Summary
Se utilizó un sistema de recombinación mediado por λ-Red para crear un mutante de deleción de un pequeño micC de ARN no codificante.
Abstract
Un ARN pequeño no codificante (ARNs) es un nuevo factor para regular la expresión génica a nivel post-transcripcional. Un tipo de sRNA MicC, conocido en Escherichia coli y Salmonella Typhimurium, podría reprimir la expresión de proteínas de la membrana externa. Para investigar más a fondo la función de regulación de micC en Salmonella Enteritidis, clonamos el gen micC en la cepa 50336 de Salmonella Enteritidis, y luego construimos el mutante 50336Δ micC mediante el sistema de recombinación λ de base roja y el mutante complementario 50336Δ micC/p micC portador del plásmido recombinante pBR322 que expresa micC. Los resultados de qRT-PCR demostraron que la transcripción de ompD en 50336Δ micC fue 1,3 veces mayor que en la cepa de tipo salvaje, mientras que la transcripción de ompA y ompC en 50336Δ micC fue 2,2 veces mayor y 3 veces mayor que la de la cepa de tipo salvaje. Estos indicaron que micC reprime la expresión de ompA y ompC. En el siguiente estudio, la patogenicidad de 50336ΔmicC se detectó infectando ratones Balb/c de 6 semanas de edad y pollos de 1 día de edad. El resultado mostró que la LD 50 de la cepa de tipo salvaje 50336, los mutantes 50336Δ micC y 50336Δ micC / p micC para ratones Balb / c de 6 semanas de edad fueron 12.59 UFC, 5.01 UFC y 19.95 UFC, respectivamente. Las DL 50 de las cepas para pollos de 1 día de edad fueron 1.13 x 109 UFC, 1.55 x 10 8 UFC y2.54 x 10 8 UFC, respectivamente. Indicó que la eliminación de micC aumentaba la virulencia de S. Enteritidis en ratones y pollos mediante la regulación de la expresión de proteínas de la membrana externa.
Introduction
Los ARN pequeños no codificantes (ARNs) tienen una longitud de 40-400 nucleótidos, que generalmente no codifican proteínas, pero podrían transcribirse independientemente en cromosomas bacterianos 1,2,3. La mayoría de los ARNs están codificados en las regiones intergénicas (IGR) entre las regiones codificantes de genes e interactúan con los ARNm diana a través de acciones de apareamiento de bases, y regulan la expresión de genes diana a nivel post-transcripcional 4,5. Desempeñan importantes funciones de regulación en el metabolismo de sustancias, la síntesis de proteínas de la membrana externa, la detección de quórum y la expresión génica de virulencia5.
MicC es un pequeño transcrito de ARN de 109 nucleótidos presente en Escherichia coli y Salmonella enterica serovar Typhimurium, que podría regular la expresión de múltiples proteínas de membrana externa como OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 y Omp36 6,7,8,9. MicC regula la expresión de OmpC inhibiendo la unión del ribosoma al ARNm de ompC líder in vitro y requiere la chaperona de ARN Hfq para su función en Escherichia coli6. En Salmonella Typhimurium, MicC silencia el ARNm ompD a través de un ARN dúplex de ≤12 pb dentro de la secuencia codificante (codones 23-26) y luego desestabiliza el ARNm endonucleolítico7. Este proceso de regulación es asistido por la proteína chaperona Hfq10. La OmpC es una proteína abundante de la membrana externa que se pensaba que era importante en ambientes donde las concentraciones de nutrientes y toxinas eran altas, como en el intestino6. La porina OmpD es la proteína de la membrana externa más abundante en Salmonella Typhimurium y representa aproximadamente el 1% de la proteína celular total11. OmpD está implicado en la adhesión a macrófagos humanos y células epiteliales intestinales12. MicC también reprime la expresión de las porinas OmpC y OmpD. Se cree que MicC puede regular la virulencia. Para explorar nuevos genes diana regulados por MicC y estudiar la función de regulación de virulencia de micC, clonamos el gen micC en la cepa 50336 de Salmonella Enteritidis (SE), y luego construimos el mutante 50336ΔmicC y el mutante complementario 50336ΔmicC/p micC. Los nuevos genes diana fueron examinados por qRT-PCR. La virulencia de 50336ΔmicC fue detectada por infecciones de ratones y pollos.
