Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

بروتوكول محسن فعال من حيث الوقت والعمل لعزل خلايا الكبد الأولية للماوس

Published: October 25, 2021 doi: 10.3791/61812
Automatic Translation
1, 3, 1,2
1Department of Pediatrics, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Physiology, Temple University School of Medicine, 3Department of Pediatrics, Seattle Children’s Hospital

Summary

خلايا الكبد الأولية هي أداة قيمة لدراسة استجابة الكبد والتمثيل الغذائي في المختبر. باستخدام الكواشف المتاحة تجاريا ، تم تطوير بروتوكول محسن فعال من حيث الوقت والعمالة لعزل خلايا الكبد الأولية للفئران.

Abstract

تستخدم خلايا الكبد الأولية على نطاق واسع في أبحاث الكبد في المختبر ، خاصة في دراسات استقلاب الجلوكوز. تم تكييف تقنية أساسية بناء على احتياجات مختلفة ، مثل الوقت والعمالة والتكلفة واستخدام خلايا الكبد الأولية ، مما أدى إلى بروتوكولات عزل خلايا الكبد الأولية المختلفة. ومع ذلك ، فإن الخطوات العديدة ومستحضرات الكواشف التي تستغرق وقتا طويلا في عزل خلايا الكبد الأولية هي عيوب رئيسية للكفاءة. بعد مقارنة بروتوكولات مختلفة لإيجابياتها وسلبياتها ، تم الجمع بين مزايا كل منها ، وتم صياغة بروتوكول عزل خلايا الكبد الأولية بسرعة وكفاءة. في غضون 35 دقيقة فقط ، يمكن لهذا البروتوكول أن ينتج الكثير ، إن لم يكن أكثر ، من خلايا الكبد الأولية الصحية مثل البروتوكولات الأخرى. علاوة على ذلك ، أثبتت تجارب استقلاب الجلوكوز التي أجريت باستخدام خلايا الكبد الأولية المعزولة فائدة هذا البروتوكول في دراسات استقلاب الكبد في المختبر . كما قمنا بمراجعة وتحليل أهمية وغرض كل خطوة في هذه الدراسة على نطاق واسع حتى يتمكن الباحثون المستقبليون من تحسين هذا البروتوكول بناء على الاحتياجات.

Introduction

الكبد بمثابة واحد من أهم الأعضاء في الجسم الفقاري بسبب الدور الحيوي الذي يلعبه في العديد من الوظائف الداعمة للحياة مثل هضم الطعام والدورة الدموية وإزالة السموم. استخدام خلايا الكبد الأولية للفئران في ثقافة المختبر تحظى بشعبية متزايدة في دراسات استقلاب الكربوهيدرات وسرطان الكبد. لذلك ، من المهم تطوير طريقة ملائمة لعزل خلايا الكبد الأولية للفأر مع الحفاظ على وظيفتها الفسيولوجية الفطرية. نظرا لوظيفته كمركز لاستقلاب الجلوكوز ، فإن الكبد هو أيضا مركز لإنتاج الجلوكوز وتخزينه1. التجارب مع خلايا الكبد الأولية في المختبر أمر لا بد منه لمعظم دراسات استقلاب الجلوكوز. لذلك ، لسنوات ، طورت مجموعات بحثية مختلفة بروتوكولات لعزل خلايا الكبد الأولية للفئران.

الإجراء العام لعزل خلايا الكبد لدى الفئران هو أولا طرد الدم في الكبد بسائل متساوي السمو مثل محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) أو محلول الملح المتوازن من هانكس (HBSS) ثم استخدام محلول يحتوي على الكولاجيناز لفصل خلايا الكبد. تشترك هذه البروتوكولات في إجراء عام ولكنها تختلف في الكواشف والخطوات القائمة على الاحتياجات المختلفة. ومع ذلك ، فإن إعداد الكواشف المطلوبة وتنفيذ خطوات العزل يستغرق وقتا. ولدى وضع هذا البروتوكول، وضعت الكفاءة كأولوية، مع جعل جميع الكواشف جاهزة للاستخدام ومتاحة من السوق، وبأقل خطوات ممكنة. الهدف العام من هذا البروتوكول هو توفير طريقة سريعة وفعالة في العمل لعزل خلايا الكبد الأولية عن الفأر ، دون تعريض نقاء خلايا الكبد الأولية المعزولة وقدرتها على البقاء للخطر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة جونز هوبكنز لرعاية الحيوانات واستخدامها. تم استخدام C57BL/6 إناث الفئران (8 أسابيع) في هذه الدراسة.

1. التحضير:

  1. امزج ويليام E Medium (ملحق GlutaMAX) مع محلول FBS بنسبة 10٪ ومحلول مضاد للفطريات بنسبة 1٪ لجعل الثقافة متوسطة.
  2. قم بتصفية 25 مل من وسط الكولاجيناز المنفصل (على سبيل المثال ، Liver Digest Medium) من خلال مرشح حقنة 0.45 ميكرومتر لإزالة حطام الجسيمات.
  3. دافئ 50 مل من H 2 O مزدوج المقطر (ddH2O) ، و 35 ملمن وسط التروية (على سبيل المثال ، وسط تروية الكبد) (أو 50 مل في المرة الأولى باستخدام هذا البروتوكول) ، و 25 مل من وسط الكولاجيناز المصفى في حمام مائي 45 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  4. داخل غطاء زراعة الأنسجة المعقمة، امزج 2 مل من 10x HBSS و 18 مل من Percoll في أنبوب 50 مل لصنع 20 مل 1x Percoll-HBSS والحفاظ على الجليد أو 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يمكن الاحتفاظ ب 1x Percoll-HBSS عند 4 درجات مئوية لمدة 6 أشهر على الأقل.
  5. داخل غطاء زراعة الأنسجة المعقمة، صب 30 مل من وسط الغسيل (على سبيل المثال، وسط غسيل خلايا الكبد) في طبق بتري نظيف، واحتفظ به على الثلج.
  6. اغمر أنبوب الضخ في ماء حمام مائي 45 درجة مئوية. تكون النتائج أكثر موثوقية إذا كانت درجة حرارة الغرفة عند 25 درجة مئوية.
  7. تحضير 2 مل من مخدر 1x عن طريق خلط 225 ميكرولتر من الكيتامين HCL ، 93.75 ميكرولتر من Xylazine ، و 1681 ميكرولتر من 1x PBS.
  8. تخدير فأر واحد باستخدام طريقة معتمدة. هنا تم حقن الفأر داخل الصفاق مع 150 ميكرولتر من 1x التخدير. قم بإجراء اختبارات فقدان ردود الفعل مثل رد الفعل على قرص إصبع القدم لضمان التخدير الكامل.
  9. قم بتثبيت الماوس على ظهره على وسادة التشريح بواسطة أربعة أطراف ، إما عن طريق تثبيت أو استخدام شريط مقاوم للماء أو طرق أخرى معتمدة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات في المؤسسة (أو ما يعادلها).
  10. تحضير ملقط ومقص معقم للتشريح. لتجنب التلوث المحتمل ، قم بإجراء جميع الخطوات داخل غطاء محرك السيارة المعقم.

