Summary
Gli epatociti primari sono uno strumento prezioso per studiare la risposta epatica e il metabolismo in vitro. Utilizzando reagenti disponibili in commercio, è stato sviluppato un protocollo migliorato efficiente in termini di tempo e lavoro per l'isolamento degli epatociti primari del topo.
Abstract
Gli epatociti primari sono ampiamente utilizzati nella ricerca in vitro sul fegato, specialmente negli studi sul metabolismo del glucosio. Una tecnica di base è stata adattata in base a diverse esigenze, come tempo, manodopera, costi e utilizzo di epatociti primari, con conseguente vari protocolli di isolamento degli epatociti primari. Tuttavia, i numerosi passaggi e le lunghe preparazioni di reagenti nell'isolamento degli epatociti primari sono i principali svantaggi per l'efficienza. Dopo aver confrontato diversi protocolli per i loro pro e contro, i vantaggi di ciascuno sono stati combinati ed è stato formulato un protocollo di isolamento degli epatociti primari rapido ed efficiente. Entro soli ~ 35 minuti, questo protocollo potrebbe produrre tanto, se non di più, epatociti primari sani come altri protocolli. Inoltre, gli esperimenti sul metabolismo del glucosio eseguiti utilizzando gli epatociti primari isolati hanno convalidato l'utilità di questo protocollo negli studi in vitro sul metabolismo epatico. Abbiamo anche ampiamente esaminato e analizzato il significato e lo scopo di ogni fase di questo studio in modo che i futuri ricercatori possano ottimizzare ulteriormente questo protocollo in base alle esigenze.
Introduction
Il fegato funge da uno degli organi più importanti nel corpo dei vertebrati a causa del ruolo vitale che svolge in numerose funzioni di supporto vitale come la digestione del cibo, la circolazione sanguigna e la disintossicazione. L'uso di epatociti primari di topo in coltura in vitro è sempre più popolare negli studi sul metabolismo dei carboidrati e sul carcinoma epatico. Pertanto, è importante sviluppare un metodo conveniente per l'isolamento degli epatociti primari del topo mantenendo la sua funzione fisiologica innata. Grazie alla sua funzione di hub del metabolismo del glucosio, il fegato è anche centrale per la produzione e lo stoccaggio del glucosio1. Gli esperimenti con epatociti primari in vitro sono un must per la maggior parte degli studi sul metabolismo del glucosio. Pertanto, per anni, vari gruppi di ricerca hanno sviluppato protocolli per l'isolamento degli epatociti primari del topo.
La procedura generale di isolamento degli epatociti di topo consiste nel scovare prima il sangue nel fegato con un liquido isosmotico come la soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) o la soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) e quindi utilizzare la soluzione contenente collagenasi per dissociare gli epatociti. Questi protocolli condividono una procedura generale, ma differiscono in reagenti e passaggi in base alle diverse esigenze. Tuttavia, la preparazione dei reagenti richiesti e l'esecuzione delle fasi di isolamento richiedono tempo. Nello sviluppo del presente protocollo, l'efficienza è stata fissata come priorità, con tutti i reagenti pronti all'uso e disponibili sul mercato e il minor numero possibile di passaggi. L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di fornire un metodo rapido ed efficiente per isolare gli epatociti primari dal topo, senza compromettere la purezza e la vitalità degli epatociti primari isolati.
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Protocol
Tutte le procedure sono state approvate dal Johns Hopkins Animal Care and Use Committee. C57BL/6 topi femmina (8 settimane) sono stati utilizzati in questo studio.
1. Preparazione:
- Mescolare William's E Medium (GlutaMAX Supplement) con 10% FBS e 1% di soluzione antibiotico-antimicotica per rendere il terreno di coltura.
- Filtrare 25 mL di collagenasi-dispasi (ad es. Liver Digest Medium) attraverso un filtro a siringa da 0,45 μm per rimuovere i detriti particellari.
- Riscaldare 50 mL di H2O a doppio distillato (ddH2O), 35 mL di mezzo di perfusione (ad esempio, mezzo di perfusione epatica) (o 50 mL al primo utilizzo di questo protocollo) e 25 mL di collagenasi-dispasi filtrata in un bagno d'acqua a 45 °C per 30 minuti.
- All'interno di una cappa di coltura tissutale sterile, mescolare 2 mL di 10x HBSS e 18 mL di Percoll in un tubo da 50 mL per produrre 20 mL 1x Percoll-HBSS e mantenere sul ghiaccio o 4 °C.
NOTA: 1x Percoll-HBSS può essere conservato a 4 °C per almeno 6 mesi. - All'interno di una cappa di coltura di tessuto sterile, versare 30 ml di mezzo di lavaggio (ad esempio, Hepatocyte Wash Medium) in una capsula di Petri pulita e tenere sul ghiaccio.
- Immergere il tubo di pompaggio nell'acqua di un bagno d'acqua a 45 °C. I risultati sono più affidabili se la temperatura ambiente è a 25 °C.
- Preparare 2 mL di 1x anestetici mescolando 225 μL di ketamina HCL, 93,75 μL di xilazina e 1681 μL di 1x PBS.