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Protocol
Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Consejo Nacional de Investigación. El comité de cuidado y uso de animales de la Universidad de Yangzhou aprobó todos los experimentos y procedimientos aplicados a los animales (SYXK2016-0020).
1. Cepas bacterianas, plásmidos y condiciones de cultivo
- Utilice las bacterias y plásmidos enumerados en la Tabla 1.
- Cultivar bacterias en caldo LB o en placas de agar LB a 37 °C, en presencia de 50 μg/ml de ampicilina (Amp) cuando proceda.
- Las cepas de cultivo que contienen plásmidos sensibles a la temperatura se utilizan para la construcción de mutantes de deleción a 30 °C.
2. Clone micC gene of S. Enteritidis cepa 50336
- Basado en la secuencia aguas arriba y aguas abajo del gen micC de S. Typhimurium cepa SL1344, diseñan cebadores vmicC-F y vmicC-R para amplificar un fragmento que contiene el gen micC mediante PCR utilizando ADN genómico SE50336 como plantilla.
- Mezclar 5 μL de tampón de reacción de PCR 10x, 2 μL de mezcla de dNTP (2,5 mM), 1 μL de cebadores vmicC-F y vmicC-R, respectivamente, 5 μL de plantilla, 1 μL de ADN polimerasa Taq y 35 μL deddH2Ojuntos para PCR.
- Utilice las siguientes condiciones de reacción por PCR: desnaturalización previa a 94 °C durante 4 min; 94 °C durante 30 s, 53 °C durante 1 min, 72 °C durante 1 min durante 25 ciclos y extensión a 72 °C durante 10 min.
- Secuenciar el producto de PCR para obtener la secuencia del gen micC .
3. Construcción del mutante de deleción micC
NOTA: El mutante micC negativo de Salmonella Enteritidis cepa 50336 se construyó utilizando la recombinación mediada por λ-Red como se describió anteriormente13,14. Los cebadores utilizados se enumeran en la Tabla 2.
- Amplificar el casete de cloranfenicol que contiene fragmentos de homología del gen micC .
- Diseñar cebadores micC-F y micC-R para amplificar el casete de cloranfenicol (Cm) a partir del plásmido pKD3, incluidas extensiones de homología de 50 pb del gen 5' y 3' del gen micC .
- Extraiga el plásmido pKD3 como plantilla de PCR.
- Mezclar 5 μL de tampón de reacción de PCR 10x, 2 μL de mezcla de dNTP (2,5 mM), 1 μL de cebadores micC-F y micC-R, respectivamente, 5 μL de plantilla, 1 μL de ADN polimerasa Taq y 35 μL deddH2Ojuntos como mezcla de reacción de PCR
- Amplificar el casete Cm con las siguientes condiciones de reacción por PCR: predesnaturalización a 94 °C durante 4 min; 94 °C durante 1 min, 52 °C durante 1 min, 72 °C durante 1 min durante 10 ciclos; 94 °C durante 1 min, 63 °C durante 1 min, 72 °C durante 1 min durante 25 ciclos y extensión a 72 °C durante 10 min.
- Detectar el tamaño del producto de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa. Purificar y recuperar el producto de PCR con el kit de recuperación de gel de ADN, y determinar la concentración de ADN por espectrofotómetro.
PRECAUCIÓN: La PCR debe realizarse dos veces. El primer producto de PCR se diluyó en una proporción de 1:200 y se utilizó como plantilla para la PCR secundaria, para eliminar la interferencia de una mayor recombinación por el plásmido pKD3.
