Summary
Hepatócitos primários são uma ferramenta valiosa para estudar a resposta hepática e o metabolismo in vitro. Utilizando reagentes disponíveis comercialmente, foi desenvolvido um protocolo aprimorado de tempo e trabalho eficiente para o isolamento primário do hepatócito do rato.
Abstract
Hepatócitos primários são usados extensivamente em pesquisas in vitro hepáticas, especialmente em estudos de metabolismo de glicose. Uma técnica base foi adaptada com base em diferentes necessidades, como tempo, trabalho, custo e uso primário de hepatócitos, resultando em vários protocolos primários de isolamento hepatócito. No entanto, os numerosos passos e os preparativos demorados de reagentes no isolamento primário do hepatocitado são grandes desvantagens para a eficiência. Depois de comparar diferentes protocolos para seus prós e contras, as vantagens de cada um foram combinadas, e um protocolo rápido e eficiente de isolamento hepatócito primário foi formulado. Dentro de apenas ~35 min, este protocolo poderia produzir tanto, se não mais, hepatócitos primários saudáveis como outros protocolos. Além disso, os experimentos de metabolismo de glicose realizados usando os hepatócitos primários isolados validaram a utilidade deste protocolo em estudos in vitro de metabolismo hepático. Também revisamos e analisamos extensivamente a importância e o propósito de cada etapa deste estudo para que os futuros pesquisadores possam otimizar ainda mais esse protocolo com base nas necessidades.
Introduction
O fígado serve como um dos órgãos mais importantes no corpo de vertebrados devido ao papel vital que desempenha em inúmeras funções de suporte à vida, como digestão alimentar, circulação sanguínea e desintoxicação. O uso de hepatócitos primários de camundongos na cultura vitro é cada vez mais popular em estudos de metabolismo de carboidratos e carcinoma hepático. Por isso, é importante desenvolver um método conveniente para o isolamento primário do hepatocito do camundongo, mantendo sua função fisiológica inata. Devido à sua função como um centro do metabolismo da glicose, o fígado também é central para a produção e armazenamentode glicose 1. Experimentos com hepatócitos primários in vitro são imperdíveis para a maioria dos estudos de metabolismo de glicose. Portanto, durante anos, vários grupos de pesquisa desenvolveram protocolos para o isolamento primário do hepatocite do rato.
O procedimento geral do isolamento do hepatocito do camundongo é primeiro liberar sangue no fígado com um líquido isotomótico, como salina tamponada com fosfato (PBS) ou Solução de Sal Balanceado (HBSS) da Hanks e, em seguida, usar solução contendo colagem para dissociar hepatócitos. Esses protocolos compartilham um procedimento geral, mas diferem em reagentes e passos baseados em diferentes necessidades. No entanto, preparar reagentes necessários e realizar passos de isolamento levam tempo. No desenvolvimento do presente protocolo, a eficiência foi definida como prioridade, com todos os reagentes prontos para uso e disponíveis no mercado, e o menor número possível de etapas. O objetivo geral deste protocolo é fornecer um método rápido e eficiente para isolar hepatócitos primários do rato, sem comprometer a pureza e viabilidade primária isolada.
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Protocol
Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais johns Hopkins. Neste estudo, foram utilizados camundongos C57BL/6 fêmeas (8 semanas de idade).
1. Preparação:
- Misture o William's E Medium (GlutaMAX Supplement) com 10% de FBS e 1% solução antibiótico-antimíctica para tornar a cultura média.
- Filtrar 25 mL de meio de colagenase-dispase (por exemplo, Liver Digest Medium) através de um filtro de seringa de 0,45 μm para remover detritos de partículas.
- Quente 50 mL de H2O destilado duplo (ddH2O), 35 mL de médio de perfusão (por exemplo, Médio de Perfusão de Fígado) (ou 50 mL pela primeira vez usando este protocolo), e 25 mL de meio de colagenase-dispase filtrado em um banho de água de 45 °C por 30 min.
- Dentro de uma capa de cultura tecidual estéril, misture 2 mL de HBSS 10x e 18 mL de Percoll em um tubo de 50 mL para fazer 20 mL 1x Percoll-HBSS e manter no gelo ou 4 °C.
NOTA: 1x Percoll-HBSS pode ser mantido a 4 °C por pelo menos 6 meses. - Dentro de uma capa de cultura de tecido estéril, despeje 30 mL de meio de lavagem (por exemplo, Hepatocyte Wash Medium) em uma placa de Petri limpa, e mantenha no gelo.
- Submerse o tubo de bombeamento na água de um banho de água de 45 °C. Os resultados são mais confiáveis se a temperatura ambiente estiver em 25 °C.
- Prepare 2 mL de anestésicos 1x misturando 225 μL de Cetamina HCL, 93,75 μL de Xilazina e 1681 μL de 1x PBS.