2. الإجراء:

  1. باستخدام مضخة تمعجية ، ابدأ في ضخ ddH2O المحموم بسرعة 4 مل / دقيقة لمدة 5 دقائق. قم بتغيير أنبوب الضخ من الماء إلى وسط تروية مسخن.
  2. قم بتطهير بطن الفأر المخدر بنسبة 70٪ EtOH وقم بفتحه بمقص لفضح الكبد والوريد البابي والوريد الأجوف السفلي (IVC).
  3. أوقف المضخة التمعجية. أدخل قسطرة 24 جم (على سبيل المثال، قسطرة وريدية مغلقة، 24 جم، 0.75 بوصة) في IVC. ابدأ في الضخ وقطع الوريد البابي مفتوحا.
  4. استمر في الضخ حتى يصبح السائل الذي تم تنظيفه صافيا (حوالي 3-5 دقائق). اضغط على الوريد البابي كل دقيقة للسماح للسائل بالوصول إلى كل ركن من أركان الكبد. احرص على عدم السماح لفقاعات الهواء بالدخول إلى IVC.
    ملاحظة: هذه الخطوة هي طرد أكبر قدر ممكن من الدم من الكبد.
  5. قم بتغيير أنبوب الضخ من وسط التروية إلى وسط الكولاجيناز المنفصل. استمر في الضخ حتى يتم استنفاد كل 25 مل من وسط الكولاجيناز المنفصل أثناء القيام بالخطوة 2.6.
  6. اضغط على الوريد البابي كل دقيقة للسماح للسائل بالوصول إلى كل ركن من أركان الكبد.
    ملاحظة: في هذه المرحلة ، يكون الفقدان الكامل للدم قاتلا للماوس. يمكن تأكيد وفاة الفأر من خلال نقص ضربات القلب بعد التجربة. تخلص من الذبيحة وفقا لسياسات المنشأة.
  7. اعزل الكبد بالكامل بدون مرارة إلى وسط الغسيل 30 مل في طبق بتري على الثلج.
  8. قم بتمزيقه إلى قطع باستخدام ملقط لإطلاق خلايا الكبد الأولية في محلول. هذه الخطوة من شأنها أن تحول وسط الغسيل إلى محلول غائم مليء بخلايا الكبد الأولية التي تم إطلاقها وقطع الكبد الصغيرة.
  9. قم بتصفية المحلول الغائم في الخطوة 2.8 من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر إلى 20 مل 1x Percoll-HBSS في أنبوب 50 مل على الجليد. اخلط عن طريق عكس الأنبوب 20 مرة.
  10. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  11. داخل غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة ، شفط supernatant. اغسل الكريات ببرودة 30 مل من وسط الغسيل.
  12. جهاز طرد مركزي عند 50 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  13. قم بإزالة السوبرناتانت وإعادة تعليق الكريات في 25 مل من وسط المزرعة (أو الأحجام الأخرى المناسبة) داخل غطاء زراعة الأنسجة.
  14. عد رقم الخلية ولوحة الخلايا على لوحات الثقافة المطلوبة وفقا للتصميم التجريبي.
    ملاحظة: عادة ما تكون خلايا الكبد الأولية المعزولة بشكل صحيح من فأر واحد عمره 8 أسابيع كافية ليتم طلاؤها على أربعة ألواح من 6 آبار أو أربع لوحات من 12 بئرا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

من أجل اختبار الكفاءة ، تم إجراء بروتوكول عزل خلايا الكبد الأولية الحالية على الفئران C57BL / 6 البالغة من العمر 8 أسابيع. تم اختبار تعلق ونقاء خلايا الكبد الأولية المعزولة. يستخدم عزل خلايا الكبد الأولية لمجموعة واسعة من التجارب على فسيولوجيا الكبد ، مثل تأثيرات الأدوية الكبدية واستقلاب الجلوكوز ، ونشاط المؤشرات الحيوية الصيدلانية2 ، وحساسية الأنسولين ، وإنتاج الجلوكوز. لذلك ، تم اختبار أنشطة خلايا الكبد الأولية المعزولة بهذا البروتوكول في التجارب التالية.

لم يكن الطلاء مطلوبا لمرفق خلايا الكبد الأولية في هذا البروتوكول
تم طلاء خلايا الكبد الأولية المعزولة في 5 × 105 خلايا / بئر على لوحة من 6 آبار. بعد 1 ساعة ، لوحظ وجود مرفق ثابت ، وتوسعت خلايا الكبد الأولية بالكامل 12 ساعة بعد الطلاء (الشكل 3). هذا يشير إلى أنه بعد 12 ساعة من الطلاء ، كانت الخلايا جاهزة للاستخدام في التجارب. استنادا إلى مورفولوجيا نواة خلايا الكبد الفئران داخل الكبد ، تم تخصيب خلايا الكبد أحادية النواة على الحدود ، في حين كانت خلايا الكبد ثنائية النواة / متعددة النواة ، وهي علامة على التمايز الطرفي ، في الوسط 3,4. أظهرت كمية كبيرة من الخلايا المصورة مورفولوجيا نموذجية ثنائية النواة (ثنائية الصبغيات) ، مما يشير إلى نجاح عزل وتنقية خلايا الكبد الأولية الحية. هذا يشير أيضا إلى أن طلاء الكولاجين ليس شرطا لربط خلايا الكبد الأولية بهذا البروتوكول.

تم إثراء النقاء في مجموعة خلايا الكبد الأولية المعزولة
تم استخدام العديد من العلامات الجينية الخاصة بنوع الخلية في البروتوكولات السابقة للتحقق من نقاء خلايا الكبد الأولية المعزولة (الجدول 1). TTR (Transthyretin) ، CD95 (مجموعة التمايز 95 ، المعروف أيضا باسم Fas) ، ASGR1 (مستقبلات Asialoglycoprotein 1) ، و ASGR2 هي علامات لخلايا الكبد. بعد العزل ، زادت مستويات الحمض النووي الريبوزي المرسال لعلامات خلايا الكبد هذه بشكل كبير ، مقارنة بالكبد بأكمله (الشكل 4A-D ، H).

كما قلل هذا البروتوكول بشكل كبير من التداخل من الخلايا الكبدية الأخرى. كان وجود الخلايا المناعية والخلايا النجمية والخلايا البطانية أقل ، كما يتضح من الانخفاض الحاد في مستويات الحمض النووي الريبوزي المرسال من CD45 (علامة الخلايا المناعية) ، COL1A1 (الكولاجين ، النوع الأول ، ألفا 1 ، علامة الخلية النجمية) ، و TIE2 (كيناز الخلية البطانية Tunica interna ، علامة الخلية البطانية) ، مقارنة بالكبد بأكمله (الشكل 4E-H ). تشير هذه إلى أن هذا البروتوكول يمكن أن ينقي مجموعة خلايا الكبد الأولية من الخلايا الكبدية وبالتالي يقلل من التداخل المحتمل من أنواع الخلايا الأخرى في التجارب.