- Construct1st recombinant strain 50336ΔmicC::cat
- Mezclar 100 μL de células competentes SE50336 con 5 μL de plásmido pKD46 uniformemente e incubar en hielo durante 30 min. Golpee térmicamente la mezcla anterior a 42 °C durante 90 s y transfiera rápidamente la mezcla al hielo durante 2 minutos para transformar el plásmido pKD46 a SE50336. Detectar colonias positivas cultivando durante la noche a 30 °C en una placa resistente a amperios (50 μg/ml).
- Añadir 30 mM de L-arabinosa al cultivo líquido SE50336/pKD46 e inducir la expresión de recombinasa mediante un cultivo de agitación a 30 °C durante 1 h. Luego prepare células competentes.
- Mezcle 100 ng de producto de PCR purificado (paso 3.1) y 40 μL de células competentes SE50336/pKD46 en una taza de descarga eléctrica (por ejemplo, Bio-Rad). Realice la transformación de descargas eléctricas con los parámetros de voltaje 1.8 kV, pulso 25 μF y resistencia 200 Ω.
- Después de la electrotransformación, transferir la mezcla a 1 ml de medio SOC y un cultivo de agitación a 150 rpm y 30 °C durante 1 h. Luego unte la mezcla en una placa LB resistente a Cm (34 μg / ml) y cultive a 37 ° C durante la noche para detectar colonias positivas.
- Cultivar la colonia positiva anterior a 42 °C durante 2 h. Cribar la colonia sensible a Amp (50 μg/mL) pero resistente a Cm (34 μg/mL) a 37 °C durante la noche para obtener la 1ª cepa recombinante sin pKD46.
- Identificar la 1ª cepa recombinante 50336ΔmicC::Cat.
- Extraiga 50336ΔmicC::ADN genómico de Cat como plantilla de PCR. Utilice los mismos componentes de reacción de PCR que en el paso 2.1. Realizar la reacción de PCR en las mismas condiciones que en el paso 2.1.
- Detectar el tamaño del producto de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa y secuenciar el producto de PCR.
- Construir deleción mutante 50336ΔmicC.
- Electroporar 100 ng de plásmido pCP20 en 40 μL de 50336ΔmicC::Células competentes Cat con los parámetros de tensión 1,8 kV, pulso 25 μF y resistencia 200 Ω, cribar transformadores positivos en placas resistentes a Amp (50 μg/mL) y Cm (34 μg/mL) a 30 °C.
- Transfiera los transformadores positivos por encima de los transformadores a LB no resistentes y crípelos durante la noche a 42 °C, y luego aísle colonias individuales en una placa de LB a 37 °C. Seleccione la colonia que sea sensible tanto a Amp como a Cm. Este mutante es el mutante de deleción micC SE50336ΔmicC.
- Verifique 50336ΔmicC por PCR.
- Extraer ADN genómico 50336ΔmicC como plantilla de PCR. Mezclar 5 μL de tampón de reacción de PCR 10x, 2 μL de mezcla dNTP (2,5 mM), 1 μL de cebador vmicC-F, 1 μL de cebador vmicC-R, 5 μL de plantilla, 1 μL de ADN polimerasa Taq y 35 μL deddH2Ojuntos para PCR.
- Utilice las siguientes condiciones de reacción por PCR: desnaturalización previa a 94 °C durante 4 min; 94 °C durante 30 s, 53 °C durante 1 min, 72 °C durante 1 min durante 25 ciclos y extensión a 72 °C durante 10 min.
4. Construcción de la cepa complementada micC
- Diseño de imprimaciones pBR-micC-F y pBR-micC-R con sitios de restricción NheI y SalI.
- Amplificar el gen micC de longitud completa con secuencias de flanco utilizando una mezcla de reacción de PCR que contiene 5 μL de ADN genómico SE50336 como plantilla, cebadores 1 μL de pBR-micC-F y 1 μL de pBR-micC-R como cebadores, 5 μL de tampón de reacción de PCR 10x, 2 μL de mezcla dNTP (2.5 mM), 2 μL de mezcla dNTP (2.5 mM) y 35 μL deddH2O.
