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Biology

माउस प्राथमिक हेपेटोसाइट अलगाव के लिए एक बेहतर समय और श्रम- कुशल प्रोटोकॉल

Published: October 25, 2021 doi: 10.3791/61812
Automatic Translation
1, 3, 1,2
1Department of Pediatrics, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Physiology, Temple University School of Medicine, 3Department of Pediatrics, Seattle Children’s Hospital

Summary

प्राथमिक हेपेटोसाइट्स विट्रो में जिगर की प्रतिक्रिया और चयापचय का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण हैं। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मकों का उपयोग करते हुए, माउस प्राथमिक हेपेटोसाइट अलगाव के लिए एक बेहतर समय और श्रम-कुशल प्रोटोकॉल विकसित किया गया था।

Abstract

प्राथमिक हेपेटोसाइट्स का उपयोग विट्रो अनुसंधान में यकृत में बड़े पैमाने पर किया जाता है, विशेष रूप से ग्लूकोज चयापचय अध्ययन में। एक आधार तकनीक को विभिन्न आवश्यकताओं के आधार पर अनुकूलित किया गया है, जैसे समय, श्रम, लागत और प्राथमिक हेपेटोसाइट उपयोग, जिसके परिणामस्वरूप विभिन्न प्राथमिक हेपेटोसाइट अलगाव प्रोटोकॉल होते हैं। हालांकि, प्राथमिक हेपेटोसाइट अलगाव में कई कदम और समय लेने वाली अभिकर्मक तैयारी दक्षता के लिए प्रमुख कमियां हैं। उनके पेशेवरों और विपक्षों के लिए विभिन्न प्रोटोकॉल की तुलना करने के बाद, प्रत्येक के लाभों को संयुक्त किया गया था, और एक तेजी से और कुशल प्राथमिक हेपेटोसाइट अलगाव प्रोटोकॉल तैयार किया गया था। केवल ~ 35 मिनट के भीतर, यह प्रोटोकॉल अन्य प्रोटोकॉल के रूप में अधिक नहीं, स्वस्थ प्राथमिक हेपेटोसाइट्स के रूप में अधिक उपज सकता है। इसके अलावा, पृथक प्राथमिक हेपेटोसाइट्स का उपयोग करके किए गए ग्लूकोज चयापचय प्रयोगों ने इन विट्रो यकृत चयापचय अध्ययनों में इस प्रोटोकॉल की उपयोगिता को मान्य किया। हमने इस अध्ययन में प्रत्येक चरण के महत्व और उद्देश्य की भी व्यापक रूप से समीक्षा और विश्लेषण किया ताकि भविष्य के शोधकर्ता आवश्यकताओं के आधार पर इस प्रोटोकॉल को और अनुकूलित कर सकें।

Introduction

जिगर कशेरुकी शरीर में सबसे महत्वपूर्ण अंगों में से एक के रूप में कार्य करता है क्योंकि यह भोजन पाचन, रक्त परिसंचरण और विषहरण जैसे कई जीवन-सहायक कार्यों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। विट्रो संस्कृति में माउस प्राथमिक हेपेटोसाइट का उपयोग कार्बोहाइड्रेट चयापचय और यकृत कार्सिनोमा के अध्ययन में तेजी से लोकप्रिय है। इसलिए, माउस प्राथमिक हेपेटोसाइट अलगाव के लिए एक सुविधाजनक विधि विकसित करना महत्वपूर्ण है, जबकि इसके जन्मजात शारीरिक कार्य को बनाए रखना महत्वपूर्ण है। ग्लूकोज चयापचय के केंद्र के रूप में इसके कार्य के कारण, जिगर ग्लूकोज उत्पादन और भंडारण1 के लिए भी केंद्रीय है। विट्रो में प्राथमिक हेपेटोसाइट्स के साथ प्रयोग अधिकांश ग्लूकोज चयापचय अध्ययनों के लिए आवश्यक हैं। इसलिए, वर्षों से, विभिन्न शोध समूहों ने माउस प्राथमिक हेपेटोसाइट अलगाव के लिए प्रोटोकॉल विकसित किए हैं।

माउस हेपेटोसाइट अलगाव की सामान्य प्रक्रिया पहले एक आइसोस्मोटिक तरल जैसे फॉस्फेट-बफ़र्ड लवण (पीबीएस) या हैंक्स के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) के साथ जिगर में रक्त को बाहर निकालना है और फिर हेपेटोसाइट्स को अलग करने के लिए कोलेजेनेस युक्त समाधान का उपयोग करना है। ये प्रोटोकॉल एक सामान्य प्रक्रिया साझा करते हैं लेकिन विभिन्न आवश्यकताओं के आधार पर अभिकर्मकों और चरणों में भिन्न होते हैं। हालांकि, आवश्यक अभिकर्मकों को तैयार करने और अलगाव के चरणों को करने में समय लगता है। वर्तमान प्रोटोकॉल को विकसित करने में, दक्षता को प्राथमिकता के रूप में निर्धारित किया गया था, जिसमें सभी अभिकर्मकों को उपयोग के लिए तैयार किया गया था और बाजार से उपलब्ध था, और जितना संभव हो उतना कम कदम। इस प्रोटोकॉल का समग्र लक्ष्य माउस से प्राथमिक हेपेटोसाइट्स को अलग करने के लिए एक तेज और श्रम-कुशल विधि प्रदान करना है, अलग-थलग प्राथमिक हेपेटोसाइट शुद्धता और व्यवहार्यता को खतरे में डाले बिना।

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं को जॉन्स हॉपकिन्स पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। इस अध्ययन में C57BL /6 मादा चूहों (8 सप्ताह की उम्र) का उपयोग किया गया था।

1. तैयारी:

  1. संस्कृति को मध्यम बनाने के लिए 10% FBS और 1% एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक समाधान के साथ विलियम के ई मीडियम (ग्लूटामैक्स सप्लीमेंट) को मिलाएं।
  2. कण मलबे को हटाने के लिए 0.45 μm सिरिंज फिल्टर के माध्यम से कोलेजनेज-डिस्पेज़ माध्यम (जैसे, लिवर डाइजेस्ट मीडियम) के 25 मिलीलीटर फ़िल्टर करें।
  3. डबल-आसुत एच2ओ (डीडीएच2ओ), 35 मिलीलीटर परफ्यूजन माध्यम (जैसे, लिवर परफ्यूजन मध्यम) (या इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके पहली बार 50 एमएल) के गर्म 50 मिलीलीटर), और 30 मिनट के लिए 45 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में फ़िल्टर किए गए कोलेजेनेस-डिस्पेज़ माध्यम के 25 मिलीलीटर।
  4. एक बाँझ ऊतक संस्कृति हुड के भीतर, 20 mL 1x Percoll-HBSS बनाने के लिए एक 50 mL ट्यूब में 10x HBSS के 2 mL और Percoll के 18 mL को मिलाएं और बर्फ या 4 °C पर रखें।
    नोट: 1x Percoll-HBSS को कम से कम 6 महीने के लिए 4 °C पर रखा जा सकता है।
  5. एक बाँझ ऊतक संस्कृति हुड के भीतर, एक साफ पेट्री डिश में 30 मिलीलीटर धोने के माध्यम (जैसे, हेपेटोसाइट वॉश मीडियम) डालें, और बर्फ पर रखें।
  6. पंपिंग ट्यूब को 45 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान के पानी में डुबोएं। परिणाम सबसे विश्वसनीय हैं यदि कमरे का तापमान 25 डिग्री सेल्सियस पर है।
  7. केटामाइन एचसीएल के 225 μL, Xylazine के 93.75 μL, और 1x PBS के 1681 μL को मिलाकर 1x एनेस्थेटिक्स के 2 mL तैयार करें।
  8. अनुमोदित विधि का उपयोग करके एक माउस को एनेस्थेटिक करें। यहां माउस को 1x एनेस्थेटिक्स के 150 μL के साथ इंट्रापेरिटोनियल रूप से इंजेक्ट किया गया था। पूर्ण संज्ञाहरण सुनिश्चित करने के लिए पैर की अंगुली की प्रतिक्रिया जैसे सजगता के नुकसान के लिए परीक्षण करें।
  9. माउस को विच्छेदन पैड पर चार अंगों द्वारा अपनी पीठ पर सुरक्षित करें, या तो पिन करके या पानी-सबूत टेप या संस्था की पशु देखभाल और उपयोग समिति (या समकक्ष) द्वारा अनुमोदित अन्य तरीकों का उपयोग करके।
  10. विच्छेदन के लिए निष्फल संदंश और कैंची तैयार करें। संभावित संदूषण से बचने के लिए, एक बाँझ हुड के भीतर सभी चरणों का संचालन करें।

