Summary
Первичные гепатоциты являются ценным инструментом для изучения реакции печени и метаболизма in vitro. Используя коммерчески доступные реагенты, был разработан улучшенный протокол экономии времени и труда для выделения первичных гепатоцитов мышей.
Abstract
Первичные гепатоциты широко используются в исследованиях печени in vitro , особенно в исследованиях метаболизма глюкозы. Базовая методика была адаптирована на основе различных потребностей, таких как время, труд, стоимость и использование первичных гепатоцитов, что привело к различным протоколам выделения первичных гепатоцитов. Однако многочисленные этапы и трудоемкие препараты реагентов при первичном выделении гепатоцитов являются основными недостатками эффективности. После сравнения различных протоколов на предмет их плюсов и минусов преимущества каждого из них были объединены, и был сформулирован быстрый и эффективный протокол выделения первичных гепатоцитов. Всего за 35 минут этот протокол может дать столько же, если не больше, здоровых первичных гепатоцитов, сколько и другие протоколы. Кроме того, эксперименты с метаболизмом глюкозы, проведенные с использованием изолированных первичных гепатоцитов, подтвердили полезность этого протокола в исследованиях метаболизма печени in vitro . Мы также подробно рассмотрели и проанализировали значение и цель каждого шага в этом исследовании, чтобы будущие исследователи могли дополнительно оптимизировать этот протокол на основе потребностей.
Introduction
Печень служит одним из самых важных органов в организме позвоночных из-за жизненно важной роли, которую она играет в многочисленных жизнеобеспечивающих функциях, таких как переваривание пищи, кровообращение и детоксикация. Использование мышиной первичной культуры гепатоцитов in vitro становится все более популярным в исследованиях углеводного обмена и печеночной карциномы. Поэтому важно разработать удобный метод выделения первичного гепатоцита мыши при сохранении его врожденной физиологической функции. Благодаря своей функции центра метаболизма глюкозы, печень также занимает центральное место в производстве и хранении глюкозы1. Эксперименты с первичными гепатоцитами in vitro являются обязательными для большинства исследований метаболизма глюкозы. Поэтому в течение многих лет различные исследовательские группы разрабатывали протоколы выделения первичных гепатоцитов мышей.
Общая процедура выделения гепатоцитов у мышей заключается в том, чтобы сначала вымыть кровь в печени изосмотической жидкостью, такой как фосфат-буферный физиологический раствор (PBS) или сбалансированный солевой раствор Хэнкса (HBSS), а затем использовать раствор, содержащий коллагеназу, для диссоциации гепатоцитов. Эти протоколы имеют общую процедуру, но различаются по реагентам и шагам, основанным на различных потребностях. Однако подготовка необходимых реагентов и выполнение этапов изоляции требуют времени. При разработке настоящего протокола эффективность была поставлена в качестве приоритета, при этом все реагенты готовы к использованию и доступны на рынке, и как можно меньше шагов. Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы обеспечить быстрый и эффективный с трудом метод выделения первичных гепатоцитов у мыши, не ставя под угрозу чистоту и жизнеспособность выделенных первичных гепатоцитов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Джона Хопкинса. В этом исследовании использовались самки мышей C57BL/6 (8-недельного возраста).
1. Подготовка:
- Смешайте Е-среду Уильяма (Добавка GlutaMAX) с 10% FBS и 1% антибиотико-антимикотическим раствором, чтобы получить культуральную среду.
- Фильтруйте 25 мл коллагеназно-диспазной среды (например, liver Digest Medium) через шприцевой фильтр 0,45 мкм для удаления остатков частиц.
- Нагревают 50 мл двойной дистилляцииH2O (ddH2O), 35 мл перфузионной среды (например, перфузионной среды печени) (или 50 мл в первый раз с использованием этого протокола) и 25 мл фильтрованной коллагеназно-диспазной среды на водяной бане 45 °C в течение 30 мин.
- В стерильной вытяжке для культивирования тканей смешайте 2 мл 10x HBSS и 18 мл Percoll в трубке 50 мл, чтобы получить 20 мл 1x Percoll-HBSS и держать на льду или 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: 1x Percoll-HBSS можно хранить при 4 °C в течение не менее 6 месяцев. - В стерильной вытяжке для культивирования тканей налейте 30 мл моющей среды (например, гепатоцитарной моющей среды) в чистую чашку Петри и держите на льду.
- Погрузите насосную трубку в воду водяной бани с температурой 45 °C. Результаты наиболее надежны, если температура в помещении составляет 25 °C.
- Приготовьте 2 мл 1x анестетиков, смешав 225 мкл кетамина HCL, 93,75 мкл ксилазина и 1681 мкл 1x PBS.
- Обезболить одну мышь по утвержденному методу. Здесь мышке внутрибрюшинно вводили 150 мкл 1x анестетиков. Выполните тесты на потерю рефлексов, таких как реакция на защемление пальцев ног, чтобы обеспечить полную анестезию.
- Закрепите мышь на спине на подушечке для рассечения четырьмя конечностями, либо прикалывая, либо используя водонепроницаемую ленту или другие методы, одобренные Комитетом по уходу и использованию животных учреждения (или эквиваленты).
- Подготовьте стерилизованные щипцы и ножницы для рассечения. Чтобы избежать возможного загрязнения, проводите все шаги в стерильной вытяжке.
2. Процедура:
- С помощью перистальтического насоса начинают откачку нагретого ddH2Oсо скоростью 4 мл/мин в течение 5 мин. Замените насосную трубку с воды на подогретую перфузионную среду.