- Anestetizzare un mouse utilizzando un metodo approvato. Qui il topo è stato iniettato per via intraperitoneale con 150 μL di 1x anestetici. Eseguire i test per la perdita di riflessi come la reazione al pizzicamento delle dita dei piedi per garantire un'anestesia completa.
- Fissare il mouse sulla schiena sul pad di dissezione con quattro arti, bloccando o utilizzando nastro impermeabile o altri metodi approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'istituzione (o equivalenti).
- Preparare pinze e forbici sterilizzate per la dissezione. Per evitare possibili contaminazioni, eseguire tutti i passaggi all'interno di un cappuccio sterile.
2. Procedura:
- Utilizzando una pompa peristaltica, iniziare a pompare ddH2O riscaldato ad una velocità di 4 ml / min per 5 minuti. Cambiare il tubo di pompaggio dall'acqua a un mezzo di perfusione riscaldato.
- Disinfettare l'addome del topo anestetizzato con il 70% di EtOH e tagliare con una forbice per esporre il fegato, la vena porta e la vena cava inferiore (IVC).
- Arrestare la pompa peristaltica. Inserire un catetere da 24 G (ad esempio, catetere IV chiuso, 24 G, 0,75 IN) in IVC. Inizia a pompare e taglia la vena porta aperta.
- Continuare a pompare fino a quando il liquido svuotato è limpido (circa 3-5 minuti). Premere la vena porta ogni minuto per lasciare che il liquido raggiunga ogni angolo del fegato. Fare attenzione a non lasciare che le bolle d'aria entrino nell'IVC.
NOTA: Questo passaggio è quello di scovare più sangue possibile dal fegato. - Cambiare il tubo di pompaggio dal mezzo di perfusione al mezzo di collagenasi-dispasi. Continuare a pompare fino a quando tutti i 25 mL del mezzo collagenasi-dispasi sono esauriti mentre si esegue il passaggio 2.6.
- Premere la vena porta ogni minuto per lasciare che il liquido raggiunga ogni angolo del fegato.
NOTA: In questa fase, la completa perdita di sangue è fatale per il topo. La morte del topo può essere confermata da una mancanza di battito cardiaco dopo l'esperimento. Smaltire la carcassa secondo le politiche della struttura. - Isolare l'intero fegato senza cistifellea al mezzo di lavaggio da 30 ml nella capsula di Petri sul ghiaccio.
- Strapparlo a pezzi con una pinza per rilasciare gli epatociti primari in soluzione. Questo passaggio trasformerebbe il mezzo di lavaggio in una soluzione torbida piena di epatociti primari rilasciati e piccoli pezzi di fegato.
- Filtrare la soluzione torbida nel passaggio 2.8 attraverso un filtro cellulare da 70 μm nel Percoll-HBSS da 20 mL 1x in un tubo da 50 mL su ghiaccio. Mescolare invertendo il tubo 20 volte.
- Centrifugare a 300 x g per 10 min a 4 °C.
- All'interno del cappuccio di coltura dei tessuti, aspirare il surnatante. Lavare il pellet con 30 ml di mezzo di lavaggio a freddo.
- Centrifugare a 50 x g per 5 min a 4 °C.
- Rimuovere il surnatante e risospesciare il pellet in 25 ml del terreno di coltura (o di altri volumi appropriati) all'interno della cappa di coltura del tessuto.
- Contare il numero di cellule e placcare le cellule sulle piastre di coltura desiderate secondo il disegno sperimentale.
NOTA: gli epatociti primari correttamente isolati da un topo di 8 settimane sono di solito sufficienti per essere placcati su quattro piastre a 6 pozzetti o quattro piastre a 12 pozzetti.
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Representative Results
Al fine di testare l'efficienza, l'attuale protocollo di isolamento degli epatociti primari è stato eseguito su topi C57BL/6 di 8 settimane. Sono stati testati l'attaccamento e la purezza degli epatociti primari isolati. L'isolamento primario degli epatociti viene utilizzato per un'ampia varietà di esperimenti sulla fisiologia epatica, come gli effetti dei farmaci epatici e il metabolismo del glucosio, l'attività dei biomarcatori farmaceutici2, la sensibilità all'insulina e la produzione di glucosio. Pertanto, le attività degli epatociti primari isolati con questo protocollo sono state testate nei seguenti esperimenti.
Il rivestimento non era richiesto per l'attaccamento degli epatociti primari nel presente protocollo
Gli epatociti primari isolati sono stati placcati a 5 x 105 cellule/pozzetto su una piastra a 6 pozzetti. Dopo 1 ora, è stato osservato un attaccamento fermo e gli epatociti primari si sono completamente espansi 12 ore dopo la placcatura (Figura 3). Ciò indicava che 12 ore dopo la placcatura, le cellule erano pronte per essere utilizzate per gli esperimenti. Sulla base della morfologia del nucleo degli epatociti di topo all'interno del fegato, gli epatociti mononucleati sono stati arricchiti ai bordi, mentre gli epatociti binucleari/polinucleari, una firma della differenziazione terminale, erano nel mezzo 3,4. Una quantità significativa di cellule fotografate ha mostrato la tipica morfologia a doppio nucleo (diploide), indicando il successo dell'isolamento e della purificazione degli epatociti primari vivi. Ciò indica anche che il rivestimento di collagene non è un requisito per l'attaccamento primario degli epatociti con questo protocollo.
