Summary
Primære hepatocytter er et værdifuldt redskab til at studere leverrespons og metabolisme in vitro. Ved hjælp af kommercielt tilgængelige reagenser blev der udviklet en forbedret tids- og arbejdseffektiv protokol til musens primære hepatocytisolering.
Abstract
Primære hepatocytter anvendes i vid udstrækning i leverin vitro-forskning , især i glukosemetabolismeundersøgelser. En basisteknik er blevet tilpasset baseret på forskellige behov, som tid, arbejdskraft, omkostninger og primær hepatocytbrug, hvilket resulterer i forskellige primære hepatocytisoleringsprotokoller. Imidlertid er de mange trin og tidskrævende reagenspræparater i primær hepatocytisolering store ulemper for effektiviteten. Efter at have sammenlignet forskellige protokoller for deres fordele og ulemper blev fordelene ved hver enkelt kombineret, og en hurtig og effektiv primær hepatocytisoleringsprotokol blev formuleret. Inden for kun ~ 35 minutter kunne denne protokol give lige så meget, hvis ikke mere, sunde primære hepatocytter som andre protokoller. Endvidere validerede glukosemetabolismeforsøg udført ved anvendelse af de isolerede primære hepatocytter nytten af denne protokol i in vitro-levermetabolismeundersøgelser . Vi gennemgik og analyserede også i vid udstrækning betydningen og formålet med hvert trin i denne undersøgelse, så fremtidige forskere yderligere kan optimere denne protokol baseret på behov.
Introduction
Leveren tjener som et af de vigtigste organer i hvirveldyrets krop på grund af den afgørende rolle, den spiller i mange livsstøttende funktioner som fordøjelse af mad, blodcirkulation og afgiftning. Brug af musens primære hepatocyt in vitro-kultur bliver stadig mere populær i undersøgelser af kulhydratmetabolisme og leverkarcinom. Derfor er det vigtigt at udvikle en bekvem metode til musens primære hepatocytisolering, samtidig med at den medfødte fysiologiske funktion opretholdes. På grund af sin funktion som et knudepunkt for glukosemetabolisme er leveren også central for glukoseproduktion og opbevaring1. Eksperimenter med primære hepatocytter in vitro er et must for de fleste glukosemetabolismeundersøgelser. Derfor har forskellige forskergrupper i årevis udviklet protokoller til musenes primære hepatocytisolering.
Den generelle procedure for musehpatocytisolering er først at skylle blod ud i leveren med en isosmotisk væske, såsom fosfatbufret saltvand (PBS) eller Hanks 'Balanced Salt Solution (HBSS) og derefter bruge collagenaseholdig opløsning til dissociere hepatocytter. Disse protokoller deler en generel procedure, men adskiller sig i reagenser og trin baseret på forskellige behov. Det tager dog tid at forberede nødvendige reagenser og udføre isolationstrin. Ved udviklingen af denne protokol blev effektivitet sat som en prioritet, idet alle reagenser var klar til brug og tilgængelige fra markedet og så få trin som muligt. Det overordnede mål med denne protokol er at tilvejebringe en hurtig og arbejdseffektiv metode til at isolere primære hepatocytter fra mus uden at bringe den isolerede primære hepatocytrenhed og levedygtighed i fare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer blev godkendt af Johns Hopkins Animal Care and Use Committee. C57BL/6 hunmus (8 uger gamle) blev anvendt i denne undersøgelse.
1. Forberedelse:
- Bland Williams E Medium (GlutaMAX Supplement) med 10% FBS og 1% antibiotika-antimykotisk opløsning for at gøre kulturmediet.
- Filtrer 25 ml kollagenase-dispase medium (f.eks. Liver Digest Medium) gennem et 0,45 μm sprøjtefilter for at fjerne partikelaffald.
- Varm 50 ml dobbeltdestilleretH20(ddH20), 35 ml perfusionsmedium (f.eks. leverperfusionsmedium) (eller 50 ml første gang ved hjælp af denne protokol) og 25 ml filtreret collagenasedistpasemedium i et 45 °C vandbad i 30 minutter.
- Inden for en steril vævskulturhætte blandes 2 ml 10x HBSS og 18 ml Percoll i et 50 ml rør for at fremstille 20 ml 1x Percoll-HBSS og opbevares på is eller 4 ° C.
BEMÆRK: 1x Percoll-HBSS kan opbevares ved 4 °C i mindst 6 måneder. - Inden for en steril vævskulturhætte hældes 30 ml vaskemedium (f.eks. Hepatocyt Wash Medium) i en ren petriskål og opbevares på is.
- Nedsænk pumperøret i vandet i et 45 °C vandbad. Resultaterne er mest pålidelige, hvis stuetemperaturen er på 25 °C.
- Forbered 2 ml 1x anæstetika ved at blande 225 μL Ketamin HCL, 93,75 μL Xylazin og 1681 μL 1x PBS.
- Anæstesi en mus ved hjælp af en godkendt metode. Her blev musen intraperitonealt injiceret med 150 μL 1x anæstetika. Udfør testene for tab af reflekser såsom reaktion på tåklemning for at sikre fuld anæstesi.
- Fastgør musen på ryggen på dissektionspuden med fire lemmer ved enten at fastgøre eller bruge vandtæt tape eller andre metoder, der er godkendt af institutionens Animal Care and Use Committee (eller tilsvarende).
- Forbered steriliserede tang og saks til dissektion. For at undgå mulig forurening skal du udføre alle trin i en steril hætte.