- Продезинфицируйте живот анестезируемой мыши с помощью 70% EtOH и разрежьте ножницами, чтобы обнажить печень, воротную вену и нижнюю полую вену (IVC).
- Остановите перистальтический насос. Вставьте катетер 24 г (например, закрытый внутривенный катетер, 24 г, 0,75 ДЮЙМА) в IVC. Начните откачку и разрежьте портальную вену.
- Продолжайте откачку до тех пор, пока смытая жидкость не станет прозрачной (около 3-5 минут). Каждую минуту нажимайте на воротную вену, чтобы жидкость достигла каждого уголка печени. Будьте осторожны, чтобы не позволить пузырькам воздуха проникнуть в IVC.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг заключается в том, чтобы вымыть как можно больше крови из печени. - Измените насосную трубку с перфузионной среды на коллагеназно-диспазную среду. Продолжайте сцеживание до тех пор, пока все 25 мл коллагеназно-диспазной среды не истощатся, выполняя шаг 2.6.
- Каждую минуту нажимайте на воротную вену, чтобы жидкость достигла каждого уголка печени.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе полная потеря крови смертельна для мыши. Смерть мыши может быть подтверждена отсутствием сердцебиения после эксперимента. Утилизируйте тушу в соответствии с политикой объекта. - Изолировать всю печень без желчного пузыря до промывной среды объемом 30 мл в чашке Петри на льду.
- Разорвите его на куски щипцами, чтобы освободить первичные гепатоциты в раствор. Этот шаг превратит промывную среду в мутный раствор, полный высвобождаемых первичных гепатоцитов и мелких кусочков печени.
- Отфильтруйте мутный раствор на этапе 2.8 через клеточный ситечко 70 мкм в 20 мл 1x Percoll-HBSS в трубке объемом 50 мл на льду. Перемешайте, перевернув трубку 20 раз.
- Центрифуга при 300 х г в течение 10 мин при 4 °C.
- В тканевом культуральном капюшоне аспирируйте супернатант. Вымойте гранулы холодными 30 мл моющей среды.
- Центрифуга при 50 х г в течение 5 мин при 4 °C.
- Удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулу в 25 мл питательной среды (или соответствующих других объемов) в вытяжке культуры ткани.
- Подсчитайте номер ячейки и нанесите ячейки на желаемые культуральные пластины в соответствии с экспериментальной конструкцией.
ПРИМЕЧАНИЕ: Первичных гепатоцитов, правильно выделенных у одной 8-недельной мыши, обычно достаточно для нанесения на четыре 6-луночные пластины или четыре 12-луночные пластины.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы проверить эффективность, настоящий протокол первичной изоляции гепатоцитов был выполнен на 8-недельных самках мышей C57BL/6. Проверено прикрепление и чистота изолированных первичных гепатоцитов. Первичное выделение гепатоцитов используется для широкого спектра экспериментов по физиологии печени, таких как эффекты печеночных лекарств и метаболизм глюкозы, активность фармацевтических биомаркеров2, чувствительность к инсулину и выработка глюкозы. Поэтому деятельность первичных гепатоцитов, выделенных по этому протоколу, была проверена в следующих экспериментах.
Покрытие не требовалось для первичного прикрепления гепатоцитов в настоящем протоколе
Выделенные первичные гепатоциты были покрыты 5 х 105 клетками / лункой на 6-луночной пластине. Через 1 ч наблюдалось твердое прикрепление, а первичные гепатоциты полностью расширялись через 12 ч после нанесения покрытия (рисунок 3). Это указывало на то, что через 12 часов после нанесения покрытия клетки были готовы к использованию для экспериментов. Основываясь на морфологии ядра гепатоцитов мыши в печени, мононуклеарные гепатоциты обогащались на границах, в то время как бинуклеарные/полинуклеарные гепатоциты, сигнатура терминальной дифференцировки, находились в середине 3,4. Значительное количество изображенных клеток продемонстрировало типичную морфологию двойного ядра (диплоида), что указывает на успех выделения и очистки живых первичных гепатоцитов. Это также указывает на то, что коллагеновое покрытие не является обязательным требованием для первичного присоединения гепатоцитов к этому протоколу.
Чистота обогатилась в изолированной первичной популяции гепатоцитов
Различные маркеры генов, специфичные для типа клеток, использовались в предыдущих протоколах для проверки чистоты изолированных первичных гепатоцитов (таблица 1). TTR (транстиретин), CD95 (кластер дифференцировки 95, также известный как Fas), ASGR1 (азиалогликопротеиновый рецептор 1) и ASGR2 являются маркерами для гепатоцитов. После выделения уровни мРНК этих маркеров гепатоцитов были значительно повышены по сравнению со всей печенью (рисунок 4A-D,H).
Этот протокол также значительно уменьшил помехи от других печеночных клеток. Присутствие иммунных клеток, звездчатых клеток и эндотелиальных клеток было ниже, о чем свидетельствует резкое снижение уровней мРНК CD45 (маркер иммунных клеток), COL1A1 (коллаген, тип I, альфа 1, маркер звездчатых клеток) и TIE2 (Tunica interna эндотелиальная клеточная киназа, маркер эндотелиальных клеток) по сравнению со всей печенью (рисунок 4E-H) ). Они предполагают, что этот протокол может очистить первичную популяцию гепатоцитов от печеночных клеток и, таким образом, уменьшить возможное вмешательство других типов клеток в экспериментах.