La purezza è stata arricchita nella popolazione di epatociti primari isolati
Vari marcatori genetici specifici del tipo cellulare sono stati utilizzati nei protocolli precedenti per verificare la purezza degli epatociti primari isolati (Tabella 1). TTR (Transtiretina), CD95 (Cluster di differenziazione 95, noto anche come Fas), ASGR1 (recettore Asialoglycoprotein 1) e ASGR2 sono marcatori per gli epatociti. Dopo l'isolamento, i livelli di mRNA di questi marcatori epatocitari sono stati significativamente aumentati, rispetto all'intero fegato (Figura 4A-D,H).
Questo protocollo ha anche ridotto notevolmente l'interferenza da altre cellule epatiche. La presenza di cellule immunitarie, cellule stellate e cellule endoteliali era inferiore, dimostrata dalla forte diminuzione dei livelli di mRNA di CD45 (marcatore delle cellule immunitarie), COL1A1 (collagene, tipo I, alfa 1, marcatore cellulare stellato) e TIE2 (Chinasi delle cellule endoteliali tunica interna, marcatore delle cellule endoteliali), rispetto all'intero fegato (Figura 4E-H ). Questi suggeriscono che questo protocollo potrebbe purificare la popolazione di epatociti primari dalle cellule epatiche e quindi ridurre la possibile interferenza da altri tipi di cellule negli esperimenti.
L'attività dei biomarcatori farmaceutici è stata preservata
I biomarcatori sugli epatociti sono stati ampiamente utilizzati per il targeting e la somministrazione di farmaci. La conservazione dell'attività dei biomarcatori farmaceutici è quindi un punto chiave nell'isolamento primario degli epatociti ed è uno standard per testare l'utilità dell'isolamento degli epatociti primari2. I marcatori epatocitari ASGR1 e ASGR2 sono usati in questo modo2. Abbiamo prima testato il livello di espressione a tempo di questi due marcatori prima e dopo la placcatura primaria degli epatociti. Dopo la placcatura, il loro livello di mRNA è diminuito considerevolmente con il tempo, ma i livelli sono rimasti considerevoli rispetto all'intero fegato fino al punto temporale di 12 ore dopo la placcatura, in particolare per ASGR1 (Figura 5A,B). La tendenza all'espressione era coerente con un precedente rapporto2 e indicava una salubrità epatocitaria primaria comparabile. Vari agenti patogeni prendono di mira CD81, una proteina legata alla membrana degli epatociti, per facilitare il loro ingresso nelle cellule e l'infezione, come il virus dell'epatite5, Plasmodium falciparum e Plasmodium yoelii6. Altre proteine localizzate sulla membrana degli epatociti, come TLR4 (Toll-like receptor 4), sono anch'esse prese di mira dai patogeni e importanti per la risposta immunitaria degli epatociti7. Dopo la placcatura, il livello di espressione di CD81 è stato costante fino a 48 ore (Figura 5C). Il livello di espressione di TLR4 è generalmente aumentato, ma non fino a dopo 48 ore, quando ha raggiunto un livello superiore a quello in vivo (Figura 5D). Questi suggeriscono che gli epatociti primari isolati da questo protocollo possono essere utilizzati anche per studi CD81 e TLR4 entro almeno 48 ore dalla placcatura. Insieme, questi risultati indicano che gli epatociti primari isolati sono validi per l'uso in studi relativi ai biomarcatori farmaceutici. Vale la pena notare che i livelli di RNA e proteine possono essere incoerenti a causa delle influenze delle attività post-trascrizionali come la migrazione dell'RNA indotta dal peptide di segnale, la modifica post-traduzionale e / o la degradazione proteica. Pertanto, la verifica del livello proteico e della bioattività dei biomarcatori farmaceutici identificati dall'mRNA può essere necessaria se richiesto dal paradigma sperimentale.
Gli epatociti primari isolati erano insulino-sensibili
Sono state analizzate anche le prestazioni degli epatociti primari negli esperimenti sul metabolismo del glucosio. L'insulina, un ormone che svolge un ruolo centrale nel metabolismo del glucosio, diminuisce il livello di glucosio, promuovendo l'assorbimento e lo stoccaggio epatico del glucosio attraverso il fosforilante AKT e FOXO1 (Forkhead box O1). Pertanto, è stato effettuato un test di sensibilità all'insulina con epatociti primari isolati. Dopo 16 ore, le cellule sono state affamate per 3 ore, con un mezzo privo di siero. All'ultima 0,5 ore di fame, 100 nM di insulina sono stati somministrati al terreno di coltura. Come mostrato nella Figura 6A-C, l'insulina ha promosso significativamente la fosforilazione sia di AKT a Ser473 che di FOXO1 a Ser256, indicando la sensibilità degli epatociti primari all'insulina. Ciò suggerisce che gli epatociti primari isolati del presente protocollo sono utili negli studi sul metabolismo dell'insulina / glucosio.