- Utilice las siguientes condiciones de reacción por PCR: desnaturalización previa a 94 °C durante 4 min; 94 °C durante 30 s, 52 °C durante 50 s, 72 °C durante 1 min durante 25 ciclos y extensión a 72 °C durante 10 min. Purificar y recuperar el producto de PCR.
- Digerir el producto PCR y el plásmido pBR322 respectivamente utilizando la enzima de restricción NheI y SalI, y ligarlos usando T4 ligasa a 16 °C durante la noche para obtener el plásmido pBR322-micC.
- Transformar pBR322-micC en las células competentes SE50336ΔmicC y detectar el transformador positivo para obtener la cepa complementaria SE50336ΔmicC/pmicC. Extraer el plásmido pBR322-micC de la cepa complementada y verificarlo mediante digestión y secuenciación de enzimas de restricción.
5. Aislamiento de ARN y PCR cuantitativa en tiempo real
- Cultivo SE50336, 50336ΔmicC y 50336ΔmicC/pmicC en medio LB durante la noche a 24 °C con 180 rpm cultivo de agitación a un OD600 de 2.0. Recolectar el cultivo bacteriano por centrifugación a 13000 rpm durante 2 min.
- Extraer ARN total utilizando el reactivo TRIzol. Incubar 50 μL de ARN aislado con 2 μL de DNasa I y 6 μL de tampón 10x a 37 °C durante 30 min para eliminar el ADN. Determinar la cantidad de ARN pipeteando 1 μL de muestra de ARN a un microespectrofotómetro.
- Síntesis de ADNc
- Utilice 1 μg de ARN total para la síntesis de ADNc en 20 μL del sistema de reacción de transcripción inversa (4 μL de tampón 5x, 1 μL de mezcla de enzimas RT, 1 μL de mezcla de cebador RT, 10 μL de ARN total y 4 μL deddH2O). Incubar por encima del sistema de reacción a 37 °C durante 15 min y luego a 85 °C durante 5 s.
- Diseño de cebadores basados en la secuencia de genes diana ompA, ompC y ompD. Realice la PCR con transcripción inversa utilizando un kit de reactivos RT. Los componentes de la reacción de PCR contienen 2,5 μLde de tampón de reacción de PCR 10x, 1 μL de mezcla de dNTP (2,5 mM), 1 μL de cebadores del gen diana (ompA, ompC u ompD), 2,5 μL de plantilla, 0,5 μL de ADN polimerasa Taq y 17,5 μL de ddH2O.
- Utilice las siguientes condiciones de reacción por PCR: desnaturalización previa a 94 °C durante 4 min; 94 °C durante 30 s, 60 °C durante 1 min, 72 °C durante 1 min durante 25 ciclos y extensión a 72 °C durante 10 min.
- Realizar PCR en tiempo real utilizando el kit RT-PCR verde SYBR en un instrumento RT-PCT por triplicado.
- Utilice los siguientes componentes de reacción de PCR: 10 μL de 2x tampón SYBR, 0,4 μLde cebador directo y cebador inverso respectivamente, 0,4 μL de RoxDye II, 2 μLde de ADNc y 6,8 μL deH2Olibre de RNasa.
- Utilice las siguientes condiciones de reacción por PCR: predesnaturalización a 95 °C durante 1 minuto durante un ciclo; 95 °C durante 5 s, 60 °C durante 34 s durante 40 ciclos.
- Normalizar todos los datos al gen de referencia endógeno gyrA. Utilizar el método 2-ΔΔCT para la cuantificación de los datos15.
6. Ensayos de virulencia
- Cultivo SE50336, 50336ΔmicC y 50336ΔmicC/pmicC en LB fase estacionaria media a temprana (OD600 de 2-3) a 24 °C, cosecha por centrifugación y diluir a CFU mL-1 apropiado en PBS estéril.