2. प्रक्रिया:

  1. एक पेरिस्टाल्टिक पंप का उपयोग करके, 5 मिनट के लिए 4 एमएल / मिनट की गति से वार्म-अप डीडीएच2ओ पंप करना शुरू करें। पानी से पंपिंग ट्यूब को एक वार्म-अप परफ्यूजन माध्यम में बदलें।
  2. 70% EtOH के साथ anesthetized माउस के पेट कीटाणुरहित और जिगर, पोर्टल नस, और अवर वेना कावा (IVC) को उजागर करने के लिए एक कैंची के साथ खुला काट।
  3. Peristaltic पंप बंद करो. IVC में एक 24 G कैथेटर डालें (उदाहरण के लिए, बंद IV कैथेटर, 24 G, 0.75 IN)। पंप करना शुरू करें और पोर्टल नस को खोलें काटें।
  4. फ्लश-आउट तरल स्पष्ट होने तक पंप करना जारी रखें (लगभग 3-5 मिनट)। तरल को जिगर के हर कोने तक पहुंचने देने के लिए पोर्टल नस को हर मिनट दबाएं। सावधान रहें कि हवा के बुलबुले को आईवीसी में प्रवेश न करने दें।
    नोट: यह कदम जिगर से जितना संभव हो उतना रक्त बाहर निकालना है।
  5. परफ्यूजन माध्यम से कोलेजेनेस-डिस्पेज़ माध्यम में पंपिंग ट्यूब बदलें। चरण 2.6 करते समय कोलेजनेज-डिस्पेज़ माध्यम के सभी 25 एमएल समाप्त होने तक पंप करना जारी रखें।
  6. तरल को जिगर के हर कोने तक पहुंचने देने के लिए पोर्टल नस को हर मिनट दबाएं।
    नोट: इस स्तर पर, रक्त की पूरी हानि माउस के लिए घातक है। प्रयोग के बाद दिल की धड़कन की कमी से माउस की मौत की पुष्टि की जा सकती है। शव का निपटान सुविधा नीतियों के अनुसार करें।
  7. बर्फ पर पेट्री डिश में 30 मिलीलीटर धोने के माध्यम के लिए पित्ताशय की थैली के बिना पूरे जिगर को अलग करें।
  8. समाधान में प्राथमिक हेपेटोसाइट्स को जारी करने के लिए संदंश के साथ इसे टुकड़ों में फाड़ दें। यह कदम धोने के माध्यम को जारी किए गए प्राथमिक हेपेटोसाइट्स और छोटे जिगर के टुकड़ों से भरे बादल समाधान में बदल देगा।
  9. बर्फ पर एक 50 mL ट्यूब में 20 mL 1x Percoll-HBSS में एक 70 μm सेल छलनी के माध्यम से चरण 2.8 में बादल समाधान फ़िल्टर करें। ट्यूब को 20 बार उलटकर मिलाएं।
  10. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  11. ऊतक संस्कृति हुड के भीतर, supernatant aspirate. वॉश मीडियम के ठंडे 30 मिलीलीटर के साथ गोली को धोएं।
  12. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 50 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  13. supernatant निकालें और ऊतक संस्कृति हुड के भीतर संस्कृति माध्यम (या उपयुक्त अन्य मात्रा) के 25 मिलीलीटर में गोली resuspend.
  14. सेल नंबर की गणना करें और प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार वांछित संस्कृति प्लेटों पर कोशिकाओं को प्लेट करें।
    नोट: प्राथमिक हेपेटोसाइट्स को एक 8 सप्ताह पुराने माउस से ठीक से अलग किया जाता है, आमतौर पर चार 6-अच्छी तरह से प्लेटों या चार 12-अच्छी तरह से प्लेटों पर चढ़ाया जाने के लिए पर्याप्त होता है।

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Representative Results

दक्षता का परीक्षण करने के लिए, वर्तमान प्राथमिक हेपेटोसाइट अलगाव प्रोटोकॉल 8 सप्ताह की महिला C57BL / 6 चूहों पर किया गया था। पृथक प्राथमिक हेपेटोसाइट्स के लगाव और शुद्धता का परीक्षण किया गया था। प्राथमिक हेपेटोसाइट अलगाव का उपयोग यकृत शरीर विज्ञान पर विभिन्न प्रकार के प्रयोगों के लिए किया जाता है, जैसे कि यकृत दवा प्रभाव और ग्लूकोज चयापचय, दवा बायोमार्कर गतिविधि2, इंसुलिन संवेदनशीलता और ग्लूकोज उत्पादन। इसलिए, इस प्रोटोकॉल के साथ अलग किए गए प्राथमिक हेपेटोसाइट्स की गतिविधियों का परीक्षण निम्नलिखित प्रयोगों में किया गया था।

वर्तमान प्रोटोकॉल में प्राथमिक हेपेटोसाइट अनुलग्नक के लिए कोटिंग की आवश्यकता नहीं थी
अलग किए गए प्राथमिक हेपेटोसाइट्स को 6-अच्छी तरह से प्लेट पर 5 x 105 कोशिकाओं / अच्छी तरह से चढ़ाया गया था। 1 घंटे के बाद, एक फर्म लगाव देखा गया था, और प्राथमिक हेपेटोसाइट्स पूरी तरह से चढ़ाना के बाद 12 घंटे का विस्तार किया गया था (चित्रा 3)। इसने संकेत दिया कि चढ़ाना के 12 घंटे बाद, कोशिकाएं प्रयोगों के लिए उपयोग करने के लिए तैयार थीं। जिगर के भीतर माउस हेपेटोसाइट्स के नाभिक आकृति विज्ञान के आधार पर, मोनोन्यूक्लियर हेपेटोसाइट्स को सीमाओं पर समृद्ध किया गया था, जबकि द्विनाभिकीय / पॉलीन्यूक्लियर हेपेटोसाइट्स, टर्मिनल भेदभाव का एक हस्ताक्षर, मध्य 3,4 में थे। छवि वाली कोशिकाओं की एक महत्वपूर्ण मात्रा ने विशिष्ट दोहरे-नाभिक (द्विगुणित) आकृति विज्ञान को प्रदर्शित किया, जो जीवित प्राथमिक हेपेटोसाइट्स को अलग करने और शुद्ध करने की सफलता का संकेत देता है। यह भी इंगित करता है कि कोलेजन कोटिंग इस प्रोटोकॉल के साथ प्राथमिक हेपेटोसाइट लगाव के लिए एक आवश्यकता नहीं है।