Сохранена активность фармацевтических биомаркеров
Биомаркеры на гепатоцитах широко используются для нацеливания и доставки лекарств. Таким образом, сохранение активности фармацевтических биомаркеров является ключевым моментом в выделении первичных гепатоцитов и является стандартом для проверки полезности выделения первичных гепатоцитов2. Маркеры гепатоцитов ASGR1 и ASGR2 используются таким образом2. Сначала мы проверили уровень экспрессии этих двух маркеров до и после первичного гепатоцитарного покрытия. После покрытия их уровень мРНК значительно снижался со временем, но уровни оставались значительными по сравнению со всей печенью до 12-часовой временной точки после покрытия, особенно для ASGR1 (рисунок 5A, B). Тенденция экспрессии соответствовала предыдущему отчету2 и указывала на сопоставимую первичную гигиену гепатоцитов. Различные патогены нацелены на CD81, белок, связанный с мембраной гепатоцитов, чтобы облегчить их вход в клетки и инфекцию, такие как вирус гепатита5, Plasmodium falciparum и Plasmodium yoelii6. Другие белки, расположенные на мембране гепатоцитов, такие как TLR4 (Toll-подобный рецептор 4), также нацелены на патогены и важны для иммунного ответа гепатоцитов7. После нанесения покрытия уровень экспрессии CD81 был постоянным до 48 ч (рисунок 5C). Уровень экспрессии TLR4 обычно увеличивался, но только через 48 ч, когда он достиг уровня выше, чем in vivo (рисунок 5D). Это говорит о том, что первичные гепатоциты, выделенные по этому протоколу, также могут быть использованы для исследований CD81 и TLR4 в течение не менее 48 ч после покрытия. Вместе эти результаты указывают на то, что выделенные первичные гепатоциты действительны для использования в исследованиях, связанных с фармацевтическими биомаркерами. Стоит отметить, что уровни РНК и белка могут быть непоследовательными из-за влияния посттранскрипционной активности, такой как миграция РНК, вызванная сигнальным пептидом, посттрансляционная модификация и / или деградация белка. Поэтому проверка уровня белка и биоактивности фармацевтических биомаркеров, идентифицированных мРНК, может быть необходима, если этого требует экспериментальная парадигма.
Выделенные первичные гепатоциты были чувствительны к инсулину
Также анализировались показатели первичных гепатоцитов в экспериментах по метаболизму глюкозы. Инсулин, гормон, играющий центральную роль в метаболизме глюкозы, снижает уровень глюкозы, способствуя поглощению и хранению глюкозы в печени путем фосфорилирования AKT и FOXO1 (Forkhead box O1). Поэтому анализ чувствительности к инсулину проводили с изолированными первичными гепатоцитами. Через 16 ч клетки голодали в течение 3 ч, с безсыворочной средой. В последние 0,5 ч голодания в культуральную среду вводили 100 нМ инсулина. Как показано на рисунке 6A-C, инсулин значительно способствовал фосфорилированию как AKT в Ser473, так и FOXO1 в Ser256, что указывает на чувствительность первичных гепатоцитов к инсулину. Это говорит о том, что выделенные первичные гепатоциты из настоящего протокола полезны в исследованиях метаболизма инсулина / глюкозы.
Изолированные первичные гепатоциты были способны к выработке глюкозы
Мало того, что они являются центром хранения глюкозы, но гепатоциты также отвечают за выработку глюкозы. Чтобы проверить, полезны ли выделенные нами первичные гепатоциты в исследованиях производства глюкозы, клетки голодали в течение 10 ч в присутствии глюкагона, чтобы стимулировать выработку глюкозы. Затем среду голодания собирали для анализа глюкозы, в то время как клетки собирали для вестерн-блоттинга. Фосфоенолпируваткарбоноксикиназа (PEPCK) является важным компонентом в производстве глюкозы в печени, контролируя ее скорость8. Уровень белка PEPCK был значительно повышен после лечения глюкагоном, предполагая, что путь производства глюкозы был активирован (рисунок 7A, B). Эта активация была дополнительно подтверждена повышенным уровнем производства глюкозы (рисунок 7C). Это явление было также подтверждено другими стимуляторами производства глюкозы, такими как форсколин плюс IBMX (рисунок 7A-C). Однако из-за ограничения этого эксперимента мы не смогли проверить, было ли производство глюкозы эксклюзивным посредством глюконеогенеза или есть ли компонент гликогенолиза.