Gli epatociti primari isolati erano in grado di produrre glucosio
Non solo sono un centro per la conservazione del glucosio, ma gli epatociti sono anche responsabili della produzione di glucosio. Per verificare se gli epatociti primari che abbiamo isolato sono utili negli studi sulla produzione di glucosio, le cellule sono state affamate per 10 ore in presenza di glucagone per stimolare la produzione di glucosio. Il mezzo di fame è stato quindi raccolto per il test del glucosio, mentre le cellule sono state raccolte per il western blot. La fosfoenolpiruvato carbossichinasi (PEPCK) è un componente essenziale nella produzione di glucosio nel fegato, controllando il suo tasso8. Il livello proteico di PEPCK è stato significativamente aumentato dopo il trattamento con glucagone, suggerendo che la via di produzione del glucosio è stata attivata (Figura 7A,B). Questa attivazione è stata ulteriormente confermata da un aumento del livello di produzione di glucosio (Figura 7C). Questo fenomeno è stato confermato anche con altri stimolatori della produzione di glucosio come forskolin più IBMX (Figura 7A-C). Tuttavia, a causa della limitazione di questo esperimento, non abbiamo potuto verificare se la produzione di glucosio fosse esclusiva tramite gluconeogenesi o se esiste anche un componente della glicogenolisi.
Figura 1: Configurazione del banco. (A) La configurazione del banco per l'isolamento degli epatociti primari. (B) La configurazione del banco animato per l'isolamento degli epatociti primari. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Dissezione, perfusione e purificazione primaria degli epatociti del topo. (A) Il topo sezionato, con frecce che puntano al fegato, all'IVC e alla vena porta. (B) Inserimento del catetere nell'IVC. (C) Pressuring della vena porta che causa ingrossamento e rigidità dei gilli epatici, indicando una perfusione riuscita. (D) Gilli epatici ammorbiditi dopo la perfusione, che indicano il successo della digestione della collagenasi. (E) La posizione della cistifellea nel fegato isolato (freccia che punta alla cistifellea). (F) Rimozione della cistifellea. (G) Fegato lacerato nel mezzo di lavaggio degli epatociti. (H) Miscelazione di 1x Percoll-HBSS con epatociti primari filtrati prima della centrifuga. (I, J) pellet epatocitario primario dopo centrifuga. (K) Risospensione primaria degli epatociti all'interno del mezzo di lavaggio degli epatociti. (L, M) Pellet epatocitario primario formato all'interno del mezzo di lavaggio degli epatociti dopo la centrifuga. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Epatociti primari dopo placcatura. Le immagini sono state scattate dopo (A)1 h, (B, C) 12 h, (D) 24 h, (E) 36 h, (F) 48 h, (G) 72 h e (H) 96 h placcatura epatocitaria primaria. Barra della scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Maggiore purezza degli epatociti primari dopo l'isolamento. L'RNA è stato isolato prima (da tutto il fegato) e dopo (da epatociti primari isolati) l'isolamento primario degli epatociti, seguito dalla trascrizione inversa PCR, secondo un precedente protocollo9. La purezza primaria degli epatociti è stata valutata mediante PCR in tempo reale con primer per marcatori epatocitari (A) TTR, (B) CD95, (C) ASGR1 e (D) ASGR2, mentre anche con marcatore di cellule immunitarie (E) CD45, (F) marcatore di cellule stellate COL1A1 e (G) marcatore di cellule endoteliali TIE2. (H) La mappa di calore è stata generata per i cambiamenti di espressione dei marcatori del tipo cellulare prima e dopo l'isolamento primario degli epatociti. GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate deihydrogenase) è stato utilizzato come controllo interno. I primer usati qui erano per i geni (le sequenze di Primer sono nella Tabella 2. I riferimenti alla sequenza sono citati qui): TTR10; CD9511; ASGR112; ASGR213; CD4514; COL1A115; TIE216; GAPDH17. Grafici e heatmap sono stati generati con GraphPad Prism 8. La barra di errore indica la deviazione standard e la coppia a due code (poiché i campioni primari di epatociti e fegato intero sono stati spaiati perché questo protocollo richiede fegato intatto per cominciare) il significato del t-test è indicato da asterischi (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001). N=7. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Espressione di biomarcatori farmaceutici. L'RNA è stato isolato dall'intero fegato e dall'epatocita primario dopo la placcatura, seguito dalla PCR a trascrizione inversa. L'espressione dei biomarcatori farmaceutici è stata valutata mediante REAL-TIME PCR con primer per (A) ASGR1, (B) ASGR2, (C) CD81 e (D) TLR4. GAPDH è stato utilizzato come controllo interno. I nuovi primer usati qui erano per i geni (le sequenze di Primer sono nella Tabella 2. I riferimenti alla sequenza sono citati qui): CD8118; TLR419. I grafici sono stati generati con GraphPad Prism 8. N = 5. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Sensibilità all'insulina preservata dopo l'isolamento primario degli epatociti. (A) Western blot di p-AKT (S473), AKT, p-FOXO1 (S256), FOXO1 e GAPDH dopo il trattamento con insulina. (B) p-AKT (S473)/AKT in densitometria del western blot. (C) p-FOXO1 (S256)/FOXO1 in densitometria del western blot. Il test di sensibilità all'insulina è stato effettuato 16 ore dopo la placcatura primaria degli epatociti. Gli epatociti primari sono stati affamati per 3 ore nel william's E Medium (GlutaMAX Supplement) senza FBS ma con soluzione antibiotico-antimicotica all'1% e con trattamento insulinico da 100 nM negli ultimi 30 minuti, prima di essere raccolti per la lisi proteica con 1x tampone RIPA. I grafici sono stati generati con GraphPad Prism 8. L'imaging Western blot è stato effettuato con LI-COR Odyssey CLx. La barra di errore indica la deviazione standard e il significato del t-test accoppiato a due code è indicato da asterischi (* p < 0,05; ** p < 0,01). N = 4. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Saggio di produzione di glucosio. (A) Western blot di PEPCK e GAPDH dopo glucagone o forskolin+IBMX trattamento per 10 h. (B) Densitometria del livello di proteina PEPCK rispetto a GAPDH dopo glucagone o forskolina+ibmx trattamento per 10 h. (C) Livello di glucosio rispetto al livello proteico dopo glucagone o forskolina+IBMX trattamento per 10 ore. Il test di produzione di glucosio è stato effettuato 16 ore dopo la placcatura primaria degli epatociti. Gli epatociti primari sono stati affamati per 10 ore in DMEM privo di glucosio e fenolo rosso (aggiunto con 2 mM di L-Glutammina, 2 mM di Piruvato di Sodio, 20 mM di L-Lattato di Sodio, 1% pen Strep), con 50nM di glucagone o 20 μM di forskolina e 200 μM di IBMX. Il mezzo è stato raccolto per la misurazione della concentrazione di glucosio con Glucose Assay Kit, mentre le proteine sono state raccolte per western blot. L'imaging Western blot è stato effettuato con LI-COR Odyssey CLx. La barra di errore indica la deviazione standard e il significato del t-test accoppiato a due code è indicato da asterischi (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001). N = 4. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Tempi di centrifugazione | Rimozione della gabbia toracica | Tamponi di perfusione autoprodotti | Nodo chirurgico | Riscaldamento della lampada | Rivestimento della piastra | Quantità di celle isolate/mouse | Centrifugazione a gradiente | Geni marcatori di purezza | |
| Protocollo attuale | 2 | No | No | No | No | No | 2,5–4 x 107 | Sì | TTR, CD95, ASGR1, ASGR2, CD45, COL1A1, TIE2 |
| Severgnini et al.2. | 4 | Sì | Sì | Sì | Sì | Sì | 1,8–2 x 107 | No | TTR, CD45, COL1A1, TIE2 |
| Gonçalves et al.24. | 5 o 6 | No | No | No | No | Sì | 1–3 x 106 | Sì | CD45, CD95 |
| Li et al.20. | 4 o 5 | No | Sì | Sì | No | Non menzionato | 1–4 x 107 | No | N/D |
| Salem et al.21. | 3 | No | Sì | No | No | Non menzionato | 2 x 107 | Sì | N/D |
| Cabral et al.22. | 3 o 6 (con centrifugazione a gradiente) | No | Sì | Sì | No | Sì/Consigliato | N/D | Opzionale | N/A (Purezza valutata al microscopio ottico) |
| Korelova et al.23. | 3 | No | Sì | Sì | No | Sì | N/D | Sì | N/D |
Tabella 1: Confronto dei protocolli epatocitari primari.
| Primer (Avanti) | Primer (inverso) | Riferimento | ||
| TTR Forward 5'-3': AGCCCTTTGCCTCTGGGAAGAC | TTR Reverse 5'-3': TGCGATGGTGTAGTGGCGATGG | 10 | ||
| CD95 Forward 5'-3': ATGCACACTCTGCGATGAAG | CD95 Reverse 5'-3': CAGTGTTCACAGCCAGGAGA | 11 | ||
| ASGR1 Avanti 5'-3': GAGTCGAAGCTGGAAAAACAG | ASGR1 Reverse 5'-3': CCTTCATACTCCACCCAGTTG | 12 | ||
| ASGR2 Avanti 5'-3': CTACTGGTTTTCTCGGGATGG | ASGR2 Reverse 5'-3': CAAATATGAAACTGGCTCCTGTG | 13 | ||
| CD45 Forward 5'-3': GAACATGCTGCCAATGGTTCT | CD45 Reverse 5'-3': TGTCCCACATGACTCCTTTCC | 14 | ||
| COL1A1 Avanti 5'-3': GAAGCACGTCTGGTTTGGA | COL1A1 Reverse 5'-3': ACTCGAACGGGAATCCATC | 15 | ||
| TIE2 Avanti 5'-3': ATGTGGAAGTCGAGAGGCGAT | TIE2 Reverse 5'-3': CGAATAGCCATCCACTATTGTCC | 16 | ||
| GAPDH Forward 5'-3': CGACTTCAACAGCAACTCCCACTCTTCC | GAPDH Reverse 5'-3': TGGGTGGTCCAGGGTTTCTTACTCCTT | 17 | ||
| CD81 Forward 5'-3': CCAAGGCTGTGGTGAAGACTTTC | CD81 Reverse 5'-3': GGCTGTTCCTCAGTATGGTGGTAG | 18 | ||
| TLR4 Avanti 5'-3': ACCTGGCTGGTTTACACGTC | TLR4 Reverse 5'-3': CTGCCAGAGACATTGCAGAA | 19 | ||
Tabella 2: Elenco dei primer: Primer utilizzati per i geni TTR, CD95, ASGR1, ASGR2, CD45, COL1A1, TIE2, GAPDH, CD81 e TLR4
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Discussion
Sono stati sviluppati vari protocolli primari di isolamento degli epatociti. Inoltre sono stati mantenuti ottimizzati e adattati in base alle diverse esigenze (Tabella 1). I protocolli di isolamento sono generalmente composti da due parti: perfusione (compresa la digestione enzimatica) e purificazione.
