되었다. 염기서열 분석과 결합된 PCR 결과는 동종 micC 돌연변이가 성공적으로 구성되고 50336ΔmicC로 명명되었음을 확인했습니다(그림 1).
MicC는 ompA, ompC 및 ompD 유전자 발현을 조절합니다
MicC의 표적을 확인하기 위해 SE 균주 50336, 50336ΔmicC 및 50336ΔmicC/pmicC에서 ompA, ompC 및 ompD 유전자의 발현을 정상화 내부 표준물질로 gyrA를 사용하여 실시간 정량 PCR로 분석했습니다. 그 결과, 50336ΔmicC의 ompA 및 ompC의 전사는 야생형 균주보다 약 2.2배 및 3배 증가한 반면, 50336ΔmicC의 ompD는 야생형 균주보다 약간(1.3배) 증가한 것으로 나타났습니다(그림 2). 이는 micC가 ompA, ompC 및 ompD의 발현을 억제할 수 있음을 나타내었다. OmpA는 아마도 micC에 의해 직접 조절되는 잠재적인 새로운 표적 유전자였을 것입니다.
micC를 삭제하면 S 가 향상됩니다. 생쥐와 닭의 Enteritidis 독성
우리는 S에 대한 micC 삭제의 영향을 정량화하기 위해LD50 분석을 수행했습니다. 생쥐와 닭의 Enteritidis 독성. 6-8주령 Balb/c 마우스에 3가지 균주 각각에 대해 103 CFU를 감염시킨 후, 50336ΔmicC에 감염된 대부분의 마우스가 감염 후 48시간 후에 권태감, 식욕 부진 또는 설사를 나타내고 감염 후 96시간 후에 연속적으로 사망하는 것으로 나타났습니다. WT 균주 및 50336ΔmicC/pmicC에 의해 감염된 마우스는 감염 후 72시간 후에 위와 같은 증상을 나타내었고, 감염 후 120시간 후에 사망하였다. LD50s는 감염 후 7일로 계산되었습니다. 그 결과 마우스에 대한 WT 균주 50336, 50336ΔmicC 및 50336ΔmicC/pmicC의LD50은 각각 12.59, 5.01 및 19.95 CFU인 것으로 나타났습니다. 돌연변이체 50336ΔmicC의 독성이 마우스에서 WT와 비교하여 2.5배 향상되었음을 나타내었다(표 3). 1 일 된 닭에게 3 가지 균주 각각에 대해 109 CFU를 감염시킨 후, 대부분의 닭은 감염 후 10 시간 후에 장 충혈과 설사를 나타냈다. 108 CFU에 감염되었을 때, 50336ΔmicC에 감염된 닭은 WT 균주 및 50336ΔmicC/pmicC에 비해 더 높은 사망률을 보였다. LD50s는 감염 후 14일 동안 계산되었습니다. 그 결과 닭에 대한 WT 균주 50336, 50336ΔmicC 및 50336ΔmicC/pmicC의LD50은 각각 1.13×109, 1.55×108 및 2.54×108 CFU인 것으로 나타났습니다. micC의 결실은 또한 S의 독성을 증가시킨다는 것을 나타내었다. 닭의 Enteritidis. S. Enteritidis의 세 가지 균주는 모두 감염된 닭의 간, 비장 및 맹장에서 회수되었습니다.
그림 1: 프라이머 vmicC-F 및 vmicC-R을 사용한 50336 ΔmicC 돌연변이체의 PCR 검증. 280 bp PCR 산물을 주형으로 하였을 때 야생형 50336 게놈을 수득하였다(레인 1). Cm 카세트 유전자를 S의 게놈에 삽입하였다. Enteritidis, 1차 재조합 50336Δmic::cat을 PCR로 검증하고 1100 bp PCR 산물을 얻었다(레인 2). FLP 재조합효소 발현 벡터 pCP20을 도입하여 50336Δ mic::cat의 Cm 카세트 유전자를 적출하고, 2차 재조합 50336Δmic를 얻어 PCR(레인 3)로 검증하였다. M: 분자 질량 마커. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 야생형 균주와 비교하여 정량적 RT-PCR에 의해 돌연변이 50336 Δ mic 및 보완된 균주 50336Δ mic/p mic 에서 ompA, ompC 및 ompD 유전자 mRNA 수준의 배수 변화가 측정되었습니다. 분석은 삼중으로 수행되었다. 2-ΔΔCT 방법을 데이터 정량화에 사용했습니다. *야생형 균주와 비교하여 통계적으로 유의한 차이를 나타냄(p<0.05) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 균주/플라스미드 | 특성 | 참조 |
| 변종 | ||
| CMCC(비)50336 | 살모넬라 엔테리카 혈청형 엔테리티디스 야생형 | NICPBP, 중국 |
| 50336Δ마이크C | micC 결핍 돌연변이 | 이 연구는 |
| 50336ΔmicC/pmicC | 50336ΔmicC 담지 pBR-micC (Ampr) | 이 연구는 |
| 플라스 미드: | ||
| pKD3 | Cmr; Cm 카세트 테플레이트 | [13] |
| pKD46 | Ampr, λRed 재조합효소 발현 | [13] |
| 피CP20 | 암페어r, Cmr; Flp 재조합효소 발현 | [13] |
| pBR-micC | 전체 micC 유전자를 운반하는 pBR322(Ampr) | 이 연구는 |
| pGEM-T 이지 | 클로닝 벡터, Ampr | 타카라 |
| pMD19 T-심플 | 클로닝 벡터, Ampr | 타카라 |
표 1. 이 연구에 사용된 박테리아 균주 및 플라스미드.