- Para infecciones en ratones, diluir las cepas cultivadas a 10 UFC/200 μL, 102 UFC/200 μL y 103 UFC/200 μL de gradiente de resuspensiones. Infectar grupos de cinco ratones Balb/c de 6-8 semanas de edad por cepa mediante inyección subcutánea. Inyectar el grupo control con 200 μL de solución salina fisiológica.
- Para infecciones de pollo, diluir por encima de tres cepas a 107 UFC/200 μL, 108 UFC/200 μL y 109 UFC/200 μL de gradiente de resuspensiones. Infectar grupos de veinte pollos de 1 día de edad por cepa mediante inyección subcutánea.
- Monitoree diariamente los signos de enfermedad y muertes de animales de experimentación. Calcular la DL50 (dosis letal mediana) 14 días después de la infección como se describió anteriormente16. Procesar los datos utilizando un software de análisis de datos.
- En los grupos de infección, recolecte el corazón, el hígado, el bazo, el pulmón y el riñón de los pollitos recién muertos. Pese 0,5 g de los tejidos anteriores por separado y muélalos con una operación estéril. Diluir las muestras de molienda gradualmente, extenderlas en la placa LB y cultivar durante 8-10 h a 37 °C. Registrar la cantidad de cepas de Salmonella colonizadas en los tejidos de los pollitos.
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Representative Results
Construcción del mutante 50336Δ micC y cepa complementada 50336Δ micC /p micC
El resultado del clon del gen micC indicó que este gen estaba compuesto por 109 pb mostrando una identidad del 100% con la de S. Typhimurium. Con base en los datos de secuencia, el mutante de deleción 50336ΔmicC y el mutante complementario 50336ΔmicC/pmicC se construyeron con éxito. En detalle, los resultados de la secuenciación mostraron que un casete de resistencia de 1.1 kb Cm fue amplificado y utilizado para construir el1er recombinante. El1er 50336ΔmicC::cat recombinante se validó mediante PCR utilizando cebadores vmicC-F y vmicC-R con un tamaño de banda esperado de aproximadamente 1200 pb de productos de PCR con inserción de Cm en comparación con 279 pb de productos de PCR en cepas de tipo salvaje (Figura 1). En la segunda recombinación, el casete Cm fue eliminado por pCP20. Los resultados de la PCR combinados con la secuenciación confirmaron que el mutante isogénico micC se construyó con éxito y se denominó 50336ΔmicC (Figura 1).
MicC regula la expresión génica de ompA, ompC y ompD
Para determinar las dianas de MicC, se analizó la expresión de los genes ompA, ompC y ompD en las cepas SE 50336, 50336ΔmicC y 50336ΔmicC/p micC mediante PCR cuantitativa en tiempo real utilizando gyrA como estándar interno normalizador. Los resultados mostraron que la transcripción de ompA y ompC en 50336ΔmicC aumentó aproximadamente 2,2 veces y 3 veces que las de la cepa de tipo salvaje, mientras que la ompD en 50336ΔmicC aumentó ligeramente (1,3 veces) que en la cepa de tipo salvaje (Figura 2). Indicó que micC podría reprimir la expresión de ompA, ompC y ompD. OmpA fue probablemente un nuevo gen diana potencial regulado directamente por micC.
