Summary
原代肝细胞是 研究体外肝脏反应和新陈代谢的宝贵工具。利用市售试剂,开发了一种改进的小鼠原代肝细胞分离时间和劳动效率方案。
Abstract
原代肝细胞广泛用于肝脏 体外 研究,特别是在葡萄糖代谢研究中。根据不同的需求(如时间、人工、成本和原代肝细胞使用)对基本技术进行了调整,从而产生了各种原发性肝细胞分离方案。然而,原代肝细胞分离中的众多步骤和耗时的试剂制备是效率的主要缺点。在比较了不同方案的优缺点后,综合了每种方案的优点,并制定了快速有效的原代肝细胞分离方案。 在短短约35分钟内,该方案可以产生与其他方案一样多(如果不是更多)的健康原代肝细胞。此外,使用分离的原代肝细胞进行的葡萄糖代谢实验验证了该方案 在体外 肝脏代谢研究中的有用性。我们还广泛回顾和分析了本研究每个步骤的意义和目的,以便未来的研究人员可以根据需要进一步优化该协议。
Introduction
肝脏是脊椎动物体内最重要的器官之一,因为它在食物消化,血液循环和解毒等许多生命支持功能中起着至关重要的作用。小鼠原代肝细胞 在体外 培养中的应用在碳水化合物代谢和肝癌的研究中越来越受欢迎。因此,在维持其先天生理功能的同时,开发一种方便的小鼠原代肝细胞分离方法非常重要。由于其作为葡萄糖代谢中心的功能,肝脏也是葡萄糖产生和储存的核心1。在 体外 进行原代肝细胞实验是大多数葡萄糖代谢研究的必要条件。因此,多年来,各种研究小组已经制定了小鼠原代肝细胞分离方案。
小鼠肝细胞分离的一般程序是首先用等渗液体(如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或Hanks平衡盐溶液(HBSS)冲洗肝脏中的血液,然后使用含胶原酶的溶液解离肝细胞。这些实验方案共享一般程序,但根据不同的需求,试剂和步骤不同。然而,制备所需的试剂和执行分离步骤需要时间。在开发本方案时,效率被确定为优先事项,所有试剂都是即用型的,可以从市场上获得,并且步骤尽可能少。该协议的总体目标是提供一种快速且劳动高效的方法,以从小鼠中分离原代肝细胞,而不会危及分离的原代肝细胞纯度和活力。
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Protocol
所有程序均由约翰霍普金斯大学动物护理和使用委员会批准。本研究使用C57BL / 6雌性小鼠(8周龄)。
1. 准备工作:
- 将William's E培养基(GlutaMAX补充剂)与10%FBS和1%抗生素抗真菌剂溶液混合,制成培养基。
- 通过0.45μm注射器过滤器过滤25mL胶原酶 - 分散酶培养基(例如,肝脏消化培养基),以除去颗粒碎片。
- 将50 mL双蒸馏H2O(ddH2O),35mL灌注培养基(例如,肝脏灌注培养基)(或首次使用该方案时为50mL)和25mL过滤的胶原酶 - 分散酶培养基在45°C水浴中加热30分钟。
- 在无菌组织培养罩内,将2 mL 10x HBSS和18 mL Percoll混合在50 mL管中,制成20 mL 1x Percoll-HBSS并保持在冰上或4°C。
注意:1x Percoll-HBSS可以在4°C下保持至少6个月。 - 在无菌组织培养罩内,将30mL洗涤培养基(例如肝细胞洗涤培养基)倒入干净的培养皿中,并保持在冰上。
- 将泵送管浸入45°C水浴的水中。如果室温为25°C,则结果最可靠。
- 通过混合225μL氯胺酮盐酸盐,93.75μL木拉嗪和1681μL1x PBS制备2mL1x麻醉剂。
- 使用批准的方法麻醉一只鼠标。在这里,将小鼠腹膜内注射150μL1x麻醉剂。进行反射丧失测试,例如对脚趾捏合的反应,以确保完全麻醉。
- 通过固定或使用防水胶带或该机构动物护理和使用委员会(或同等机构)批准的其他方法,用四肢将鼠标背对着解剖垫。
- 准备灭菌的镊子和剪刀进行解剖。为避免可能的污染,请在无菌罩内执行所有步骤。
2. 程序:
- 使用蠕动泵,以4 mL / min的速度开始泵送预热的ddH2O,持续5分钟。将泵送管从水改为预热灌注介质。
- 用70%的EtOH消毒麻醉小鼠的腹部,并用剪刀切开以暴露肝脏,门静脉和下腔静脉(IVC)。