2. Fremgangsmåde:
- Brug en peristaltisk pumpe til at begynde at pumpe opvarmet ddH2O med en hastighed på 4 ml/min i 5 minutter. Skift pumperøret fra vand til et opvarmet perfusionsmedium.
- Desinficere den anæstetiserede muss mave med 70% EtOH og skær op med en saks for at udsætte leveren, portalvenen og ringere vena cava (IVC).
- Stop den peristaltiske pumpe. Indsæt et 24 G-kateter (f.eks. Lukket IV-kateter, 24 G, 0,75 IN) i IVC. Begynd at pumpe og skær portalvenen åben.
- Fortsæt med at pumpe, indtil den udskyllede væske er klar (ca. 3-5 min). Tryk på portalvenen hvert minut for at lade væske nå hvert hjørne af leveren. Pas på ikke at lade luftbobler komme ind i IVC.
BEMÆRK: Dette trin er at skylle så meget blod som muligt ud af leveren. - Skift pumperøret fra perfusionsmediet til collagenase-dispase-mediet. Fortsæt med at pumpe, indtil alle 25 ml af collagenase-dispase-mediet er udtømt, mens du udfører trin 2.6.
- Tryk på portalvenen hvert minut for at lade væske nå hvert hjørne af leveren.
BEMÆRK: På dette stadium er det fuldstændige tab af blod dødeligt for musen. Musens død kan bekræftes af mangel på hjerteslag efter eksperimentet. Bortskaf slagtekroppen i henhold til facilitetspolitikker. - Isoler hele leveren ud uden galdeblære til 30 ml vaskemediet i petriskålen på is.
- Riv det op i stykker med tang for at frigive primære hepatocytter i opløsning. Dette trin ville gøre vaskemediet til en overskyet opløsning fuld af frigivne primære hepatocytter og små leverstykker.
- Filtrer den overskyede opløsning i trin 2.8 gennem en 70 μm cellesil ind i 20 ml 1x Percoll-HBSS i et 50 ml rør på is. Bland ved at vende røret 20 gange.
- Centrifuge ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C.
- Inden for vævskulturhætten aspirerer supernatanten. Vask pillen med koldt 30 ml vaskemedium.
- Centrifuge ved 50 x g i 5 min ved 4 °C.
- Fjern supernatanten, og ophæft pelleten igen i 25 ml af dyrkningsmediet (eller passende andre volumener) i vævskulturhætten.
- Tæl cellenummeret og plade cellerne på ønskede dyrkningsplader i henhold til det eksperimentelle design.
BEMÆRK: Primære hepatocytter, der er korrekt isoleret fra en 8 uger gammel mus, er normalt tilstrækkelige til at blive belagt på fire 6-brønds plader eller fire 12-brøndsplader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at teste effektiviteten blev den nuværende primære hepatocytisoleringsprotokol udført på 8 uger gamle C57BL/6-hungren. Vedhæftningen og renheden af isolerede primære hepatocytter blev testet. Primær hepatocytisolering anvendes til en lang række eksperimenter med leverfysiologi, såsom leverlægemiddeleffekter og glukosemetabolisme, farmaceutisk biomarkøraktivitet2, insulinfølsomhed og glukoseproduktion. Derfor blev aktiviteterne af de primære hepatocytter isoleret med denne protokol testet i de følgende eksperimenter.
Belægning var ikke påkrævet for primær hepatocytfastgørelse i denne protokol
Isolerede primære hepatocytter blev belagt med 5 x 105 celler/brønd på en 6-brønds plade. Efter 1 time blev der observeret en fast fastgørelse, og primære hepatocytter udvidede sig fuldt ud 12 timer efter plettering (figur 3). Dette indikerede, at celler 12 timer efter plettering var klar til at blive brugt til eksperimenter. Baseret på kernemorfologien af musehpatocytter i leveren blev mononukleære hepatocytter beriget ved grænser, mens binukleære / polynukleare hepatocytter, en signatur af terminal differentiering, var i midten 3,4. En betydelig mængde afbildede celler viste typisk dual-nucleus (diploid) morfologi, hvilket indikerer succesen med at isolere og rense levende primære hepatocytter. Dette indikerer også, at kollagenbelægning ikke er et krav til primær hepatocytfastgørelse med denne protokol.
Renhed blev beriget i den isolerede primære hepatocytpopulation
Forskellige celletypespecifikke genmarkører er blevet anvendt i tidligere protokoller til at kontrollere isoleret primær hepatocytrenhed (tabel 1). TTR (Transthyretin), CD95 (Cluster of differentiation 95, også kendt som Fas), ASGR1 (Asialoglycoprotein receptor 1) og ASGR2 er markører for hepatocytter. Efter isolation blev mRNA-niveauerne af disse hepatocytmarkører signifikant øget sammenlignet med hele leveren (figur 4A-D,H).
Denne protokol reducerede også i høj grad interferensen fra andre leverceller. Tilstedeværelsen af immunceller, stellatceller og endotelceller var lavere, vist ved det kraftige fald i mRNA-niveauer af CD45 (immuncellemarkør), COL1A1 (kollagen, type I, alfa 1, stellatcellemarkør) og TIE2 (Tunica interna endotelcellekinase, endotelcellemarkør) sammenlignet med hele leveren (figur 4E-H ). Disse tyder på, at denne protokol kunne rense den primære hepatocytpopulation fra leverceller og dermed reducere den mulige interferens fra andre celletyper i eksperimenter.