La eliminación de micC mejora S. Virulencia de enteritidisen ratones y pollos
Realizamos ensayos LD50 para cuantificar el impacto de eliminar micC en S. Virulencia de Enteritidis en ratones y pollos. Después de infectar ratones Balb/c de 6-8 semanas de edad con 103 UFC de cada una de las tres cepas, observamos que la mayoría de los ratones infectados por 50336ΔmicC mostraron lasitud, inapetencia o diarrea 48 h después de la infección, y parecieron morir sucesivamente 96 h después de la infección. Mientras que los ratones infectados por la cepa WT y 50336ΔmicC / pmicC mostraron los síntomas anteriores 72 h después de la infección, y murieron 120 h después de la infección. La DL50s se calculó 7 días después de la infección. Los resultados mostraron que la DL50 de la cepa WT 50336, 50336ΔmicC y 50336ΔmicC/p micC para ratones fueron 12.59, 5.01 y 19.95UFC, respectivamente. Indicó que la virulencia del mutante 50336ΔmicC mejoró 2,5 veces en comparación con WT en ratones (Tabla 3). Después de infectar pollos de 1 día de edad con 109 UFC de cada una de las tres cepas, la mayoría de los pollos mostraron hiperemia intestinal y diarrea 10 h después de la infección. Cuando se infectaron con 108 UFC, los pollos infectados con 50336ΔmicC mostraron una mayor mortalidad, en comparación con la cepa WT y 50336ΔmicC/pmicC. La DL50s se calculó para 14 días después de la infección. Los resultados mostraron que la DL 50 de la cepa WT 50336, 50336ΔmicC y 50336ΔmicC/pmicC para pollos fueron 1.13×109, 1.55×10 8 y2.54×10 8 UFC, respectivamente. Indicó que la eliminación de micC también mejoró la virulencia de S. Enteritidis en pollos. Las tres cepas de S. enteritidis se recuperaron del hígado, bazo y ciego de los pollos infectados.
Figura 1: Verificación por PCR de los mutantes 50336ΔmicC con cebadores vmicC-F y vmicC-R. Se obtuvo un producto de PCR de 280 pb cuando el genoma salvaje 50336 como plantilla (carril 1). Cuando el gen del casete Cm se insertó en el genoma de S. Enteritidis, el1er micrófono::cat recombinante 50336Δ se verificó mediante PCR y se obtuvo un producto de PCR de 1100 pb (carril 2). El gen del casete Cm de 50336Δ mic::cat se extirpó introduciendo el vector pCP20 que expresa la recombinasa FLP y el2º mic recombinante 50336Δ se obtuvo y verificó mediante PCR (carril 3). M: marcador de masa molecular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Se determinaron los cambios en el pliegue del nivel de ARNm de los genes ompA, ompC y ompD en el micrófono mutante 50336 Δ y se complementó la cepa 50336Δmic/pmic mediante RT-PCR cuantitativa en comparación con la cepa de tipo salvaje. Los ensayos se realizaron por triplicado. Se utilizó el método 2-ΔΔCT para la cuantificación de los datos. *Indica diferencia estadísticamente significativa en comparación con la cepa de tipo salvaje (p<0.05) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Cepas/plásmidos | Características | Referencias |
| Cepas | ||
| CMCC(B)50336 | Salmonella enterica serovar Enteritidis tipo salvaje | NICPBP, China |
| 50336ΔmicC | mutante deficiente micC | Este estudio |
| 50336ΔmicC/pmicC | 50336Δ micC portador de pBR-micC (Ampr) | Este estudio |
| Plasmidios: | ||
| pKD3 | Cmr; Placa de cassette Cm | [13] |
| pKD46 | Ampr, expresión de λRed recombinasa | [13] |
| pCP20 | Amp r, Cmr; Expresión de recombinasa de FLP | [13] |
| pBR-micC | pBR322 portador del gen micC completo (Ampr) | Este estudio |
| pGEM-T Fácil | vector de clonación, Ampr | Takara |
| pMD19 T-simple | vector de clonación, Ampr | Takara |
Tabla 1. Cepas bacterianas y plásmidos utilizados en este estudio.