Рисунок 1: Установка стенда. (A) Стендовая установка для первичной изоляции гепатоцитов. (B) Карикатурная установка стенда для первичной изоляции гепатоцитов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Рассечение мыши, перфузия и первичная очистка гепатоцитов. (A) Рассеченная мышь со стрелками, указывающими на печень, IVC и воротную вену. (B) Установка катетера в IVC. (C) Давление на воротную вену, вызывающее увеличение и жесткость лоз печени, что указывает на успешную перфузию. (D) Размягченные лопесы печени после перфузии, свидетельствующие об успехе переваривания коллагеназы. (E) Положение желчного пузыря в изолированной печени (стрелка, указывающая на желчный пузырь). (F) Удаление желчного пузыря. (G) Разрыв печени в промывной среде гепатоцитов. (H) Смешивание 1x Percoll-HBSS с фильтрованным первичным гепатоцитом перед центрифугой. (I, J) первичная гранула гепатоцитов после центрифуги. (K) Первичная ресуспензия гепатоцитов в среде промывки гепатоцитов. (Л, М) Первичная гранула гепатоцитов образуется внутри промывной среды гепатоцитов после центрифуги. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Первичные гепатоциты после гальванизации. Снимки были сделаны после (A)1 ч, (B, C) 12 ч, (D) 24 ч, (E) 36 ч, (F) 48 ч, (G) 72 ч и (H) 96 ч первичного гепатоцитарного покрытия. Шкала = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Повышенная чистота первичных гепатоцитов после выделения. РНК выделяли до (из всей печени) и после (из выделенных первичных гепатоцитов) первичного выделения гепатоцитов с последующей ПЦР с обратной транскрипцией, согласно предыдущему протоколу9. Первичная чистота гепатоцитов оценивалась с помощью ПЦР в режиме реального времени с праймерами для маркеров гепатоцитов (A) TTR, (B) CD95, (C) ASGR1 и (D) ASGR2, а также с маркером иммунных клеток (E) CD45, (F) звездчатым клеточным маркером COL1A1 и (G) маркером эндотелиальных клеток TIE2. (H) Тепловая карта была сгенерирована для изменения экспрессии маркеров типа клеток до и после первичной изоляции гепатоцитов. В качестве внутреннего контроля использовался GAPDH (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа). Праймеры, используемые здесь, были для генов (последовательности праймеров приведены в таблице 2. Ссылки на последовательности приведены здесь): TTR10; СД9511; АСГР112; АСГР213; СД4514; КОЛ1А115; ТИ216; ГАПДХ17. Графики и тепловая карта были сгенерированы с помощью GraphPad Prism 8. Полоса ошибок указывает на стандартное отклонение, а двуххвостые непарные (поскольку первичные образцы гепатоцитов и всей печени были непарными, поскольку этот протокол требует интактной печени для начала) значение t-теста указывается звездочками (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001). N=7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Экспрессия фармацевтических биомаркеров. РНК выделяли из всей печени и первичного гепатоцита после покрывания с последующей ПЦР с обратной транскрипцией. Экспрессию фармацевтических биомаркеров оценивали с помощью ПЦР в режиме реального времени с праймерами для (A) ASGR1, (B) ASGR2, (C) CD81 и (D) TLR4. В качестве внутреннего контроля использовался GAPDH. Новые праймеры, использованные здесь, были для генов (последовательности праймеров приведены в таблице 2. Ссылки на последовательности приведены здесь): CD8118; ТЛР419. Графики были сгенерированы с помощью GraphPad Prism 8. N = 5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Чувствительность к инсулину сохраняется после первичной изоляции гепатоцитов. (A) Вестерн-блоттинг p-AKT (S473), AKT, p-FOXO1 (S256), FOXO1 и GAPDH после лечения инсулином. (B) p-AKT (S473)/AKT в денситометрии вестерн-блот. (C) p-FOXO1 (S256)/FOXO1 в денситометрии западного пятна. Анализ чувствительности к инсулину проводили через 16 ч после первичного гепатоцитарного покрытия. Первичные гепатоциты голодали в течение 3 ч в среде William's E Medium (GlutaMAX Supplement) без FBS, но с 1% антибиотико-антимикотическим раствором и с лечением инсулином 100 нМ в течение последних 30 мин, прежде чем их собирали для лизиса белка с 1x буфером RIPA. Графики были сгенерированы с помощью GraphPad Prism 8. Вестерн-блот-визуализация проводилась с помощью LI-COR Odyssey CLx. Полоса ошибок указывает на стандартное отклонение, а значимость двуххвостого парного t-теста обозначена звездочками (* p < 0,05; ** p < 0,01). N = 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Анализ производства глюкозы. (A) Вестерн-блоттинг PEPCK и GAPDH после лечения глюкагоном или форсколином+IBMX в течение 10 ч. (B) Денситометрия уровня белка PEPCK по сравнению с GAPDH после лечения глюкагоном или форсколином+IBMX в течение 10 ч. (C) Уровень глюкозы по сравнению с уровнем белка после лечения глюкагоном или форсколином+IBMX в течение 10 ч. Анализ производства глюкозы проводили через 16 ч после первичного гепатоцитарного покрытия. Первичные гепатоциты голодали в течение 10 ч в dmEM без глюкозы и фенола (добавляли 2 мМ L-глутамина, 2 мМ пирувата натрия, 20 мМ L-лактата натрия, 1% стрептококка Пера), либо 50нМ глюкагона, либо 20 мкМ форсколина и 200 мкМ IBMX. Среда была собрана для измерения концентрации глюкозы с помощью набора для анализа глюкозы, в то время как белок был собран для вестерн-блоттинга. Вестерн-блот-визуализация проводилась с помощью LI-COR Odyssey CLx. Полоса ошибок указывает на стандартное отклонение, а значимость двуххвостого парного t-теста обозначена звездочками (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001). N = 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Время центрифугирования | Удаление грудной клетки | Перфузионные буферы самопроизводящиеся | Хирургический узел | Отопление лампы | Покрытие пластин | Количество изолированных ячеек/мышь | Градиентное центрифугирование | Гены маркеров чистоты | |
| Настоящий протокол | 2 | Нет | Нет | Нет | Нет | Нет | 2,5–4 х 107 | Да | TTR, CD95, ASGR1, ASGR2, CD45, COL1A1, TIE2 |
| Севергини и др.2. | 4 | Да | Да | Да | Да | Да | 1,8–2 х 107 | Нет | ТТР, CD45, COL1A1, TIE2 |
| Гонсалвес и др.24. | 5 или 6 | Нет | Нет | Нет | Нет | Да | 1–3 х 106 | Да | СД45, СД95 |
| Ли и др.20. | 4 или 5 | Нет | Да | Да | Нет | Не упоминается | 1–4 х 107 | Нет | Н/Д |
| Салем и др.21. | 3 | Нет | Да | Нет | Нет | Не упоминается | 2 х 107 | Да | Н/Д |
| Кабрал и др.22. | 3 или 6 (с градиентным центрифугированием) | Нет | Да | Да | Нет | Да/Рекомендуется | Н/Д | Необязательный | N/A (чистота, оцениваемая с помощью световой микроскопии) |
| Корелова и др.23. | 3 | Нет | Да | Да | Нет | Да | Н/Д | Да | Н/Д |
Таблица 1: Сравнение протоколов первичных гепатоцитов.