Aktiviteten af farmaceutiske biomarkører blev bevaret
Biomarkører på hepatocytter er blevet anvendt i vid udstrækning til lægemiddelmålretning og levering. Aktivitetsbevarelsen af farmaceutiske biomarkører er således et nøglepunkt i primær hepatocytisolering og er en standard til at teste nytten af primær hepatocytisolering2. Hepatocytmarkører ASGR1 og ASGR2 anvendes på denne måde2. Vi testede først tidsforløbsudtryksniveauet for disse to markører før og efter primær hepatocytbelægning. Efter plettering faldt deres mRNA-niveau betydeligt med tiden, men niveauerne forblev betydelige sammenlignet med hele leveren indtil 12 timers tidspunktet efter plettering, især for ASGR1 (figur 5A,B). Ekspressionstendensen var i overensstemmelse med en tidligere rapport2 og indikerede sammenlignelig primær hepatocytsundhed. Forskellige patogener er rettet mod CD81, et hepatocytmembranbundet protein, for at lette deres adgang til celler og infektion, som hepatitisvirus5, Plasmodium falciparum og Plasmodium yoelii6. Andre hepatocytmembran-lokaliserede proteiner, som TLR4 (Toll-lignende receptor 4), er også målrettet mod patogener og vigtige for hepatocytimmunrespons7. Efter plettering var ekspressionsniveauet for CD81 konsistent indtil 48 timer (figur 5C). TLR4-ekspressionsniveauet steg generelt, men først efter 48 timer, da det nåede et niveau, der var højere end in vivo (figur 5D). Disse tyder på, at primære hepatocytter isoleret af denne protokol også kan anvendes til CD81- og TLR4-undersøgelser inden for mindst 48 timer efter plettering. Tilsammen indikerer disse resultater, at isolerede primære hepatocytter er gyldige til brug i undersøgelser relateret til farmaceutiske biomarkører. Det er værd at bemærke, at RNA- og proteinniveauer kan være inkonsekvente på grund af påvirkninger fra posttranskriptionelle aktiviteter som signalpeptidinduceret RNA-migration, posttranslationel modifikation og / eller proteinnedbrydning. Derfor kan proteinniveau og bioaktivitetsverifikation af farmaceutiske biomarkører identificeret ved mRNA være nødvendig, hvis det kræves af det eksperimentelle paradigme.
Isolerede primære hepatocytter var insulinfølsomme
Primær hepatocytpræstation i eksperimenter med glukosemetabolisme blev også analyseret. Insulin, et hormon, der spiller en central rolle i glukosemetabolismen, nedsætter glukoseniveauet og fremmer optagelse og opbevaring af leverglukose gennem fosforylering akt og FOXO1 (Forkhead box O1). Derfor blev der udført et insulinfølsomhedsassay med isolerede primære hepatocytter. Efter 16 timer blev cellerne sultet i 3 timer med et serumfrit medium. Ved de sidste 0,5 timers sult blev 100 nM insulin administreret til kulturmediet. Som vist i figur 6A-C fremmede insulin signifikant fosforyleringen af både AKT ved Ser473 og FOXO1 ved Ser256, hvilket indikerer følsomheden af primære hepatocytter over for insulin. Dette tyder på, at de isolerede primære hepatocytter fra denne protokol er nyttige i insulin/glukosemetabolismestudier.
Isolerede primære hepatocytter var i stand til glukoseproduktion
Ikke alene er de et center for glukoseopbevaring, men hepatocytter er også ansvarlige for glukoseproduktion. For at teste, om de primære hepatocytter, vi isolerede, er nyttige i undersøgelser af glukoseproduktion, blev cellerne sultet i 10 timer i nærværelse af glukagon for at stimulere glukoseproduktionen. Sultemediet blev derefter indsamlet til glukoseanalyse, mens celler blev høstet til western blot. Phosphoenolpyruvatcarboxykinase (PEPCK) er en væsentlig komponent i leverglukoseproduktionen, der styrer dens hastighed8. Proteinniveauet af PEPCK blev signifikant øget efter glucagonbehandling, hvilket tyder på, at glukoseproduktionsvejen blev aktiveret (figur 7A,B). Denne aktivering blev yderligere bekræftet af et øget niveau af glukoseproduktion (figur 7C). Dette fænomen blev også bekræftet med andre glukoseproduktionsstimulatorer som forskolin plus IBMX (figur 7A-C). På grund af begrænsningen af dette eksperiment kunne vi imidlertid ikke kontrollere, om glukoseproduktionen var eksklusiv via glukoneogenese, eller om der også er en komponent i glycogenolyse.
Figur 1: Bænkopsætning. (A) Bænkopsætningen til primær hepatocytisolering. (B) Den tegneserieagtige bænkopsætning til primær hepatocytisolering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Musedissektion, perfusion og primær hepatocytrensning. (A) Den dissekerede mus med pile, der peger på leveren, IVC og portalvenen. B) Indsættelse af kateter i IVC. (C) Trykportalvene, der forårsager forstørrelse og stivhed af leverlopes, hvilket indikerer vellykket perfusion. (D) Blødgjorte leverlopes efter perfusion, hvilket indikerer succesen med kollagenasefordøjelsen. (E) Galdeblærens position i den isolerede lever (pil, der peger på galdeblæren). (F) Fjernelse af galdeblæren. (G) Revet lever i hepatocytvaskemiddel. H) Blanding af 1x Percoll-HBSS med filtreret primær hepatocyt før centrifuge. (I, J) primær hepatocytpellet efter centrifuge. K) Primær hepatocytresuspension inden for hepatocytvaskemediet. (L, M) Primær hepatocytpellet dannet i hepatocytvaskemedium efter centrifuge. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Primære hepatocytter efter plettering. Billeder blev taget efter (A)1 h, (B, C) 12 h, (D) 24 h, (E) 36 h, (F) 48 h, (G) 72 h og (H) 96 h primær hepatocytbelægning. Skalabjælke = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Forbedret primær hepatocytrenhed efter isolering. RNA blev isoleret før (fra hele leveren) og efter (fra isolerede primære hepatocytter) primær hepatocytisolering efterfulgt af omvendt transkription PCR i henhold til en tidligere protokol9. Den primære hepatocytrenhed blev vurderet ved PCR i realtid med primere til hepatocytmarkører (A) TTR, (B) CD95, (C) ASGR1 og (D) ASGR2, mens også med immuncellemarkør (E) CD45, (F) Stellatcellemarkør COL1A1 og (G) endotelcellemarkør TIE2. (H) Heatmap blev genereret for ekspressionsændringer af celletypemarkører før og efter primær hepatocytisolering. GAPDH (glyceraldehyd 3-phosphatdehydrogenase) blev anvendt som intern kontrol. Primere, der blev brugt her, var til gener (Primersekvenser er i tabel 2. Sekvensreferencer er citeret her): TTR10; CD9511; ASGR112; ASGR213; CD4514; COL1A115; TIE216; GAPDH17. Grafer og heatmap blev genereret med GraphPad Prism 8. Fejllinjen angiver standardafvigelse, og to-halet uparret (da primære hepatocyt- og hele leverprøver blev uparret, fordi denne protokol kræver intakt lever til at begynde med) t-test signifikans er angivet med stjerner (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001). N=7. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Ekspression af farmaceutiske biomarkører. RNA blev isoleret fra hele leveren og primær hepatocyt efter plettering efterfulgt af omvendt transkription PCR. Ekspressionen af farmaceutiske biomarkører blev vurderet ved PCR i realtid med primere til (A) ASGR1, (B) ASGR2, (C) CD81 og (D) TLR4. GAPDH blev brugt som intern kontrol. Nye primere, der blev brugt her, var til gener (Primersekvenser er i tabel 2. Sekvenshenvisninger er citeret her): CD8118; TLR419. Grafer blev genereret med GraphPad Prism 8. N = 5. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Insulinfølsomhed bevaret efter primær hepatocytisolering. (A) Western blot af p-AKT (S473), AKT, p-FOXO1 (S256), FOXO1 og GAPDH efter insulinbehandling. (B) p-AKT (S473)/AKT i densitometri af western blot. C) p-FOXO1 (S256)/FOXO1 i densitometri af western blot. Insulinfølsomhedsassay blev udført 16 timer efter primær hepatocytbelægning. Primære hepatocytter blev sultet i 3 timer i Williams E Medium (GlutaMAX Supplement) uden FBS, men med 1% antibiotika-antimykotisk opløsning og med 100 nM insulinbehandling i de sidste 30 minutter, før de blev høstet til proteinlyse med 1x RIPA-buffer. Grafer blev genereret med GraphPad Prism 8. Western blot-billeddannelse blev udført med LI-COR Odyssey CLx. Fejllinjen angiver standardafvigelse, og to-halet parret t-test-signifikans er angivet med stjerner (* p < 0,05; ** p < 0,01). N = 4. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Glukoseproduktionsassay. (A) Western blot af PEPCK og GAPDH efter glucagon eller forskolin+IBMX-behandling i 10 timer. (B) Densitometri af PEPCK-proteinniveau sammenlignet med GAPDH efter enten glucagon- eller forskolin+IBMX-behandling i 10 timer. (C) Glukoseniveau sammenlignet med proteinniveau efter enten glukagon- eller forskolin+IBMX-behandling i 10 timer. Glukoseproduktionsassay blev udført 16 timer efter primær hepatocytbelægning. Primære hepatocytter blev sultet i 10 timer i glucose- og phenolrødfri DMEM (tilsat 2 mM L-glutamin, 2 mM natriumpyruvat, 20 mM natrium-L-lactat, 1% Pen Strep), med enten 50nM glucagon eller 20 μM forskolin og 200 μM IBMX. Mediet blev høstet til glukosekoncentrationsmåling med Glucose Assay Kit, mens protein blev høstet til western blot. Western blot-billeddannelse blev udført med LI-COR Odyssey CLx. Fejllinjen angiver standardafvigelse, og to-halet parret t-test-signifikans er angivet med stjerner (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001). N = 4. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Centrifugeringstider | Fjernelse af ribbenbur | Perfusionsbuffere selvfremstilling | Kirurgisk knude | Lampe Opvarmning | Pladebelægning | Isoleret cellemængde/mus | Gradient centrifugering | Renhedsmarkørgener | |
| Nuværende protokol | 2 | Nej | Nej | Nej | Nej | Nej | 2,5-4 x 107 | Ja | TTR, CD95, ASGR1, ASGR2, CD45, COL1A1, TIE2 |
| Severgnini et al.2. | 4 | Ja | Ja | Ja | Ja | Ja | 1,8-2 x 107 | Nej | TTR, CD45, COL1A1, TIE2 |
| Gonçalves et al.24. | 5 eller 6 | Nej | Nej | Nej | Nej | Ja | 1-3 x 106 | Ja | CD45, CD95 |
| Li et al.20. | 4 eller 5 | Nej | Ja | Ja | Nej | Ikke nævnt | 1-4 x 107 | Nej | NIELSEN |
| Salem et al.21. | 3 | Nej | Ja | Nej | Nej | Ikke nævnt | 2 x 107 | Ja | NIELSEN |
| Cabral et al.22. | 3 eller 6 (med gradient centrifugering) | Nej | Ja | Ja | Nej | Ja/Anbefalet | NIELSEN | Valgfri | N/A (Renhed vurderet ved lysmikroskopi) |
| Korelova et al.23. | 3 | Nej | Ja | Ja | Nej | Ja | NIELSEN | Ja | NIELSEN |
Tabel 1: Sammenligning af primære hepatocytprotokoller.