| Cebador | Secuencia (5'-3') | Tamaño del producto (bp) | ||||||
| micC-F | TGTCAGGAAAGACCTAAAAAGAGATGTTACCGTTTAATTCAATAATTAATTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG | 1114 | ||||||
| micC -R | TGGAAATAAAAAAAGCCCGAACATCCGTTCGGGCTTGTCAATTTATACCATATGAATATCCTCCTTAG | |||||||
| vmicC -F | AGCGAGTTGACGTTAAAACGTTAT | 279/140 | ||||||
| vmicC -R | TTCGTTCGGGCTTGTCAATTTATA | |||||||
| pBR-micC-F | CAGGCTAGCCACTTTATGTACAATGACATACGTCAC | 434 | ||||||
| pBR-micC-R | CAGGTCGACAAATATTCTAAGGATTAACCTGGAAAC | |||||||
| ompA-F | ACTGAACGCCCTGAGCTTTA | 177 | ||||||
| ompA-R | ACACCGGCTTCATTCACAAT | |||||||
| ompC-F | AAAGTTCTGCGCTTTGTTGG | 187 | ||||||
| ompC-R | CGCTGACGAACACCTGTATG | |||||||
| ompD-F | ACGGTCAGACTTCGCATAGG | 184 | ||||||
| ompD-R | TGTTGCCACCTACCGTAACA | |||||||
| gyrA-F | GCATGACTTCGTCAGAACCA | 278 | ||||||
| gyrA-R | GGTCTATCAGTTGCCGGAAG | |||||||
Tabla 2. Imprimaciones utilizadas en este estudio
| Cepas | DL50 para ratones (UFC) | Mejora del pliegue | DL50 para pollos (UFC) | Mejora del pliegue |
| S. enteritidis 50336 | 12.59 | 1 | 1.13×109 | 1 |
| 50336ΔmicC | 5.01 | 2.51 | 1.55×108 | 7.29 |
| 50336Δ micC/pmicC | 19.95 | 0.63 | 2.54×108 | 4.45 |
| Control negativo | 0 | / | 0 | / |
Tabla 3. Propiedades de virulencia de S. Enteritidis 50336 cepas en ratones y pollos
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Discussion
S. La enteritidis es un importante patógeno intracelular facultativo que puede infectar pollos jóvenes y produce síntomas desde enteritis hasta infección sistémica y muerte17,18. Además, S. enteritidis causa infecciones latentes en pollos adultos y los portadores crónicos contaminan los productos avícolas, lo que resulta en infecciones transmitidas por los alimentos en humanos19. El mecanismo patogénico de S. enteritidis aún no se ha investigado más. Hasta la fecha, se ha encontrado que algunos ARNs como IsrJ, SroA e IsrM afectan la virulencia de Salmonella 20,21,22,23. El gen micC de ARN pequeño no codificante se identificó en muchas enterobacterias como Escherichia coli, Salmonella Typhimurium, Salmonella Bongori y Shigella flexneri 6,7,24. Aquí, encontramos que la secuencia de micC en S. Enteritidis 50336 era el mismo que en S. Typhimurium. Indica que MicC es un ARNs conservador en Enterobacterias.
Para investigar si MicC media la virulencia en S. Enteritidis para animales e identificar dianas MicC, construimos el mutante de deleción 50336ΔmicC y el mutante complementario 50336ΔmicC/pmicC que expresa micC con éxito. Los resultados de qRT-PCR indicaron que micC podría reprimir la expresión de ompA y ompC. OmpA es probablemente un nuevo objetivo potencial de MicC. El sRNA RybB podría reprimir la síntesis de OmpA mediante el apareamiento de bases con las regiones 5' no traducidas (5' UTRs) del mRNA 25 de ompA objetivo. El ARNs de MicA también facilita la rápida descomposición del ARNm de ompA mediante el emparejamiento antisentido de manera similar a RybB25,26. No se sabe si MicC utiliza un mecanismo de regulación similar para regular la ompA y aún no se ha estudiado en un futuro próximo. En E. coli, la deleción de MicC aumentó la expresión de ompC de 1,5 a 2 veces. Un estudio posterior mostró que se demostró que MicC inhibe la unión del ribosoma al mRNA ompC 5' líder6. Además, Pfeiffer descubrió que OmpC era el objetivo principal de MicC7. Se supone que MicC regula ompC en un mecanismo similar en S. Enteritidis con la de E. coli y S. Typhimurium. Además de OmpA y OmpC, MicC también podría reprimir la expresión de OmpD. El resultado mostró que la transcripción de ompD en 50336ΔmicC aumentó ligeramente (1,3 veces) que en la cepa de tipo salvaje. Basándose en los resultados anteriores, demostró que MicC podría reprimir la transcripción de múltiples ARNm diana (ompA, ompC y ompD) en S. Enteritidis. MicC no es el único ARNs que puede regular múltiples objetivos. Algunos ARNs como RybB, DsrA, GcvB, RNAIII y RyhB también actúan sobre múltiples objetivos 25,27,28,29,30,31. Debido a que los ARNs regulan los objetivos mediante un mecanismo de apareamiento de bases para lograr las interacciones ARNs-objetivo32, es posible que subregiones o dominios conservados de ARNs puedan unirse a diferentes objetivos.