تم الحفاظ على نشاط المؤشرات الحيوية الصيدلانية
تم استخدام المؤشرات الحيوية على خلايا الكبد على نطاق واسع لاستهداف المخدرات وتوصيلها. وبالتالي فإن الحفاظ على نشاط المؤشرات الحيوية الصيدلانية هو نقطة رئيسية في عزل خلايا الكبد الأولية وهو معيار لاختبار فائدة عزل خلايا الكبد الأولية2. تستخدم علامات خلايا الكبد ASGR1 و ASGR2 بهذه الطريقة2. لقد اختبرنا أولا مستوى التعبير عن المسار الزمني لهاتين العلامتين قبل وبعد طلاء خلايا الكبد الأولية. بعد الطلاء ، انخفض مستوى الحمض النووي الريبوزي المرسال بشكل كبير مع مرور الوقت ، ولكن ظلت المستويات كبيرة مقارنة بالكبد بأكمله حتى النقطة الزمنية 12 ساعة بعد الطلاء ، خاصة بالنسبة ل ASGR1 (الشكل 5A ، B). وكان اتجاه التعبير متسقا مع تقرير سابق2 وأشار إلى صحة خلايا الكبد الأولية القابلة للمقارنة. تستهدف مسببات الأمراض المختلفة CD81 ، وهو بروتين مرتبط بغشاء خلايا الكبد ، لتسهيل دخولها إلى الخلايا والعدوى ، مثل فيروس التهاب الكبد5 ، المتصورة المنجلية ، والمتصورة اليويلي6. البروتينات الأخرى الموجودة في غشاء خلايا الكبد ، مثل TLR4 (مستقبلات تشبه الحصيلة 4) ، مستهدفة أيضا من قبل مسببات الأمراض ومهمة للاستجابة المناعية لخلايا الكبد7. بعد الطلاء ، كان مستوى التعبير CD81 ثابتا حتى 48 ساعة (الشكل 5C). ارتفع مستوى التعبير TLR4 بشكل عام ، ولكن ليس حتى بعد 48 ساعة ، عندما وصل إلى مستوى أعلى مما هو عليه في الجسم الحي (الشكل 5D). تشير هذه إلى أن خلايا الكبد الأولية المعزولة بواسطة هذا البروتوكول يمكن استخدامها أيضا لدراسات CD81 و TLR4 في غضون 48 ساعة على الأقل بعد الطلاء. تشير هذه النتائج مجتمعة إلى أن خلايا الكبد الأولية المعزولة صالحة للاستخدام في الدراسات المتعلقة بالمؤشرات الحيوية الصيدلانية. تجدر الإشارة إلى أن مستويات الحمض النووي الريبي والبروتين قد تكون غير متسقة بسبب التأثيرات الناتجة عن أنشطة ما بعد النسخ مثل هجرة الحمض النووي الريبي الناجم عن الببتيد ، والتعديل بعد الترجمة و / أو تدهور البروتين. لذلك ، قد يكون التحقق من مستوى البروتين والنشاط الحيوي للمؤشرات الحيوية الصيدلانية التي حددها mRNA ضروريا إذا لزم الأمر من قبل النموذج التجريبي.

كانت خلايا الكبد الأولية المعزولة حساسة للأنسولين
كما تم تحليل أداء خلايا الكبد الأولية في تجارب استقلاب الجلوكوز. الأنسولين ، وهو هرمون يلعب دورا مركزيا في استقلاب الجلوكوز ، يقلل من مستوى الجلوكوز ، ويعزز امتصاص الجلوكوز الكبدي وتخزينه من خلال الفوسفوريلات AKT و FOXO1 (صندوق الرأس الشوكي O1). لذلك ، تم إجراء فحص حساسية الأنسولين باستخدام خلايا الكبد الأولية المعزولة. بعد 16 ساعة ، تم تجويع الخلايا لمدة 3 ساعات ، مع وسط خال من المصل. في آخر 0.5 ساعة من الجوع ، تم إعطاء الأنسولين 100 نانومتر إلى وسط الثقافة. كما هو موضح في الشكل 6A-C ، عزز الأنسولين بشكل كبير فسفرة كل من AKT في Ser473 و FOXO1 في Ser256 ، مما يشير إلى حساسية خلايا الكبد الأولية للأنسولين. هذا يشير إلى أن خلايا الكبد الأولية المعزولة من البروتوكول الحالي مفيدة في دراسات استقلاب الأنسولين / الجلوكوز.

كانت خلايا الكبد الأولية المعزولة قادرة على إنتاج الجلوكوز
فهي ليست فقط مركزا لتخزين الجلوكوز ، ولكن خلايا الكبد مسؤولة أيضا عن إنتاج الجلوكوز. لاختبار ما إذا كانت خلايا الكبد الأولية التي عزلناها مفيدة في دراسات إنتاج الجلوكوز ، تم تجويع الخلايا لمدة 10 ساعات في وجود الجلوكاجون لتحفيز إنتاج الجلوكوز. ثم تم جمع وسط المجاعة لفحص الجلوكوز ، في حين تم حصاد الخلايا للبقع الغربية. فوسفونولبيروفات كاربوكسيكيناز (PEPCK) هو عنصر أساسي في إنتاج الجلوكوز في الكبد ، والتحكم في معدله8. تم زيادة مستوى البروتين في PEPCK بشكل كبير بعد علاج الجلوكاجون ، مما يشير إلى تنشيط مسار إنتاج الجلوكوز (الشكل 7A ، B). تم تأكيد هذا التنشيط بشكل أكبر من خلال زيادة مستوى إنتاج الجلوكوز (الشكل 7C). تم تأكيد هذه الظاهرة أيضا مع محفزات إنتاج الجلوكوز الأخرى مثل فورسكولين بالإضافة إلى IBM (الشكل 7A-C). ومع ذلك ، نظرا لمحدودية هذه التجربة ، لم نتمكن من التحقق مما إذا كان إنتاج الجلوكوز حصريا عن طريق تكوين الجلوكوز أو ما إذا كان هناك مكون من تحلل الجليكوجين أيضا.