- Anestesiar um rato usando um método aprovado. Aqui o rato foi injetado intraperitonealmente com 150 μL de anestésicos 1x. Realize os testes para perda de reflexos, como reação ao beliscão do dedo do dedo para garantir anestesia total.
- Fixar o mouse de costas na almofada de dissecção por quatro membros, fixando ou usando fita adesiva à prova d'água ou outros métodos aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da instituição (ou equivalentes).
- Prepare fórceps esterilizados e tesouras para dissecção. Para evitar uma possível contaminação, conduza todas as etapas dentro de um capô estéril.
2. Procedimento:
- Usando uma bomba peristáltica, comece a bombear ddH2O aquecido a uma velocidade de 4 mL/min por 5 min. Mude o tubo de bombeamento da água para um meio de perfusão aquecido.
- Desinfete o abdômen do camundongo anestesiado com 70% de EtOH e corte aberto com uma tesoura para expor o fígado, a veia portal e a veia inferior (IVC).
- Pare a bomba peristáltica. Insira um cateter de 24 G (por exemplo, Cateter IV Fechado, 24 G, 0,75 IN) no IVC. Comece a bombear e corte a veia do portal aberta.
- Continue bombeando até que o líquido liberado esteja limpo (em torno de 3-5 min). Pressione a veia do portal a cada minuto para deixar o líquido alcançar cada canto do fígado. Tenha cuidado para não deixar bolhas de ar entrarem no IVC.
NOTA: Este passo é para remover o máximo de sangue possível do fígado. - Altere o tubo de bombeamento do meio de perfusão para o meio de colagenase-dispase. Continue bombeando até que todos os 25 mL do meio de colagenase-dispase sejam esgotados enquanto fazem a etapa 2.6.
- Pressione a veia do portal a cada minuto para deixar o líquido alcançar cada canto do fígado.
NOTA: Nesta fase, a perda completa de sangue é fatal para o rato. A morte do rato pode ser confirmada por falta de batimentos cardíacos após o experimento. Descarte a carcaça de acordo com as políticas de instalação. - Isole todo o fígado sem vesícula biliar ao meio de lavagem de 30 mL na placa de Petri no gelo.
- Rasgá-lo em pedaços com fórceps para liberar hepatócitos primários em solução. Esta etapa transformaria o meio de lavagem em uma solução nublada cheia de hepatócitos primários liberados e pequenos pedaços de fígado.
- Filtre a solução nublada na etapa 2.8 através de um coador de células de 70 μm no Percoll-HBSS de 20 mL em um tubo de 50 mL no gelo. Misture invertendo o tubo 20 vezes.
- Centrifugar a 300 x g por 10 min a 4 °C.
- Dentro da capa da cultura tecidual, aspire o supernante. Lave a pelota com 30 mL frio de meio de lavagem.
- Centrifugar a 50 x g por 5 min a 4 °C.
- Remova o supernatante e resuspense a pelota em 25 mL do meio de cultura (ou outros volumes apropriados) dentro da capa da cultura tecidual.
- Conte o número da célula e emplaque as células nas placas de cultura desejadas de acordo com o projeto experimental.
NOTA: Hepatócitos primários devidamente isolados de um rato de 8 semanas de idade são geralmente suficientes para serem banhados em quatro placas de 6 poços ou quatro placas de 12 poços.
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Representative Results
Para testar a eficiência, foi realizado o presente protocolo primário de isolamento do hepatocito em camundongos C57BL/6 femininos de 8 semanas. O apego e a pureza dos hepatócitos primários isolados foram testados. O isolamento primário do hepatócito é usado para uma grande variedade de experimentos em fisiologia hepática, como efeitos hepáticos de drogas e metabolismo de glicose, atividade biomarcadora farmacêutica2, sensibilidade à insulina e produção de glicose. Portanto, as atividades dos hepatócitos primários isolados com este protocolo foram testadas nos seguintes experimentos.
O revestimento não era necessário para o apego primário ao hepatócito no protocolo atual
Hepatócitos primários isolados foram banhados em 5 x 105 células/poço em uma placa de 6 poços. Após 1h, observou-se um anexo firme, e os hepatócitos primários se expandiram totalmente 12h após o revestimento (Figura 3). Isso indicou que 12 horas após o revestimento, as células estavam prontas para serem utilizadas para experimentos. Com base na morfologia do núcleo dos hepatócitos do camundongo dentro do fígado, os hepatócitos mononucleares foram enriquecidos nas fronteiras, enquanto os hepatócitos binucleares/polinucleares, uma assinatura de diferenciação terminal, estavam no meio 3,4. Uma quantidade significativa de células imagens exibiu morfologia típica de dois núcleos (diploide), indicando o sucesso de isolar e purificar hepatócitos primários vivos. Isso também indica que o revestimento de colágeno não é um requisito para o apego hepatócito primário com este protocolo.
A pureza foi enriquecida na população hepatócida primária isolada
Vários marcadores genéticos específicos do tipo celular têm sido usados em protocolos anteriores para verificar a pureza isolada do hepatócito primário (Tabela 1). TTR (Transthyretin), CD95 (Cluster de diferenciação 95, também conhecido como Fas), ASGR1 (Asialoglycoprotein receptor 1) e ASGR2 são marcadores para hepatócitos. Após o isolamento, os níveis de mRNA desses marcadores hepatócitos foram significativamente aumentados, em comparação com todo o fígado (Figura 4A-D,H).
Este protocolo também reduziu muito a interferência de outras células hepáticas. A presença de células imunes, células estelares e células endoteliais foram menores, mostradas pela diminuição acentuada dos níveis de mRNA de CD45 (marcador de células imunes), COL1A1 (Colágeno, tipo I, alfa 1, marcador de células estelares) e TIE2 (Ligica interna endotelial cell quinase, marcador celular endotelial), em comparação com todo o fígado (Figura 4E-H) ). Estes sugerem que este protocolo poderia purificar a população primária de hepatocitos a partir de células hepáticas e, assim, reduzir a possível interferência de outros tipos de células em experimentos.
Atividade de biomarcadores farmacêuticos foi preservada
Biomarcadores em hepatócitos têm sido amplamente usados para direcionamento e entrega de drogas. A preservação da atividade de biomarcadores farmacêuticos, portanto, é um ponto-chave no isolamento primário do hepatocitado e é um padrão para testar a utilidade do isolamento hepatócito primário2. Os marcadores hepatócitos ASGR1 e ASGR2 são usados desta forma2. Testamos pela primeira vez o nível de expressão do curso de tempo desses dois marcadores antes e depois do revestimento primário de hepatócito. Após o revestimento, seu nível de mRNA diminuiu consideravelmente com o tempo, mas os níveis permaneceram consideráveis em comparação com todo o fígado até o ponto de tempo de 12h após o revestimento, especialmente para ASGR1 (Figura 5A,B). A tendência de expressão foi consistente com um relatório anterior2 e indicou saúde comparável do hepatocitado primário. Vários patógenos têm como alvo o CD81, uma proteína ligada à membrana hepatocito, para facilitar sua entrada em células e infecções, como o vírus da hepatite5, Plasmodium falciparum e Plasmodium yoelii6. Outras proteínas localizadas em membrana hepatócica, como o TLR4 (receptor 4), também são alvo de patógenos e importantes para a resposta imune hepatocitte7. Após o revestimento, o nível de expressão do CD81 foi consistente até 48 h (Figura 5C). O nível de expressão TLR4 geralmente aumentou, mas não até depois de 48 h, quando atingiu um nível superior ao in vivo (Figura 5D). Estes sugerem que hepatócitos primários isolados por este protocolo também podem ser usados para estudos CD81 e TLR4 dentro de pelo menos 48 h após o revestimento. Juntos, esses resultados indicam que os hepatócitos primários isolados são válidos para uso em estudos relacionados a biomarcadores farmacêuticos. Vale ressaltar que os níveis de RNA e proteína podem ser inconsistentes devido a influências de atividades pós-transcrição, como migração de RNA induzida por peptídeos, modificação pós-transicional e/ou degradação de proteínas. Portanto, o nível de proteína e a verificação da bioatividade de biomarcadores farmacêuticos identificados pelo mRNA podem ser necessários, se necessário, pelo paradigma experimental.
Hepatócitos primários isolados eram sensíveis à insulina
Também foi analisado o desempenho primário do hepatócito em experimentos de metabolismo de glicose. A insulina, um hormônio que desempenha um papel central no metabolismo da glicose, diminui o nível de glicose, promovendo a absorção e armazenamento de glicose hepática através da fosforilação AKT e FOXO1 (Caixa de Garfo O1). Por isso, foi realizado um ensaio de sensibilidade à insulina com hepatócitos primários isolados. Após 16 h, as células ficaram famintas por 3h, com um meio livre de soro. No último 0,5 h de fome, a insulina de 100 nM foi administrada ao meio da cultura. Como mostrado na Figura 6A-C, a insulina promoveu significativamente a fosforilação tanto da AKT em Ser473 quanto do FOXO1 em Ser256, indicando a sensibilidade dos hepatócitos primários à insulina. Isso sugere que os hepatócitos primários isolados do presente protocolo são úteis em estudos de metabolismo de insulina/glicose.
Hepatócitos primários isolados eram capazes de produzir glicose
Não só são um centro de armazenamento de glicose, mas os hepatócitos também são responsáveis pela produção de glicose. Para testar se os hepatócitos primários que isolamos são úteis em estudos de produção de glicose, as células ficaram famintas por 10h na presença de glucagon para estimular a produção de glicose. O meio de fome foi então coletado para ensaio de glicose, enquanto as células foram colhidas para mancha ocidental. Phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) é um componente essencial na produção de glicose hepática, controlando sua taxa8. O nível de proteína de PEPCK foi significativamente aumentado após o tratamento glucagon, sugerindo que a via de produção de glicose foi ativada (Figura 7A,B). Essa ativação foi confirmada ainda por um aumento do nível de produção de glicose (Figura 7C). Este fenômeno também foi confirmado com outros estimuladores de produção de glicose como forskolin mais IBMX (Figura 7A-C). No entanto, devido à limitação deste experimento, não foi possível verificar se a produção de glicose era exclusiva via gliconeogênese ou se há um componente de glicogenólise também.
Figura 1: Configuração do banco. (A) A configuração do banco para isolamento hepatócito primário. (B) A configuração de bancada de desenho animado para isolamento hepatócito primário. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Dissecção do rato, perfusão e purificação hepatocitada primária. (A) O rato dissecado, com setas apontando para o fígado, IVC e veia portal. (B) Inserção do cateter em IVC. (C) Pressionar a veia portal causando alargamento e rigidez do fígado lopes, indicando perfusão bem sucedida. (D) Fígado amolecido lopes após a perfusão, indicando o sucesso da digestão de colagenase. (E) A posição da vesícula biliar no fígado isolado (seta apontando para a vesícula biliar). (F) Remoção da vesícula biliar. (G) Fígado rasgado no meio de lavagem de hepatocitte. (H) Misturando 1x Percoll-HBSS com hepatócito primário filtrado antes da centrífuga. (I, J) pelota primária de hepatocitte após centrífuga. (K) Ressuspensão hepatocitar primária dentro do meio de lavagem de hepatocitte. (L, M) Pelota primária de hepatocitte formada dentro do meio de lavagem hepatocitte após centrífuga. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Hepatócitos primários após o revestimento. As imagens foram tiradas após (A)1 h, (B, C) 12 h, (D) 24 h, (E) 36 h, (F) 48 h, (G) 72 h, e (H) 96 h de chapeamento primário hepatocyte. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Pureza primária de hepatocitar aumentada após o isolamento. O RNA foi isolado antes (de todo o fígado) e após (de hepatócitos primários isolados) isolamento primário do hepatócito, seguido de transcrição reversa pcr, de acordo com um protocolo anterior9. A pureza hepatocito primário foi avaliada por PCR em tempo real com primers para marcadores hepatocitos (A) TTR, (B) CD95, (C) ASGR1 e (D) ASGR2, enquanto também com marcador de célula imune (E) CD45, (F) Marcador celular estelar COL1A1 e (G) marcador celular endotelial TIE2. (H) O mapa de calor foi gerado para as alterações de expressão dos marcadores do tipo celular antes e depois do isolamento primário do hepatócito. GAPDH (Glicealdeído 3-fosfato desidrogenase) foi usado como controle interno. Os primers usados aqui foram para genes (as sequências de primer estão na Tabela 2. As referências de sequência são citadas aqui): TTR10; CD9511; ASGR112; ASGR213; CD4514; COL1A115; TIE216; GAPDH17. Gráficos e mapa de calor foram gerados com GraphPad Prism 8. A barra de erro indica desvio padrão, e amostras não pagas de duas caudas (uma vez que as amostras primárias de hepatocitado e fígado inteiro não foram pagas porque este protocolo requer fígado intacto para começar) o significado do teste t é indicado por asteriscos (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001). N=7. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Expressão de biomarcadores farmacêuticos. O RNA foi isolado de todo o fígado e hepatócito primário após o revestimento, seguido de transcrição reversa pcr. A expressão dos biomarcadores farmacêuticos foi avaliada por PCR em tempo real com primers para (A) ASGR1, (B) ASGR2, (C) CD81 e (D) TLR4. GAPDH foi usado como controle interno. Os novos primers usados aqui foram para genes (as sequências do Primer estão na Tabela 2. As referências de sequência são citadas aqui): CD8118; TLR419. Os gráficos foram gerados com o GraphPad Prism 8. N = 5. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Sensibilidade à insulina preservada após isolamento primário de hepatócitos. (A) Mancha ocidental de p-AKT (S473), AKT, p-FOXO1 (S256), FOXO1 e GAPDH após tratamento de insulina. (B) p-AKT (S473)/AKT em densitometria de mancha ocidental. (C) p-FOXO1 (S256)/FOXO1 em densitometria de mancha ocidental. O ensaio de sensibilidade à insulina foi realizado 16 h após o revestimento primário de hepatócito. Os hepatócitos primários ficaram famintos por 3h no William's E Medium (Suplemento GlutaMAX) sem FBS, mas com 1% de solução antimíctica antibiótico e com tratamento de insulina de 100 nM nos últimos 30 minutos, antes de serem colhidos para lise proteica com 1x de tampão RIPA. Os gráficos foram gerados com o GraphPad Prism 8. A imagem de mancha ocidental foi realizada com LI-COR Odyssey CLx. A barra de erro indica desvio padrão, e o significado do teste t emparelhado de duas caudas é indicado por asteriscos (* p < 0,05; ** p < 0,01). N = 4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Ensaio de produção de glicose. (A) Mancha ocidental de PEPCK e GAPDH após tratamento glucagon ou forskolin+IBMX para 10 h. (B) Densitometria do nível de proteína PEPCK comparando com gapDh após tratamento glucagon ou forskolin+IBMX por 10 h. (C) Nível de glicose comparando com o nível de proteína após o tratamento glucagon ou forskolin+IBMX por 10 h. O ensaio de produção de glicose foi realizado 16 h após o revestimento primário de hepatócito. Os hepatócitos primários ficaram famintos por 10 h em DMEM sem glicose e fenol (adicionado com 2 mM L-Glutamine, 2 mM Pyruato de Sódio, 20 mM de Sódio L-Lactato, 1% De Strep de caneta), com glucagon de 50nM ou 20 μM de forskolin e 200 μM IBMX. O meio foi colhido para medição de concentração de glicose com Kit de Ensaio de Glicose, enquanto a proteína foi colhida para mancha ocidental. A imagem de mancha ocidental foi realizada com LI-COR Odyssey CLx. A barra de erro indica desvio padrão, e a significância do teste t emparelhado de duas caudas é indicada por asteriscos (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001). N = 4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Tempos de Centrifugação | Remoção da gaiola das costelas | Buffers de perfusão auto-fabricação | Nó Cirúrgico | Aquecimento da lâmpada | Revestimento de placas | Quantidade/rato celular isolado | Centrifugação gradiente | Genes marcadores de pureza | |
| Protocolo presente | 2 | Não | Não | Não | Não | Não | 2.5-4 x 107 | Sim | TTR, CD95, ASGR1, ASGR2, CD45, COL1A1, TIE2 |
| Severgnini et al.2. | 4 | Sim | Sim | Sim | Sim | Sim | 1.8-2 x 107 | Não | TTR, CD45, COL1A1, TIE2 |
| Gonçalves et al.24. | 5 ou 6 | Não | Não | Não | Não | Sim | 1-3 x 106 | Sim | CD45, CD95 |
| Li et al.20. | 4 ou 5 | Não | Sim | Sim | Não | Não mencionado | 1-4 x 107 | Não | N/A |
| Salem et al.21. | 3 | Não | Sim | Não | Não | Não mencionado | 2 x 107 | Sim | N/A |
| Cabral et al.22. | 3 ou 6 (com centrifugação gradiente) | Não | Sim | Sim | Não | Sim/Recomendado | N/A | Opcional | N/A (Pureza avaliada por microscopia leve) |
| Korelova et al.23. | 3 | Não | Sim | Sim | Não | Sim | N/A | Sim | N/A |
Tabela 1: Comparação dos protocolos primários de hepatócitos.
| Primer (Para a frente) | Primer (Reverso) | Referência | ||
| TTR Forward 5'-3': AGCCCTTTCTCTGGGAAGAC | TTR Reverso 5'-3': TGCGATGGTGTAGTGGCGATGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG | 10 | ||
| CD95 Forward 5'-3': ATGCACACTCTGCGATGAAG | CD95 Reverso 5'-3': CAGTGTTCACAGCCAGGAGA | 11 | ||
| ASGR1 Forward 5'-3': GAGTCGAAGCTGGAAAAACAG | ASGR1 Reverso 5'-3': CCTTCATACTCCACCCAGTTG | 12 | ||
| ASGR2 Forward 5'-3': CTACTGGTTCTCGGGATGG | ASGR2 Reverso 5'-3': CAAATATGAAACTGGCTCCTGTG | 13 | ||
| CD45 Forward 5'-3': GAACATGCTGCCAATGGTTCT | CD45 Reverso 5'-3': TGTCCCACATGACTCCTTTCC | 14 | ||
| COL1A1 Forward 5'-3': GAAGCACGTCTGGTTTGGA | COL1A1 Reverso 5'-3': ACTCGAACGGGAATCCATC | 15 | ||
| TIE2 Forward 5'-3': ATGTGGAAGTCGAGAGGCGAT | Tie2 Reverso 5'-3': CGAATAGCCATCCACTATTGTCC | 16 | ||
| GAPDH Forward 5'-3': CGACTTCAACAGCAACTCCCACTCTTCC | GAPDH Reverso 5'-3': TGGGTGGTCCAGGGTTTCTTACTCCTT | 17 | ||
| CD81 Forward 5'-3': CCAAGGCTGGTGAACTTTC | CD81 Reverso 5'-3': GGCTGTCTCAGTATGGTGGTAG | 18 | ||
| TLR4 Forward 5'-3': ACCTGGCTGGTTTACACGTC | TLR4 Reverso 5'-3': CTGCCAGAGACATTGCAGAA | 19 | ||
Tabela 2: Lista de primers: Primers usados para genes TTR, CD95, ASGR1, ASGR2, CD45, COL1A1, TIE2, GAPDH, CD81 e TLR4
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Discussion
Vários protocolos primários de isolamento de hepatocitas foram desenvolvidos. Eles também foram mantidos otimizados e adaptados com base em diferentes necessidades (Tabela 1). Os protocolos de isolamento são geralmente compostos de duas partes: perfusão (incluindo digestão enzimápica) e purificação.
A perfusão pode ser realizada com todo o fígado in vivo 2,20,21,22,23 ou com lóbulos hepáticos dissecados 24. A perfusão de lóbulos dissecados era geralmente restrita aos lóbulos esquerdo e médio para facilidade técnica. Teoricamente, a perfusão in vivo deve produzir mais hepatócitos primários devido ao uso de todo o fígado com todos os lóbulos. Manter o fígado no lugar durante a perfusão também pode reduzir a morte celular, uma vez que hepatócitos in vivo podem ser banhados em fluidos, seja tampões sanguíneos ou de perfusão, em todos os momentos durante esta etapa.
A manutenção de condições estéreis também desempenha um papel importante nesta etapa. Se a condição permitir, é melhor realizar perfusão em um capô limpo. Todas as ferramentas com toque direto aos tecidos devem ser estéreis, o que pode ser alcançado por autoclave. Para evitar qualquer contaminação de bactérias e fungos, uma solução antibiótico-antimíctica foi adicionada ao meio da cultura.
O IVC e a veia portal são dois vasos principais que conectam o fígado com outros órgãos. A maioria dos protocolos utiliza qualquer uma dessas veias para inserir agulhas para perfusão: IVC 2,20,21,23, veia portal 22. A posição da veia do portal está em um ângulo distorcido, o que leva à dificuldade de posicionamento e estabilização da agulha inserida. Uma sutura é, portanto, geralmente necessária para amarrar a agulha no lugar com um nó cirúrgico, que deve ser feito com muito cuidado, pois a veia é propensa a danos. Geralmente, o diâmetro da veia portal também é menor que o IVC, complicando a inserção da agulha. Considerando isso, o uso de IVC pode ser mais conveniente, embora em alguns protocolos, a agulha também seja cirurgicamente atada ao IVC20. Foi relatado que a perfusão com a inserção de IVC resultou em hepatócitos primários menos viáveis do que a veia portal25. No entanto, no presente protocolo, utilizamos com sucesso a inserção de IVC, e a viabilidade isolada do hepatócito primário (>96% em condições otimizadas, medida com a coloração Trypan Blue de acordo com o protocolo do fabricante) foi tão alta, se não mais, quanto outros protocolos (varia entre 80% e 96% com base em protocolos e condições 2,22,23,24).
Há dois objetivos para o passo de perfusão: tirar sangue dos lobos do fígado e digerir o fígado para liberar hepatócitos primários. Para atingir esses objetivos, devem ser utilizados pelo menos dois buffers, um para fluxo sanguíneo (Tampão de Fluxo) e outro para digestão (Buffer de Digestão). A maioria dos protocolos prepara o Tampão de Fluxo baseado em HBSS e adiciona colagenase dentro para torná-lo capaz de digestão, como Buffer de Digestão. A preparação desses buffers é demorada, e os buffers podem variar ligeiramente em algumas propriedades delicadas, como pH, de lote para lote, introduzindo variáveis não convidadas. Considerando isso, utilizar buffers disponíveis comercialmente economiza trabalho e tempo valiosos, minimizando essas variáveis. Gibco desenvolveu um protocolo para isolamento primário de hepatócitos de ratos adultos26, com base no uso de meio de perfusão hepática comercialmente disponível (como Buffer de Fluxo) e Meio de Digestão hepática (como Buffer de Digestão). Rato e rato, como roedores, compartilham altas semelhanças nas propriedades do corpo; pode-se integrar esses dois buffers otimizados para ratos no isolamento primário do hepatocitte do mouse. De fato, Gonçalves et al. 24, realizou com sucesso a perfusão de lóbulos hepáticos dissecados com esses tampões, elevando a promessa de seu uso na perfusão hepática in vivo. Aqui testamos com sucesso o meio de perfusão hepática e o meio de digestão hepática no atual protocolo hepatócito primário do camundongo, que produziu hepatócitos primários viáveis de alta qualidade (Figura 3 e Figura 4).
A temperatura do tampão de perfusão determina o quão bem os hepatócitos primários sobrevivem ao isolamento. Se a temperatura estiver muito alta, a colagem dentro do Buffer de Digestão pode ter atividade reduzida; se muito baixo, os hepatócitos primários podem sofrer choque frio, causando possível rendimento de isolamento comprometido. O tempo que o buffer leva para fluir através da tubulação de perfusão também determina a temperatura do tampão quando atinge o fígado. Nos protocolos anteriores, foi utilizado 40 °C2 ou 42 °C21 banho de água. Esta temperatura pode estar sujeita a alterações com base em condições de laboratório, como a temperatura do ambiente, o comprimento do tubo de perfusão e o tipo de Bomba Peristáltica. No presente protocolo, após vários vezes de testes, otimizamos a temperatura do banho de água para 45 °C para aquecer os buffers.
A pureza dos hepatócitos primários isolados desempenha um papel importante nos experimentos subsequentes, como quanto maior a razão de pureza, menos interferência possível. Embora o fígado seja composto principalmente de hepatócitos, representando 60%-80% pela massa27, vários tipos de outras células também estão presentes, como células imunes, células estelares e células endoteliais, que são importantes para atividades imunológicas hepáticas. Cada uma dessas células poderia postar uma interferência potencial em experimentos posteriores28. Por exemplo, células estelares no fígado também respondem a invasões de patógenos e lesões hepáticas, envolvendo na formação de cicatrizes29. Em números, 5%-8% da população total de células hepáticas é contribuída por células estelares30. Normalmente, as células estelares estão em quiescência, mas esse status pode ser quebrado quando as tensões estão presentes. Portanto, as atividades celulares estelares podem ser desencadeadas por tensões introduzidas durante o isolamento ou tratamento subsequente se algumas dessas células permanecerem na piscina de hepatócitos primários isolados finais. Outros tipos de células também contribuem para uma parcela considerável da população de células hepáticas, como as células endoteliais hepáticas (LSECs), representando 20% da população total de células hepáticas31. Como eliminar a presença dessas células tem sido uma parte intrigante no processo primário de isolamento do hepatocito. Portanto, a purificação é uma parte fundamental no isolamento primário do hepatocitado, que geralmente aproveita as diferenças de peso e tamanho entre diferentes tipos de células. Otimizando a velocidade da centrífuga e/ou tampão de purificação, os hepatócitos primários podem ser pelotados até a parte inferior do tubo.
Separar células vivas de células mortas também é fundamental na obtenção de hepatócitos primários saudáveis e contagem precisa de células. Normalmente, contar o número de células é imperdível após a purificação, uma vez que os resultados de inúmeros experimentos variam à medida que a confluência celular muda. Reagentes de centrífugas gradientes podem ser usados nesta etapa para cumprir esta missão, como Percoll. 36%-40% de Percoll em pelotas de centrífugas para baixo células vivas e mantém células mortas em supernasce. Otimizamos com sucesso a velocidade e o tempo de centrifugação para reduzir a população de células hepatócitas não primárias no presente protocolo. Marcadores específicos do tipo celular foram usados para testar a pureza de hepatócitos primários isolados aqui, como outros protocolos. Os marcadores de hepatócito utilizados aqui foram TTR2, CD9524,32, ASGR133 e ASGR234. Os marcadores para outros tipos de células incluem CD45 (marcador de células imunes), COL1A1 (marcador de célula estelar), TIE2 (marcador celular endotelial)2,35. Com esses marcadores, os hepatócitos primários isolados com o protocolo atual apresentaram alto nível de pureza (Figura 4), comparável aos protocolos anteriores 2,24.
Durante a perfusão, a colagem em Tampão de Digestão afrouxa o apego entre as células ao quebrar o colágeno dentro da matriz extracelular. Isso leva à dificuldade na realização celular durante o revestimento. A maioria dos protocolos anteriores exige/recomenda pré-revestimento de placas com colágeno 2,22 ou gelatina24 para melhor fixação de hepatócitos primários. Pelo que sabemos, enquanto Salem et al. 21 e Li et al. 20 não discutiram essa etapa, outros protocolos avaliados neste estudo claramente afirmaram/recomendaram o uso de placas pré-revestidas 2,22,23,24. No presente protocolo, descobrimos que o revestimento da placa não era necessário para placas de certos tipos. Embora não tenhamos certeza se isso foi porque diferentes tipos de placas, especialmente se são de diferentes fabricantes, têm suavidade superficial diferente, e se essa suavidade variada, se alguma vez existir, desempenha um papel importante no apego hepatocitado primário, é benéfico notar para que outro passo (revestimento de placa) possa ser pulado para a eficácia. Também é importante notar que este protocolo gera uma proporção significativa de hepatócitos diploides, por exemplo, diploides, juntamente com hepatócitos mononucleares, semelhantes ao in vivo hepatic sinusoid.