पृथक प्राथमिक हेपेटोसाइट आबादी में शुद्धता को समृद्ध किया गया था
अलग-थलग प्राथमिक हेपेटोसाइट शुद्धता की जांच करने के लिए पिछले प्रोटोकॉल में विभिन्न सेल प्रकार-विशिष्ट जीन मार्करों का उपयोग किया गया है (तालिका 1)। TTR (Transthyretin), CD95 (विभेदन का क्लस्टर 95, जिसे Fas के रूप में भी जाना जाता है), ASGR1 (Asialoglycoprotein रिसेप्टर 1), और ASGR2 हेपेटोसाइट्स के लिए मार्कर हैं। अलगाव के बाद, इन हेपेटोसाइट मार्करों के एमआरएनए स्तर में काफी वृद्धि हुई थी, पूरे जिगर की तुलना में (चित्रा 4 ए-डी, एच)।

इस प्रोटोकॉल ने अन्य यकृत कोशिकाओं से हस्तक्षेप को भी बहुत कम कर दिया। प्रतिरक्षा कोशिकाओं, ताराकार कोशिकाओं और एंडोथेलियल कोशिकाओं की उपस्थिति कम थी, जो सीडी 45 (प्रतिरक्षा सेल मार्कर), COL1A1 (कोलेजन, प्रकार I, अल्फा 1, ताराकार सेल मार्कर), और TIE2 (ट्यूनिका इंटर्ना एंडोथेलियल सेल किनेज, एंडोथेलियल सेल मार्कर) के एमआरएनए स्तरों की तेज कमी से दिखाया गया था, पूरे जिगर की तुलना में (चित्रा 4ई-एच) ). ये सुझाव देते हैं कि यह प्रोटोकॉल यकृत कोशिकाओं से प्राथमिक हेपेटोसाइट आबादी को शुद्ध कर सकता है और इस प्रकार प्रयोगों में अन्य सेल प्रकारों से संभावित हस्तक्षेप को कम कर सकता है।

फार्मास्यूटिकल बायोमाकर्स की गतिविधि को संरक्षित किया गया था
हेपेटोसाइट्स पर बायोमाकर्स का उपयोग बड़े पैमाने पर दवा लक्ष्यीकरण और वितरण के लिए किया गया है। इस प्रकार फार्मास्युटिकल बायोमार्कर की गतिविधि संरक्षण प्राथमिक हेपेटोसाइट अलगाव में एक महत्वपूर्ण बिंदु है और प्राथमिक हेपेटोसाइट अलगाव2 की उपयोगिता का परीक्षण करने के लिए एक मानक है। हेपेटोसाइट मार्करों ASGR1 और ASGR2 इस तरीके से उपयोग किया जाताहै 2. हमने पहली बार प्राथमिक हेपेटोसाइट चढ़ाना से पहले और बाद में इन दो मार्करों के समय-पाठ्यक्रम अभिव्यक्ति स्तर का परीक्षण किया। चढ़ाना के बाद, समय के साथ उनके एमआरएनए स्तर में काफी कमी आई, लेकिन चढ़ाना के बाद 12 घंटे के समय बिंदु तक पूरे जिगर की तुलना में स्तर काफी बने रहे, खासकर एएसजीआर 1 (चित्रा 5 ए, बी) के लिए। अभिव्यक्ति की प्रवृत्ति पिछली रिपोर्ट2 के अनुरूप थी और तुलनीय प्राथमिक हेपेटोसाइट स्वस्थता का संकेत दिया। विभिन्न रोगजनकों को लक्षित CD81, एक हेपेटोसाइट झिल्ली-बाध्य प्रोटीन, कोशिकाओं और संक्रमण में उनके प्रवेश की सुविधा के लिए, जैसे हेपेटाइटिस वायरस5, प्लास्मोडियम फाल्सीपेरम, और प्लास्मोडियम योएली6। अन्य हेपेटोसाइट झिल्ली स्थित प्रोटीन, जैसे टीएलआर 4 (टोल-जैसे रिसेप्टर 4), रोगजनकों द्वारा भी लक्षित होते हैं और हेपेटोसाइट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया7 के लिए महत्वपूर्ण होते हैं। चढ़ाना के बाद, CD81 की अभिव्यक्ति का स्तर 48 h (चित्रा 5C) तक सुसंगत था। टीएलआर 4 अभिव्यक्ति का स्तर आम तौर पर बढ़ जाता है, लेकिन 48 घंटे के बाद तक नहीं, जब यह विवो (चित्रा 5 डी) की तुलना में उच्च स्तर पर पहुंच गया। ये सुझाव देते हैं कि इस प्रोटोकॉल द्वारा अलग किए गए प्राथमिक हेपेटोसाइट्स का उपयोग चढ़ाना के बाद कम से कम 48 घंटे के भीतर सीडी 81 और टीएलआर 4 अध्ययनों के लिए भी किया जा सकता है। साथ में, इन परिणामों से संकेत मिलता है कि प्राथमिक हेपेटोसाइट्स अलग-थलग फार्मास्यूटिकल बायोमार्कर से संबंधित अध्ययनों में उपयोग के लिए मान्य हैं। यह ध्यान देने योग्य है कि आरएनए और प्रोटीन का स्तर सिग्नल पेप्टाइड-प्रेरित आरएनए माइग्रेशन, पोस्टट्रांसलेशनल संशोधन और / या प्रोटीन गिरावट जैसी पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधियों के प्रभावों के कारण असंगत हो सकता है। इसलिए, प्रोटीन स्तर और एमआरएनए द्वारा पहचाने गए फार्मास्यूटिकल बायोमाकर्स का बायोएक्टिविटी सत्यापन आवश्यक हो सकता है यदि प्रयोगात्मक प्रतिमान द्वारा आवश्यक हो।

पृथक प्राथमिक हेपेटोसाइट्स इंसुलिन-संवेदनशील थे
ग्लूकोज चयापचय के प्रयोगों में प्राथमिक हेपेटोसाइट प्रदर्शन का भी विश्लेषण किया गया था। इंसुलिन, एक हार्मोन जो ग्लूकोज चयापचय में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है, ग्लूकोज के स्तर को कम करता है, फॉस्फोराइलेटिंग एकेटी और FOXO1 (फोर्कहेड बॉक्स O1) के माध्यम से यकृत ग्लूकोज अपटेक और स्टोरेज को बढ़ावा देता है। इसलिए, एक इंसुलिन संवेदनशीलता परख अलग प्राथमिक हेपेटोसाइट्स के साथ किया गया था। 16 घंटे के बाद, कोशिकाओं को सीरम-मुक्त माध्यम के साथ 3 घंटे के लिए भूखा रखा गया था। भुखमरी के अंतिम 0.5 घंटे में, 100 एनएम इंसुलिन को संस्कृति माध्यम के लिए प्रशासित किया गया था। जैसा कि चित्रा 6ए-सी में दिखाया गया है, इंसुलिन ने Ser473 में AKT और Ser256 में FOXO1 दोनों के फॉस्फोराइलेशन को काफी बढ़ावा दिया, जो इंसुलिन के लिए प्राथमिक हेपेटोसाइट्स की संवेदनशीलता को दर्शाता है। इससे पता चलता है कि वर्तमान प्रोटोकॉल से अलग-थलग प्राथमिक हेपेटोसाइट्स इंसुलिन / ग्लूकोज चयापचय अध्ययन में उपयोगी हैं।