| Primer (Fremad) | Primer (omvendt) | Henvisning | ||
| TTR Forward 5'-3': AGCCCTTTGCCTCTGGGAAGAC | TTR Omvendt 5'-3': TGCGATGGTGTAGTGGCGATGGGG | 10 | ||
| CD95 Forward 5'-3': ATGCACACTCTGCGATGAAG | CD95 Omvendt 5'-3': CAGTGTTCACAGCCAGGAGA | 11 | ||
| ASGR1 Forward 5'-3': GAGTCGAAGCTGGAAAAACAG | ASGR1 Omvendt 5'-3': CCTTCATACTCCACCCAGTTG | 12 | ||
| ASGR2 Forward 5'-3': CTACTGGTTTTCTCGGGGGGGG | ASGR2 Omvendt 5'-3': CAAATATGAAACTGGCTCCTGTG | 13 | ||
| CD45 Forward 5'-3': GAACATGCTGCCAATGGTTCT | CD45 Omvendt 5'-3': TGTCCCACATGACTCCTTTCC | 14 | ||
| COL1A1 Forward 5'-3': GAAGCACGTCTGGTTTGGA | COL1A1 Omvendt 5'-3': ACTCGAACGGGAATCCATC | 15 | ||
| TIE2 Forward 5'-3': ATGTGGAAGTCGAGAGGCGAT | TIE2 Omvendt 5'-3': CGAATAGCCATCCACTATTGTCC | 16 | ||
| GAPDH Forward 5'-3': CGACTTCAACAGCAACTCCCACTCTTCC | GAPDH Omvendt 5'-3': TGGGTGGTCCAGGGTTTCTTACTCCTT | 17 | ||
| CD81 Forward 5'-3': CCAAGGCTGTGGTGAAGACTTTC | CD81 Omvendt 5'-3': GGCTGTTCCTCAGTATGGTGGTAG | 18 | ||
| TLR4 Forward 5'-3': ACCTGGCTGGTTTACACGTC | TLR4 Omvendt 5'-3': CTGCCAGAGACATTGCAGAA | 19 | ||
Tabel 2: Liste over primere: Primere anvendt til gener TTR, CD95, ASGR1, ASGR2, CD45, COL1A1, TIE2, GAPDH, CD81 og TLR4
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forskellige primære hepatocytisoleringsprotokoller er blevet udviklet. De er også blevet holdt optimeret og tilpasset ud fra forskellige behov (tabel 1). Isolationsprotokoller er generelt sammensat af to dele: perfusion (herunder enzymfordøjelse) og oprensning.
Perfusionen kan udføres med hele leveren in vivo 2,20,21,22,23 eller med dissekerede leverlapper 24. Perfusionen af dissekerede lobes var generelt begrænset til venstre og medium lobes for teknisk lethed. Teoretisk set bør in vivo perfusion give flere primære hepatocytter på grund af brugen af hele leveren med alle lobes. At holde leveren på plads under perfusion kan også reducere celledød, da hepatocytter in vivo kan bades i væske, enten blod eller perfusionsbuffere, til enhver tid i løbet af dette trin.
Vedligeholdelsen af sterile forhold spiller også en vigtig rolle i dette trin. Hvis tilstanden tillader det, er det bedre at udføre perfusion i en ren hætte. Alle værktøjer med direkte berøring til væv skal være sterile, hvilket kan opnås ved autoklave. For at forhindre forurening fra bakterier og svampe blev der tilsat en antibiotikum-antimykotisk opløsning i kulturmediet.
IVC og portalvenen er to hovedkar, der forbinder leveren med andre organer. De fleste protokoller bruger en af disse vener til at indsætte nåle til perfusion: IVC 2,20,21,23, portalvene 22. Portalvenens position er i en skæv vinkel, hvilket fører til vanskeligheder med at placere og stabilisere den indsatte nål. En sutur er således normalt nødvendig for at binde nålen på plads med en kirurgisk knude, hvilket skal gøres meget omhyggeligt, da venen er tilbøjelig til at blive beskadiget. Generelt er diameteren af portalvenen også mindre end IVC, hvilket komplicerer nåleindsættelsen. I betragtning af dette kan brugen af IVC være mere praktisk, selvom nålen i nogle protokoller også er kirurgisk knyttet til IVC20. Det er blevet rapporteret, at perfusion med IVC-indsættelse resulterede i mindre levedygtige primære hepatocytter end portalvene25. I den nuværende protokol brugte vi imidlertid med succes IVC-indsættelse, og den isolerede primære hepatocytbreddeevne (>96% under optimerede forhold målt med Trypan Blue-farvning i henhold til producentens protokol) var lige så høj, hvis ikke mere, som andre protokoller (varierer mellem 80% og 96% baseret på protokoller og betingelser 2,22,23,24).