- 停止蠕动泵。将 24 G 导管(例如,闭合静脉导管,24 G,0.75 IN)插入 IVC。开始泵送并切开门静脉。
- 继续泵送,直到冲洗出的液体变清(约 3-5 分钟)。每分钟按压门静脉,让液体到达肝脏的每个角落。注意不要让气泡进入IVC。
注意:此步骤是从肝脏中冲洗出尽可能多的血液。 - 将泵管从灌注培养基更换为胶原酶-分散酶培养基。继续泵送,直到在执行步骤 2.6 时耗尽所有 25 mL 胶原酶-分散酶培养基。
- 每分钟按压门静脉,让液体到达肝脏的每个角落。
注意:在这个阶段,完全失血对小鼠来说是致命的。小鼠的死亡可以通过实验后缺乏心跳来确认。根据设施政策处理胴体。 - 将整个肝脏分离出来,没有胆囊,放入冰上培养皿中的30 mL洗涤培养基中。
- 用镊子将其撕成碎片,将原代肝细胞释放到溶液中。该步骤将洗涤培养基变成充满释放的原代肝细胞和小肝块的浑浊溶液。
- 通过70μm细胞过滤器过滤步骤2.8中的浑浊溶液,在50mL冰管中加入20 mL 1x Percoll-HBSS。通过倒置管子20次混合。
- 在4°C下以300× g 离心10分钟。
- 在组织培养罩内,吸出上清液。用冷的30mL洗涤培养基洗涤沉淀。
- 在4°C下以50× g 离心5分钟。
- 除去上清液并将沉淀重悬于组织培养罩内的25mL培养基(或适当的其他体积)中。
- 根据实验设计,计数细胞数量并将细胞接种在所需的培养板上。
注意:从一只8周龄的小鼠中正确分离的原代肝细胞通常足以接种在四个6孔板或四个12孔板上。
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Representative Results
为了测试效率,在8周龄雌性C57BL / 6小鼠上进行了本原代肝细胞分离方案。测试分离的原代肝细胞的附着性和纯度。原发性肝细胞分离用于肝脏生理学的各种实验,例如肝脏药物效应和葡萄糖代谢,药物生物标志物活性2,胰岛素敏感性和葡萄糖产生。因此,在以下实验中测试了用该方案分离的原代肝细胞的活性。
在本方案中,原发性肝细胞附着不需要包衣
将分离的原代肝细胞以5×105 个细胞/孔接种在6孔板上。1 h后,观察到牢固的附着,并且原代肝细胞在接种后12 h完全膨胀(图3)。这表明接种后12小时,细胞已准备好用于实验。基于肝脏内小鼠肝细胞的细胞核形态,单核肝细胞在边界富集,而双核/多核肝细胞(终末分化的特征)位于中间3,4。大量成像的细胞显示出典型的双核(二倍体)形态,表明分离和纯化活原代肝细胞的成功。这也表明胶原细胞包被不是该方案原代肝细胞附着的必要条件。
纯度在分离的原代肝细胞群中富集
在以前的方案中已经使用了各种细胞类型特异性基因标记物来检查分离的原代肝细胞纯度(表1)。TTR(转甲状腺素蛋白)、CD95(分化簇 95,也称为 Fas)、ASGR1(Asialoglycoprotin receptor 1)和 ASGR2 是肝细胞的标志物。分离后,与整个肝脏相比,这些肝细胞标志物的mRNA水平显着增加(图4A-D,H)。
该方案还大大减少了来自其他肝细胞的干扰。与整个肝脏相比,免疫细胞,星状细胞和内皮细胞的存在较低,CD45(免疫细胞标志物),COL1A1(胶原蛋白,I型,α1,星状细胞标志物)和TIE2(Tunica间皮细胞激酶,内皮细胞标志物)的mRNA水平急剧下降(图4E-H).这些表明,该方案可以从肝细胞中纯化原代肝细胞群,从而减少实验中其他细胞类型可能的干扰。
保留了药物生物标志物的活性