| 입문서 | 시퀀스 (5'-3') | 제품 크기 (bp) | ||||||
| micC-F | TGTCAGGAAAGACCTAAAAAGAGATGTTACCGTTTAATTCAATAATTAATTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG | 1114 | ||||||
| micC -R | TGGAAATAAAAAAAGCCCGAACATCCGTTCGGGCTTGTCAATTTATACCATATGAATATCCTCCTTAG | |||||||
| vmicC -F | AGCGAGTTGACGTTAAAACGTTAT | 279/140 | ||||||
| vmicC -R | TTCGTTCGGGCTTGTCAATTTATA | |||||||
| pBR-micC-F | CAGGCTAGC칵츄타그타카아트가카타크크캉 | 434 | ||||||
| pBR-micC-R | CAGGTCGACAAATATTCTAAGGATTAACCTGGAAAC | |||||||
| 옴pA-F | ACTGAACGCCCTGAGCTTTA | 177 | ||||||
| 옴pA-R | ACACCGGCTTCATTCACAAT | |||||||
| 옴프씨프-F | AAAGTTCTGCGCTTTGTTGG | 187 | ||||||
| ompC-R | CGCTGACGAACACCTGTATG | |||||||
| 옴프DF | ACGGTCAGACTTCGCATAGG | 184 | ||||||
| 옴프D-R | TGTTGCCACCTACCGTAACA | |||||||
| gyrA-F | GCATGACTTCGTCAGAACCA | 278 | ||||||
| 자이라-R | GGTCTATCAGTTGCCGGAAG | |||||||
표 2. 이 연구에 사용된 프라이머
| 변종 | 마우스용LD50 (CFU) | 접기 향상 | 닭 용 LD50 (CFU) | 접기 향상 |
| S. 엔테리티디스 50336 | 12.59 | 1 | 1.13×109 | 1 |
| 50336Δ마이크C | 5.01 | 2.51 | 1.55×108 | 7.29 |
| 50336Δ micC/pmicC | 19.95 | 0.63 | 2.54×108 | 4.45 |
| 음성 대조군 | 0 | / | 0 | / |
표 3. S의 독성 특성 . Enteritidis 50336 균주는 생쥐와 닭에서
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Discussion
에스. Enteritidis는 어린 닭을 감염시킬 수 있는 중요한 통성 세포 내 병원체이며 장염에서 전신 감염 및 사망에 이르기까지 증상을 유발합니다17,18. 또한, S. Enteritidis는 성충에게 잠복 감염을 일으키고 만성 보균자는 가금류 제품을 오염시켜 인간에게 식중독 감염을 일으킨다19. S. Enteritidis의 병원성 메커니즘은 더 자세히 조사되어야 합니다. 현재까지 IsrJ, SroA 및 IsrM과 같은 일부 sRNA는 살모넬라 독성20,21,22,23에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌습니다. 비코딩 소형 RNA micC 유전자는 대장균, 살모넬라 티피무리움, 살모넬라 봉고리 및 시겔라 플렉스네리 6,7,24와 같은 많은 장내세균에서 확인되었습니다. 여기서, 우리는 S에서 micC의 서열을 발견하였다. Enteritidis 50336은 S와 동일했습니다. 티피무리움. 이는 MicC가 장내세균의 보존적 sRNA임을 나타냅니다.