पृथक प्राथमिक हेपेटोसाइट्स ग्लूकोज उत्पादन में सक्षम थे
न केवल वे ग्लूकोज भंडारण के लिए एक केंद्र हैं, बल्कि हेपेटोसाइट्स ग्लूकोज उत्पादन के लिए भी जिम्मेदार हैं। यह परीक्षण करने के लिए कि क्या प्राथमिक हेपेटोसाइट्स जिन्हें हमने अलग किया है, ग्लूकोज उत्पादन के अध्ययन में उपयोगी हैं, ग्लूकोज उत्पादन को प्रोत्साहित करने के लिए ग्लूकागन की उपस्थिति में कोशिकाओं को 10 घंटे के लिए भूखा रखा गया था। भुखमरी माध्यम तब ग्लूकोज परख के लिए एकत्र किया गया था, जबकि कोशिकाओं को पश्चिमी धब्बा के लिए काटा गया था। Phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) यकृत ग्लूकोज उत्पादन में एक आवश्यक घटक है, जो इसकी दर 8 को नियंत्रित करताहै। ग्लूकागन उपचार के बाद PEPCK के प्रोटीन स्तर में काफी वृद्धि हुई थी, यह सुझाव देते हुए कि ग्लूकोज उत्पादन मार्ग सक्रिय था (चित्रा 7ए, बी)। इस सक्रियण को ग्लूकोज उत्पादन के बढ़े हुए स्तर (चित्रा 7 सी) द्वारा आगे की पुष्टि की गई थी। इस घटना की पुष्टि अन्य ग्लूकोज उत्पादन उत्तेजकों जैसे forskolin plus IBMX (चित्रा 7A-C) के साथ भी की गई थी। हालांकि, इस प्रयोग की सीमा के कारण, हम यह सत्यापित नहीं कर सके कि ग्लूकोज उत्पादन ग्लूकोनोजेनेसिस के माध्यम से अनन्य था या क्या ग्लाइकोजेनोलिसिस का एक घटक भी है।