Neste estudo, foram combinadas as vantagens dos protocolos anteriores de isolamento primário do hepatocitado, e o processo foi simplificado tanto quanto possível, utilizando reagentes disponíveis comercialmente e eliminando etapas desnecessárias. As etapas de centrifugação foram reduzidas com sucesso a duas, ou seja, pelo que sabemos, o menor número em protocolos publicados. Para confirmar a pureza e a bioatividade de hepatócitos primários isolados, foi avaliado o nível de vários marcadores de células hepáticas, confirmando que o presente protocolo poderia aumentar consideravelmente a pureza hepatócida primária e reduzir outras populações de células hepáticas, como células imunes, células estelares e células endoteliais. A atividade de biomarcadores farmacêuticos como ASGR1, ASGR2, CD81 e TLR4 foi bem preservada em hepatócitos primários isolados com o protocolo atual, que também tiveram atividade confirmada de sensibilidade à insulina e produção de glicose. A principal limitação deste protocolo é a despesa, uma vez que todos os reagentes foram comprados comercialmente para eficiência. Não verificamos especificamente se a glicogenose estava intacta em hepatócitos primários isolados usando o protocolo atual, e isso pode precisar de mais pesquisas para estudos relacionados. Este protocolo tem etapas de perfusão semelhantes às anteriores, como Salem et al.21, Severgnini et al.2 e Li et al.20, e Korelova et al.23, usando inserção IVC. Seus tampões de perfusão e digestão, que podem exigir trabalho extra para preparar, também podem trabalhar com o protocolo atual com pouca modificação do tempo de digestão da enzima. Portanto, a combinação de reagentes de protocolos anteriores com etapas do presente protocolo também pode ser benéfica, tanto no tempo quanto economicamente amigável.
Em resumo, foi desenvolvido um protocolo melhorado de tempo e trabalho para o isolamento primário de hepatócitos do fígado de rato. Este protocolo utiliza reagentes disponíveis comercialmente inteiramente e pode ser concluído em ~35 min, desde o dissecando o mouse até o revestimento de hepatócitos primários, fornecendo assim uma técnica útil para estudos primários relacionados ao hepatócito.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (Grant 5R01HD095512-02 a S.W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Gibco | 10010023 | |
| 10x HBSS | Gibco | 14065-056 | |
| 12-well Plate | FALCON | 353043 | Coating not required |
| 6-well Plate | FALCON | 353046 | Coating not required |
| anti-AKT | Cell Signaling | 2920S | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x), Stabilized | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| anti-FOXO1 | Cell Signaling | 97635S | |
| anti-GAPDH | Cell Signaling | 2118S | |
| anti-p-AKT (S473) | Cell Signaling | 9271L | |
| anti-PEPCK | Santa Cruz | SC-166778 | |
| anti-p-FOXO1 (S256) | Cell Signaling | 84192S | |
| Cell Strainer, 70 µm | CELLTREAT | 229483 | |
| Closed IV Catheter, 24 Gauge 0.75 IN | Becton Dickinson | 383511 | |
| DMEM, no glucose, no glutamine, no phenol red | ThermoFisher Scientific | A1443001 | |
| EnzyChrom Glucose Assay Kit | BioAssay Systems | EBGL-100 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
| Forskolin | MilliporeSigma | F3917-10MG | |
| Glucagon | Sigma-Aldrich | G2044 | |
| Goat Anti-mouse IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-68070 | |
| Goat Anti-rabbit IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-32211 | |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Software | NA | |
| Hepatocyte Wash Medium | Gibco | 17704-024 | |
| IBMX | Cell Signaling | 13630S | |
| Insulin | Lilly | NDC 0002-8215-01 | |
| Ketamine HCL (100 mg/mL) | Hospira Inc | NDC 0409-2051-05 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Liver Digest Medium | Gibco | 17703-034 | Aliquot within tissue culture hood to 25 mL each in 50 mL tube, and keep in -20 °C freezer |
| Liver Perfusion Medium | Gibco | 17701-038 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140122 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Peristaltic Pump | Gilson | Minipuls 2 | Capable of pumping at 4 mL/min |
| Petri Dish | Fisherbrand | 08-757-12 | |
| Refrigerated Centrifuge | Sorvall | Legend RT | Capable to centrifuge 50 mL tube at 4 °C |
| Sodium L-Lactate | Sigma-Aldrich | L7022 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| Syringe Filter, PVDF 0.45 µm 30mm diameter | CELLTREAT | 229745 | |
| Syringe, 0.5 mL | Becton Dickinson | 329461 | |
| Syringe, 60 mL | Becton Dickinson | 309653 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Tube, 15 mL | Corning | 430052 | |
| Tube, 50 mL | Corning | 430290 | |
| Water Bath Tank | Corning | CLS6783 | Or any water bath tank capable of heating up to 45 °C |
| William’s E Medium (GlutaMAX Supplement) | Gibco | 32551020 | |
| Xylozine (100 mg/mL) | Vetone Anased LA | NDC13985-704-10 |
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