Figure 1
الشكل 1: إعداد المقعد. (أ) إعداد المقعد لعزل خلايا الكبد الأولية. (ب) إعداد المقعد الكاريكاتوري لعزل خلايا الكبد الأولية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تشريح الفأر ، التروية ، وتنقية خلايا الكبد الأولية. (أ) الفأر التشريحي ، مع الأسهم التي تشير إلى الكبد ، IVC ، والوريد البابي. (ب) إدخال القسطرة في IVC. (ج) ضغط الوريد البابي مما يسبب تضخم وتصلب لوب الكبد ، مما يدل على نجاح التروية. (د) خفف الكبد بعد التروية، مما يدل على نجاح هضم الكولاجيناز. (ه) وضع المرارة في الكبد المعزول (سهم يشير إلى المرارة). (و) إزالة المرارة. (ز) الكبد الممزق في وسط غسل خلايا الكبد. (ح) خلط 1x Percoll-HBSS مع خلايا الكبد الأولية المصفاة قبل أجهزة الطرد المركزي. (I، J) بيليه خلايا الكبد الأولية بعد جهاز الطرد المركزي. (K) إعادة تعليق خلايا الكبد الأولية داخل وسط غسل خلايا الكبد. (ل، م) بيليه خلايا الكبد الأولية التي تشكلت داخل وسط غسل خلايا الكبد بعد جهاز الطرد المركزي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: خلايا الكبد الأولية بعد الطلاء. تم التقاط الصور بعد (A) 1 h و (B و C) 12 h و (D) 24 h و (E) 36 h و (F) 48 h و (G) 72 h و (H) 96 h طلاء خلايا الكبد الأولية. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تعزيز نقاء خلايا الكبد الأولية بعد العزل. تم عزل الحمض النووي الريبي قبل (من الكبد بأكمله) وبعد (من خلايا الكبد الأولية المعزولة) عزل خلايا الكبد الأولية ، تليها النسخ العكسي PCR ، وفقا للبروتوكول السابق9. تم تقييم نقاء خلايا الكبد الأولية بواسطة PCR في الوقت الفعلي مع الاشعال لعلامات خلايا الكبد (A) TTR و (B) CD95 و (C) ASGR1 و (D) ASGR2 ، بينما أيضا مع علامة الخلية المناعية (E) CD45 ، (F) علامة الخلية النجمية COL1A1 ، و (G) علامة الخلية البطانية TIE2. (ح) تم إنشاء خريطة حرارية لتغيرات التعبير عن علامات نوع الخلية قبل وبعد عزل خلايا الكبد الأولية. تم استخدام GAPDH (نازعة هيدروجيناز الجلسرالدهيد 3-فوسفات) كعنصر تحكم داخلي. كانت الاشعال المستخدمة هنا للجينات (تسلسل التمهيدي موجود في الجدول 2. يتم الاستشهاد بمراجع التسلسل هنا): TTR10 ؛ CD9511; ASGR112; ASGR213; CD4514; COL1A115; TIE216; GAPDH17. تم إنشاء الرسوم البيانية والخريطة الحرارية باستخدام GraphPad Prism 8. يشير شريط الخطأ إلى الانحراف المعياري ، ويشار إلى أهمية اختبار t ذات الذيل المزدوج (نظرا لأن خلايا الكبد الأولية وعينات الكبد الكاملة كانت غير مقترنة لأن هذا البروتوكول يتطلب كبدا سليما للبدء) ، يشار إلى أهمية اختبار t بواسطة العلامات النجمية (* p < 0.05 ؛ ** p < 0.01 ؛ *** p < 0.001). ن = 7. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: التعبير عن المؤشرات الحيوية الصيدلانية. تم عزل الحمض النووي الريبي من الكبد بأكمله وخلايا الكبد الأولية بعد الطلاء ، تليها النسخ العكسي PCR. تم تقييم التعبير عن المؤشرات الحيوية الصيدلانية بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي مع الاشعال ل (A) ASGR1 و (B) ASGR2 و (C) CD81 و (D) TLR4. تم استخدام GAPDH كمراقبة داخلية. كانت الاشعال الجديدة المستخدمة هنا للجينات (تسلسل التمهيدي موجود في الجدول 2. وترد هنا مراجع للتسلسل: CD8118؛ TLR419. تم إنشاء الرسوم البيانية باستخدام GraphPad Prism 8. N = 5. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: حساسية الأنسولين المحفوظة بعد عزل خلايا الكبد الأولية. (أ) اللطخة الغربية من p-AKT (S473) و AKT و p-FOXO1 (S256) و FOXO1 و GAPDH بعد معالجة الأنسولين. (B) p-AKT (S473)/AKT في قياس كثافة اللطخة الغربية. (C) p-FOXO1 (S256)/FOXO1 في قياس كثافة اللطخة الغربية. تم إجراء فحص حساسية الأنسولين بعد 16 ساعة من طلاء خلايا الكبد الأولية. تم تجويع خلايا الكبد الأولية لمدة 3 ساعات في ويليام E Medium (ملحق GlutaMAX) بدون FBS ولكن مع محلول مضاد للمضادات الحيوية بنسبة 1٪ ومع علاج الأنسولين 100 نانومتر في آخر 30 دقيقة ، قبل أن يتم حصادها لتحلل البروتين مع 1x RIPA العازل. تم إنشاء الرسوم البيانية باستخدام GraphPad Prism 8. تم إجراء تصوير اللطخة الغربية باستخدام LI-COR Odyssey CLx. يشير شريط الخطأ إلى الانحراف المعياري ، ويشار إلى أهمية اختبار t المقترن ثنائي الذيل بواسطة العلامات النجمية (* p < 0.05 ؛ ** p < 0.01). N = 4. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: فحص إنتاج الجلوكوز. (أ) اللطخة الغربية من PEPCK و GAPDH بعد علاج الجلوكاجون أو الفورسكولين + IBMX لمدة 10 ساعات (B) قياس كثافة مستوى بروتين PEPCK مقارنة ب GAPDH بعد علاج الجلوكاجون أو الفورسكولين + IBMX لمدة 10 ساعات (C) مستوى الجلوكوز مقارنة بمستوى البروتين بعد علاج الجلوكاجون أو الفورسكولين + IBMX لمدة 10 ساعات. تم إجراء فحص إنتاج الجلوكوز بعد 16 ساعة من طلاء خلايا الكبد الأولية. تم تجويع خلايا الكبد الأولية لمدة 10 ساعات في DMEM الخالي من الجلوكوز والفينول الأحمر (يضاف مع 2 mM L-Glutamine ، 2 mM Sodium Pyruvate ، 20 mM Sodium L-Lactate ، 1٪ Pen Strep) ، إما مع 50nM glucagon أو 20 μM forskolin و 200 μM IBMX. تم حصاد الوسط لقياس تركيز الجلوكوز باستخدام مجموعة فحص الجلوكوز ، في حين تم حصاد البروتين للبقع الغربية. تم إجراء تصوير اللطخة الغربية باستخدام LI-COR Odyssey CLx. يشير شريط الخطأ إلى الانحراف المعياري ، ويشار إلى أهمية اختبار t المقترن ثنائي الذيل بواسطة العلامات النجمية (* p < 0.05 ؛ ** p < 0.01 ؛ *** p < 0.001). N = 4. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