Figure 1
चित्रा 1: बेंच सेटअप. (ए) प्राथमिक हेपेटोसाइट अलगाव के लिए बेंच सेटअप। (बी) प्राथमिक हेपेटोसाइट अलगाव के लिए कार्टून बेंच सेटअप। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: माउस विच्छेदन, परफ्यूजन, और प्राथमिक हेपेटोसाइट शुद्धिकरण। (ए) विच्छेदित माउस, तीर के साथ जिगर, आईवीसी, और पोर्टल नस की ओर इशारा करते हैं। (बी) आईवीसी में कैथेटर सम्मिलन। (ग) जिगर के लोप्स की वृद्धि और कठोरता के कारण पोर्टल शिरा पर दबाव डालना, जो सफल परफ्यूजन को दर्शाता है। (डी) परफ्यूजन के बाद नरम जिगर lopes, कोलेजनेस पाचन की सफलता का संकेत. (ई) पृथक जिगर में पित्ताशय की थैली की स्थिति (पित्ताशय की थैली की ओर इशारा करते हुए तीर)। (च) पित्ताशय की थैली हटाने. (जी) हेपेटोसाइट वॉश माध्यम में फटा हुआ जिगर। (एच) सेंट्रीफ्यूज से पहले फ़िल्टर किए गए प्राथमिक हेपेटोसाइट के साथ 1x Percoll-HBSS मिश्रण। (I, J) सेंट्रीफ्यूज के बाद प्राथमिक हेपेटोसाइट गोली। (के) हेपेटोसाइट धोने के माध्यम के भीतर प्राथमिक हेपेटोसाइट पुन: निलंबन। (L, M) प्राथमिक हेपेटोसाइट गोली सेंट्रीफ्यूज के बाद हेपेटोसाइट वॉश माध्यम के भीतर गठित होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: चढ़ाना के बाद प्राथमिक हेपेटोसाइट्स। छवियों को (ए) 1 एच, (बी, सी) 12 एच, (डी) 24 एच, (ई) 36 एच, (एफ) 48 एच, (जी) 72 एच, और (एच) 96 एच प्राथमिक हेपेटोसाइट चढ़ाना के बाद लिया गया था। स्केल बार = 100 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: अलगाव के बाद उन्नत प्राथमिक हेपेटोसाइट शुद्धता। आरएनए को पहले (पूरे जिगर से) और बाद में (अलग-थलग प्राथमिक हेपेटोसाइट्स से) प्राथमिक हेपेटोसाइट अलगाव से अलग किया गया था, इसके बाद रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर, पिछले प्रोटोकॉल9 के अनुसार। प्राथमिक हेपेटोसाइट शुद्धता का मूल्यांकन हेपेटोसाइट मार्कर (ए) टीटीआर, (बी) सीडी 9 5, (सी) एएसजीआर 1 और (डी) एएसजीआर 2 के लिए प्राइमरों के साथ वास्तविक समय पीसीआर द्वारा किया गया था, जबकि प्रतिरक्षा सेल मार्कर (ई) सीडी 45, (एफ) ताराकार सेल मार्कर COL1A1, और (जी) एंडोथेलियल सेल मार्कर TIE2 के साथ भी। (एच) हीटमैप प्राथमिक हेपेटोसाइट अलगाव से पहले और बाद में सेल प्रकार मार्करों की अभिव्यक्ति परिवर्तन के लिए उत्पन्न किया गया था। GAPDH (ग्लिसराल्डिहाइड 3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज) का उपयोग आंतरिक नियंत्रण के रूप में किया गया था। यहां उपयोग किए जाने वाले प्राइमर जीन के लिए थे (प्राइमर अनुक्रम तालिका 2 में हैं। अनुक्रम संदर्भ यहां उद्धृत किए गए हैं): टीटीआर10; CD9511; ASGR112; ASGR213; CD4514; COL1A115; TIE216; GAPDH17. ग्राफ़ और हीटमैप GraphPad प्रिज्म 8 के साथ उत्पन्न किए गए थे। त्रुटि पट्टी मानक विचलन को इंगित करती है, और दो-पूंछ वाले अनपेयर्ड (चूंकि प्राथमिक हेपेटोसाइट और पूरे जिगर के नमूनों को अनपेयर किया गया था क्योंकि इस प्रोटोकॉल को शुरू करने के लिए बरकरार जिगर की आवश्यकता होती है) टी-टेस्ट महत्व तारांकन द्वारा इंगित किया जाता है (* पी < 0.05; ** पी < 0.01; *** पी < 0.001)। N = 7. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: फार्मास्यूटिकल बायोमाकर्स की अभिव्यक्ति। आरएनए को चढ़ाना के बाद पूरे जिगर और प्राथमिक हेपेटोसाइट से अलग किया गया था, इसके बाद रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर। फार्मास्युटिकल बायोमार्कर की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन वास्तविक समय पीसीआर द्वारा (ए) एएसजीआर 1, (बी) एएसजीआर 2, (सी) सीडी 81 और (डी) टीएलआर 4 के लिए प्राइमरों के साथ किया गया था। GAPDH का उपयोग आंतरिक नियंत्रण के रूप में किया जाता था। यहां उपयोग किए जाने वाले नए प्राइमर जीन के लिए थे (प्राइमर अनुक्रम तालिका 2 में हैं। अनुक्रम संदर्भ यहाँ उद्धृत कर रहे हैं): CD8118; TLR419. ग्राफ़ ग्राफपैड प्रिज्म 8 के साथ उत्पन्न किए गए थे। N = 5 कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: प्राथमिक हेपेटोसाइट अलगाव के बाद इंसुलिन संवेदनशीलता संरक्षित है। (ए) पी-एकेटी (S473), AKT, p-FOXO1 (S256), FOXO1, और GAPDH का पश्चिमी धब्बा इंसुलिन उपचार के बाद। (बी) पश्चिमी धब्बा के घनत्वमिति में पी-एकेटी (एस 473)/एकेटी। (C) पश्चिमी धब्बा के घनत्वमिति में p-FOXO1 (S256)/FOXO1। इंसुलिन संवेदनशीलता परख प्राथमिक हेपेटोसाइट चढ़ाना के बाद 16 ज बाहर किया गया था. प्राथमिक हेपेटोसाइट्स एफबीएस के बिना विलियम के ई मीडियम (ग्लूटामैक्स सप्लीमेंट) में 3 घंटे के लिए भूखे थे, लेकिन 1% एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक समाधान के साथ और पिछले 30 मिनट में 100 एनएम इंसुलिन उपचार के साथ, 1x RIPA बफर के साथ प्रोटीन लाइसिस के लिए काटा जा रहा था। ग्राफ़ ग्राफपैड प्रिज्म 8 के साथ उत्पन्न किए गए थे। पश्चिमी धब्बा इमेजिंग LI-COR ओडिसी CLx के साथ किया गया था। त्रुटि पट्टी मानक विचलन को इंगित करती है, और दो-पूंछ वाले युग्मित टी-परीक्षण महत्व को तारांकन चिह्नों द्वारा इंगित किया जाता है (* पी < 0.05; ** पी < 0.01)। N = 4 कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: ग्लूकोज उत्पादन परख. (ए) 10 घंटे के लिए ग्लूकागन या फॉर्सकोलिन + आईबीएमएक्स उपचार के बाद पेपकेक और जीएपीडीएच का पश्चिमी धब्बा (बी) 10 घंटे के लिए ग्लूकागन या फोर्सकोलिन + आईबीएमएक्स उपचार के बाद जीएपीडीएच की तुलना में पीईपीसीके प्रोटीन स्तर की घनत्वमिति (सी) ग्लूकोज स्तर या तो ग्लूकागन या फोर्सकोलिन + आईबीएमएक्स उपचार के बाद प्रोटीन स्तर की तुलना में 10 घंटे के लिए। ग्लूकोज उत्पादन परख प्राथमिक हेपेटोसाइट चढ़ाना के बाद 16 ज बाहर किया गया था। प्राथमिक हेपेटोसाइट्स को ग्लूकोज में 10 घंटे के लिए भूखा रखा गया था- और फिनोल लाल-मुक्त डीएमईएम (2 एमएम एल-ग्लूटामाइन, 2 एमएम सोडियम पाइरूवेट, 20 एमएम सोडियम एल-लैक्टेट, 1% पेन स्ट्रेप के साथ जोड़ा गया), या तो 50एनएम ग्लूकागन या 20 μM forskolin और 200 μM IBMX के साथ। माध्यम ग्लूकोज परख किट के साथ ग्लूकोज एकाग्रता माप के लिए काटा गया था, जबकि प्रोटीन पश्चिमी धब्बा के लिए काटा गया था। पश्चिमी धब्बा इमेजिंग LI-COR ओडिसी CLx के साथ किया गया था। त्रुटि पट्टी मानक विचलन को इंगित करती है, और दो-पूंछ वाले युग्मित टी-परीक्षण महत्व को तारांकन द्वारा इंगित किया जाता है (* पी < 0.05; ** पी < 0.01; *** पी < 0.001)। N = 4 कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Centrifugation टाइम्स रिब पिंजरे हटाने परफ्यूजन बफ़र्स स्व-निर्माण सर्जिकल गाँठ लैंप हीटिंग प्लेट कोटिंग पृथक सेल मात्रा/ प्रवणता अपकेंद्रण शुद्धता मार्कर जीन
वर्तमान प्रोटोकॉल 2 नहीं नहीं नहीं नहीं नहीं 2.5–4 x 107 हाँ TTR, CD95, ASGR1, ASGR2, CD45, COL1A1, TIE2
Severgnini et al.2. 4 हाँ हाँ हाँ हाँ हाँ 1.8–2 x 107 नहीं TTR, CD45, COL1A1, TIE2
Gonçalves et al.24. 5 या 6 नहीं नहीं नहीं नहीं हाँ 1–3 x 106 हाँ CD45, CD95
ली एट अल.20. 4 या 5 नहीं हाँ हाँ नहीं उल्लेख नहीं किया गया है 1–4 x 107 नहीं N/A
सलेम एट अल.21. 3 नहीं हाँ नहीं नहीं उल्लेख नहीं किया गया है 2 x 107 हाँ N/A
Cabral et al.22. 3 या 6 (ग्रेडिएंट सेंट्रीफ्यूजेशन के साथ) नहीं हाँ हाँ नहीं हाँ/ अनुशंसित N/A वैकल्पिक N/A (प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन की गई शुद्धता)
कोरेलोवा एट अल.23। 3 नहीं हाँ हाँ नहीं हाँ N/A हाँ N/A

तालिका 1: प्राथमिक हेपेटोसाइट प्रोटोकॉल की तुलना।

प्राइमर (अग्रेषित) प्राइमर (रिवर्स) संदर्भ
TTR आगे 5'-3': AGCCCTTTGCCTGGGAAGAC TTR रिवर्स 5'-3': TGCGATGGTGTAGTGGGGGGGG 10
CD95 अग्रेषित 5'-3': ATGCACACTCTGCGATGAAG CD95 रिवर्स 5'-3': CAGTGTTCACAGCCAGGAGA 11
ASGR1 फॉरवर्ड 5'-3': GAGTCGAAGCTGGAAAAAAACAG ASGR1 रिवर्स 5'-3': CCTTCATACTCCACCCAGTTG 12
ASGR2 आगे 5'-3': CTACTGGTTTTCGGGGGGGG ASGR2 रिवर्स 5'-3': CAAATGAAACTGGCTCCTGTG 13
CD45 अग्रेषित 5'-3': GAACATGCTGCCAATGGTTCT CD45 रिवर्स 5'-3': TGTCCCACATGACTCCTTTCC 14
COL1A1 आगे 5'-3': GAAGCACGTCTGGTTTGGGA COL1A1 रिवर्स 5'-3': ACTCGAACGGGAATCCATC 15
TIE2 फॉरवर्ड 5'-3': ATGTGGAAGTCGAGAGGCGAT TIE2 रिवर्स 5'-3': CGAATAGCCATCCACTGTCC 16
GAPDH फॉरवर्ड 5'-3': CGACTTCAACCAACCAACTCCCACTCTTCC GAPDH रिवर्स 5'-3': TGGGTGGTCCAGGGTTTCTTACTCCTT 17
CD81 अग्रेषित 5'-3': CCAAGGCTGTGGTGAAGACTTTC CD81 रिवर्स 5'-3': GGCTGTTCCTCAGTGGTGGTAG 18
TLR4 आगे 5'-3': ACCTGGCTGGTTTACACGTC TLR4 रिवर्स 5'-3': CTGCCAGAGACATTGCAGAA 19