| Грунтовка (Вперед) | Грунтовка (реверс) | Ссылка | ||
| TTR Форвард 5'-3': AGCCCTTTGCCTCTGGGAAGAC | TTR Реверс 5'-3': TGCGATGGTGTAGTGGCGATGG | 10 | ||
| CD95 Форвард 5'-3': ATGCACACTCTGCGATGAAG | CD95 Реверс 5'-3': CAGTGTTCACAGCCAGGAGA | 11 | ||
| ASGR1 Форвард 5'-3': GAGTCGAAGCTGGAAAAACAG | ASGR1 Реверс 5'-3': CCTTCATACTCCACCCAGTTG | 12 | ||
| ASGR2 Форвард 5'-3': CTACTGGTTTTCTCGGGATGG | ASGR2 Реверс 5'-3': CAAATATGAAACTGGCTCCTGTG | 13 | ||
| CD45 Вперед 5'-3': GAACATGCTGCCAATGGTTCT | CD45 Реверс 5'-3': TGTCCCACATGACTCCTTTCC | 14 | ||
| COL1A1 Форвард 5'-3': GAAGCACGTCTGGTTTGGA | COL1A1 Реверс 5'-3': ACTCGAACGGGAATCCATC | 15 | ||
| TIE2 Форвард 5'-3': ATGTGGAAGTCGAGAGGCGAT | TIE2 Реверс 5'-3': CGAATAGCCATCCACTATTGTCC | 16 | ||
| GAPDH Форвард 5'-3': CGACTTCAACAGCAACTCCCACTCTTCC | GAPDH Реверс 5'-3': TGGGTGGTCCAGGGTTTCTTACTCCTT | 17 | ||
| CD81 Форвард 5'-3': CCAAGGCTGTGGTGAAGACTTTC | CD81 Реверс 5'-3': GGCTGTTCCTCAGTATGGTGGTAG | 18 | ||
| TLR4 Вперед 5'-3': ACCTGGCTGGTTTACACGTC | TLR4 Реверс 5'-3': CTGCCAGAGACATTGCAGAA | 19 | ||
Таблица 2: Перечень грунтовок: Праймеры, используемые для генов TTR, CD95, ASGR1, ASGR2, CD45, COL1A1, TIE2, GAPDH, CD81 и TLR4
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Разработаны различные протоколы выделения первичных гепатоцитов. Они также были оптимизированы и адаптированы с учетом различных потребностей (таблица 1). Протоколы выделения обычно состоят из двух частей: перфузии (включая ферментное сбраживание) и очистки.
Перфузия может быть выполнена со всей печенью in vivo 2,20,21,22,23 или с рассеченными долями печени 24. Перфузия рассеченных долей обычно ограничивалась левыми и средними долями для технической легкости. Теоретически, перфузия in vivo должна давать больше первичных гепатоцитов из-за использования всей печени со всеми долями. Поддержание печени на месте во время перфузии может также снизить гибель клеток, поскольку гепатоциты in vivo могут быть купаются в жидкости, либо в крови, либо в перфузионных буферах, в любое время на этом этапе.
Поддержание стерильных условий также играет важную роль на этом этапе. Если условие позволяет, лучше проводить перфузию в чистой вытяжке. Все средства при непосредственном прикосновении к тканям должны быть стерильными, чего можно добиться автоклавом. Чтобы предотвратить любое загрязнение бактериями и грибками, в культуральную среду добавляли антибиотически-антимикотический раствор.
IVC и воротная вена являются двумя основными сосудами, соединяющими печень с другими органами. Большинство протоколов используют любую из этих вен для введения игл для перфузии: IVC 2,20,21,23, портальная вена 22. Положение воротной жилы находится под наклонным углом, что приводит к трудностям в позиционировании и стабилизации вставленной иглы. Таким образом, шов обычно необходим, чтобы связать иглу на месте хирургическим узлом, что должно быть сделано очень осторожно, так как вена подвержена повреждениям. Как правило, диаметр воротной вены также меньше, чем IVC, что усложняет введение иглы. Учитывая это, использование IVC может быть более удобным, хотя в некоторых протоколах игла также хирургическим путем привязывается к IVC20. Сообщалось, что перфузия с введением IVC привела к менее жизнеспособным первичным гепатоцитам, чем воротная вена25. Однако в настоящем протоколе мы успешно использовали вставку IVC, и изолированная первичная жизнеспособность гепатоцитов (>96% в оптимизированных условиях, измеренная с помощью окрашивания Trypan Blue в соответствии с протоколом производителя) была такой же высокой, если не больше, как и другие протоколы (варьируется от 80% до 96% в зависимости от протоколов и условий 2,22,23,24).