أوقات الطرد المركزي إزالة قفص الضلع المخازن المؤقتة التروية ذاتية الصنع عقدة جراحية مصباح التدفئة طلاء لوحة كمية الخلية المعزولة/الماوس الطرد المركزي المتدرج جينات علامة النقاء
البروتوكول الحالي 2 لا لا لا لا لا 2.5-4 × 107 نعم TTR، CD95، ASGR1، ASGR2، CD45، COL1A1، TIE2
Severgnini et al.2. 4 نعم نعم نعم نعم نعم 1.8-2 × 107 لا TTR، CD45، COL1A1، TIE2
Gonçalves et al.24. 5 أو 6 لا لا لا لا نعم 1-3 × 106 نعم CD45، CD95
لي وآخرون.20. 4 أو 5 لا نعم نعم لا غير مذكور 1-4 × 107 لا غير متوفر
سالم وآخرون.21. 3 لا نعم لا لا غير مذكور 2 × 107 نعم غير متوفر
كابرال وآخرون 22. 3 أو 6 (مع الطرد المركزي المتدرج) لا نعم نعم لا نعم/موصى به غير متوفر اختياري N/A (تم تقييم النقاء بواسطة الفحص المجهري الضوئي)
كوريلوفا وآخرون 23. 3 لا نعم نعم لا نعم غير متوفر نعم غير متوفر

الجدول 1: مقارنة بروتوكولات خلايا الكبد الأولية.

التمهيدي (إلى الأمام) التمهيدي (عكسي) مرجع
TTR إلى الأمام 5'-3': AGCCCTTTGCCTCTGGGAAGAC TTR عكس 5'-3': TGCGATGGTGTAGTGGCGATGG 10
CD95 إلى الأمام 5'-3': ATGCACACTCTGCGATGAAG CD95 عكس 5'-3': CAGTGTTCACAGCCAGGAGA 11
ASGR1 إلى الأمام 5'-3': GAGTCGAAGCTGGAAAAACAG ASGR1 عكس 5'-3': CCTTCATACTCCACCCAGTTG 12
ASGR2 إلى الأمام 5'-3': CTACTGGTTTTCTCGGGATGG ASGR2 عكس 5'-3': CAAATATGAAACTGGCTCCTGTG 13
CD45 إلى الأمام 5'-3': GAACATGCTGCCAATGGTTCT CD45 عكس 5'-3': TGTCCCACATGACTCCTTTCC 14
COL1A1 إلى الأمام 5'-3': GAAGCACGTCTGGTTTGGA COL1A1 عكس 5'-3': ACTCGAACGGGAATCCATC 15
TIE2 إلى الأمام 5'-3': ATGTGGAAGTCGAGAGGCGAT TIE2 عكس 5'-3': CGAATAGCCATCCACTATTGTCC 16
GAPDH إلى الأمام 5'-3': CGACTTCAACAGCACCCACTCCTTTCC GAPDH عكس 5'-3': TGGGTGGTCCAGGGTTTCTTACTCCTT 17
CD81 إلى الأمام 5'-3': CCAAGGCTGTGGAAGACTTTC CD81 عكس 5'-3': GGCTGTTCCTCAGTATGGTGGTAG 18
TLR4 إلى الأمام 5'-3': ACCTGGCTGGTTTACACGTC TLR4 عكس 5'-3': CTGCCAGAGACATTGCAGAA 19

الجدول 2: قائمة الاشعال : الاشعال المستخدمة للجينات TTR و CD95 و ASGR1 و ASGR2 و CD45 و COL1A1 و TIE2 و GAPDH و CD81 و TLR4

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تم تطوير العديد من بروتوكولات عزل خلايا الكبد الأولية. كما تم الحفاظ عليها على النحو الأمثل وتكييفها بناء على الاحتياجات المختلفة (الجدول 1). تتكون بروتوكولات العزل عموما من جزأين: التروية (بما في ذلك هضم الإنزيم) والتنقية.

يمكن إجراء التروية مع الكبد بأكمله في الجسم الحي 2،20،21،22،23 أو مع فصوص الكبد تشريح24. كانت تروية الفصوص المشوهة تقتصر عموما على الفصوص اليسرى والمتوسطة للسهولة التقنية. من الناحية النظرية ، يجب أن ينتج عن التروية في الجسم الحي المزيد من خلايا الكبد الأولية بسبب استخدام الكبد بأكمله مع جميع الفصوص. قد يؤدي الحفاظ على الكبد في مكانه أثناء التروية أيضا إلى تقليل موت الخلايا لأن خلايا الكبد في الجسم الحي يمكن أن تستحم في السوائل ، إما الدم أو المخازن المؤقتة للتروية ، في جميع الأوقات خلال هذه الخطوة.

تلعب صيانة الظروف المعقمة أيضا دورا مهما في هذه الخطوة. إذا سمحت الحالة ، فمن الأفضل إجراء التروية في غطاء نظيف. يجب أن تكون جميع الأدوات ذات اللمس المباشر للأنسجة معقمة ، والتي يمكن تحقيقها عن طريق الأوتوكلاف. من أجل منع أي تلوث من البكتيريا والفطريات ، تمت إضافة محلول مضاد حيوي مضاد للفطريات إلى وسط الثقافة.

IVC والوريد البابي هما وعاءان رئيسيان يربطان الكبد بالأعضاء الأخرى. تستخدم معظم البروتوكولات أيا من هذه الأوردة لإدخال إبر للتروية: IVC 2,20,21,23 ، الوريد البابي 22. يكون موضع الوريد البابي بزاوية منحرفة ، مما يؤدي إلى صعوبة في تحديد موضع الإبرة المدرجة وتثبيتها. وبالتالي عادة ما تكون هناك حاجة إلى خياطة لربط الإبرة في مكانها بعقدة جراحية ، والتي يجب القيام بها بعناية فائقة لأن الوريد عرضة للتلف. بشكل عام ، يكون قطر الوريد البابي أصغر أيضا من IVC ، مما يعقد إدخال الإبرة. بالنظر إلى ذلك ، يمكن أن يكون استخدام IVC أكثر ملاءمة ، على الرغم من أنه في بعض البروتوكولات ، يتم أيضا عقد الإبرة جراحيا إلى IVC20. وقد أفيد أن التروية مع إدخال IVC أدت إلى خلايا كبد أولية أقل قابلية للحياة من الوريد البابي25. ومع ذلك ، في البروتوكول الحالي ، استخدمنا بنجاح إدخال IVC ، وكانت صلاحية خلايا الكبد الأولية المعزولة (>96٪ في ظروف محسنة ، تم قياسها باستخدام تلطيخ Trypan Blue وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة) عالية ، إن لم يكن أكثر ، مثل البروتوكولات الأخرى (تتراوح بين 80٪ و 96٪ بناء على البروتوكولات والظروف2،22،23،24).