तालिका 2: प्राइमरों की सूची: प्राइमर जीन TTR, CD95, ASGR1, ASGR2, CD45, COL1A1, TIE2, GAPDH, CD81, और TLR4 के लिए उपयोग किया जाता है

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Discussion

विभिन्न प्राथमिक हेपेटोसाइट अलगाव प्रोटोकॉल विकसित किए गए हैं। उन्हें विभिन्न आवश्यकताओं के आधार पर अनुकूलित और अनुकूलित भी रखा गया है (तालिका 1)। अलगाव प्रोटोकॉल आमतौर पर दो भागों से बने होते हैं: परफ्यूजन (एंजाइम पाचन सहित) और शुद्धिकरण।

परफ्यूजन पूरे जिगर के साथ विवो 2,20,21,22,23 में या विच्छेदित यकृत लोब24 के साथ किया जा सकता है। विच्छेदित लोबों का छिड़काव आम तौर पर तकनीकी आसानी के लिए बाएं और मध्यम लोब तक सीमित था। सैद्धांतिक रूप से, विवो परफ्यूजन में सभी लोब के साथ पूरे जिगर के उपयोग के कारण अधिक प्राथमिक हेपेटोसाइट्स उत्पन्न करना चाहिए। परफ्यूजन के दौरान जिगर को जगह में रखने से सेल मृत्यु भी कम हो सकती है क्योंकि विवो में हेपेटोसाइट्स को इस चरण के दौरान हर समय तरल पदार्थ, या तो रक्त या परफ्यूजन बफर में स्नान किया जा सकता है।

बाँझ स्थितियों का रखरखाव भी इस चरण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। यदि स्थिति अनुमति देती है, तो एक साफ हुड में परफ्यूजन का संचालन करना बेहतर है। ऊतकों के लिए सीधे स्पर्श के साथ सभी उपकरण बाँझ होने चाहिए, जिसे आटोक्लेव द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। बैक्टीरिया और कवक से किसी भी संदूषण को रोकने के लिए, संस्कृति माध्यम में एक एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक समाधान जोड़ा गया था।

आईवीसी और पोर्टल नस दो मुख्य वाहिकाएं हैं जो जिगर को अन्य अंगों के साथ जोड़ती हैं। अधिकांश प्रोटोकॉल इन नसों में से किसी एक का उपयोग परफ्यूजन के लिए सुइयों को सम्मिलित करने के लिए करते हैं: IVC 2,20,21,23, पोर्टल शिरा22। पोर्टल नस की स्थिति एक तिरछे कोण पर है, जो डाली गई सुई की स्थिति और स्थिर करने में कठिनाई की ओर जाता है। इस प्रकार आमतौर पर एक सर्जिकल गाँठ के साथ सुई को बांधने के लिए एक सीवन की आवश्यकता होती है, जिसे बहुत सावधानी से किया जाना चाहिए क्योंकि नस को नुकसान होने की संभावना है। आम तौर पर, पोर्टल नस का व्यास भी आईवीसी की तुलना में छोटा होता है, जो सुई सम्मिलन को जटिल बनाता है। इसे ध्यान में रखते हुए, आईवीसी का उपयोग अधिक सुविधाजनक हो सकता है, हालांकि कुछ प्रोटोकॉल में, सुई को आईवीसी20 के लिए शल्य चिकित्सा से भी जोड़ा जाता है। यह बताया गया है कि आईवीसी सम्मिलन के साथ परफ्यूजन के परिणामस्वरूप पोर्टल शिरा25 की तुलना में कम व्यवहार्य प्राथमिक हेपेटोसाइट्स हुए। हालांकि, वर्तमान प्रोटोकॉल में, हमने सफलतापूर्वक आईवीसी सम्मिलन का उपयोग किया, और अलग-थलग प्राथमिक हेपेटोसाइट व्यवहार्यता (>अनिमित स्थितियों में 96%), निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार ट्रिपैन ब्लू स्टेनिंग के साथ मापा गया) उतना ही उच्च था, यदि अधिक नहीं, तो अन्य प्रोटोकॉल के रूप में (प्रोटोकॉल और शर्तों के आधार पर 80% और 96% के बीच भिन्न होता है2,22,23,24)।

परफ्यूजन चरण के लिए दो उद्देश्य हैं: जिगर के लोब से रक्त को बाहर निकालना और प्राथमिक हेपेटोसाइट्स को जारी करने के लिए जिगर को पचाना। इन उद्देश्यों को प्राप्त करने के लिए, कम से कम दो बफर का उपयोग किया जाना चाहिए, एक रक्त प्रवाह (फ्लक्स बफर) के लिए, और एक पाचन (पाचन बफर) के लिए। अधिकांश प्रोटोकॉल एचबीएसएस-आधारित फ्लक्स बफर तैयार करते हैं और पाचन बफर के रूप में पाचन के लिए सक्षम बनाने के लिए भीतर कोलेजनेज जोड़ते हैं। इन बफ़र्स की तैयारी समय लेने वाली है, और बफ़र्स कुछ नाजुक गुणों में थोड़ा भिन्न हो सकते हैं, जैसे पीएच, बैच से बैच तक, इसलिए बिन बुलाए चर पेश करते हैं। इस पर विचार करते हुए, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बफ़र्स का उपयोग इन चरों को कम करते हुए मूल्यवान श्रम और समय बचाता है। गिबको ने वयस्क चूहों से प्राथमिक हेपेटोसाइट अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल विकसितकिया, जो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लिवर परफ्यूजन माध्यम (फ्लक्स बफर के रूप में) और यकृत पाचन माध्यम (पाचन बफर के रूप में) के उपयोग के आधार पर है। माउस और चूहा, कृन्तकों के रूप में, शरीर के गुणों में उच्च समानताएं साझा करते हैं; एक माउस प्राथमिक हेपेटोसाइट अलगाव में इन दो चूहे-अनुकूलित बफ़र्स को एकीकृत कर सकता है। वास्तव में, Gonçalves एट अल. 24, इन बफ़र्स के साथ विच्छेदित जिगर लोब के छिड़काव को सफलतापूर्वक अंजाम दिया, जिससे विवो में यकृत परफ्यूजन में उनके उपयोग का वादा किया गया। यहां हमने वर्तमान माउस प्राथमिक हेपेटोसाइट प्रोटोकॉल में लिवर परफ्यूजन मध्यम और यकृत पाचन माध्यम का सफलतापूर्वक परीक्षण किया, जिसने उच्च गुणवत्ता वाले व्यवहार्य प्राथमिक हेपेटोसाइट्स (चित्रा 3 और चित्रा 4) को उत्पन्न किया।