肝细胞上的生物标志物已被广泛用于药物靶向和递送。因此,药物生物标志物的活性保存是原发性肝细胞分离的关键点,也是测试原代肝细胞分离有用性的标准2。肝细胞标志物ASGR1和ASGR2以这种方式使用2。我们首先测试了原发性肝细胞电镀前后这两种标志物的时程表达水平。电镀后,它们的mRNA水平随着时间的推移而显着下降,但与整个肝脏相比,直到电镀后的12小时时间点,其水平仍然相当可观,特别是对于ASGR1(图5A,B)。表达趋势与先前的报告2 一致,并表明具有可比的原发性肝细胞健康状况。各种病原体靶向CD81,一种肝细胞膜结合蛋白,以促进它们进入细胞和感染,如肝炎病毒5, 恶性疟原虫 和 疟原虫6。其他位于肝细胞膜的蛋白质,如TLR4(Toll样受体4),也是病原体的目标,对肝细胞免疫反应很重要7。接种后,CD81的表达水平一直持续到48小时(图5C)。TLR4表达水平通常增加,但直到48小时后才达到高于 体内 水平的水平(图5D)。这些提示,通过该方案分离的原代肝细胞也可用于接种后至少48小时内的CD81和TLR4研究。总之,这些结果表明,分离的原代肝细胞可用于与药物生物标志物相关的研究。值得注意的是,由于信号肽诱导的RNA迁移,翻译后修饰和/或蛋白质降解等转录后活动的影响,RNA和蛋白质水平可能不一致。因此,如果实验范式要求,则可能需要对mRNA鉴定的药物生物标志物进行蛋白质水平和生物活性验证。
分离的原发性肝细胞对胰岛素敏感
还分析了葡萄糖代谢实验中的原代肝细胞性能。胰岛素是一种在葡萄糖代谢中起核心作用的激素,通过磷酸化AKT和FOXO1(叉头盒O1)来降低葡萄糖水平,促进肝脏葡萄糖的摄取和储存。因此,使用分离的原代肝细胞进行胰岛素敏感性测定。16小时后,用无血清培养基使细胞饥饿3小时。在饥饿的最后0.5小时,将100nM胰岛素施用于培养基。如图6A-C所示,胰岛素显着促进了Ser473处AKT和Ser256处FOXO1的磷酸化,表明原代肝细胞对胰岛素的敏感性。这表明从本方案中分离出的原代肝细胞在胰岛素/葡萄糖代谢研究中是有用的。
分离的原代肝细胞能够产生葡萄糖
它们不仅是葡萄糖储存的中心,而且肝细胞也负责葡萄糖的产生。为了测试我们分离的原代肝细胞在葡萄糖生产研究中是否有用,细胞在胰高血糖素存在下饥饿10小时以刺激葡萄糖产生。然后收集饥饿培养基进行葡萄糖测定,同时收获细胞进行蛋白质印迹。磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)是肝脏葡萄糖产生的重要组成部分,控制其速率8。胰高血糖素治疗后PEPCK的蛋白质水平显着增加,表明葡萄糖产生途径被激活(图7A,B)。这种激活通过增加葡萄糖产生水平进一步证实(图7C)。这种现象也得到了其他葡萄糖生产刺激剂的证实,如毛喉素和IBMX(图7A-C)。然而,由于该实验的局限性,我们无法验证葡萄糖的产生是否通过糖异生排他性,或者是否也存在糖原分解的成分。
图1:工作台设置。 (A)原代肝细胞分离的工作台设置。(B)用于原代肝细胞分离的卡通工作台设置。 请点击此处查看此图的大图。
图2:小鼠解剖,灌注和原代肝细胞纯化。 (A)解剖小鼠,箭头指向肝脏,IVC和门静脉。(B)导管插入IVC。(C)门静脉加压导致肝沟肿大和僵硬,提示灌注成功。(D)灌注后肝糜软,说明胶原酶消化成功。(E)胆囊在孤立肝脏中的位置(箭头指向胆囊)。(F) 胆囊切除术。(G)肝细胞洗涤培养基中撕裂的肝脏。(H)在离心前将1x Percoll-HBSS与过滤的原代肝细胞混合。(I, J)离心后的原代肝细胞沉淀。(K)原发性肝细胞在肝细胞洗涤培养基内重悬。(长、 中)离心后在肝细胞洗涤培养基内形成的原代肝细胞沉淀。 请点击此处查看此图的大图。
图3:接种后的原代肝细胞。 在(A)1小时,(B, C)12小时,(D)24小时,(E)36小时,(F)48小时,(G)72小时和(H)96小时原发性肝细胞电镀后拍摄图像。比例尺 = 100 μm。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4:分离后初级肝细胞纯度增强。 根据先前的方案9,在(从整个肝脏)和之后(从分离的原代肝细胞)原代肝细胞分离之前(从整个肝脏)分离RNA,然后进行逆转录PCR。通过实时荧光定量PCR与肝细胞标志物(A)TTR,(B)CD95,(C)ASGR1和(D)ASGR2的引物以及免疫细胞标志物(E)CD45,(F)星状细胞标志物COL1A1和(G)内皮细胞标志物TIE2来评估原代肝细胞纯度。(H)生成原代肝细胞分离前后细胞类型标志物表达变化的热图。GAPDH(甘油醛3-磷酸脱氢酶)被用作内控品。这里使用的引物用于基因(引物序列在 表2中。此处引用的序列参考文献): TTR10; CD9511; ASGR112; ASGR213; CD4514; COL1A115; TIE216; GAPDH17.图形和热图是使用GraphPad Prism 8生成的。误差线表示标准差,双尾未成对(因为原代肝细胞和整个肝脏样本未成对,因为该方案需要完整的肝脏才能开始)t检验的显著性由星号表示(* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001)。N=7。 请点击此处查看此图的大图。