La membrana externa de las bacterias gramnegativas es una interfaz clave en las interacciones huésped-patógeno. OmpA, OmpC y OmpD son proteínas importantes y abundantes de la membrana externa. OmpC juega un papel importante en un ambiente abominable como en el intestino6. OmpD está implicado en la adhesión a macrófagos humanos y células epiteliales intestinales12. Se pensó que el cambio de expresión de OMPs causado por la eliminación de MicC podría influir en la virulencia de S. Enteritidis y MicC acumulados en células en fase estacionaria y especialmente en condiciones de crecimiento indujeron los genes de virulencia Salmonella SPI-1 y SPI-27. Se cree que MicC está relacionado con la virulencia en Salmonella, mientras que se realizaron experimentos de infecciones animales para detectar la virulencia de MicC. Los resultados mostraron que la DL50 de los mutantes 50336ΔmicC para pollos de 1 día de edad y ratones Balb / c de 6 semanas de edad disminuyeron obviamente en comparación con la cepa de tipo salvaje. Indicó que la eliminación de micC mejoró la virulencia de S. Enteritidis en ratones y pollos. Se supone que el aumento de la expresión de OmpA, OmpC y OmpD, que es causada por la eliminación de MicC, conduce a la mejora de la virulencia en S. Enteritidis.
MicC regula negativamente S. Virulencia de Enteritidis en ratones y pollos probablemente mediante la regulación negativa de la expresión de las principales proteínas de la membrana externa OmpA y OmpC.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias de China (Nos. 31972651 y 31101826), la Fundación de Ciencias de Educación Superior de Jiangsu (No.14KJB230002), el Laboratorio Estatal Clave de Biotecnología Veterinaria (No.SKLVBF201509), la Subvención de la Fundación de Ciencias de la Naturaleza de Yangzhou (No.YZ2014019), un proyecto financiado por el Desarrollo del Programa Académico Prioritario de las Instituciones de Educación Superior de Jiangsu (PAPD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| dextrose | Sangon Biotech | A610219 | for broth preparation |
| DNA purification kit | TIANGEN | DP214 | for DNA purification |
| Ex Taq | TaKaRa | RR01A | PCR |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017608 | for broth preparation |
| K2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 20032116 | for broth preparation |
| L-Arabinose | Sangon Biotech | A610071 | λ-Red recombination |
| Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP106 | plasmid extraction |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | for broth preparation |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | for broth preparation |
| PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser | TaKaRa | RR047 | qRT-PCR |
| SYBRR Premix Ex Taq II | TaKaRa | RR820 | qRT-PCR |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202 | Ligation |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | for broth preparation |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | for broth preparation |
| centrifuge | Eppendorf | 5418 | centrifugation |
| Electrophoresis apparatus | Bio-Rad | 164-5050 | Electrophoresis |
| Electroporation System | Bio-Rad | 165-2100 | for bacterial transformation |
| Spectrophotometer | BioTek | Epoch | Absorbance detection |
| Real-Time PCR system | Applied Biosystems | 7500 system | qRT-PCR |
References
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