परफ्यूजन बफर का तापमान यह निर्धारित करता है कि प्राथमिक हेपेटोसाइट्स अलगाव से कितनी अच्छी तरह जीवित रहते हैं। यदि तापमान बहुत अधिक है, तो पाचन बफर के भीतर कोलेजनेस ने गतिविधि को कम कर दिया हो सकता है; यदि बहुत कम है, तो प्राथमिक हेपेटोसाइट्स को ठंड के झटके का सामना करना पड़ सकता है, जिससे संभावित समझौता अलगाव उपज हो सकती है। बफर परफ्यूजन ट्यूबिंग के माध्यम से प्रवाह करने में लगने वाला समय भी बफर के तापमान को निर्धारित करता है जब यह जिगर तक पहुंचता है। पिछले प्रोटोकॉल में, 40 डिग्री सेल्सियस2 या 42 डिग्री सेल्सियस21 पानी के स्नान का उपयोग किया गया था। यह तापमान प्रयोगशाला की स्थितियों के आधार पर परिवर्तन के अधीन हो सकता है, जैसे पर्यावरण का तापमान, परफ्यूजन ट्यूब की लंबाई, और पेरिस्टाल्टिक पंप का प्रकार। वर्तमान प्रोटोकॉल में, परीक्षण के कई बार बाद, हमने बफर को गर्म करने के लिए पानी के स्नान के तापमान को 45 डिग्री सेल्सियस होने के लिए अनुकूलित किया।

पृथक प्राथमिक हेपेटोसाइट्स की शुद्धता बाद के प्रयोगों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है, क्योंकि शुद्धता अनुपात जितना अधिक होता है, उतना ही कम संभव हस्तक्षेप होता है। यद्यपि यकृत मुख्य रूप से हेपेटोसाइट्स से बना होता है, जो द्रव्यमान27 द्वारा 60% -80% के लिए लेखांकन करता है, विभिन्न प्रकार की अन्य कोशिकाएं भी मौजूद होती हैं, जैसे प्रतिरक्षा कोशिकाएं, ताराकार कोशिकाएं और एंडोथेलियल कोशिकाएं, जो यकृत प्रतिरक्षाविज्ञानी गतिविधियों के लिए महत्वपूर्ण हैं। इन कोशिकाओं में से प्रत्येक बाद में प्रयोगों में एक संभावित हस्तक्षेप पोस्ट कर सकताहै 28. उदाहरण के लिए, जिगर में ताराकार कोशिकाएं भी रोगज़नक़ आक्रमणों और जिगर की चोटों का जवाब देती हैं, जिसमें निशान गठन29 शामिल होता है। संख्याओं में, कुल यकृत कोशिका आबादी का 5% -8% ताराकार कोशिकाओं30 द्वारा योगदान दिया जाता है। आम तौर पर, ताराकार कोशिकाएं क्विसेंस में होती हैं, लेकिन तनाव मौजूद होने पर इस स्थिति को तोड़ा जा सकता है। इसलिए, ताराकार सेल गतिविधियों को अलगाव या बाद के उपचार के दौरान पेश किए गए तनावों से ट्रिगर किया जा सकता है यदि इनमें से कुछ कोशिकाएं अंतिम पृथक प्राथमिक हेपेटोसाइट पूल में रहती हैं। अन्य प्रकार की कोशिकाएं भी यकृत कोशिका आबादी के काफी हिस्से में योगदान करती हैं, जैसे यकृत ज्यावक्रीय एंडोथेलियल कोशिकाएं (एलएसईसी), कुल यकृत कोशिका आबादी के 20% के लिए लेखांकन। इन कोशिकाओं की उपस्थिति को कैसे खत्म किया जाए, यह प्राथमिक हेपेटोसाइट अलगाव प्रक्रिया में एक पेचीदा हिस्सा रहा है। इसलिए, शुद्धिकरण प्राथमिक हेपेटोसाइट अलगाव में एक महत्वपूर्ण हिस्सा है, जो आमतौर पर विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के बीच वजन और आकार के अंतर का लाभ उठाता है। सेंट्रीफ्यूज गति और / या शुद्धिकरण बफर को अनुकूलित करके, प्राथमिक हेपेटोसाइट्स को ट्यूब के नीचे तक गोली मार दी जा सकती है।

मृत कोशिकाओं से जीवित कोशिकाओं को अलग करना स्वस्थ प्राथमिक हेपेटोसाइट्स और सटीक सेल गिनती प्राप्त करने में भी महत्वपूर्ण है। आमतौर पर, सेल संख्या की गिनती शुद्धिकरण के बाद आवश्यक है क्योंकि कई प्रयोगों के परिणाम सेल संगम परिवर्तनों के रूप में भिन्न होते हैं। ग्रेडिएंट सेंट्रीफ्यूज अभिकर्मकों का उपयोग इस चरण में इस मिशन को पूरा करने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि परकोल। सेंट्रीफ्यूज छर्रों में Percoll का 36% -40% जीवित कोशिकाओं के नीचे रहता है और मृत कोशिकाओं को supernatant में रखता है। हमने वर्तमान प्रोटोकॉल में गैर-प्राथमिक हेपेटोसाइट सेल आबादी को कम करने के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन गति और समय को सफलतापूर्वक अनुकूलित किया। सेल प्रकार-विशिष्ट मार्करों का उपयोग यहां अलग-थलग प्राथमिक हेपेटोसाइट्स की शुद्धता का परीक्षण करने के लिए किया गया था, अन्य प्रोटोकॉल की तरह। यहां उपयोग किए जाने वाले हेपेटोसाइट मार्करों में टीटीआर2, सीडी 9524,32, एएसजीआर 133 और एएसजीआर 234 थे। अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए मार्करों में CD45 (प्रतिरक्षा सेल मार्कर), COL1A1 (ताराकार सेल मार्कर), TIE2 (एंडोथेलियल सेल मार्कर) 2,35 शामिल हैं। इन मार्करों के साथ, वर्तमान प्रोटोकॉल के साथ अलग किए गए प्राथमिक हेपेटोसाइट्स ने उच्च स्तर की शुद्धता (चित्रा 4) दिखाई, जो पिछले प्रोटोकॉल2,24 के बराबर है।

परफ्यूजन के दौरान, पाचन बफर में कोलेजेनेस बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स के भीतर कोलेजन को तोड़कर कोशिकाओं के बीच लगाव को ढीला करता है। इससे चढ़ाना के दौरान कोशिका प्राप्ति में कठिनाई होती है। पिछले प्रोटोकॉल के अधिकांश को प्राथमिक हेपेटोसाइट्स के बेहतर लगाव के लिए कोलेजन2,22 या जिलेटिन 24 के साथ प्लेटों की पूर्व-कोटिंग की आवश्यकता / सिफारिश करते हैं। हमारे ज्ञान के लिए, जबकि सलेम एट अल। 21 और ली एट अल। 20 ने इस चरण पर चर्चा नहीं की, इस अध्ययन में मूल्यांकन किए गए अन्य प्रोटोकॉल ने स्पष्ट रूप से कहा / पूर्व-लेपित प्लेटों के उपयोग की सिफारिश की 2,22,23,24। वर्तमान प्रोटोकॉल में, हमने पाया कि कुछ प्रकार की प्लेटों के लिए प्लेट कोटिंग की आवश्यकता नहीं थी। हालांकि हम सुनिश्चित नहीं हैं कि क्या यह इसलिए था क्योंकि विभिन्न प्रकार की प्लेटें, खासकर यदि वे विभिन्न निर्माताओं से हैं, तो अलग-अलग सतह चिकनाई है, और क्या यह विविध चिकनाई, यदि कभी मौजूद है, प्राथमिक हेपेटोसाइट अनुलग्नक में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है, तो यह ध्यान रखना फायदेमंद है ताकि एक और कदम (प्लेट-कोटिंग) को प्रभावकारिता के लिए छोड़ दिया जा सके। यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि यह प्रोटोकॉल टर्मिनल रूप से विभेदित का एक महत्वपूर्ण अनुपात उत्पन्न करता है, उदाहरण के लिए, द्विगुणित हेपेटोसाइट्स, मोनोन्यूक्लियर हेपेटोसाइट्स के साथ, विवो हेपेटिक साइनसॉइड के समान।