Der er to mål for perfusionstrinnet: at skylle blod ud af leverlopper og fordøje leveren for at frigive primære hepatocytter. For at nå disse mål bør der anvendes mindst to buffere, en til blodgennemstrømning (Fluxbuffer) og en til fordøjelse (fordøjelsesbuffer). De fleste af protokollerne forbereder HBSS-baseret Flux Buffer og tilføjer collagenase indeni for at gøre det i stand til fordøjelse som fordøjelsesbuffer. Forberedelsen af disse buffere er tidskrævende, og bufferne kan variere lidt i nogle sarte egenskaber, som pH, fra batch til batch og derfor indføre ubudne variabler. I betragtning af dette sparer brugen af kommercielt tilgængelige buffere værdifuld arbejdskraft og tid, samtidig med at disse variabler minimeres. Gibco udviklede en protokol til primær hepatocytisolering fra voksne rotter26, baseret på brugen af kommercielt tilgængeligt leverperfusionsmedium (som fluxbuffer) og leverfordøjelsesmedium (som fordøjelsesbuffer). Mus og rotte, som gnavere, deler høje ligheder i kropsegenskaber; man kan integrere disse to rotteoptimerede buffere i musens primære hepatocytisolering. Faktisk Gonçalves et al. 24, med succes udført perfusion af dissekerede leverlober med disse buffere, hvilket hævede løftet om deres anvendelse i leverperfusion in vivo. Her testede vi med succes Liver Perfusion Medium og Liver Digestion Medium i den nuværende muse primære hepatocytprotokol, hvilket gav levedygtige primære hepatocytter af høj kvalitet (figur 3 og figur 4).
Temperaturen på perfusionsbufferen bestemmer, hvor godt primære hepatocytter overlever isolationen. Hvis temperaturen er for høj, kan kollagenasen i fordøjelsesbufferen have nedsat aktivitet; hvis de er for lave, kan de primære hepatocytter lide af kuldechok, hvilket forårsager mulig kompromitteret isolationsudbytte. Den tid, bufferen tager at strømme gennem perfusionsrør, bestemmer også buffertemperaturen, når den når leveren. I tidligere protokoller blev der anvendt 40 °C2 eller 42 °C21 vandbad. Denne temperatur kan ændres baseret på laboratorieforhold, som miljøtemperaturen, længden af perfusionsrøret og typen af peristaltisk pumpe. I den nuværende protokol optimerede vi efter flere gange test vandbadets temperatur til at være 45 °C for at opvarme bufferne.
Renheden af isolerede primære hepatocytter spiller en vigtig rolle i efterfølgende eksperimenter, da jo højere renhedsforholdet er, desto mindre mulig interferens. Selvom leveren hovedsageligt består af hepatocytter, der tegner sig for 60% -80% af masse27, er forskellige typer andre celler også til stede, som immunceller, stellatceller og endotelceller, som er vigtige for leverimmunologiske aktiviteter. Hver af disse celler kunne sende en potentiel interferens i senere eksperimenter28. For eksempel reagerer stellatceller i leveren også på patogeninvasioner og leverskader, der involverer ardannelse29. I tal er 5% -8% af den samlede levercellepopulation bidraget af stellatceller30. Normalt er stellatceller i stilhed, men denne status kan brydes, når der er spændinger til stede. Derfor kan stellatcelleaktiviteter udløses af belastninger, der indføres under isolation eller efterfølgende behandling, hvis nogle af disse celler forbliver i den endelige isolerede primære hepatocytpool. Andre typer celler bidrager også til en betydelig del af levercellepopulationen, såsom leversydusoide endotelceller (LDC'er), der tegner sig for 20% af den samlede levercellepopulation31. Hvordan man eliminerer tilstedeværelsen af disse celler har været en forvirrende del i den primære hepatocytisoleringsproces. Derfor er oprensning en nøgledel i primær hepatocytisolering, som normalt drager fordel af vægt- og størrelsesforskellene mellem forskellige typer celler. Ved at optimere centrifugehastigheden og/eller renselsesbufferen kan primære hepatocytter pelleteres ned til bunden af røret.
Adskillelse af levende celler fra døde celler er også afgørende for at opnå sunde primære hepatocytter og nøjagtig celletælling. Normalt er tælling af celletal et must efter oprensning, da resultaterne af adskillige eksperimenter varierer, da cellesammenløbet ændres. Gradientcentrifugereagenser kan bruges i dette trin til at opfylde denne mission, ligesom Percoll. 36%-40% af Percoll i centrifuge pellets ned levende celler og holder døde celler i supernatant. Vi optimerede med succes centrifugeringshastigheden og -tiden for at reducere den ikke-primære hepatocytcellepopulation i den nuværende protokol. Celletypespecifikke markører blev brugt til at teste renheden af isolerede primære hepatocytter her, ligesom andre protokoller. De hepatocytmarkører, der blev brugt her, var TTR2, CD9524,32, ASGR133 og ASGR234. Markører for andre typer celler omfatter CD45 (immuncellemarkør), COL1A1 (Stellatcellemarkør), TIE2 (Endotelcellemarkør)2,35. Med disse markører viste de primære hepatocytter isoleret med den nuværende protokol et højt renhedsniveau (figur 4), der kan sammenlignes med de tidligere protokoller 2,24.
Under perfusion løsner kollagenase i fordøjelsesbuffer tilknytningen mellem celler ved at nedbryde kollagen i den ekstracellulære matrix. Dette fører til vanskeligheder med celleopnåelse under plettering. De fleste af de tidligere protokoller kræver/anbefaler forbelægning af plader med kollagen 2,22 eller gelatine24 for bedre fastgørelse af primære hepatocytter. Så vidt vi ved, mens Salem et al. 21 og Li et al. 20 diskuterede ikke dette trin, andre protokoller, der blev vurderet i denne undersøgelse, angav klart/ anbefalede brugen af præbelagte plader 2,22,23,24. I denne protokol fandt vi, at pladebelægningen ikke var påkrævet for plader af visse typer. Selvom vi ikke er sikre på, om dette skyldtes, at forskellige typer plader, især hvis de er fra forskellige producenter, har forskellig overfladeglathed, og om denne varierede glathed, hvis den nogensinde eksisterer, spiller en vigtig rolle i primær hepatocytfastgørelse, er det gavnligt at bemærke, så et andet trin (pladebelægning) kunne springes over for effektivitet. Det er også vigtigt at bemærke, at denne protokol genererer en betydelig andel af terminalt differentierede, f.eks. diploide hepatocytter sammen med mononukleære hepatocytter, svarende til in vivo hepatisk sinusoid.
I denne undersøgelse blev fordelene ved tidligere primære hepatocytisoleringsprotokoller kombineret, og processen blev forenklet så meget som muligt ved anvendelse af kommercielt tilgængelige reagenser og eliminering af unødvendige trin. Centrifugeringstrinnene blev med succes reduceret til to, hvilket efter vores viden er det færreste i offentliggjorte protokoller. For at bekræfte renheden og bioaktiviteten af isolerede primære hepatocytter blev niveauet af forskellige levercellemarkører vurderet, hvilket bekræftede, at denne protokol i høj grad kunne forbedre den primære hepatocytrenhed og reducere andre levercellepopulationer, såsom immunceller, stellatceller og endotelceller. Aktiviteten af farmaceutiske biomarkører som ASGR1, ASGR2, CD81 og TLR4 var velbevaret i primære hepatocytter isoleret med den nuværende protokol, som også havde bekræftet insulinfølsomhed og glukoseproduktionsaktivitet. Hovedbegrænsningen i denne protokol er udgiften, da alle reagenser blev købt kommercielt for effektivitet. Vi kontrollerede ikke specifikt, at glykogenose var intakt i primære hepatocytter isoleret ved hjælp af denne protokol, og dette kan kræve yderligere forskning til relaterede undersøgelser. Denne protokol har lignende perfusionstrin som tidligere, som Salem et al.21, Severgnini et al.2 og Li et al.20 og Korelova et al.23, ved hjælp af IVC-indsættelse. Deres perfusions- og fordøjelsesbuffere, som kan kræve ekstra arbejde at forberede, kan også arbejde med den nuværende protokol med lidt ændring af enzymfordøjelsestiden. Derfor kan det også være gavnligt, både tids- og økonomisk venligt, at kombinere reagenser fra tidligere protokoller med trin i denne protokol.
Sammenfattende blev der udviklet en forbedret tids- og arbejdseffektiv protokol til primær hepatocytisolering fra muselever. Denne protokol anvender kommercielt tilgængelige reagenser fuldstændigt og kan udfyldes på ~ 35 minutter, fra dissekering af mus til plettering af primære hepatocytter, hvilket giver en nyttig teknik til primære hepatocytrelaterede undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (Grant 5R01HD095512-02 til S.W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Gibco | 10010023 | |
| 10x HBSS | Gibco | 14065-056 | |
| 12-well Plate | FALCON | 353043 | Coating not required |
| 6-well Plate | FALCON | 353046 | Coating not required |
| anti-AKT | Cell Signaling | 2920S | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x), Stabilized | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| anti-FOXO1 | Cell Signaling | 97635S | |
| anti-GAPDH | Cell Signaling | 2118S | |
| anti-p-AKT (S473) | Cell Signaling | 9271L | |
| anti-PEPCK | Santa Cruz | SC-166778 | |
| anti-p-FOXO1 (S256) | Cell Signaling | 84192S | |
| Cell Strainer, 70 µm | CELLTREAT | 229483 | |
| Closed IV Catheter, 24 Gauge 0.75 IN | Becton Dickinson | 383511 | |
| DMEM, no glucose, no glutamine, no phenol red | ThermoFisher Scientific | A1443001 | |
| EnzyChrom Glucose Assay Kit | BioAssay Systems | EBGL-100 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
| Forskolin | MilliporeSigma | F3917-10MG | |
| Glucagon | Sigma-Aldrich | G2044 | |
| Goat Anti-mouse IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-68070 | |
| Goat Anti-rabbit IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-32211 | |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Software | NA | |
| Hepatocyte Wash Medium | Gibco | 17704-024 | |
| IBMX | Cell Signaling | 13630S | |
| Insulin | Lilly | NDC 0002-8215-01 | |
| Ketamine HCL (100 mg/mL) | Hospira Inc | NDC 0409-2051-05 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Liver Digest Medium | Gibco | 17703-034 | Aliquot within tissue culture hood to 25 mL each in 50 mL tube, and keep in -20 °C freezer |
| Liver Perfusion Medium | Gibco | 17701-038 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140122 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Peristaltic Pump | Gilson | Minipuls 2 | Capable of pumping at 4 mL/min |
| Petri Dish | Fisherbrand | 08-757-12 | |
| Refrigerated Centrifuge | Sorvall | Legend RT | Capable to centrifuge 50 mL tube at 4 °C |
| Sodium L-Lactate | Sigma-Aldrich | L7022 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| Syringe Filter, PVDF 0.45 µm 30mm diameter | CELLTREAT | 229745 | |
| Syringe, 0.5 mL | Becton Dickinson | 329461 | |
| Syringe, 60 mL | Becton Dickinson | 309653 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Tube, 15 mL | Corning | 430052 | |
| Tube, 50 mL | Corning | 430290 | |
| Water Bath Tank | Corning | CLS6783 | Or any water bath tank capable of heating up to 45 °C |
| William’s E Medium (GlutaMAX Supplement) | Gibco | 32551020 | |
| Xylozine (100 mg/mL) | Vetone Anased LA | NDC13985-704-10 |
References
- Han, H. S., Kang, G., Kim, J. S., Choi, B. H., Koo, S. H. Regulation of glucose metabolism from a liver-centric perspective. Experimental and Molecular Medicine. 48, 218 (2016).
- Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
- Guidotti, J. E., et al. Liver cell polyploidization: a pivotal role for binuclear hepatocytes. Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).
- Morales-Navarrete, H., et al. A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture. Elife. 4, 11214 (2015).
- Bruening, J., et al. Hepatitis C virus enters liver cells using the CD81 receptor complex proteins calpain-5 and CBLB. PLoS Pathogens. 14 (7), 1007111 (2018).
- Silvie, O., et al. Hepatocyte CD81 is required for Plasmodium falciparum and Plasmodium yoelii sporozoite infectivity. Nature Medicine. 9 (1), 93-96 (2003).
- Crispe, I. N.
- Liu, N. C., et al. Loss of TR4 orphan nuclear receptor reduces phosphoenolpyruvate carboxykinase-mediated gluconeogenesis. Diabetes. 56 (12), 2901-2909 (2007).
- Wang, Z., et al. Gonadotrope androgen receptor mediates pituitary responsiveness to hormones and androgen-induced subfertility. JCI Insight. 5 (17), 127817 (2019).
- Santos, S. D., et al. CSF transthyretin neuroprotection in a mouse model of brain ischemia. Journal of Neurochemistry. 115 (6), 1434-1444 (2010).
- Pinhu, L., et al. Overexpression of Fas and FasL is associated with infectious complications and severity of experimental severe acute pancreatitis by promoting apoptosis of lymphocytes. Inflammation. 37 (4), 1202-1212 (2014).
- Mi, Y., Lin, A., Fiete, D., Steirer, L., Baenziger, J. U. Modulation of mannose and asialoglycoprotein receptor expression determines glycoprotein hormone half-life at critical points in the reproductive cycle. Journal of Biological Chemistry. 289 (17), 12157-12167 (2014).
- Tanowitz, M., et al. Asialoglycoprotein receptor 1 mediates productive uptake of N-acetylgalactosamine-conjugated and unconjugated phosphorothioate antisense oligonucleotides into liver hepatocytes. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12388-12400 (2017).
- Manczak, M., et al. Neutralization of granulocyte macrophage colony-stimulating factor decreases amyloid beta 1-42 and suppresses microglial activity in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Human Molecular Genetics. 18 (20), 3876-3893 (2009).
- Zhang, Y., et al. JAK1-dependent transphosphorylation of JAK2 limits the antifibrotic effects of selective JAK2 inhibitors on long-term treatment. Annals of the Rheumatic Diseases. 76 (8), 1467-1475 (2017).
- Shih, S. C., et al.
- Liu, G., et al. miR-147, a microRNA that is induced upon Toll-like receptor stimulation, regulates murine macrophage inflammatory responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15819-15824 (2009).
- Ding, Q., et al. Mice expressing minimally humanized CD81 and occludin genes support Hepatitis C virus uptake in vivo. Journal of Virology. 91 (4), 01799 (2017).
- Renshaw, M., et al. Cutting edge: impaired Toll-like receptor expression and function in aging. Journal of Immunology. 169 (9), 4697-4701 (2002).
- Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
- Salem, E. S. B., et al. Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323 (2018).
- Cabral, F., et al. Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507 (2019).
- Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies. Malar Journal. 6, 169 (2007).
- Yin, Z., Ellis, E. C., Nowak, G. Isolation of mouse hepatocytes for transplantation: a comparison between antegrade and retrograde liver perfusion. Cell Transplant. 16 (8), 859-865 (2007).
- Hepatocyte media, Thermofisher. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/Hepatocyte_Media_UG.pdf (2021).
- Sia, D., Villanueva, A., Friedman, S. L., Llovet, J. M. Liver cancer cell of origin, molecular class, and effects on patient prognosis. Gastroenterology. 152 (4), 745-761 (2017).
- Freitas-Lopes, M. A., Mafra, K., David, B. A., Carvalho-Gontijo, R., Menezes, G. B. Differential location and distribution of hepatic immune cells. Cells. 6 (4), 48 (2017).
- Schachtrup, C., Le Moan, N., Passino, M. A., Akassoglou, K. Hepatic stellate cells and astrocytes: Stars of scar formation and tissue repair. Cell Cycle. 10 (11), 1764-1771 (2011).
- Geerts, A. History, heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells. Seminars in Liver Disease. 21 (3), 311-335 (2001).
- Poisson, J., et al. Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases. Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).
- Peter, M. E., et al. The CD95 receptor: apoptosis revisited. Cell. 129 (3), 447-450 (2007).
- Peters, D. T., et al. Asialoglycoprotein receptor 1 is a specific cell-surface marker for isolating hepatocytes derived from human pluripotent stem cells. Development. 143 (9), 1475-1481 (2016).
- Willoughby, J. L. S., et al. Evaluation of GalNAc-siRNA conjugate activity in pre-clinical animal models with reduced asialoglycoprotein receptor expression. Molecular Therapy. 26 (1), 105-114 (2018).
- Hutchins, N. A., Chung, C. S., Borgerding, J. N., Ayala, C. A., Ayala, A. Kupffer cells protect liver sinusoidal endothelial cells from Fas-dependent apoptosis in sepsis by down-regulating gp130. American Journal of Pathology. 182 (3), 742-754 (2013).