Есть две цели для этапа перфузии: вымыть кровь из долей печени и переварить печень для высвобождения первичных гепатоцитов. Для достижения этих целей следует использовать по крайней мере два буфера, один для потока крови (буфер потока) и один для пищеварения (буфер пищеварения). Большинство протоколов готовят буфер потока на основе HBSS и добавляют коллагеназу внутрь, чтобы сделать ее способной к пищеварению, в качестве буфера пищеварения. Подготовка этих буферов занимает много времени, и буферы могут незначительно различаться по некоторым деликатным свойствам, таким как pH, от партии к партии, поэтому вводят непрошеные переменные. Учитывая это, использование коммерчески доступных буферов экономит ценные трудозатраты и время, сводя к минимуму эти переменные. Gibco разработала протокол первичного выделения гепатоцитов у взрослых крыс26, основанный на использовании коммерчески доступной среды перфузии печени (в качестве буфера потока) и среды пищеварения печени (в качестве буфера пищеварения). Мыши и крысы, как грызуны, имеют большое сходство в свойствах тела; можно интегрировать эти два оптимизированных для крыс буферов в выделение первичных гепатоцитов мышей. Действительно, Гонсалвес и др. 24, успешно проводят перфузию рассеченных долей печени с этими буферами, повышая перспективность их применения при перфузии печени in vivo. Здесь мы успешно протестировали среду перфузии печени и среду пищеварения печени в настоящем протоколе первичных гепатоцитов мыши, которые дали высококачественные жизнеспособные первичные гепатоциты (рисунок 3 и рисунок 4).
Температура перфузионного буфера определяет, насколько хорошо первичные гепатоциты выживают при выделении. Если температура слишком высока, коллагеназа в пищеварительном буфере может иметь пониженную активность; если они слишком низкие, первичные гепатоциты могут страдать от холодового шока, вызывая возможный скомпрометированный выход изоляции. Время, необходимое буферу для протекания через перфузионную трубку, также определяет температуру буфера, когда он достигает печени. В предыдущих протоколах использовалась водяная баня 40 °C2 или42 °C 21 . Эта температура может быть подвержена изменениям в зависимости от лабораторных условий, таких как температура окружающей среды, длина перфузионной трубки и тип перистальтического насоса. В настоящем протоколе, после многократного тестирования, мы оптимизировали температуру водяной бани до 45 ° C для нагрева буферов.
Чистота выделенных первичных гепатоцитов играет важную роль в последующих экспериментах, так как чем выше коэффициент чистоты, тем меньше возможных помех. Хотя печень в основном состоит из гепатоцитов, на которые приходится 60%-80% по массе27, также присутствуют различные типы других клеток, таких как иммунные клетки, звездчатые клетки и эндотелиальные клетки, которые важны для печеночной иммунологической активности. Каждая из этих клеток может разместить потенциальную интерференцию в более поздних экспериментах28. Например, звездчатые клетки в печени также реагируют на патогенные инвазии и повреждения печени, вовлекая образование рубцов29. В цифрах 5%-8% от общей популяции печеночных клеток вносят звездчатые клетки30. Обычно звездчатые клетки находятся в состоянии покоя, но этот статус может быть нарушен при наличии стрессов. Таким образом, активность звездчатых клеток может быть вызвана стрессами, введенными во время изоляции или последующего лечения, если некоторые из этих клеток остаются в окончательном изолированном первичном пуле гепатоцитов. Другие типы клеток также вносят вклад в значительную часть популяции печеночных клеток, таких как синусоидальные эндотелиальные клетки печени (LSECs), на которые приходится 20% от общей популяции печеночных клеток31. Как устранить присутствие этих клеток было загадочной частью в процессе первичной изоляции гепатоцитов. Таким образом, очистка является ключевой частью первичной изоляции гепатоцитов, которая обычно использует преимущества различий в весе и размере между различными типами клеток. Оптимизируя скорость центрифуги и/или буфер очистки, первичные гепатоциты могут быть гранулированы до нижней части трубки.
Отделение живых клеток от мертвых клеток также имеет решающее значение для получения здоровых первичных гепатоцитов и точного подсчета клеток. Обычно подсчет количества клеток является обязательным после очистки, поскольку результаты многочисленных экспериментов меняются по мере изменения слияния клеток. Градиентные центрифужные реагенты могут быть использованы на этом этапе для выполнения этой миссии, как Percoll. 36%-40% Перколла в гранулах центрифуги опускают живые клетки и удерживают мертвые клетки в супернатанте. Мы успешно оптимизировали скорость и время центрифугирования для уменьшения популяции клеток непервичных гепатоцитов в настоящем протоколе. Клеточные тип-специфические маркеры использовались для проверки чистоты изолированных первичных гепатоцитов здесь, как и другие протоколы. Маркерами гепатоцитов, используемыми здесь, были TTR2, CD9524,32, ASGR133 и ASGR234. Маркеры для других типов клеток включают CD45 (маркер иммунных клеток), COL1A1 (маркер звездчатых клеток), TIE2 (маркер эндотелиальных клеток) 2,35. С помощью этих маркеров первичные гепатоциты, выделенные по настоящему протоколу, показали высокий уровень чистоты (фиг.4), сопоставимый с предыдущими протоколами 2,24.
Во время перфузии коллагеназа в пищеварительном буфере ослабляет прикрепление между клетками, разрушая коллаген во внеклеточном матриксе. Это приводит к трудностям в достижении клеток во время покрытия. Большинство предыдущих протоколов требуют/рекомендуют предварительное покрытие пластин коллагеном2,22 или желатином24 для лучшего прикрепления первичных гепатоцитов. Насколько нам известно, в то время как Salem et al. 21 и Ли и др. 20 не обсуждался этот этап, другие протоколы, оцененные в этом исследовании, четко указывали/рекомендовали использование предварительно покрытых пластин 2,22,23,24. В настоящем протоколе мы обнаружили, что покрытие пластин не требуется для пластин определенных типов. Хотя мы не уверены, было ли это связано с тем, что различные типы пластин, особенно если они от разных производителей, имеют разную гладкость поверхности, и играет ли эта разнообразная гладкость, если она когда-либо существует, важную роль в первичном прикреплении гепатоцитов, полезно отметить, что другой этап (покрытие пластин) может быть пропущен для эффективности. Также важно отметить, что этот протокол генерирует значительную долю терминально дифференцированных, например, диплоидных гепатоцитов, наряду с мононуклеарными гепатоцитами, аналогичными in vivo печеночным синусоидам.
В этом исследовании преимущества предыдущих протоколов выделения первичных гепатоцитов были объединены, и процесс был максимально упрощен, используя коммерчески доступные реагенты и устраняя ненужные шаги. Этапы центрифугирования были успешно сокращены до двух, что, насколько нам известно, является наименьшим в опубликованных протоколах. Чтобы подтвердить чистоту и биоактивность выделенных первичных гепатоцитов, оценивали уровень различных маркеров печеночных клеток, подтверждая, что настоящий протокол может значительно повысить чистоту первичных гепатоцитов и уменьшить другие популяции печеночных клеток, таких как иммунные клетки, звездчатые клетки и эндотелиальные клетки. Активность фармацевтических биомаркеров, таких как ASGR1, ASGR2, CD81 и TLR4, хорошо сохранялась в первичных гепатоцитах, выделенных с помощью настоящего протокола, который также подтвердил чувствительность к инсулину и активность производства глюкозы. Основным ограничением этого протокола является стоимость, так как все реагенты были приобретены коммерчески для эффективности. Мы специально не проверили, что гликогеноз был неповрежденным в первичных гепатоцитах, выделенных с использованием настоящего протокола, и это может потребовать дальнейших исследований для соответствующих исследований. Этот протокол имеет сходные этапы перфузии с предыдущими, такими как Salem et al.21, Severgnini et al.2 и Li et al.20, и Korelova et al.23, с использованием вставки IVC. Их буферы перфузии и пищеварения, которые могут потребовать дополнительной работы для подготовки, также могут работать с настоящим протоколом с небольшой модификацией времени переваривания ферментов. Поэтому сочетание реагентов предыдущих протоколов с этапами настоящего протокола также может быть полезным, как временным, так и экономически выгодным.
Таким образом, был разработан улучшенный протокол с точки зрения времени и труда для первичного выделения гепатоцитов из печени мыши. Этот протокол полностью использует коммерчески доступные реагенты и может быть завершен за ~ 35 мин, от рассечения мыши до покрытия первичных гепатоцитов, тем самым обеспечивая полезную технику для первичных исследований, связанных с гепатоцитами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (грант 5R01HD095512-02 для S.W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Gibco | 10010023 | |
| 10x HBSS | Gibco | 14065-056 | |
| 12-well Plate | FALCON | 353043 | Coating not required |
| 6-well Plate | FALCON | 353046 | Coating not required |
| anti-AKT | Cell Signaling | 2920S | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x), Stabilized | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| anti-FOXO1 | Cell Signaling | 97635S | |
| anti-GAPDH | Cell Signaling | 2118S | |
| anti-p-AKT (S473) | Cell Signaling | 9271L | |
| anti-PEPCK | Santa Cruz | SC-166778 | |
| anti-p-FOXO1 (S256) | Cell Signaling | 84192S | |
| Cell Strainer, 70 µm | CELLTREAT | 229483 | |
| Closed IV Catheter, 24 Gauge 0.75 IN | Becton Dickinson | 383511 | |
| DMEM, no glucose, no glutamine, no phenol red | ThermoFisher Scientific | A1443001 | |
| EnzyChrom Glucose Assay Kit | BioAssay Systems | EBGL-100 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
| Forskolin | MilliporeSigma | F3917-10MG | |
| Glucagon | Sigma-Aldrich | G2044 | |
| Goat Anti-mouse IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-68070 | |
| Goat Anti-rabbit IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-32211 | |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Software | NA | |
| Hepatocyte Wash Medium | Gibco | 17704-024 | |
| IBMX | Cell Signaling | 13630S | |
| Insulin | Lilly | NDC 0002-8215-01 | |
| Ketamine HCL (100 mg/mL) | Hospira Inc | NDC 0409-2051-05 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Liver Digest Medium | Gibco | 17703-034 | Aliquot within tissue culture hood to 25 mL each in 50 mL tube, and keep in -20 °C freezer |
| Liver Perfusion Medium | Gibco | 17701-038 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140122 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Peristaltic Pump | Gilson | Minipuls 2 | Capable of pumping at 4 mL/min |
| Petri Dish | Fisherbrand | 08-757-12 | |
| Refrigerated Centrifuge | Sorvall | Legend RT | Capable to centrifuge 50 mL tube at 4 °C |
| Sodium L-Lactate | Sigma-Aldrich | L7022 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| Syringe Filter, PVDF 0.45 µm 30mm diameter | CELLTREAT | 229745 | |
| Syringe, 0.5 mL | Becton Dickinson | 329461 | |
| Syringe, 60 mL | Becton Dickinson | 309653 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Tube, 15 mL | Corning | 430052 | |
| Tube, 50 mL | Corning | 430290 | |
| Water Bath Tank | Corning | CLS6783 | Or any water bath tank capable of heating up to 45 °C |
| William’s E Medium (GlutaMAX Supplement) | Gibco | 32551020 | |
| Xylozine (100 mg/mL) | Vetone Anased LA | NDC13985-704-10 |
References
- Han, H. S., Kang, G., Kim, J. S., Choi, B. H., Koo, S. H. Regulation of glucose metabolism from a liver-centric perspective. Experimental and Molecular Medicine. 48, 218 (2016).
- Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
- Guidotti, J. E., et al. Liver cell polyploidization: a pivotal role for binuclear hepatocytes. Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).
- Morales-Navarrete, H., et al. A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture. Elife. 4, 11214 (2015).
- Bruening, J., et al. Hepatitis C virus enters liver cells using the CD81 receptor complex proteins calpain-5 and CBLB. PLoS Pathogens. 14 (7), 1007111 (2018).
- Silvie, O., et al. Hepatocyte CD81 is required for Plasmodium falciparum and Plasmodium yoelii sporozoite infectivity. Nature Medicine. 9 (1), 93-96 (2003).
- Crispe, I. N.
- Liu, N. C., et al. Loss of TR4 orphan nuclear receptor reduces phosphoenolpyruvate carboxykinase-mediated gluconeogenesis. Diabetes. 56 (12), 2901-2909 (2007).
- Wang, Z., et al. Gonadotrope androgen receptor mediates pituitary responsiveness to hormones and androgen-induced subfertility. JCI Insight. 5 (17), 127817 (2019).
- Santos, S. D., et al. CSF transthyretin neuroprotection in a mouse model of brain ischemia. Journal of Neurochemistry. 115 (6), 1434-1444 (2010).
- Pinhu, L., et al. Overexpression of Fas and FasL is associated with infectious complications and severity of experimental severe acute pancreatitis by promoting apoptosis of lymphocytes. Inflammation. 37 (4), 1202-1212 (2014).
- Mi, Y., Lin, A., Fiete, D., Steirer, L., Baenziger, J. U. Modulation of mannose and asialoglycoprotein receptor expression determines glycoprotein hormone half-life at critical points in the reproductive cycle. Journal of Biological Chemistry. 289 (17), 12157-12167 (2014).
- Tanowitz, M., et al. Asialoglycoprotein receptor 1 mediates productive uptake of N-acetylgalactosamine-conjugated and unconjugated phosphorothioate antisense oligonucleotides into liver hepatocytes. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12388-12400 (2017).
- Manczak, M., et al. Neutralization of granulocyte macrophage colony-stimulating factor decreases amyloid beta 1-42 and suppresses microglial activity in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Human Molecular Genetics. 18 (20), 3876-3893 (2009).
- Zhang, Y., et al. JAK1-dependent transphosphorylation of JAK2 limits the antifibrotic effects of selective JAK2 inhibitors on long-term treatment. Annals of the Rheumatic Diseases. 76 (8), 1467-1475 (2017).
- Shih, S. C., et al.
- Liu, G., et al. miR-147, a microRNA that is induced upon Toll-like receptor stimulation, regulates murine macrophage inflammatory responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15819-15824 (2009).
- Ding, Q., et al. Mice expressing minimally humanized CD81 and occludin genes support Hepatitis C virus uptake in vivo. Journal of Virology. 91 (4), 01799 (2017).
- Renshaw, M., et al. Cutting edge: impaired Toll-like receptor expression and function in aging. Journal of Immunology. 169 (9), 4697-4701 (2002).
- Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
- Salem, E. S. B., et al. Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323 (2018).
- Cabral, F., et al. Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507 (2019).
- Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies. Malar Journal. 6, 169 (2007).
- Yin, Z., Ellis, E. C., Nowak, G. Isolation of mouse hepatocytes for transplantation: a comparison between antegrade and retrograde liver perfusion. Cell Transplant. 16 (8), 859-865 (2007).
- Hepatocyte media, Thermofisher. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/Hepatocyte_Media_UG.pdf (2021).
- Sia, D., Villanueva, A., Friedman, S. L., Llovet, J. M. Liver cancer cell of origin, molecular class, and effects on patient prognosis. Gastroenterology. 152 (4), 745-761 (2017).
- Freitas-Lopes, M. A., Mafra, K., David, B. A., Carvalho-Gontijo, R., Menezes, G. B. Differential location and distribution of hepatic immune cells. Cells. 6 (4), 48 (2017).
- Schachtrup, C., Le Moan, N., Passino, M. A., Akassoglou, K. Hepatic stellate cells and astrocytes: Stars of scar formation and tissue repair. Cell Cycle. 10 (11), 1764-1771 (2011).
- Geerts, A. History, heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells. Seminars in Liver Disease. 21 (3), 311-335 (2001).
- Poisson, J., et al. Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases. Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).
- Peter, M. E., et al. The CD95 receptor: apoptosis revisited. Cell. 129 (3), 447-450 (2007).
- Peters, D. T., et al. Asialoglycoprotein receptor 1 is a specific cell-surface marker for isolating hepatocytes derived from human pluripotent stem cells. Development. 143 (9), 1475-1481 (2016).
- Willoughby, J. L. S., et al. Evaluation of GalNAc-siRNA conjugate activity in pre-clinical animal models with reduced asialoglycoprotein receptor expression. Molecular Therapy. 26 (1), 105-114 (2018).
- Hutchins, N. A., Chung, C. S., Borgerding, J. N., Ayala, C. A., Ayala, A. Kupffer cells protect liver sinusoidal endothelial cells from Fas-dependent apoptosis in sepsis by down-regulating gp130. American Journal of Pathology. 182 (3), 742-754 (2013).