هناك هدفان لخطوة التروية: طرد الدم من فصوص الكبد وهضم الكبد لإطلاق خلايا الكبد الأولية. من أجل تحقيق هذه الأهداف ، يجب استخدام اثنين على الأقل من المخازن المؤقتة ، أحدهما لتدفق الدم (Flux Buffer) ، والآخر للهضم (Digestion Buffer). تقوم معظم البروتوكولات بإعداد Flux Buffer القائم على HBSS وإضافة الكولاجيناز داخله لجعله قادرا على الهضم ، مثل Digestion Buffer. يستغرق إعداد هذه المخازن المؤقتة وقتا طويلا ، ويمكن أن تختلف المخازن المؤقتة قليلا في بعض الخصائص الحساسة ، مثل الرقم الهيدروجيني ، من دفعة إلى أخرى ، وبالتالي إدخال متغيرات غير مدعوة. بالنظر إلى ذلك ، فإن استخدام المخازن المؤقتة المتاحة تجاريا يوفر العمالة والوقت الثمينين مع تقليل هذه المتغيرات. طورت Gibco بروتوكولا لعزل خلايا الكبد الأولية عن الفئران البالغة26 ، استنادا إلى استخدام Liver Perfusion Medium (مثل Flux Buffer) المتاح تجاريا ، و Liver Digestion Medium (ك Digestion Buffer). الفأر والفئران ، كقوارض ، يشتركان في أوجه تشابه عالية في خصائص الجسم ؛ يمكن للمرء أن يدمج هذين المخازن المؤقتة المحسنة للفئران في عزل خلايا الكبد الأولية للماوس. والواقع أن غونسالفيس وآخرين 24 ، نفذت بنجاح تروية فصوص الكبد تشريح مع هذه المخازن المؤقتة ، مما رفع الوعد باستخدامها في تروية الكبد في الجسم الحي. هنا اختبرنا بنجاح وسط تروية الكبد ووسط هضم الكبد في بروتوكول خلايا الكبد الأولية الحالية للفأر ، والتي أسفرت عن خلايا كبد أولية قابلة للحياة عالية الجودة (الشكل 3 والشكل 4).

تحدد درجة حرارة المخزن المؤقت للتروية مدى نجاة خلايا الكبد الأولية من العزلة. إذا كانت درجة الحرارة مرتفعة جدا ، فقد يكون الكولاجيناز داخل Digestion Buffer قد قلل من النشاط ؛ إذا كانت منخفضة جدا، فقد تعاني خلايا الكبد الأولية من صدمة باردة، مما يتسبب في احتمال تعرض عائد العزل للخطر. يحدد الوقت الذي يستغرقه المخزن المؤقت للتدفق عبر أنابيب التروية أيضا درجة حرارة المخزن المؤقت عندما يصل إلى الكبد. في البروتوكولات السابقة ، تم استخدام 40 درجة مئوية2 أو 42 درجة مئوية21 حمام مائي. قد تكون درجة الحرارة هذه عرضة للتغيير بناء على ظروف المختبر، مثل درجة حرارة البيئة، وطول أنبوب التروية، ونوع المضخة التمعجية. في البروتوكول الحالي ، بعد عدة مرات من الاختبار ، قمنا بتحسين درجة حرارة الحمام المائي لتكون 45 درجة مئوية لتسخين المخازن المؤقتة.

تلعب نقاء خلايا الكبد الأولية المعزولة دورا مهما في التجارب اللاحقة ، حيث أنه كلما ارتفعت نسبة النقاء ، قل التداخل المحتمل. على الرغم من أن الكبد يتكون بشكل رئيسي من خلايا الكبد ، وهو ما يمثل 60٪ -80٪ من الكتلة27 ، إلا أن أنواعا مختلفة من الخلايا الأخرى موجودة أيضا ، مثل الخلايا المناعية والخلايا النجمية والخلايا البطانية ، والتي تعتبر مهمة للأنشطة المناعية الكبدية. يمكن لكل خلية من هذه الخلايا نشر تداخل محتمل في التجارب اللاحقة28. على سبيل المثال ، تستجيب الخلايا النجمية في الكبد أيضا لغزوات مسببات الأمراض وإصابات الكبد ، والتي تنطوي على تكوين ندبة29. بالأرقام ، تساهم الخلايا النجمية30 بنسبة 5٪ -8٪ من إجمالي عدد الخلايا الكبدية. عادة ما تكون الخلايا النجمية في حالة هدوء ، ولكن يمكن كسر هذه الحالة عند وجود إجهادات. لذلك ، قد يتم تشغيل أنشطة الخلايا النجمية بسبب الضغوط التي يتم إدخالها أثناء العزل أو العلاج اللاحق إذا بقيت بعض هذه الخلايا في تجمع خلايا الكبد الأولية المعزولة النهائية. تساهم أنواع أخرى من الخلايا أيضا في جزء كبير من عدد الخلايا الكبدية ، مثل الخلايا البطانية الجيبية الكبدية (LSECs) ، وهو ما يمثل 20٪ من إجمالي عدد الخلايا الكبدية31. كانت كيفية القضاء على وجود هذه الخلايا جزءا محيرا في عملية عزل خلايا الكبد الأولية. لذلك ، يعد التنقية جزءا أساسيا في عزل خلايا الكبد الأولية ، والتي عادة ما تستفيد من اختلافات الوزن والحجم بين أنواع مختلفة من الخلايا. من خلال تحسين سرعة جهاز الطرد المركزي و / أو المخزن المؤقت للتنقية ، يمكن تكسير خلايا الكبد الأولية إلى أسفل الأنبوب.

فصل الخلايا الحية عن الخلايا الميتة أمر بالغ الأهمية أيضا في الحصول على خلايا الكبد الأولية الصحية والعد الدقيق للخلايا. عادة ما يكون عد عدد الخلايا أمرا ضروريا بعد التنقية لأن نتائج العديد من التجارب تختلف مع تغير التقاء الخلايا. يمكن استخدام كواشف أجهزة الطرد المركزي المتدرجة في هذه الخطوة لتحقيق هذه المهمة ، مثل Percoll. 36٪ -40٪ من Percoll في أجهزة الطرد المركزي يقصف الخلايا الحية ويحافظ على الخلايا الميتة في supernatant. لقد نجحنا في تحسين سرعة ووقت الطرد المركزي لتقليل عدد خلايا الكبد غير الأولية في البروتوكول الحالي. تم استخدام علامات خاصة بنوع الخلية لاختبار نقاء خلايا الكبد الأولية المعزولة هنا ، مثل البروتوكولات الأخرى. كانت علامات خلايا الكبد المستخدمة هنا هي TTR2 و CD9524,32 و ASGR1 33 و ASGR2 34. تشمل علامات الأنواع الأخرى من الخلايا CD45 (علامة الخلايا المناعية) ، COL1A1 (علامة الخلية النجمية) ، TIE2 (علامة الخلية البطانية) 2,35. باستخدام هذه العلامات ، أظهرت خلايا الكبد الأولية المعزولة بالبروتوكول الحالي مستوى عاليا من النقاء (الشكل 4) ، مقارنة بالبروتوكولات السابقة 2,24.