इस अध्ययन में, पिछले प्राथमिक हेपेटोसाइट अलगाव प्रोटोकॉल के लाभों को जोड़ा गया था, और प्रक्रिया को जितना संभव हो उतना सरल बनाया गया था, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मकों का उपयोग करके और अनावश्यक चरणों को समाप्त करना। सेंट्रीफ्यूजेशन चरणों को सफलतापूर्वक दो तक कम कर दिया गया था, जो कि हमारे ज्ञान के लिए, प्रकाशित प्रोटोकॉल में सबसे कम है। पृथक प्राथमिक हेपेटोसाइट्स की शुद्धता और बायोएक्टिविटी की पुष्टि करने के लिए, विभिन्न यकृत सेल मार्करों के स्तर का मूल्यांकन किया गया था, यह पुष्टि करते हुए कि वर्तमान प्रोटोकॉल प्राथमिक हेपेटोसाइट शुद्धता को बहुत बढ़ा सकता है और अन्य यकृत कोशिका आबादी को कम कर सकता है, जैसे कि प्रतिरक्षा कोशिकाएं, ताराकार कोशिकाएं और एंडोथेलियल कोशिकाएं। ASGR1, ASGR2, CD81, और TLR4 जैसे फार्मास्युटिकल बायोमाकर्स की गतिविधि को वर्तमान प्रोटोकॉल के साथ अलग किए गए प्राथमिक हेपेटोसाइट्स में अच्छी तरह से संरक्षित किया गया था, जिसमें इंसुलिन संवेदनशीलता और ग्लूकोज उत्पादन गतिविधि की भी पुष्टि की गई थी। इस प्रोटोकॉल की मुख्य सीमा खर्च है क्योंकि सभी अभिकर्मकों को दक्षता के लिए व्यावसायिक रूप से खरीदा गया था। हमने विशेष रूप से यह सत्यापित नहीं किया कि ग्लाइकोजनोसिस वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग करके अलग किए गए प्राथमिक हेपेटोसाइट्स में बरकरार था, और इसे संबंधित अध्ययनों के लिए आगे के शोध की आवश्यकता हो सकती है। इस प्रोटोकॉल में पिछले लोगों के समान परफ्यूजन चरण हैं, जैसे सलेम एट अल.21, सेवरग्निनी एट अल.2 और ली एट अल.20, और कोरेलोवा एट अल.23, आईवीसी सम्मिलन का उपयोग करके। उनके परफ्यूजन और पाचन बफर, जिन्हें तैयार करने के लिए अतिरिक्त श्रम की आवश्यकता हो सकती है, एंजाइम पाचन समय के थोड़ा संशोधन के साथ वर्तमान प्रोटोकॉल के साथ भी काम कर सकते हैं। इसलिए, वर्तमान प्रोटोकॉल के चरणों के साथ पूर्व प्रोटोकॉल के अभिकर्मकों का संयोजन भी फायदेमंद हो सकता है, दोनों समय और आर्थिक रूप से अनुकूल।

संक्षेप में, माउस जिगर से प्राथमिक हेपेटोसाइट अलगाव के लिए एक बेहतर समय और श्रम-कुशल प्रोटोकॉल विकसित किया गया था। यह प्रोटोकॉल पूरी तरह से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मकों का उपयोग करता है और माउस को विच्छेदन से लेकर प्राथमिक हेपेटोसाइट्स को चढ़ाना तक ~ 35 मिनट में पूरा किया जा सकता है, इस प्रकार प्राथमिक हेपेटोसाइट से संबंधित अध्ययनों के लिए एक उपयोगी तकनीक प्रदान करता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (अनुदान 5R01HD095512-02 से S.W.) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x PBS Gibco 10010023
10x HBSS Gibco 14065-056
12-well Plate FALCON 353043 Coating not required
6-well Plate FALCON 353046 Coating not required
anti-AKT Cell Signaling 2920S
Antibiotic Antimycotic Solution (100x), Stabilized Sigma-Aldrich A5955
anti-FOXO1 Cell Signaling 97635S
anti-GAPDH Cell Signaling 2118S
anti-p-AKT (S473) Cell Signaling 9271L
anti-PEPCK Santa Cruz SC-166778
anti-p-FOXO1 (S256) Cell Signaling 84192S
Cell Strainer, 70 µm CELLTREAT 229483
Closed IV Catheter, 24 Gauge 0.75 IN Becton Dickinson 383511
DMEM, no glucose, no glutamine, no phenol red ThermoFisher Scientific A1443001
EnzyChrom Glucose Assay Kit BioAssay Systems EBGL-100
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30071.03
Forskolin MilliporeSigma F3917-10MG
Glucagon Sigma-Aldrich G2044
Goat Anti-mouse IgG Secondary Antibody LI-COR 926-68070
Goat Anti-rabbit IgG Secondary Antibody LI-COR 926-32211
GraphPad Prism 8 GraphPad Software NA
Hepatocyte Wash Medium Gibco 17704-024
IBMX Cell Signaling 13630S
Insulin Lilly NDC 0002-8215-01
Ketamine HCL (100 mg/mL) Hospira Inc NDC 0409-2051-05
L-Glutamine Gibco 25030081
Liver Digest Medium Gibco 17703-034 Aliquot within tissue culture hood to 25 mL each in 50 mL tube, and keep in -20 °C freezer
Liver Perfusion Medium Gibco 17701-038
Pen Strep Gibco 15140122
Percoll GE Healthcare 17-0891-01
Peristaltic Pump Gilson Minipuls 2 Capable of pumping at 4 mL/min
Petri Dish Fisherbrand 08-757-12
Refrigerated Centrifuge Sorvall Legend RT Capable to centrifuge 50 mL tube at 4 °C
Sodium L-Lactate Sigma-Aldrich L7022
Sodium Pyruvate Gibco 11360070
Syringe Filter, PVDF 0.45 µm 30mm diameter CELLTREAT 229745
Syringe, 0.5 mL Becton Dickinson 329461
Syringe, 60 mL Becton Dickinson 309653
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061
Tube, 15 mL Corning 430052
Tube, 50 mL Corning 430290
Water Bath Tank Corning CLS6783 Or any water bath tank capable of heating up to 45 °C
William’s E Medium (GlutaMAX Supplement) Gibco 32551020
Xylozine (100 mg/mL) Vetone Anased LA NDC13985-704-10

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References

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Feng, M., Divall, S., Wu, S. An Improved Time- and Labor- Efficient Protocol for Mouse Primary Hepatocyte Isolation. J. Vis. Exp. (176), e61812, doi:10.3791/61812 (2021).

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