图5:药物生物标志物的表达。 接种后从整个肝脏和原代肝细胞中分离RNA,然后进行逆转录PCR。通过实时荧光定量PCR与引物(A)ASGR1,(B)ASGR2,(C)CD81和(D)TLR4的药物生物标志物的表达进行评估。GAPDH被用作内部控制。这里使用的新引物用于基因(引物序列在 表2中。此处引用的序列参考文献): CD8118; TLR419.图形是使用GraphPad Prism 8生成的。N = 5。 请点击此处查看此图的大图。
图6:原发性肝细胞分离后胰岛素敏感性保持。(A)胰岛素治疗后p-AKT(S473),AKT,p-FOXO1(S256),FOXO1和GAPDH的蛋白质印迹。(B) p-AKT (S473)/AKT 在蛋白质印迹密度测定中。(C) p-FOXO1 (S256)/FOXO1 在蛋白质印迹密度测定中。原发性肝细胞接种后16小时进行胰岛素敏感性测定。在没有FBS但用1%抗生素抗真菌溶液和100nM胰岛素治疗的情况下,在没有FBS的William's E培养基(GlutaMAX补充剂)中,原代肝细胞饥饿3小时,然后用1x RIPA缓冲液收获进行蛋白质裂解。图形是使用GraphPad Prism 8生成的。蛋白质印迹成像是用LI-COR奥德赛CLx进行的,误差条表示标准偏差,双尾成对t检验显著性用星号表示(* p < 0.05; ** p < 0.01)。N = 4。请点击此处查看此图的大图。
图7:葡萄糖生产测定。 (A)胰高血糖素或毛喉素+IBMX处理10小时后PEPCK和GAPDH的蛋白质印迹(B)胰高血糖素或毛喉素+IBMX处理10小时后PEPCK蛋白水平的密度测定与GAPDH的比较。 (C)葡萄糖水平与胰高血糖素或毛喉素+IBMX处理10小时后的蛋白质水平的比较。原代肝细胞接种后16小时进行葡萄糖产生测定。原代肝细胞在不含葡萄糖和酚红的DMEM(加入2 mM L-谷氨酰胺,2 mM丙酮酸钠,20 mM L-乳酸钠,1%Pen链球菌)中饥饿10小时,50nM胰高血糖素或20μM毛喉素和200μM IBMX。用葡萄糖测定试剂盒收获培养基进行葡萄糖浓度测量,同时收获蛋白质进行蛋白质印迹。使用LI-COR Odyssey CLx进行蛋白质印迹成像,误差条表示标准偏差,双尾配对t检验显着性由星号表示(* p <0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001)。N = 4。 请点击此处查看此图的大图。
离心时间 | 肋骨保持架拆卸 | 灌注缓冲液自拍 | 手术结 | 灯具加热 | 板材涂层 | 分离的细胞数量/小鼠 | 梯度离心 | 纯度标记基因 | |
本实验方案 | 2 | 不 | 不 | 不 | 不 | 不 | 2.5–4 x 107 | 是的 | TTR, CD95, ASGR1, ASGR2, CD45, COL1A1, TIE2 |
Severgnini et al.2. | 4 | 是的 | 是的 | 是的 | 是的 | 是的 | 1.8–2 x 107 | 不 | TTR, CD45, COL1A1, TIE2 |
贡萨尔维斯等人,24。 | 5 或 6 | 不 | 不 | 不 | 不 | 是的 | 1–3 x 106 | 是的 | CD45, CD95 |
李等人.20. | 4 或 5 | 不 | 是的 | 是的 | 不 | 未提及 | 1–4 x 107 | 不 | 不适用 |
塞勒姆等人.21. | 3 | 不 | 是的 | 不 | 不 | 未提及 | 2 x 107 | 是的 | 不适用 |