أثناء التروية، يخفف الكولاجيناز في Digestion Buffer من التعلق بين الخلايا عن طريق تحطيم الكولاجين داخل المصفوفة خارج الخلية. هذا يؤدي إلى صعوبة في تحقيق الخلايا أثناء الطلاء. تتطلب معظم البروتوكولات السابقة / توصي بالطلاء المسبق للألواح بالكولاجين2،22 أو الجيلاتين 24 لتحسين ربط خلايا الكبد الأولية. على حد علمنا ، في حين أن سالم وآخرون. 21 ولي وآخرون. 20 لم تناقش هذه الخطوة ، والبروتوكولات الأخرى التي تم تقييمها في هذه الدراسة ذكرت بوضوح / أوصت باستخدام الألواح المطلية مسبقا 2،22،23،24. في هذا البروتوكول ، وجدنا أن طلاء اللوحة لم يكن مطلوبا للألواح من أنواع معينة. في حين أننا لسنا متأكدين مما إذا كان هذا يرجع إلى أن أنواعا مختلفة من الألواح ، خاصة إذا كانت من مصنعين مختلفين ، لها نعومة سطح مختلفة ، وما إذا كانت هذه النعومة المتنوعة ، إن وجدت ، تلعب دورا مهما في ربط خلايا الكبد الأولية ، فمن المفيد ملاحظة أنه يمكن تخطي خطوة أخرى (طلاء اللوحات) لتحقيق الفعالية. من المهم أيضا ملاحظة أن هذا البروتوكول يولد نسبة كبيرة من التمايز النهائي ، على سبيل المثال ، خلايا الكبد ثنائية الصبغيات ، إلى جانب خلايا الكبد أحادية النواة ، على غرار الجيوب الأنفية الكبدية في الجسم الحي.

في هذه الدراسة ، تم الجمع بين مزايا بروتوكولات عزل خلايا الكبد الأولية السابقة ، وتم تبسيط العملية قدر الإمكان ، باستخدام الكواشف المتاحة تجاريا والقضاء على الخطوات غير الضرورية. تم تخفيض خطوات الطرد المركزي بنجاح إلى خطوتين ، وهما ، على حد علمنا ، الأقل في البروتوكولات المنشورة. لتأكيد نقاء خلايا الكبد الأولية المعزولة ونشاطها الحيوي ، تم تقييم مستوى علامات الخلايا الكبدية المختلفة ، مما يؤكد أن البروتوكول الحالي يمكن أن يعزز بشكل كبير نقاء خلايا الكبد الأولية ويقلل من مجموعات الخلايا الكبدية الأخرى ، مثل الخلايا المناعية والخلايا النجمية والخلايا البطانية. تم الحفاظ على نشاط المؤشرات الحيوية الصيدلانية مثل ASGR1 و ASGR2 و CD81 و TLR4 بشكل جيد في خلايا الكبد الأولية المعزولة بالبروتوكول الحالي ، والتي أكدت أيضا حساسية الأنسولين ونشاط إنتاج الجلوكوز. القيد الرئيسي لهذا البروتوكول هو النفقات حيث تم شراء جميع الكواشف تجاريا من أجل الكفاءة. لم نتحقق على وجه التحديد من أن الجليكوجين كان سليما في خلايا الكبد الأولية المعزولة باستخدام البروتوكول الحالي ، وقد يحتاج هذا إلى مزيد من البحث للدراسات ذات الصلة. يحتوي هذا البروتوكول على خطوات تروية مماثلة للخطوات السابقة ، مثل Salem et al.21 و Severgnini et al.2 و Li et al.20 و Korelova et al.23 ، باستخدام إدراج IVC. قد تعمل المخازن المؤقتة للتروية والهضم ، والتي قد تتطلب جهدا إضافيا للتحضير ، أيضا مع البروتوكول الحالي مع تعديل طفيف في وقت هضم الإنزيم. ولذلك، فإن الجمع بين كواشف البروتوكولات السابقة وخطوات هذا البروتوكول قد يكون مفيدا أيضا، سواء كان ملائما من حيث الوقت أو من الناحية الاقتصادية.