MicC가 S에서 독성을 매개하는지 여부를 조사하기 위해.동물에 대한 Enteritidis를 확인하고 MicC 표적을 식별하여 micC를 성공적으로 발현하는 결실 돌연변이 50336ΔmicC 및 보완된 돌연변이 50336ΔmicC/pmicC를 구축했습니다. qRT-PCR의 결과는 micC가 ompA 및 ompC의 발현을 억제할 수 있음을 나타내었다. OmpA는 아마도 MicC의 잠재적인 새로운 표적일 것입니다. sRNA RybB는 표적 ompA mRNA25의 5' 비번역 영역(5' UTR)과 염기쌍을 이루어 OmpA의 합성을 억제할 수 있습니다. MicA sRNA는 또한 RybB25,26과 유사하게 안티센스 쌍을 이루어 ompA mRNA의 빠른 붕괴를 촉진합니다. MicC가 ompA를 조절하기 위해 유사한 조절 메커니즘을 사용하는지 여부는 알려져 있지 않으며 가까운 장래에 연구되어야 합니다. 대장균에서, MicC의 결실은 ompC의 발현을 1.5배에서 2배로 증가시켰다. 추가 연구에 따르면 MicC는 ompC mRNA 5' 리더6에 대한 리보솜 결합을 억제하는 것으로 나타났습니다. 또한 파이퍼는 OmpC가 MicC7의 주요 목표라는 것을 발견했습니다. MicC는 S에서 유사한 메커니즘으로 ompC를 조절한다고 가정합니다. Enteritidis는 E. coli와 S에서 그 것을 가지고 있습니다.티피무리움. OmpA 및 OmpC 외에도 MicC는 OmpD의 발현을 억제할 수도 있습니다. 그 결과, 50336ΔmicC에서 ompD의 전사가 야생형 균주에서보다 약간 (1.3 배) 증가한 것으로 나타났다. 상기 결과를 바탕으로, MicC가 S 에서 다중 표적 mRNA(ompA, ompC 및 ompD)의 전사 를 억제할 수 있음을 입증하였다.엔테리티디스. MicC는 여러 표적을 조절할 수 있는 유일한 sRNA가 아닙니다. RybB, DsrA, GcvB, RNAIII 및 RyhB와 같은 일부 sRNA는 또한 다중 표적 25,27,28,29,30,31에 대해 작용합니다. sRNA는 염기쌍 메커니즘에 의해 표적을 조절하여 sRNA-표적 상호작용을 달성하기 때문에(32), sRNA의 보존된 서브-영역 또는 도메인이 상이한 표적에 결합할 수 있다.
그람 음성 박테리아의 외막은 숙주-병원체 상호 작용의 핵심 인터페이스입니다. OmpA, OmpC 및 OmpD는 모두 중요하고 풍부한 외막 단백질입니다. OmpC는 장과 같은 가증스러운 환경에서 중요한 역할을 한다6. OmpD는 인간 대식세포와 장 상피세포에 대한 순응에 관여한다12. MicC 결실로 인한 OMP 발현의 변화는 S의 독성에 영향을 미칠 수 있다고 생각되었습니다 . Enteritidis 및 MicC는 고정상 세포에 축적되었으며, 특히 성장 조건 하에서 살모넬라 SPI-1 및 SPI-2 독성 유전자를 유도하였다7. MicC는 살모넬라균의 독성과 관련이 있는 것으로 생각되며, 동물 감염 실험은 MicC의 독성을 검출하기 위해 수행되었습니다. 그 결과, 1일령 닭과 6주령 Balb/c 마우스에 대한 돌연변이체 50336ΔmicC의LD50 이 야생형 균주에 비해 분명히 감소한 것으로 나타났다. micC 의 결실이 S의 독성을 향상시킨다는 것을 나타내 었다. 생쥐와 닭의 Enteritidis. MicC 결실에 의해 유발되는 OmpA, OmpC 및 OmpD 발현의 증가는 S의 독성 향상을 유도하는 것으로 추정된다 . 엔테리티디스.
MicC는 S를 부정적으로 조절합니다. 생쥐와 닭의 Enteritidis 독성은 아마도 주요 외막 단백질인 OmpA 및 OmpC의 발현을 하향 조절함으로써 가능합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국립 과학 재단 (Nos. 31972651 및 31101826), 장쑤 고등 교육 과학 재단 (No.14KJB230002), 수의학 생명 공학 국가 핵심 연구소 (No.SKLVBF201509), 양저우 자연 과학 재단 보조금 (No.YZ2014019), 장쑤 고등 교육 기관의 우선 학업 프로그램 개발 (PAPD)이 자금을 지원하는 프로젝트.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| dextrose | Sangon Biotech | A610219 | for broth preparation |
| DNA purification kit | TIANGEN | DP214 | for DNA purification |
| Ex Taq | TaKaRa | RR01A | PCR |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017608 | for broth preparation |
| K2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 20032116 | for broth preparation |
| L-Arabinose | Sangon Biotech | A610071 | λ-Red recombination |
| Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP106 | plasmid extraction |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | for broth preparation |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | for broth preparation |
| PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser | TaKaRa | RR047 | qRT-PCR |
| SYBRR Premix Ex Taq II | TaKaRa | RR820 | qRT-PCR |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202 | Ligation |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | for broth preparation |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | for broth preparation |
| centrifuge | Eppendorf | 5418 | centrifugation |
| Electrophoresis apparatus | Bio-Rad | 164-5050 | Electrophoresis |
| Electroporation System | Bio-Rad | 165-2100 | for bacterial transformation |
| Spectrophotometer | BioTek | Epoch | Absorbance detection |
| Real-Time PCR system | Applied Biosystems | 7500 system | qRT-PCR |
References
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