卡布拉尔等人.22. | 3 或 6 个(带梯度离心) | 不 | 是的 | 是的 | 不 | 是/推荐 | 不适用 | 自选 | N/A(通过光学显微镜评估纯度) |
科列洛娃等人,23. | 3 | 不 | 是的 | 是的 | 不 | 是的 | 不适用 | 是的 | 不适用 |
表1:原代肝细胞方案的比较。
引物(正向) | 底漆(反向) | 参考 | ||
TTR Forward 5'-3': AGCCCTGTCTGGGAGAC | TTR Reverse 5'-3': TGCGATGGTTAGTGGCGATGG | 10 | ||
CD95 前进 5'-3': ATGCACACTCTGCGATGAAG | CD95 反向 5'-3': CAGTGTTCACAGCCAGGAGA | 11 | ||
ASGR1 Forward 5'-3': GAGTCGAAGCTGAAAACAG | ASGR1 Reverse 5'-3': CCTTCATACTCCACCCAGTTG | 12 | ||
ASGR2 Forward 5'-3': CTACTTTTTCTCGGGATGG | ASGR2 Reverse 5'-3': CAAATATGAAACTGGCTCCTGTG | 13 | ||
CD45 前进 5'-3': GAACATGCTGCCAATGGTTCT | CD45 反向 5'-3': TGTCCCACATGACTCTTTCC | 14 | ||
COL1A1 Forward 5'-3': GAAGCACGTCTGGTTTGGA | COL1A1 Reverse 5'-3': ACTCGAACGGGAATCCATC | 15 | ||
TIE2 Forward 5'-3': ATGTGGAAGTCGAGAGCGAT | TIE2 反向 5'-3': CGAATAGCCATCCACTGTCC | 16 | ||
GAPDH Forward 5'-3': CGACTTCAACAGCAACTCCCACTCTTCC | GAPDH Reverse 5'-3': TGGGTGGTCCAGGGTTTCTTACTCCTT | 17 | ||
CD81 前进 5'-3': CCAAGGCTGTGTGAAGACTTTC | CD81 反向 5'-3': GGCTGTTCCTCAGTATGGTGGTAG | 18 | ||
TLR4 Forward 5'-3': ACCTGGCTGTTTACACGTC | TLR4 反向 5'-3': CTGCCAGAGACATTGCAGAA | 19 |
表2:引物列表: 用于基因TTR,CD95,ASGR1,ASGR2,CD45,COL1A1,TIE2,GAPDH,CD81和TLR4的引物
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Discussion
已经开发了各种原发性肝细胞分离方案。它们还根据不同的需求进行了优化和调整(表1)。分离方案通常由两部分组成:灌注(包括酶消化)和纯化。
灌注可以与整个肝脏在体内2,20,21,22,23或解剖的肝叶24中进行。为了便于技术操作,解剖裂叶的灌注通常局限于左叶和中等波瓣。从理论上讲,由于使用整个肝脏的所有肺叶,体内灌注应产生更多的原代肝细胞。在灌注期间保持肝脏到位也可以减少细胞死亡,因为在这个步骤中,体内的肝细胞可以始终沐浴在液体中,无论是血液还是灌注缓冲液。
无菌条件的维持在这一步中也起着重要作用。如果条件允许,最好在干净的罩子中进行灌注。所有直接接触组织的工具都应该是无菌的,这可以通过高压灭菌来实现。为了防止细菌和真菌的任何污染,在培养基中加入抗生素抗真菌剂溶液。
IVC和门静脉是连接肝脏和其他器官的两个主要血管。大多数方案利用这些静脉中的任何一个插入针进行灌注:IVC2,20,21,23,门静脉22。门静脉的位置呈偏斜角度,这导致难以定位和稳定插入的针头。因此,通常需要缝合线来用手术结将针头绑在适当的位置,由于静脉容易受损,因此必须非常小心地进行。通常,门静脉的直径也小于IVC,使针插入复杂化。考虑到这一点,使用IVC可以更方便,尽管在某些协议中,针头也通过手术打结到IVC20上。据报道,与门静脉25 相比,静脉注射术插入术后灌注导致原代肝细胞的活力降低。然而,在本方案中,我们成功地使用了IVC插入,并且分离的原代肝细胞活力(在优化条件下>96%,根据制造商的方案用台盼蓝染色测量)与其他方案一样高,如果不是更多的话(根据方案和条件2,22,23,24在80%和96%之间变化)。
灌注步骤有两个目的:将血液从肝叶中冲洗出来并消化肝脏以释放原代肝细胞。为了实现这些目标,应至少使用两个缓冲液,一个用于血液通量(通量缓冲液),一个用于消化(消化缓冲液)。大多数方案制备基于HBSS的通量缓冲液,并在其中添加胶原酶,使其能够作为消化缓冲液进行消化。这些缓冲液的制备非常耗时,并且缓冲液在某些微妙的性质(如pH值)上可能略有不同,因此引入了不请自来的变量。考虑到这一点,利用市售缓冲液可以节省宝贵的人力和时间,同时最大限度地减少这些变量。Gibco开发了一种从成年大鼠26中分离原代肝细胞的方案,基于使用市售的肝脏灌注培养基(作为通量缓冲液)和肝脏消化培养基(作为消化缓冲液)。小鼠和大鼠作为啮齿动物,在身体特性上具有高度相似性;可以将这两个大鼠优化的缓冲液整合到小鼠原代肝细胞分离中。事实上,贡萨尔维斯等人。24、用这些缓冲液成功进行了解剖肝叶的灌注,提高了它们在体内肝灌注 中的应用前景。在这里,我们成功地测试了目前小鼠原代肝细胞方案中的肝灌注培养基和肝脏消化培养基,从而产生了高质量的活原代肝细胞(图3 和 图4)。
灌注缓冲液的温度决定了原代肝细胞在分离后存活的程度。如果温度太高,消化缓冲液中的胶原酶可能降低活性;如果过低,原代肝细胞可能会遭受冷休克,导致分离率可能降低。缓冲液流经灌注管所需的时间也决定了缓冲液到达肝脏时的温度。在以前的方案中,使用40°C2 或42°C21 水浴。该温度可能会根据实验室条件而变化,例如环境温度,灌注管的长度和蠕动泵的类型。在目前的协议中,经过多次测试,我们将水浴温度优化为45°C以预热缓冲液。
分离的原代肝细胞的纯度在随后的实验中起着重要作用,因为纯度比越高,干扰的可能性越小。虽然肝脏主要由肝细胞组成,占27质量的60%-80%,但也存在各种类型的其他细胞,如免疫细胞,星状细胞和内皮细胞,这些细胞对肝脏免疫活动很重要。这些细胞中的每一个都可能在以后的实验中发出潜在的干扰28。例如,肝脏中的星状细胞也对病原体入侵和肝损伤作出反应,涉及疤痕形成29。从数量上看,5%-8%的总肝细胞群是由星状细胞30贡献的。通常,星状细胞处于静止状态,但是当存在应力时,这种状态可能会被打破。因此,如果星状细胞中的一些细胞保留在最终分离的原代肝细胞池中,则星状细胞活性可能由分离或后续治疗期间引入的压力触发。其他类型的细胞也贡献了相当大一部分肝脏细胞群,如肝窦内皮细胞(LSECs),占肝细胞总数的20%31。如何消除这些细胞的存在一直是原代肝细胞分离过程中令人费解的部分。因此,纯化是原代肝细胞分离的关键部分,通常利用不同类型细胞之间的重量和大小差异。通过优化离心机速度和/或纯化缓冲液,原代肝细胞可以沉淀到管的底部。
将活细胞与死细胞分离对于获得健康的原代肝细胞和准确的细胞计数也至关重要。通常,纯化后必须计数细胞数量,因为许多实验的结果随着细胞汇合度的变化而变化。梯度离心机试剂可用于此步骤以完成此任务,如Percoll。离心机中36%-40%的Percoll沉淀活细胞并将死细胞保持在上清液中。我们成功地优化了离心速度和时间,以减少本方案中的非原代肝细胞群。细胞类型特异性标记物用于测试分离的原代肝细胞的纯度,就像其他方案一样。这里使用的肝细胞标志物是TTR2,CD9524,32,ASGR133和ASGR234。其他类型的细胞的标志物包括CD45(免疫细胞标志物),COL1A1(星状细胞标志物),TIE2(内皮细胞标志物)2,35。有了这些标志物,用本方案分离的原代肝细胞显示出高水平的纯度(图4),与先前的方案2,24相当。
在灌注过程中,消化缓冲液中的胶原酶通过分解细胞外基质内的胶原来松弛细胞之间的附着。这导致在电镀过程中难以获得细胞。大多数先前的方案要求/推荐用胶原蛋白2,22或明胶24预包被板,以更好地附着原代肝细胞。据我们所知,而塞勒姆等人。21和李等人。20没有讨论这一步骤,本研究中评估的其他方案明确说明/建议使用预涂覆板2,22,23,24。在目前的方案中,我们发现某些类型的板不需要板涂层。虽然我们不确定这是否是因为不同类型的板,特别是如果它们来自不同的制造商,具有不同的表面光滑度,并且这种不同的光滑度(如果存在)是否在原代肝细胞附着中起重要作用,但请注意,可以跳过另一个步骤(板包衣)以获得功效。同样重要的是要注意,该方案产生显着比例的终末分化,例如,二倍体肝细胞,以及单核肝细胞,类似于体内肝窦。
在这项研究中,结合了先前原代肝细胞分离方案的优势,并尽可能简化该过程,使用市售试剂并消除不必要的步骤。离心步骤成功地减少到两个,据我们所知,这是已发布协议中最少的。为了确认分离的原代肝细胞的纯度和生物活性,评估了各种肝细胞标志物的水平,证实了该方案可以大大提高原代肝细胞纯度并减少其他肝细胞群,如免疫细胞,星状细胞和内皮细胞。药物生物标志物(如ASGR1,ASGR2,CD81和TLR4)的活性在用本方案分离的原代肝细胞中保存良好,其也证实了胰岛素敏感性和葡萄糖产生活性。该协议的主要限制是费用,因为所有试剂都是为了提高效率而商业购买的。我们没有具体验证使用本方案分离的原代肝细胞中的糖原菌病是完整的,这可能需要进一步研究相关研究。该协议具有与以前的方案相似的灌注步骤,如Salem等人21,Severgnini等人2 和Li等人20,以及Korelova等人23,使用IVC插入。它们的灌注和消化缓冲液可能需要额外的劳动来制备,也可以与本方案一起使用,几乎不需要修改酶消化时间。因此,将先前方案的试剂与本方案的步骤相结合也可能是有益的,无论是时间还是经济上。
总之,开发了一种改进的省时和劳动效率的方案,用于从小鼠肝脏中分离原代肝细胞。该方案完全利用市售试剂,从解剖小鼠到接种原代肝细胞,可在约35分钟内完成,从而为原代肝细胞相关研究提供有用的技术。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了美国国立卫生研究院的支持(向S.W.授予5R01HD095512-02)。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1x PBS | Gibco | 10010023 | |
10x HBSS | Gibco | 14065-056 | |
12-well Plate | FALCON | 353043 | Coating not required |
6-well Plate | FALCON | 353046 | Coating not required |
anti-AKT | Cell Signaling | 2920S | |
Antibiotic Antimycotic Solution (100x), Stabilized | Sigma-Aldrich | A5955 | |
anti-FOXO1 | Cell Signaling | 97635S | |
anti-GAPDH | Cell Signaling | 2118S | |
anti-p-AKT (S473) | Cell Signaling | 9271L | |
anti-PEPCK | Santa Cruz | SC-166778 | |
anti-p-FOXO1 (S256) | Cell Signaling | 84192S | |
Cell Strainer, 70 µm | CELLTREAT | 229483 | |
Closed IV Catheter, 24 Gauge 0.75 IN | Becton Dickinson | 383511 | |
DMEM, no glucose, no glutamine, no phenol red | ThermoFisher Scientific | A1443001 | |