باختصار ، تم تطوير بروتوكول محسن فعال من حيث الوقت والعمل لعزل خلايا الكبد الأولية من كبد الفئران. يستخدم هذا البروتوكول الكواشف المتاحة تجاريا بالكامل ويمكن إكماله في حوالي 35 دقيقة ، من تشريح الماوس إلى طلاء خلايا الكبد الأولية ، وبالتالي توفير تقنية مفيدة للدراسات الأولية المتعلقة بخلايا الكبد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (منحة 5R01HD095512-02 إلى S.W.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x PBS Gibco 10010023
10x HBSS Gibco 14065-056
12-well Plate FALCON 353043 Coating not required
6-well Plate FALCON 353046 Coating not required
anti-AKT Cell Signaling 2920S
Antibiotic Antimycotic Solution (100x), Stabilized Sigma-Aldrich A5955
anti-FOXO1 Cell Signaling 97635S
anti-GAPDH Cell Signaling 2118S
anti-p-AKT (S473) Cell Signaling 9271L
anti-PEPCK Santa Cruz SC-166778
anti-p-FOXO1 (S256) Cell Signaling 84192S
Cell Strainer, 70 µm CELLTREAT 229483
Closed IV Catheter, 24 Gauge 0.75 IN Becton Dickinson 383511
DMEM, no glucose, no glutamine, no phenol red ThermoFisher Scientific A1443001
EnzyChrom Glucose Assay Kit BioAssay Systems EBGL-100
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30071.03
Forskolin MilliporeSigma F3917-10MG
Glucagon Sigma-Aldrich G2044
Goat Anti-mouse IgG Secondary Antibody LI-COR 926-68070
Goat Anti-rabbit IgG Secondary Antibody LI-COR 926-32211
GraphPad Prism 8 GraphPad Software NA
Hepatocyte Wash Medium Gibco 17704-024
IBMX Cell Signaling 13630S
Insulin Lilly NDC 0002-8215-01
Ketamine HCL (100 mg/mL) Hospira Inc NDC 0409-2051-05
L-Glutamine Gibco 25030081
Liver Digest Medium Gibco 17703-034 Aliquot within tissue culture hood to 25 mL each in 50 mL tube, and keep in -20 °C freezer
Liver Perfusion Medium Gibco 17701-038
Pen Strep Gibco 15140122
Percoll GE Healthcare 17-0891-01
Peristaltic Pump Gilson Minipuls 2 Capable of pumping at 4 mL/min
Petri Dish Fisherbrand 08-757-12
Refrigerated Centrifuge Sorvall Legend RT Capable to centrifuge 50 mL tube at 4 °C
Sodium L-Lactate Sigma-Aldrich L7022
Sodium Pyruvate Gibco 11360070
Syringe Filter, PVDF 0.45 µm 30mm diameter CELLTREAT 229745
Syringe, 0.5 mL Becton Dickinson 329461
Syringe, 60 mL Becton Dickinson 309653
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061
Tube, 15 mL Corning 430052
Tube, 50 mL Corning 430290
Water Bath Tank Corning CLS6783 Or any water bath tank capable of heating up to 45 °C
William’s E Medium (GlutaMAX Supplement) Gibco 32551020
Xylozine (100 mg/mL) Vetone Anased LA NDC13985-704-10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Han, H. S., Kang, G., Kim, J. S., Choi, B. H., Koo, S. H. Regulation of glucose metabolism from a liver-centric perspective. Experimental and Molecular Medicine. 48, 218 (2016).
  2. Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
  3. Guidotti, J. E., et al. Liver cell polyploidization: a pivotal role for binuclear hepatocytes. Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).
  4. Morales-Navarrete, H., et al. A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture. Elife. 4, 11214 (2015).
  5. Bruening, J., et al. Hepatitis C virus enters liver cells using the CD81 receptor complex proteins calpain-5 and CBLB. PLoS Pathogens. 14 (7), 1007111 (2018).
  6. Silvie, O., et al. Hepatocyte CD81 is required for Plasmodium falciparum and Plasmodium yoelii sporozoite infectivity. Nature Medicine. 9 (1), 93-96 (2003).
  7. Crispe, I. N. Hepatocytes as immunological agents. Journal of Immunology. 196 (1), 17-21 (2016).
  8. Liu, N. C., et al. Loss of TR4 orphan nuclear receptor reduces phosphoenolpyruvate carboxykinase-mediated gluconeogenesis. Diabetes. 56 (12), 2901-2909 (2007).
  9. Wang, Z., et al. Gonadotrope androgen receptor mediates pituitary responsiveness to hormones and androgen-induced subfertility. JCI Insight. 5 (17), 127817 (2019).
  10. Santos, S. D., et al. CSF transthyretin neuroprotection in a mouse model of brain ischemia. Journal of Neurochemistry. 115 (6), 1434-1444 (2010).
  11. Pinhu, L., et al. Overexpression of Fas and FasL is associated with infectious complications and severity of experimental severe acute pancreatitis by promoting apoptosis of lymphocytes. Inflammation. 37 (4), 1202-1212 (2014).
  12. Mi, Y., Lin, A., Fiete, D., Steirer, L., Baenziger, J. U. Modulation of mannose and asialoglycoprotein receptor expression determines glycoprotein hormone half-life at critical points in the reproductive cycle. Journal of Biological Chemistry. 289 (17), 12157-12167 (2014).
  13. Tanowitz, M., et al. Asialoglycoprotein receptor 1 mediates productive uptake of N-acetylgalactosamine-conjugated and unconjugated phosphorothioate antisense oligonucleotides into liver hepatocytes. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12388-12400 (2017).
  14. Manczak, M., et al. Neutralization of granulocyte macrophage colony-stimulating factor decreases amyloid beta 1-42 and suppresses microglial activity in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Human Molecular Genetics. 18 (20), 3876-3893 (2009).
  15. Zhang, Y., et al. JAK1-dependent transphosphorylation of JAK2 limits the antifibrotic effects of selective JAK2 inhibitors on long-term treatment. Annals of the Rheumatic Diseases. 76 (8), 1467-1475 (2017).
  16. Shih, S. C., et al. Molecular profiling of angiogenesis markers. American Journal of Pathology. 161 (1), 35-41 (2002).
  17. Liu, G., et al. miR-147, a microRNA that is induced upon Toll-like receptor stimulation, regulates murine macrophage inflammatory responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15819-15824 (2009).
  18. Ding, Q., et al. Mice expressing minimally humanized CD81 and occludin genes support Hepatitis C virus uptake in vivo. Journal of Virology. 91 (4), 01799 (2017).
  19. Renshaw, M., et al. Cutting edge: impaired Toll-like receptor expression and function in aging. Journal of Immunology. 169 (9), 4697-4701 (2002).
  20. Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
  21. Salem, E. S. B., et al. Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323 (2018).
  22. Cabral, F., et al. Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
  23. Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507 (2019).
  24. Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies. Malar Journal. 6, 169 (2007).
  25. Yin, Z., Ellis, E. C., Nowak, G. Isolation of mouse hepatocytes for transplantation: a comparison between antegrade and retrograde liver perfusion. Cell Transplant. 16 (8), 859-865 (2007).
  26. Hepatocyte media, Thermofisher. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/Hepatocyte_Media_UG.pdf (2021).
  27. Sia, D., Villanueva, A., Friedman, S. L., Llovet, J. M. Liver cancer cell of origin, molecular class, and effects on patient prognosis. Gastroenterology. 152 (4), 745-761 (2017).
  28. Freitas-Lopes, M. A., Mafra, K., David, B. A., Carvalho-Gontijo, R., Menezes, G. B. Differential location and distribution of hepatic immune cells. Cells. 6 (4), 48 (2017).
  29. Schachtrup, C., Le Moan, N., Passino, M. A., Akassoglou, K. Hepatic stellate cells and astrocytes: Stars of scar formation and tissue repair. Cell Cycle. 10 (11), 1764-1771 (2011).
  30. Geerts, A. History, heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells. Seminars in Liver Disease. 21 (3), 311-335 (2001).
  31. Poisson, J., et al. Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases. Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).
  32. Peter, M. E., et al. The CD95 receptor: apoptosis revisited. Cell. 129 (3), 447-450 (2007).
  33. Peters, D. T., et al. Asialoglycoprotein receptor 1 is a specific cell-surface marker for isolating hepatocytes derived from human pluripotent stem cells. Development. 143 (9), 1475-1481 (2016).
  34. Willoughby, J. L. S., et al. Evaluation of GalNAc-siRNA conjugate activity in pre-clinical animal models with reduced asialoglycoprotein receptor expression. Molecular Therapy. 26 (1), 105-114 (2018).
  35. Hutchins, N. A., Chung, C. S., Borgerding, J. N., Ayala, C. A., Ayala, A. Kupffer cells protect liver sinusoidal endothelial cells from Fas-dependent apoptosis in sepsis by down-regulating gp130. American Journal of Pathology. 182 (3), 742-754 (2013).

Tags

علم الأحياء ، العدد 176 ، خلايا الكبد الأولية ، الكبد ، التمثيل الغذائي ، الماوس ، العزلة ، الكبد ، الجلوكوز
بروتوكول محسن فعال من حيث الوقت والعمل لعزل خلايا الكبد الأولية للماوس
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Feng, M., Divall, S., Wu, S. An… More

Feng, M., Divall, S., Wu, S. An Improved Time- and Labor- Efficient Protocol for Mouse Primary Hepatocyte Isolation. J. Vis. Exp. (176), e61812, doi:10.3791/61812 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter