Summary
Primaire hepatocyten zijn een waardevol hulpmiddel om leverrespons en metabolisme in vitro te bestuderen. Met behulp van in de handel verkrijgbare reagentia werd een verbeterd tijd- en arbeidsefficiënt protocol voor primaire hepatocytenisolatie bij muizen ontwikkeld.
Abstract
Primaire hepatocyten worden op grote schaal gebruikt in lever in vitro onderzoek, vooral in glucosemetabolisme studies. Een basistechniek is aangepast op basis van verschillende behoeften, zoals tijd, arbeid, kosten en primair hepatocytengebruik, wat resulteert in verschillende primaire hepatocytenisolatieprotocollen. De vele stappen en tijdrovende reagenspreparaten in primaire hepatocytenisolatie zijn echter grote nadelen voor de efficiëntie. Na het vergelijken van verschillende protocollen voor hun voor- en nadelen, werden de voordelen van elk gecombineerd en werd een snel en efficiënt primair hepatocytenisolatieprotocol geformuleerd. Binnen slechts ~ 35 minuten zou dit protocol evenveel, zo niet meer, gezonde primaire hepatocyten kunnen opleveren als andere protocollen. Verder valideerden glucosemetabolisme-experimenten uitgevoerd met behulp van de geïsoleerde primaire hepatocyten het nut van dit protocol in in vitro levermetabolismestudies. We hebben ook uitgebreid de betekenis en het doel van elke stap in deze studie beoordeeld en geanalyseerd, zodat toekomstige onderzoekers dit protocol verder kunnen optimaliseren op basis van behoeften.
Introduction
De lever dient als een van de belangrijkste organen in het gewervelde lichaam vanwege de vitale rol die het speelt in tal van levensondersteunende functies zoals voedselvertering, bloedcirculatie en ontgifting. Het gebruik van primaire hepatocyten in vitro kweek van muizen wordt steeds populairder in studies naar koolhydraatmetabolisme en levercarcinoom. Daarom is het belangrijk om een handige methode te ontwikkelen voor primaire hepatocytenisolatie bij muizen met behoud van de aangeboren fysiologische functie. Vanwege zijn functie als een hub van glucosemetabolisme, staat de lever ook centraal in de glucoseproductie en -opslag1. Experimenten met primaire hepatocyten in vitro zijn een must voor de meeste glucosemetabolismestudies. Daarom hebben verschillende onderzoeksgroepen jarenlang protocollen ontwikkeld voor primaire hepatocytenisolatie van muizen.
De algemene procedure van muishepatocytenisolatie is om eerst bloed in de lever weg te spoelen met een isosmotische vloeistof zoals fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) of Hanks 'Balanced Salt Solution (HBSS) en vervolgens collagenase-bevattende oplossing te gebruiken om hepatocyten te dissociëren. Deze protocollen delen een algemene procedure, maar verschillen in reagentia en stappen op basis van verschillende behoeften. Het voorbereiden van vereiste reagentia en het uitvoeren van isolatiestappen kost echter tijd. Bij de ontwikkeling van het huidige protocol is efficiëntie voorop gesteld, waarbij alle reagentia gebruiksklaar en uit de markt leverbaar zijn, en zo min mogelijk stappen. Het algemene doel van dit protocol is om een snelle en arbeidsefficiënte methode te bieden om primaire hepatocyten van muizen te isoleren, zonder de geïsoleerde primaire hepatocytenzuiverheid en levensvatbaarheid in gevaar te brengen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures werden goedgekeurd door de Johns Hopkins Animal Care and Use Committee. C57BL/6 vrouwelijke muizen (8 weken oud) werden gebruikt in deze studie.
1. Voorbereiding:
- Meng William's E Medium (GlutaMAX Supplement) met 10% FBS en 1% antibiotisch-antimycotische oplossing om het kweekmedium te maken.
- Filter 25 ml collagenase-dispase medium (bijv. Liver Digest Medium) door een spuitfilter van 0,45 μm om deeltjesresten te verwijderen.
- Verwarm 50 ml dubbel gedestilleerd H2O (ddH2O), 35 ml perfusiemedium (bijv. leverperfusiemedium) (of 50 ml bij de eerste keer met behulp van dit protocol) en 25 ml gefilterd collagenase-dispase medium in een waterbad van 45 °C gedurende 30 minuten.
- Meng in een steriele weefselkweekkap 2 ml 10x HBSS en 18 ml Percoll in een buis van 50 ml om 20 ml 1x percoll-HBSS te maken en houd op ijs of 4 °C.
LET OP: 1x Percoll-HBSS kan minstens 6 maanden bij 4 °C worden bewaard. - Giet in een steriele weefselkweekkap 30 ml wasmedium (bijv. Hepatocyte Wash Medium) in een schone petrischaal en bewaar op ijs.
- Dompel de pompbuis onder in het water van een waterbad van 45 °C. De resultaten zijn het meest betrouwbaar als de kamertemperatuur 25 °C is.
- Bereid 2 ml 1x anesthetica door 225 μL Ketamine HCL, 93,75 μL Xylazine en 1681 μL 1x PBS te mengen.
- Verdoven één muis met behulp van een goedgekeurde methode. Hier werd de muis intraperitoneaal geïnjecteerd met 150 μL 1x anesthetica. Voer de tests uit voor verlies van reflexen zoals reactie op teen knijpen om volledige anesthesie te garanderen.
- Bevestig de muis op zijn rug op het dissectiepad met vier ledematen, door vast te pinnen of waterbestendige tape of andere methoden te gebruiken die zijn goedgekeurd door de Animal Care and Use Committee (of equivalenten) van de instelling.
- Bereid gesteriliseerde tang en schaar voor op dissectie. Om mogelijke besmetting te voorkomen, voert u alle stappen uit in een steriele kap.
2. Werkwijze:
- Gebruik een peristaltische pomp en begin opgewarmd ddH2O te pompen met een snelheid van 4 ml / min gedurende 5 minuten. Verander de pompbuis van water in een opgewarmd perfusiemedium.
- Desinfecteer de buik van de verdoofde muis met 70% EtOH en knip open met een schaar om de lever, poortader en inferieure vena cava (IVC) bloot te leggen.
- Stop de peristaltische pomp. Plaats een katheter van 24 G (bijv. gesloten IV-katheter, 24 G, 0,75 INCH) in IVC. Begin met pompen en snijd de poortader open.
- Blijf pompen totdat de uitgespoelde vloeistof helder is (ongeveer 3-5 min). Druk elke minuut op de poortader om vloeistof elke hoek van de lever te laten bereiken. Pas op dat u geen luchtbellen in het IVC laat komen.
OPMERKING: Deze stap is om zoveel mogelijk bloed uit de lever te spoelen. - Verander de pompbuis van het perfusiemedium naar het collagenase-dispase medium. Blijf pompen totdat alle 25 ml van het collagenase-dispase medium is uitgeput tijdens het uitvoeren van stap 2.6.
- Druk elke minuut op de poortader om vloeistof elke hoek van de lever te laten bereiken.
OPMERKING: In dit stadium is het volledige bloedverlies fataal voor de muis. De dood van de muis kan worden bevestigd door een gebrek aan hartslag na het experiment. Gooi het karkas weg volgens het facilitaire beleid. - Isoleer de hele lever zonder galblaas tot het wasmedium van 30 ml in de petrischaal op ijs.
- Scheur het in stukken met een tang om primaire hepatocyten in oplossing vrij te geven. Deze stap zou het wasmedium veranderen in een troebele oplossing vol vrijgegeven primaire hepatocyten en kleine leverstukjes.
- Filtreer de troebele oplossing in stap 2.8 door een celzeef van 70 μm in de 20 ml 1x Percoll-HBSS in een buis van 50 ml op ijs. Meng door de buis 20 keer om te keren.
- Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
- In de weefselkweekkap, zuig het supernatant op. Was de pellet met koud 30 ml wasmedium.
- Centrifugeer bij 50 x g gedurende 5 min bij 4 °C.
- Verwijder het supernatant en resuspend de pellet in 25 ml van het kweekmedium (of geschikte andere volumes) in de weefselkweekkap.
- Tel het celnummer en plaats de cellen op gewenste kweekplaten volgens het experimentele ontwerp.
OPMERKING: Primaire hepatocyten die goed geïsoleerd zijn van één 8 weken oude muis zijn meestal voldoende om te worden verguld op vier 6-well platen of vier 12-well platen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de efficiëntie te testen, werd het huidige primaire hepatocytenisolatieprotocol uitgevoerd op 8 weken oude vrouwelijke C57BL / 6-muizen. De hechting en zuiverheid van geïsoleerde primaire hepatocyten werden getest. Primaire hepatocytenisolatie wordt gebruikt voor een breed scala aan experimenten op leverfysiologie, zoals levergeneesmiddeleffecten en glucosemetabolisme, farmaceutische biomarkeractiviteit2, insulinegevoeligheid en glucoseproductie. Daarom werden de activiteiten van de primaire hepatocyten geïsoleerd met dit protocol getest in de volgende experimenten.
Coating was niet vereist voor primaire hepatocytenaanhechting in het huidige protocol
Primaire hepatocyten die geïsoleerd werden, werden geplateerd op 5 x 105 cellen/put op een 6-putplaat. Na 1 uur werd een stevige aanhechting waargenomen en de primaire hepatocyten zetten 12 uur na plating volledig uit (figuur 3). Dit gaf aan dat 12 uur na plating cellen klaar waren om te worden gebruikt voor experimenten. Op basis van de nucleusmorfologie van muishepatocyten in de lever werden mononucleaire hepatocyten verrijkt aan grenzen, terwijl binucleaire / polynucleaire hepatocyten, een signatuur van terminale differentiatie, zich in het middenvan 3,4 bevonden. Een aanzienlijke hoeveelheid afgebeelde cellen vertoonde typische dual-nucleus (diploïde) morfologie, wat wijst op het succes van het isoleren en zuiveren van levende primaire hepatocyten. Dit geeft ook aan dat collageencoating geen vereiste is voor primaire hepatocytenaanhechting met dit protocol.
Zuiverheid werd verrijkt in de geïsoleerde primaire hepatocytenpopulatie
Verschillende celtypespecifieke genmarkers zijn in eerdere protocollen gebruikt om de zuiverheid van geïsoleerde primaire hepatocyten te controleren (tabel 1). TTR (Transthyretine), CD95 (Cluster van differentiatie 95, ook bekend als Fas), ASGR1 (Asialoglycoproteïnereceptor 1) en ASGR2 zijn markers voor hepatocyten. Na isolatie waren de mRNA-niveaus van deze hepatocytmarkers significant verhoogd, vergeleken met de hele lever (figuur 4A-D,H).
Dit protocol verminderde ook sterk de interferentie van andere levercellen. De aanwezigheid van immuuncellen, stellaatcellen en endotheelcellen was lager, wat blijkt uit de sterke afname van de mRNA-niveaus van CD45 (immuuncelmarker), COL1A1 (collageen, type I, alfa 1, stellaatcelmarker) en TIE2 (Tunica interna endotheelcelkinase, endotheelcelmarker), vergeleken met de hele lever (figuur 4E-H ). Deze suggereren dat dit protocol de primaire hepatocytenpopulatie uit levercellen zou kunnen zuiveren en zo de mogelijke interferentie van andere celtypen in experimenten zou kunnen verminderen.
Activiteit van farmaceutische biomarkers bleef behouden
Biomarkers op hepatocyten zijn op grote schaal gebruikt voor het richten en afleveren van geneesmiddelen. Het behoud van de activiteit van farmaceutische biomarkers is dus een belangrijk punt in primaire hepatocytenisolatie en is een standaard om het nut van primaire hepatocytenisolatie te testen2. Hepatocytenmarkers ASGR1 en ASGR2 worden op deze manier gebruikt2. We hebben eerst het tijd-beloopexpressieniveau van deze twee markers getest voor en na primaire hepatocytenbeplating. Na plating daalde hun mRNA-niveau aanzienlijk met de tijd, maar de niveaus bleven aanzienlijk in vergelijking met de hele lever tot het 12 h-tijdstip na plating, vooral voor ASGR1 (figuur 5A, B). De expressietrend was consistent met een eerder rapport2 en wees op een vergelijkbare primaire hepatocytengezondheid. Verschillende pathogenen richten zich op CD81, een hepatocytmembraangebonden eiwit, om hun toegang tot cellen en infectie te vergemakkelijken, zoals hepatitisvirus5, Plasmodium falciparum en Plasmodium yoelii6. Andere hepatocytenmembraan-gelokaliseerde eiwitten, zoals TLR4 (Toll-like receptor 4), zijn ook het doelwit van pathogenen en belangrijk voor de immuunrespons van hepatocyten7. Na plating was het expressieniveau van CD81 consistent tot 48 h (figuur 5C). Het TLR4-expressieniveau nam over het algemeen toe, maar pas na 48 uur, toen het een niveau bereikte dat hoger was dan in vivo (figuur 5D). Deze suggereren dat primaire hepatocyten geïsoleerd door dit protocol ook kunnen worden gebruikt voor CD81- en TLR4-onderzoeken binnen ten minste 48 uur na plating. Samen geven deze resultaten aan dat primaire geïsoleerde hepatocyten geldig zijn voor gebruik in studies met betrekking tot farmaceutische biomarkers. Het is vermeldenswaard dat RNA- en eiwitniveaus inconsistent kunnen zijn vanwege invloeden van post-transcriptionele activiteiten zoals signaalpeptide-geïnduceerde RNA-migratie, posttranslationele modificatie en / of eiwitafbraak. Daarom kunnen eiwitniveau en bioactiviteitsverificatie van farmaceutische biomarkers geïdentificeerd door mRNA noodzakelijk zijn als dit vereist is door het experimentele paradigma.
Geïsoleerde primaire hepatocyten waren insulinegevoelig
Primaire hepatocytenprestaties in experimenten met glucosemetabolisme werden ook geanalyseerd. Insuline, een hormoon dat een centrale rol speelt in het glucosemetabolisme, verlaagt het glucosegehalte en bevordert de opname en opslag van leverglucose door fosforylering van AKT en FOXO1 (Forkhead box O1). Daarom werd een insulinegevoeligheidstest uitgevoerd met geïsoleerde primaire hepatocyten. Na 16 uur werden de cellen gedurende 3 uur uitgehongerd, met een serumvrij medium. Bij de laatste 0,5 uur van uithongering werd 100 nM insuline toegediend aan het kweekmedium. Zoals te zien is in figuur 6A-C, bevorderde insuline significant de fosforylering van zowel AKT bij Ser473 als FOXO1 bij Ser256, wat wijst op de gevoeligheid van primaire hepatocyten voor insuline. Dit suggereert dat de geïsoleerde primaire hepatocyten uit het huidige protocol nuttig zijn in insuline / glucosemetabolismestudies.
Geïsoleerde primaire hepatocyten waren in staat tot glucoseproductie
Ze zijn niet alleen een centrum voor glucoseopslag, maar hepatocyten zijn ook verantwoordelijk voor de glucoseproductie. Om te testen of de primaire hepatocyten die we hebben geïsoleerd nuttig zijn in studies naar glucoseproductie, werden de cellen gedurende 10 uur uitgehongerd in aanwezigheid van glucagon om de glucoseproductie te stimuleren. Het uithongeringsmedium werd vervolgens verzameld voor glucosetest, terwijl cellen werden geoogst voor western blot. Fosfoenolpyruvaat carboxykinase (PEPCK) is een essentieel onderdeel in de productie van leverglucose en regelt de snelheid8. Het eiwitgehalte van PEPCK was significant verhoogd na behandeling met glucagon, wat suggereert dat de glucoseproductieroute werd geactiveerd (figuur 7A,B). Deze activering werd verder bevestigd door een verhoogd glucoseproductieniveau (figuur 7C). Dit fenomeen werd ook bevestigd met andere glucoseproductiestimulatoren zoals forskolin plus IBMX (figuur 7A-C). Vanwege de beperking van dit experiment konden we echter niet verifiëren of de glucoseproductie exclusief was via gluconeogenese of dat er ook een component van glycogenolyse is.
Figuur 1: Bench setup. (A) De bench setup voor primaire hepatocyt isolatie. (B) De cartooned bench setup voor primaire hepatocytenisolatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Muisdissectie, perfusie en primaire hepatocytenzuivering. (A) De ontleedde muis, met pijlen die wijzen naar de lever, IVC en poortader. (B) Katheter inbrengen in IVC. (C) Druk op de poortader die vergroting en stijfheid van leverlopes veroorzaakt, wat wijst op succesvolle perfusie. (D) Verzachte leverlopes na perfusie, wat wijst op het succes van collagenasevertering. (E) De positie van de galblaas in de geïsoleerde lever (pijl die naar de galblaas wijst). (F) Galblaas verwijderen. (G) Gescheurde lever in wasmedium voor hepatocyten. (H) Mengen van 1x Percoll-HBSS met gefilterde primaire hepatocyt vóór centrifuge. (I, J) primaire hepatocytenkorrel na centrifuge. (K) Primaire hepatocyten resuspensie in het wasmedium van de hepatocyt. (L, M) Primaire hepatocytenkorrel gevormd in hepatocytenwasmedium na centrifuge. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Primaire hepatocyten na plating. De beelden zijn gemaakt na (A)1 h, (B, C) 12 h, (D) 24 h, (E) 36 h, (F) 48 h, (G) 72 h en (H) 96 h primaire hepatocytenplating. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Verbeterde primaire hepatocytenzuiverheid na isolatie. RNA werd geïsoleerd vóór (uit de hele lever) en na (uit geïsoleerde primaire hepatocyten) primaire hepatocytenisolatie, gevolgd door reverse transcriptie PCR, volgens een eerder protocol9. De primaire hepatocytenzuiverheid werd beoordeeld door real-time PCR met primers voor hepatocytmarkers (A) TTR, (B) CD95, (C) ASGR1 en (D) ASGR2, terwijl ook met immuuncelmarker (E) CD45, (F) Stellate cell marker COL1A1 en (G) endotheelcelmarker TIE2. (H) Heatmap werd gegenereerd voor de expressieveranderingen van celtypemarkers voor en na primaire hepatocytenisolatie. GAPDH (Glyceraldehyde 3-fosfaatdehydrogenase) werd gebruikt als interne controle. Primers die hier werden gebruikt, waren voor genen (Primer-sequenties staan in tabel 2. Sequentieverwijzingen worden hier aangehaald): TTR10; CD9511; ASGR112; ASGR213; CD4514; COL1A115; GELIJKSPEL216; GAPDH17. Grafieken en heatmap werden gegenereerd met GraphPad Prism 8. Foutbalk geeft standaarddeviatie aan, en tweezijdig ongepaard (aangezien primaire hepatocyten en hele levermonsters ongepaard waren omdat dit protocol om te beginnen intacte lever vereist) t-test significantie wordt aangegeven met sterretjes (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001). N=7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Expressie van farmaceutische biomarkers. RNA werd geïsoleerd uit de hele lever en primaire hepatocyt na plating, gevolgd door reverse transcriptie PCR. De expressie van farmaceutische biomarkers werd beoordeeld door real-time PCR met primers voor (A) ASGR1, (B) ASGR2, (C) CD81 en (D) TLR4. GAPDH werd gebruikt als interne controle. Nieuwe primers die hier werden gebruikt, waren voor genen (Primer-sequenties staan in tabel 2. Sequentieverwijzingen worden hier aangehaald): CD8118; TLR419. Grafieken werden gegenereerd met GraphPad Prism 8. N = 5. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Insulinegevoeligheid behouden na primaire hepatocytenisolatie. (A) Western blot van p-AKT (S473), AKT, p-FOXO1 (S256), FOXO1 en GAPDH na insulinebehandeling. (B) p-AKT (S473)/AKT in densitometrie van western blot. (C) p-FOXO1 (S256)/FOXO1 in densitometrie van western blot. Insulinegevoeligheidstest werd uitgevoerd 16 uur na primaire hepatocytenbeplating. Primaire hepatocyten werden gedurende 3 uur uitgehongerd in William's E Medium (GlutaMAX Supplement) zonder FBS, maar met 1% antibiotisch-antimycotische oplossing en met 100 nM insulinebehandeling in de laatste 30 minuten, voordat ze werden geoogst voor eiwitlysis met 1x RIPA-buffer. Grafieken werden gegenereerd met GraphPad Prism 8. Western blot imaging werd uitgevoerd met LI-COR Odyssey CLx. Foutbalk geeft standaarddeviatie aan, en tweezijdige gepaarde t-test significantie wordt aangegeven met sterretjes (* p < 0,05; ** p < 0,01). N = 4. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Glucoseproductietest. (A) Western blot van PEPCK en GAPDH na behandeling met glucagon of forskolin+IBMX gedurende 10 uur. (B) Densitometrie van pepck-eiwitgehalte in vergelijking met GAPDH na behandeling met glucagon of forskolin+IBMX gedurende 10 uur. (C) Glucosespiegel vergeleken met eiwitgehalte na behandeling met glucagon of forskolin+IBMX gedurende 10 uur. Glucoseproductietest werd uitgevoerd 16 uur na primaire hepatocytenbeplating. Primaire hepatocyten werden gedurende 10 uur uitgehongerd in glucose- en fenolroodvrije DMEM (toegevoegd met 2 mM L-Glutamine, 2 mM natriumpyruvaat, 20 mM natrium L-lactaat, 1% pen strep), met 50nM glucagon of 20 μM forskolin en 200 μM IBMX. Het medium werd geoogst voor glucoseconcentratiemeting met Glucose Assay Kit, terwijl eiwit werd geoogst voor western blot. Western blot imaging werd uitgevoerd met LI-COR Odyssey CLx. Foutbalk geeft standaarddeviatie aan, en tweezijdige gepaarde t-test significantie wordt aangegeven met sterretjes (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001). N = 4. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Centrifugatie tijden | Ribbenkast verwijderen | Perfusiebuffers self-making | Chirurgische knoop | Lamp Verwarming | Plaat coating | Geïsoleerde celhoeveelheid/muis | Gradiënt centrifugatie | Zuiverheid Marker Genen | |
| Huidig protocol | 2 | Nee | Nee | Nee | Nee | Nee | 2,5–4 x 107 | Ja | TTR, CD95, ASGR1, ASGR2, CD45, COL1A1, TIE2 |
| Severgnini et al.2. | 4 | Ja | Ja | Ja | Ja | Ja | 1,8–2 x 107 | Nee | TTR, CD45, COL1A1, TIE2 |
| Gonçalves et al.24. | 5 of 6 | Nee | Nee | Nee | Nee | Ja | 1–3 x 106 | Ja | CD45, CD95 |
| Li et al.20. | 4 of 5 | Nee | Ja | Ja | Nee | Niet genoemd | 1–4 x 107 | Nee | N.V.T |
| Salem et al.21. | 3 | Nee | Ja | Nee | Nee | Niet genoemd | 2 x 107 cm | Ja | N.V.T |
| Cabral et al.22. | 3 of 6 (met gradiënt centrifugatie) | Nee | Ja | Ja | Nee | Ja/Aanbevolen | N.V.T | Facultatief | N.v.t. (Zuiverheid beoordeeld door lichtmicroscopie) |
| Korelova et al.23. | 3 | Nee | Ja | Ja | Nee | Ja | N.V.T | Ja | N.V.T |
Tabel 1: Vergelijking van primaire hepatocytenprotocollen.
| Primer (vooruit) | Primer (omgekeerd) | Referentie | ||
| TTR Forward 5'-3': AGCCCTTTGCCTCTGGGAAGAC | TTR Omgekeerde 5'-3': TGCGATGGTGTAGTGGCGATGG | 10 | ||
| CD95 Voorwaarts 5'-3': ATGCACACTCTGCGATGAAG | CD95 Omgekeerde 5'-3': CAGTGTTCACAGCCAGGAGA | 11 | ||
| ASGR1 Voorwaarts 5'-3': GAGTCGAAGCTGGAAAAACAG | ASGR1 Reverse 5'-3': CCTTCATACTCCACCCAGTTG | 12 | ||
| ASGR2 Voorwaarts 5'-3': CTACTGGTTTTCTCGGGATGG | ASGR2 Omgekeerd 5'-3': CAAATATGAAACTGGCTCCTGTG | 13 | ||
| CD45 Voorwaarts 5'-3': GAACATGCTGCCAATGGTTCT | CD45 Omgekeerde 5'-3': TGTCCCACATGACTCCTTTCC | 14 | ||
| COL1A1 Voorwaarts 5'-3': GAAGCACGTCTGGTTTGGA | COL1A1 Reverse 5'-3': ACTCGAACGGGAATCCATC | 15 | ||
| TIE2 Voorwaarts 5'-3': ATGTGGAAGTCGAGAGGCGAT | TIE2 Reverse 5'-3': CGAATAGCCATCCACTATTGTCC | 16 | ||
| GAPDH Voorwaarts 5'-3': CGACTTCAACAGCAACTCCCACTCTTCC | GAPDH Reverse 5'-3': TGGGTGGTCCAGGGTTTCTTACTCCTT | 17 | ||
| CD81 Voorwaarts 5'-3': CCAAGGCTGTGGTGAAGACTTTC | CD81 Omgekeerde 5'-3': GGCTGTTCCTCAGTATGGTGGTAG | 18 | ||
| TLR4 Voorwaarts 5'-3': ACCTGGCTGGTTTACACGTC | TLR4 Reverse 5'-3': CTGCCAGAGACATTGCAGAA | 19 | ||
Tabel 2: Lijst van primers: Primers gebruikt voor genen TTR, CD95, ASGR1, ASGR2, CD45, COL1A1, TIE2, GAPDH, CD81 en TLR4
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn verschillende primaire hepatocytenisolatieprotocollen ontwikkeld. Ze zijn ook geoptimaliseerd en aangepast op basis van verschillende behoeften (tabel 1). Isolatieprotocollen bestaan over het algemeen uit twee delen: perfusie (inclusief enzymvertering) en zuivering.
De perfusie kan worden uitgevoerd met de gehele lever in vivo 2,20,21,22,23 of met ontlede leverkwabben 24. De perfusie van ontlede lobben was over het algemeen beperkt tot de linker- en mediumlobben voor technisch gemak. Theoretisch zou in vivo perfusie meer primaire hepatocyten moeten opleveren vanwege het gebruik van de hele lever met alle lobben. Het op zijn plaats houden van de lever tijdens perfusie kan ook de celdood verminderen, omdat hepatocyten in vivo te allen tijde tijdens deze stap kunnen baden in vloeistof, bloed of perfusiebuffers.
Het behoud van steriele omstandigheden speelt ook een belangrijke rol in deze stap. Als de toestand het toelaat, is het beter om perfusie in een schone kap uit te voeren. Alle hulpmiddelen met directe aanraking van weefsels moeten steriel zijn, wat kan worden bereikt door autoclaaf. Om besmetting door bacteriën en schimmels te voorkomen, werd een antibiotisch-antimycotische oplossing aan het kweekmedium toegevoegd.
De IVC en poortader zijn twee hoofdvaten die de lever verbinden met andere organen. De meeste protocollen gebruiken een van deze aderen om naalden in te brengen voor perfusie: IVC 2,20,21,23, portalader 22. De positie van de poortader bevindt zich in een scheve hoek, wat leidt tot problemen bij het positioneren en stabiliseren van de ingebrachte naald. Een hechting is dus meestal nodig om de naald op zijn plaats te binden met een chirurgische knoop, wat heel voorzichtig moet worden gedaan omdat de ader gevoelig is voor schade. Over het algemeen is de diameter van de poortader ook kleiner dan IVC, wat het inbrengen van naalden bemoeilijkt. Gezien dit, kan het gebruik van IVC handiger zijn, hoewel in sommige protocollen de naald ook chirurgisch aan de IVC20 wordt geknoopt. Er is gemeld dat perfusie met IVC-insertie resulteerde in minder levensvatbare primaire hepatocyten dan portale ader25. In het huidige protocol hebben we echter met succes IVC-insertie gebruikt en de geïsoleerde primaire hepatocyten levensvatbaarheid (>96% in geoptimaliseerde omstandigheden, gemeten met Trypan Blue-kleuring volgens het protocol van de fabrikant) was net zo hoog, zo niet meer, als andere protocollen (varieert tussen 80% en 96% op basis van protocollen en voorwaarden 2,22,23,24).
Er zijn twee doelen voor de perfusiestap: bloed uit leverlobben spoelen en de lever verteren om primaire hepatocyten vrij te geven. Om deze doelstellingen te bereiken, moeten ten minste twee buffers worden gebruikt, één voor bloedflux (Flux Buffer) en één voor spijsvertering (Digestion Buffer). De meeste protocollen bereiden HBSS-gebaseerde fluxbuffer voor en voegen collagenase toe om het geschikt te maken voor vertering, als digestiebuffer. De voorbereiding van deze buffers is tijdrovend en de buffers kunnen enigszins variëren in sommige delicate eigenschappen, zoals pH, van batch tot batch, waardoor ongevraagde variabelen worden geïntroduceerd. Gezien dit, bespaart het gebruik van commercieel beschikbare buffers waardevolle arbeid en tijd terwijl deze variabelen worden geminimaliseerd. Gibco ontwikkelde een protocol voor primaire hepatocytenisolatie van volwassen ratten26, gebaseerd op het gebruik van in de handel verkrijgbaar leverperfusiemedium (als fluxbuffer) en leververteringsmedium (als spijsverteringsbuffer). Muis en rat, als knaagdieren, delen hoge overeenkomsten in lichaamseigenschappen; men kan deze twee voor ratten geoptimaliseerde buffers integreren in de primaire hepatocytenisolatie van muizen. Inderdaad, Gonçalves et al. 24, met succes de perfusie van ontlede leverlobben met deze buffers uitgevoerd, waardoor de belofte van hun gebruik in leverperfusie in vivo werd verhoogd. Hier hebben we met succes leverperfusiemedium en leververteringsmedium getest in het huidige primaire hepatocytenprotocol van de muis, dat hoogwaardige levensvatbare primaire hepatocyten opleverde (figuur 3 en figuur 4).
De temperatuur van de perfusiebuffer bepaalt hoe goed primaire hepatocyten de isolatie overleven. Als de temperatuur te hoog is, kan het collagenase binnen de digestiebuffer verminderde activiteit hebben; als ze te laag zijn, kunnen de primaire hepatocyten een koude shock krijgen, waardoor de mogelijke gecompromitteerde isolatieopbrengst ontstaat. De tijd die buffer nodig heeft om door perfusiebuizen te stromen, bepaalt ook de temperatuur van de buffer wanneer deze de lever bereikt. In eerdere protocollen werd 40 °C2 of 42 °C21 waterbad gebruikt. Deze temperatuur kan onderhevig zijn aan verandering op basis van laboratoriumomstandigheden, zoals de omgevingstemperatuur, de lengte van de perfusiebuis en het type peristaltische pomp. In het huidige protocol hebben we, na meerdere keren testen, de waterbadtemperatuur geoptimaliseerd tot 45 °C om de buffers op te warmen.
De zuiverheid van geïsoleerde primaire hepatocyten speelt een belangrijke rol in latere experimenten, omdat hoe hoger de zuiverheidsverhouding, hoe minder mogelijke interferentie. Hoewel de lever voornamelijk bestaat uit hepatocyten, goed voor 60% -80% van massa27, zijn er ook verschillende soorten andere cellen aanwezig, zoals immuuncellen, stellaatcellen en endotheelcellen, die belangrijk zijn voor hepatische immunologische activiteiten. Elk van deze cellen zou een potentiële interferentie kunnen plaatsen in latere experimenten28. Stellaatcellen in de lever reageren bijvoorbeeld ook op pathogene invasies en leverbeschadigingen, waarbij littekenvorming29 betrokken is. In aantallen wordt 5% -8% van de totale levercelpopulatie bijgedragen door stellaatcellen30. Normaal gesproken zijn stellaatcellen in rust, maar deze status kan worden verbroken wanneer er stress aanwezig is. Daarom kunnen stellaatcelactiviteiten worden veroorzaakt door spanningen die tijdens isolatie of daaropvolgende behandeling worden geïntroduceerd als sommige van deze cellen in de uiteindelijke geïsoleerde primaire hepatocytenpool blijven. Andere soorten cellen dragen ook bij aan een aanzienlijk deel van de levercelpopulatie, zoals lever sinusoïdale endotheelcellen (LSEC's), goed voor 20% van de totale levercelpopulatie31. Hoe de aanwezigheid van deze cellen te elimineren, is een raadselachtig onderdeel geweest in het primaire isolatieproces van hepatocyten. Daarom is zuivering een belangrijk onderdeel van primaire hepatocytenisolatie, die meestal profiteert van de gewichts- en grootteverschillen tussen verschillende soorten cellen. Door de centrifugesnelheid en/of zuiveringsbuffer te optimaliseren, kunnen primaire hepatocyten tot op de bodem van de buis worden gepelletiseerd.
Het scheiden van levende cellen van dode cellen is ook van cruciaal belang bij het verkrijgen van gezonde primaire hepatocyten en nauwkeurige celtelling. Meestal is het tellen van het celgetal een must na zuivering, omdat de resultaten van talrijke experimenten variëren naarmate de samenvloeiing van de cel verandert. Gradiëntcentrifugereagentia kunnen in deze stap worden gebruikt om deze missie te vervullen, zoals Percoll. 36%-40% van Percoll in centrifuge pellets neer levende cellen en houdt dode cellen in supernatant. We hebben met succes de centrifugeersnelheid en -tijd geoptimaliseerd om de niet-primaire hepatocytencelpopulatie in het huidige protocol te verminderen. Celtypespecifieke markers werden hier gebruikt om de zuiverheid van geïsoleerde primaire hepatocyten te testen, net als andere protocollen. De hier gebruikte hepatocytmarkers waren TTR2, CD9524,32, ASGR133 en ASGR234. Markers voor andere soorten cellen zijn CD45 (immuuncelmarker), COL1A1 (Stellate cell marker), TIE2 (Endotheelcelmarker)2,35. Met deze markers vertoonden de primaire hepatocyten geïsoleerd met het huidige protocol een hoge mate van zuiverheid (figuur 4), vergelijkbaar met de vorige protocollen 2,24.
Tijdens de perfusie maakt collagenase in Digestion Buffer de aanhechting tussen cellen los door collageen in de extracellulaire matrix af te breken. Dit leidt tot problemen bij het bereiken van cellen tijdens het platen. De meeste van de vorige protocollen vereisen / bevelen voorcoating van platen met collageen 2,22 of gelatine24 aan voor een betere hechting van primaire hepatocyten. Voor zover wij weten, terwijl Salem et al. 21 en Li et al. 20 besprak deze stap niet, andere protocollen die in deze studie werden beoordeeld, vermeldden / adviseerden duidelijk het gebruik van voorgecoate platen 2,22,23,24. In het huidige protocol vonden we dat de plaatcoating niet nodig was voor platen van bepaalde typen. Hoewel we niet zeker weten of dit kwam omdat verschillende soorten platen, vooral als ze van verschillende fabrikanten zijn, verschillende oppervlaktegladheid hebben, en of deze gevarieerde gladheid, als deze ooit bestaat, een belangrijke rol speelt bij primaire hepatocytenaanhechting, is het nuttig om op te merken dat een andere stap (plaatcoating) kan worden overgeslagen voor werkzaamheid. Het is ook belangrijk op te merken dat dit protocol een aanzienlijk deel van de terminaal gedifferentieerde, bijvoorbeeld diploïde hepatocyten genereert, samen met mononucleaire hepatocyten, vergelijkbaar met in vivo hepatische sinusoïd.
In deze studie werden de voordelen van eerdere primaire hepatocytenisolatieprotocollen gecombineerd en werd het proces zoveel mogelijk vereenvoudigd, met behulp van commercieel beschikbare reagentia en het elimineren van onnodige stappen. De centrifugeerstappen werden met succes teruggebracht tot twee, wat voor zover wij weten de minste is in gepubliceerde protocollen. Om de zuiverheid en bioactiviteit van geïsoleerde primaire hepatocyten te bevestigen, werd het niveau van verschillende levercelmarkers beoordeeld, wat bevestigt dat het huidige protocol de zuiverheid van primaire hepatocyten aanzienlijk kan verbeteren en andere levercelpopulaties, zoals immuuncellen, stellaatcellen en endotheelcellen, kan verminderen. De activiteit van farmaceutische biomarkers zoals ASGR1, ASGR2, CD81 en TLR4 was goed bewaard gebleven in primaire hepatocyten geïsoleerd met het huidige protocol, die ook de insulinegevoeligheid en glucoseproductieactiviteit hadden bevestigd. De belangrijkste beperking van dit protocol zijn de kosten, aangezien alle reagentia commercieel werden gekocht voor efficiëntie. We hebben niet specifiek geverifieerd dat glycogenose intact was in primaire hepatocyten geïsoleerd met behulp van het huidige protocol, en dit kan verder onderzoek nodig hebben voor gerelateerde studies. Dit protocol heeft vergelijkbare perfusiestappen als eerdere, zoals Salem et al.21, Severgnini et al.2 en Li et al.20, en Korelova et al.23, met behulp van IVC-insertie. Hun perfusie- en spijsverteringsbuffers, die mogelijk extra arbeid vereisen om zich voor te bereiden, kunnen ook werken met het huidige protocol met weinig wijziging van de enzymverteringstijd. Daarom kan het combineren van reagentia van eerdere protocollen met stappen van dit protocol ook nuttig zijn, zowel tijd- als economisch vriendelijk.
Samenvattend werd een verbeterd tijd- en arbeidsefficiënt protocol voor primaire hepatocytenisolatie van muizenlever ontwikkeld. Dit protocol maakt volledig gebruik van in de handel verkrijgbare reagentia en kan in ~ 35 minuten worden voltooid, van het ontleden van muizen tot het platen van primaire hepatocyten, waardoor een nuttige techniek wordt geboden voor primaire hepatocyt-gerelateerde studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (Grant 5R01HD095512-02 aan S.W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Gibco | 10010023 | |
| 10x HBSS | Gibco | 14065-056 | |
| 12-well Plate | FALCON | 353043 | Coating not required |
| 6-well Plate | FALCON | 353046 | Coating not required |
| anti-AKT | Cell Signaling | 2920S | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x), Stabilized | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| anti-FOXO1 | Cell Signaling | 97635S | |
| anti-GAPDH | Cell Signaling | 2118S | |
| anti-p-AKT (S473) | Cell Signaling | 9271L | |
| anti-PEPCK | Santa Cruz | SC-166778 | |
| anti-p-FOXO1 (S256) | Cell Signaling | 84192S | |
| Cell Strainer, 70 µm | CELLTREAT | 229483 | |
| Closed IV Catheter, 24 Gauge 0.75 IN | Becton Dickinson | 383511 | |
| DMEM, no glucose, no glutamine, no phenol red | ThermoFisher Scientific | A1443001 | |
| EnzyChrom Glucose Assay Kit | BioAssay Systems | EBGL-100 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
| Forskolin | MilliporeSigma | F3917-10MG | |
| Glucagon | Sigma-Aldrich | G2044 | |
| Goat Anti-mouse IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-68070 | |
| Goat Anti-rabbit IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-32211 | |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Software | NA | |
| Hepatocyte Wash Medium | Gibco | 17704-024 | |
| IBMX | Cell Signaling | 13630S | |
| Insulin | Lilly | NDC 0002-8215-01 | |
| Ketamine HCL (100 mg/mL) | Hospira Inc | NDC 0409-2051-05 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Liver Digest Medium | Gibco | 17703-034 | Aliquot within tissue culture hood to 25 mL each in 50 mL tube, and keep in -20 °C freezer |
| Liver Perfusion Medium | Gibco | 17701-038 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140122 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Peristaltic Pump | Gilson | Minipuls 2 | Capable of pumping at 4 mL/min |
| Petri Dish | Fisherbrand | 08-757-12 | |
| Refrigerated Centrifuge | Sorvall | Legend RT | Capable to centrifuge 50 mL tube at 4 °C |
| Sodium L-Lactate | Sigma-Aldrich | L7022 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| Syringe Filter, PVDF 0.45 µm 30mm diameter | CELLTREAT | 229745 | |
| Syringe, 0.5 mL | Becton Dickinson | 329461 | |
| Syringe, 60 mL | Becton Dickinson | 309653 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Tube, 15 mL | Corning | 430052 | |
| Tube, 50 mL | Corning | 430290 | |
| Water Bath Tank | Corning | CLS6783 | Or any water bath tank capable of heating up to 45 °C |
| William’s E Medium (GlutaMAX Supplement) | Gibco | 32551020 | |
| Xylozine (100 mg/mL) | Vetone Anased LA | NDC13985-704-10 |
References
- Han, H. S., Kang, G., Kim, J. S., Choi, B. H., Koo, S. H. Regulation of glucose metabolism from a liver-centric perspective. Experimental and Molecular Medicine. 48, 218 (2016).
- Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
- Guidotti, J. E., et al. Liver cell polyploidization: a pivotal role for binuclear hepatocytes. Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).
- Morales-Navarrete, H., et al. A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture. Elife. 4, 11214 (2015).
- Bruening, J., et al. Hepatitis C virus enters liver cells using the CD81 receptor complex proteins calpain-5 and CBLB. PLoS Pathogens. 14 (7), 1007111 (2018).
- Silvie, O., et al. Hepatocyte CD81 is required for Plasmodium falciparum and Plasmodium yoelii sporozoite infectivity. Nature Medicine. 9 (1), 93-96 (2003).
- Crispe, I. N.
- Liu, N. C., et al. Loss of TR4 orphan nuclear receptor reduces phosphoenolpyruvate carboxykinase-mediated gluconeogenesis. Diabetes. 56 (12), 2901-2909 (2007).
- Wang, Z., et al. Gonadotrope androgen receptor mediates pituitary responsiveness to hormones and androgen-induced subfertility. JCI Insight. 5 (17), 127817 (2019).
- Santos, S. D., et al. CSF transthyretin neuroprotection in a mouse model of brain ischemia. Journal of Neurochemistry. 115 (6), 1434-1444 (2010).
- Pinhu, L., et al. Overexpression of Fas and FasL is associated with infectious complications and severity of experimental severe acute pancreatitis by promoting apoptosis of lymphocytes. Inflammation. 37 (4), 1202-1212 (2014).
- Mi, Y., Lin, A., Fiete, D., Steirer, L., Baenziger, J. U. Modulation of mannose and asialoglycoprotein receptor expression determines glycoprotein hormone half-life at critical points in the reproductive cycle. Journal of Biological Chemistry. 289 (17), 12157-12167 (2014).
- Tanowitz, M., et al. Asialoglycoprotein receptor 1 mediates productive uptake of N-acetylgalactosamine-conjugated and unconjugated phosphorothioate antisense oligonucleotides into liver hepatocytes. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12388-12400 (2017).
- Manczak, M., et al. Neutralization of granulocyte macrophage colony-stimulating factor decreases amyloid beta 1-42 and suppresses microglial activity in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Human Molecular Genetics. 18 (20), 3876-3893 (2009).
- Zhang, Y., et al. JAK1-dependent transphosphorylation of JAK2 limits the antifibrotic effects of selective JAK2 inhibitors on long-term treatment. Annals of the Rheumatic Diseases. 76 (8), 1467-1475 (2017).
- Shih, S. C., et al.
- Liu, G., et al. miR-147, a microRNA that is induced upon Toll-like receptor stimulation, regulates murine macrophage inflammatory responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15819-15824 (2009).
- Ding, Q., et al. Mice expressing minimally humanized CD81 and occludin genes support Hepatitis C virus uptake in vivo. Journal of Virology. 91 (4), 01799 (2017).
- Renshaw, M., et al. Cutting edge: impaired Toll-like receptor expression and function in aging. Journal of Immunology. 169 (9), 4697-4701 (2002).
- Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
- Salem, E. S. B., et al. Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323 (2018).
- Cabral, F., et al. Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507 (2019).
- Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies. Malar Journal. 6, 169 (2007).
- Yin, Z., Ellis, E. C., Nowak, G. Isolation of mouse hepatocytes for transplantation: a comparison between antegrade and retrograde liver perfusion. Cell Transplant. 16 (8), 859-865 (2007).
- Hepatocyte media, Thermofisher. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/Hepatocyte_Media_UG.pdf (2021).
- Sia, D., Villanueva, A., Friedman, S. L., Llovet, J. M. Liver cancer cell of origin, molecular class, and effects on patient prognosis. Gastroenterology. 152 (4), 745-761 (2017).
- Freitas-Lopes, M. A., Mafra, K., David, B. A., Carvalho-Gontijo, R., Menezes, G. B. Differential location and distribution of hepatic immune cells. Cells. 6 (4), 48 (2017).
- Schachtrup, C., Le Moan, N., Passino, M. A., Akassoglou, K. Hepatic stellate cells and astrocytes: Stars of scar formation and tissue repair. Cell Cycle. 10 (11), 1764-1771 (2011).
- Geerts, A. History, heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells. Seminars in Liver Disease. 21 (3), 311-335 (2001).
- Poisson, J., et al. Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases. Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).
- Peter, M. E., et al. The CD95 receptor: apoptosis revisited. Cell. 129 (3), 447-450 (2007).
- Peters, D. T., et al. Asialoglycoprotein receptor 1 is a specific cell-surface marker for isolating hepatocytes derived from human pluripotent stem cells. Development. 143 (9), 1475-1481 (2016).
- Willoughby, J. L. S., et al. Evaluation of GalNAc-siRNA conjugate activity in pre-clinical animal models with reduced asialoglycoprotein receptor expression. Molecular Therapy. 26 (1), 105-114 (2018).
- Hutchins, N. A., Chung, C. S., Borgerding, J. N., Ayala, C. A., Ayala, A. Kupffer cells protect liver sinusoidal endothelial cells from Fas-dependent apoptosis in sepsis by down-regulating gp130. American Journal of Pathology. 182 (3), 742-754 (2013).