EnzyChrom Glucose Assay Kit | BioAssay Systems | EBGL-100 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
Forskolin | MilliporeSigma | F3917-10MG | |
Glucagon | Sigma-Aldrich | G2044 | |
Goat Anti-mouse IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-68070 | |
Goat Anti-rabbit IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-32211 | |
GraphPad Prism 8 | GraphPad Software | NA | |
Hepatocyte Wash Medium | Gibco | 17704-024 | |
IBMX | Cell Signaling | 13630S | |
Insulin | Lilly | NDC 0002-8215-01 | |
Ketamine HCL (100 mg/mL) | Hospira Inc | NDC 0409-2051-05 | |
L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
Liver Digest Medium | Gibco | 17703-034 | Aliquot within tissue culture hood to 25 mL each in 50 mL tube, and keep in -20 °C freezer |
Liver Perfusion Medium | Gibco | 17701-038 | |
Pen Strep | Gibco | 15140122 | |
Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
Peristaltic Pump | Gilson | Minipuls 2 | Capable of pumping at 4 mL/min |
Petri Dish | Fisherbrand | 08-757-12 | |
Refrigerated Centrifuge | Sorvall | Legend RT | Capable to centrifuge 50 mL tube at 4 °C |
Sodium L-Lactate | Sigma-Aldrich | L7022 | |
Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
Syringe Filter, PVDF 0.45 µm 30mm diameter | CELLTREAT | 229745 | |
Syringe, 0.5 mL | Becton Dickinson | 329461 | |
Syringe, 60 mL | Becton Dickinson | 309653 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
Tube, 15 mL | Corning | 430052 | |
Tube, 50 mL | Corning | 430290 | |
Water Bath Tank | Corning | CLS6783 | Or any water bath tank capable of heating up to 45 °C |
William’s E Medium (GlutaMAX Supplement) | Gibco | 32551020 | |
Xylozine (100 mg/mL) | Vetone Anased LA | NDC13985-704-10 |
References
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