La perfusione può essere eseguita con l'intero fegato in vivo 2,20,21,22,23 o con lobi epatici sezionati24. La perfusione di lobi sezionati era generalmente limitata ai lobi sinistro e medio per facilità tecnica. Teoricamente, la perfusione in vivo dovrebbe produrre più epatociti primari a causa dell'uso dell'intero fegato con tutti i lobi. Mantenere il fegato in posizione durante la perfusione può anche ridurre la morte cellulare poiché gli epatociti in vivo possono essere immersi in liquidi, sia nel sangue che nei tamponi di perfusione, in ogni momento durante questa fase.
Anche il mantenimento di condizioni sterili svolge un ruolo importante in questo passaggio. Se la condizione lo consente, è meglio condurre la perfusione in un cappuccio pulito. Tutti gli strumenti con contatto diretto con i tessuti dovrebbero essere sterili, che possono essere ottenuti in autoclave. Al fine di prevenire qualsiasi contaminazione da batteri e funghi, una soluzione antibiotico-antimicotica è stata aggiunta nel terreno di coltura.
L'IVC e la vena porta sono due vasi principali che collegano il fegato con altri organi. La maggior parte dei protocolli utilizza una di queste vene per inserire aghi per la perfusione: IVC 2,20,21,23, vena porta22. La posizione della vena porta è ad angolo inclinato, il che porta a difficoltà nel posizionamento e nella stabilizzazione dell'ago inserito. Una sutura è quindi di solito necessaria per legare l'ago in posizione con un nodo chirurgico, che deve essere fatto con molta attenzione poiché la vena è soggetta a danni. Generalmente, il diametro della vena porta è anche più piccolo dell'IVC, complicando l'inserimento dell'ago. Considerando questo, l'uso di IVC può essere più conveniente, anche se in alcuni protocolli, l'ago è anche annodato chirurgicamente all'IVC20. È stato riportato che la perfusione con inserimento di IVC ha portato a epatociti primari meno vitali rispetto alla vena porta25. Tuttavia, nel presente protocollo, abbiamo utilizzato con successo l'inserimento IVC e la vitalità epatocitaria primaria isolata (>96% in condizioni ottimizzate, misurata con colorazione Trypan Blue secondo il protocollo del produttore) era alta, se non di più, come altri protocolli (varia tra l'80% e il 96% in base ai protocolli e alle condizioni 2,22,23,24).
Ci sono due obiettivi per la fase di perfusione: sciacquare il sangue dai lobi del fegato e digerire il fegato per rilasciare epatociti primari. Per raggiungere questi obiettivi, dovrebbero essere utilizzati almeno due tamponi, uno per il flusso sanguigno (Flux Buffer) e uno per la digestione (Digestion Buffer). La maggior parte dei protocolli prepara flux buffer basato su HBSS e aggiunge collagenasi all'interno per renderlo capace di digestione, come buffer di digestione. La preparazione di questi tamponi richiede molto tempo e i tamponi potrebbero variare leggermente in alcune proprietà delicate, come il pH, da lotto a lotto, introducendo quindi variabili non invitate. Considerando questo, l'utilizzo di buffer disponibili in commercio consente di risparmiare tempo e manodopera preziosa riducendo al minimo queste variabili. Gibco ha sviluppato un protocollo per l'isolamento primario degli epatociti da ratti adulti26, basato sull'uso di liver perfusion medium disponibile in commercio (come flux buffer) e liver digestion medium (come digestion buffer). Topo e ratto, come roditori, condividono elevate somiglianze nelle proprietà del corpo; si possono integrare questi due tamponi ottimizzati per il ratto nell'isolamento degli epatociti primari del topo. Infatti, Gonçalves et al. 24, ha effettuato con successo la perfusione di lobi epatici sezionati con questi tamponi, aumentando la promessa del loro uso nella perfusione epatica in vivo. Qui abbiamo testato con successo liver Perfusion Medium e Liver Digestion Medium nell'attuale protocollo di epatociti primari di topo, che ha prodotto epatociti primari vitali di alta qualità (Figura 3 e Figura 4).
La temperatura del tampone di perfusione determina quanto bene gli epatociti primari sopravvivono all'isolamento. Se la temperatura è troppo alta, la collagenasi all'interno del digestione buffer può avere un'attività ridotta; se troppo bassi, gli epatociti primari possono subire shock da freddo, causando una possibile compromissione della resa di isolamento. Il tempo necessario al tampone per fluire attraverso i tubi di perfusione determina anche la temperatura del tampone quando raggiunge il fegato. Nei protocolli precedenti, veniva utilizzato 40 °C2 o 42 °C21 bagno d'acqua. Questa temperatura può essere soggetta a modifiche in base alle condizioni di laboratorio, come la temperatura ambiente, la lunghezza del tubo di perfusione e il tipo di pompa peristaltica. Nel presente protocollo, dopo più test, abbiamo ottimizzato la temperatura del bagno d'acqua a 45 °C per riscaldare i tamponi.
La purezza degli epatociti primari isolati svolge un ruolo importante negli esperimenti successivi, poiché maggiore è il rapporto di purezza, minore è l'interferenza possibile. Sebbene il fegato sia composto principalmente da epatociti, che rappresentano il 60% -80% in massa27, sono presenti anche vari tipi di altre cellule, come le cellule immunitarie, le cellule stellate e le cellule endoteliali, che sono importanti per le attività immunologiche epatiche. Ognuna di queste cellule potrebbe registrare una potenziale interferenza negli esperimentisuccessivi 28. Ad esempio, le cellule stellate nel fegato rispondono anche alle invasioni di agenti patogeni e alle lesioni epatiche, coinvolgendo nella formazione di cicatrici29. In numeri, il 5%-8% della popolazione totale di cellule epatiche è contribuito dalle cellule stellate30. Normalmente, le cellule stellate sono in quiescenza, ma questo stato può essere rotto quando sono presenti stress. Pertanto, le attività delle cellule stellate possono essere innescate da stress introdotti durante l'isolamento o il successivo trattamento se alcune di queste cellule rimangono nel pool finale di epatociti primari isolati. Altri tipi di cellule contribuiscono anche a una parte considerevole della popolazione di cellule epatiche, come le cellule endoteliali sinusoidali del fegato (LSECs), che rappresentano il 20% della popolazione totale di cellule epatiche31. Come eliminare la presenza di queste cellule è stata una parte sconcertante nel processo di isolamento degli epatociti primari. Pertanto, la purificazione è una parte fondamentale nell'isolamento primario degli epatociti, che di solito sfrutta le differenze di peso e dimensioni tra i diversi tipi di cellule. Ottimizzando la velocità della centrifuga e/o il tampone di purificazione, gli epatociti primari possono essere pellettati fino al fondo del tubo.
Separare le cellule vive dalle cellule morte è anche fondamentale per ottenere epatociti primari sani e un accurato conteggio delle cellule. Di solito, il conteggio del numero di cellule è un must dopo la purificazione poiché i risultati di numerosi esperimenti variano al variare della confluenza cellulare. I reagenti per centrifughe a gradiente possono essere utilizzati in questa fase per adempiere a questa missione, come Percoll. Il 36%-40% di Percoll in centrifuga pellet giù cellule vive e mantiene le cellule morte in surnatante. Abbiamo ottimizzato con successo la velocità e il tempo di centrifugazione per ridurre la popolazione di cellule epatocitarie non primarie nel presente protocollo. I marcatori specifici del tipo cellulare sono stati utilizzati per testare la purezza degli epatociti primari isolati qui, come altri protocolli. I marcatori epatocitari utilizzati qui erano TTR2, CD9524,32, ASGR133 e ASGR234. I marcatori per altri tipi di cellule includono CD45 (marcatore delle cellule immunitarie), COL1A1 (marcatore delle cellule stellate), TIE2 (marcatore delle cellule endoteliali)2,35. Con questi marcatori, gli epatociti primari isolati con il presente protocollo hanno mostrato un alto livello di purezza (Figura 4), paragonabile ai precedenti protocolli 2,24.
Durante la perfusione, la collagenasi nel tampone digestivo allenta l'attaccamento tra le cellule abbattendo il collagene all'interno della matrice extracellulare. Ciò porta a difficoltà nel raggiungimento delle cellule durante la placcatura. La maggior parte dei protocolli precedenti richiede/raccomanda il pre-rivestimento di piastre con collagene 2,22 o gelatina24 per un migliore attaccamento degli epatociti primari. Per quanto ne sappiamo, mentre Salem et al. 21 e Li et al. 20 non hanno discusso questo passaggio, altri protocolli valutati in questo studio hanno chiaramente dichiarato / raccomandato l'uso di piastre pre-rivestite 2,22,23,24. Nel presente protocollo, abbiamo scoperto che il rivestimento della piastra non era richiesto per piastre di determinati tipi. Mentre non siamo sicuri se ciò sia dovuto al fatto che diversi tipi di piastre, specialmente se provengono da produttori diversi, hanno una diversa levigatezza superficiale, e se questa variegata levigatezza, se mai esiste, svolge un ruolo importante nell'attaccamento degli epatociti primari, è utile notare in modo che un altro passaggio (rivestimento della piastra) possa essere saltato per l'efficacia. È anche importante notare che questo protocollo genera una percentuale significativa di epatociti terminali differenziati, ad esempio epatociti diploidi, insieme a epatociti mononucleati, simili alla sinusoide epatica in vivo.
In questo studio, i vantaggi dei precedenti protocolli di isolamento degli epatociti primari sono stati combinati e il processo è stato semplificato il più possibile, utilizzando reagenti disponibili in commercio ed eliminando passaggi non necessari. Le fasi di centrifugazione sono state ridotte con successo a due, che è, per quanto ne sappiamo, il minor numero di protocolli pubblicati. Per confermare la purezza e la bioattività degli epatociti primari isolati, è stato valutato il livello di vari marcatori delle cellule epatiche, confermando che il presente protocollo potrebbe migliorare notevolmente la purezza degli epatociti primari e ridurre altre popolazioni di cellule epatiche, come le cellule immunitarie, le cellule stellate e le cellule endoteliali. L'attività dei biomarcatori farmaceutici come ASGR1, ASGR2, CD81 e TLR4 è stata ben conservata negli epatociti primari isolati con il protocollo attuale, che aveva anche confermato la sensibilità all'insulina e l'attività di produzione di glucosio. La principale limitazione di questo protocollo è la spesa poiché tutti i reagenti sono stati acquistati commercialmente per l'efficienza. Non abbiamo verificato specificamente che la glicogenosi fosse intatta negli epatociti primari isolati utilizzando il presente protocollo, e questo potrebbe richiedere ulteriori ricerche per studi correlati. Questo protocollo ha fasi di perfusione simili a quelle precedenti, come Salem et al.21, Severgnini et al.2 e Li et al.20 e Korelova et al.23, utilizzando l'inserimento IVC. I loro tamponi di perfusione e digestione, che possono richiedere un lavoro extra per la preparazione, possono anche funzionare con il presente protocollo con poche modifiche del tempo di digestione enzimatica. Pertanto, la combinazione di reagenti di protocolli precedenti con passaggi del presente protocollo può anche essere utile, sia nel tempo che economicamente.
In sintesi, è stato sviluppato un protocollo migliorato efficiente in termini di tempo e lavoro per l'isolamento degli epatociti primari dal fegato di topo. Questo protocollo utilizza interamente reagenti disponibili in commercio e può essere completato in ~ 35 minuti, dalla dissezione del topo alla placcatura degli epatociti primari, fornendo così una tecnica utile agli studi primari relativi agli epatociti.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (Grant 5R01HD095512-02 a S.W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Gibco | 10010023 | |
| 10x HBSS | Gibco | 14065-056 | |
| 12-well Plate | FALCON | 353043 | Coating not required |
| 6-well Plate | FALCON | 353046 | Coating not required |
| anti-AKT | Cell Signaling | 2920S | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x), Stabilized | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| anti-FOXO1 | Cell Signaling | 97635S | |
| anti-GAPDH | Cell Signaling | 2118S | |
| anti-p-AKT (S473) | Cell Signaling | 9271L | |
| anti-PEPCK | Santa Cruz | SC-166778 | |
| anti-p-FOXO1 (S256) | Cell Signaling | 84192S | |
| Cell Strainer, 70 µm | CELLTREAT | 229483 | |
| Closed IV Catheter, 24 Gauge 0.75 IN | Becton Dickinson | 383511 | |
| DMEM, no glucose, no glutamine, no phenol red | ThermoFisher Scientific | A1443001 | |
| EnzyChrom Glucose Assay Kit | BioAssay Systems | EBGL-100 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
| Forskolin | MilliporeSigma | F3917-10MG | |
| Glucagon | Sigma-Aldrich | G2044 | |
| Goat Anti-mouse IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-68070 | |
| Goat Anti-rabbit IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-32211 | |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Software | NA | |
| Hepatocyte Wash Medium | Gibco | 17704-024 | |
| IBMX | Cell Signaling | 13630S | |
| Insulin | Lilly | NDC 0002-8215-01 | |
| Ketamine HCL (100 mg/mL) | Hospira Inc | NDC 0409-2051-05 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Liver Digest Medium | Gibco | 17703-034 | Aliquot within tissue culture hood to 25 mL each in 50 mL tube, and keep in -20 °C freezer |
| Liver Perfusion Medium | Gibco | 17701-038 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140122 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Peristaltic Pump | Gilson | Minipuls 2 | Capable of pumping at 4 mL/min |
| Petri Dish | Fisherbrand | 08-757-12 | |
| Refrigerated Centrifuge | Sorvall | Legend RT | Capable to centrifuge 50 mL tube at 4 °C |
| Sodium L-Lactate | Sigma-Aldrich | L7022 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| Syringe Filter, PVDF 0.45 µm 30mm diameter | CELLTREAT | 229745 | |
| Syringe, 0.5 mL | Becton Dickinson | 329461 | |
| Syringe, 60 mL | Becton Dickinson | 309653 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Tube, 15 mL | Corning | 430052 | |
| Tube, 50 mL | Corning | 430290 | |
| Water Bath Tank | Corning | CLS6783 | Or any water bath tank capable of heating up to 45 °C |
| William’s E Medium (GlutaMAX Supplement) | Gibco | 32551020 | |
| Xylozine (100 mg/mL) | Vetone Anased LA | NDC13985-704-10 |
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