Summary
Les hépatocytes primaires sont un outil précieux pour étudier la réponse hépatique et le métabolisme in vitro. En utilisant des réactifs disponibles dans le commerce, un protocole amélioré d’efficacité en termes de temps et de main-d’œuvre pour l’isolement des hépatocytes primaires chez la souris a été développé.
Abstract
Les hépatocytes primaires sont largement utilisés dans la recherche in vitro sur le foie, en particulier dans les études sur le métabolisme du glucose. Une technique de base a été adaptée en fonction de différents besoins, tels que le temps, la main-d’œuvre, le coût et l’utilisation primaire des hépatocytes, ce qui a donné lieu à divers protocoles d’isolement des hépatocytes primaires. Cependant, les nombreuses étapes et les préparations de réactifs fastidieuses dans l’isolement des hépatocytes primaires sont des inconvénients majeurs pour l’efficacité. Après avoir comparé différents protocoles pour leurs avantages et leurs inconvénients, les avantages de chacun ont été combinés et un protocole d’isolement hépatocytaire primaire rapide et efficace a été formulé. En seulement ~ 35 minutes, ce protocole pourrait produire autant, sinon plus, d’hépatocytes primaires sains que d’autres protocoles. De plus, des expériences sur le métabolisme du glucose réalisées à l’aide des hépatocytes primaires isolés ont validé l’utilité de ce protocole dans les études in vitro sur le métabolisme hépatique. Nous avons également examiné et analysé de manière approfondie l’importance et le but de chaque étape de cette étude afin que les futurs chercheurs puissent optimiser davantage ce protocole en fonction des besoins.
Introduction
Le foie est l’un des organes les plus importants du corps des vertébrés en raison du rôle vital qu’il joue dans de nombreuses fonctions vitales telles que la digestion des aliments, la circulation sanguine et la désintoxication. L’utilisation de la culture in vitro d’hépatocytes primaires de souris est de plus en plus populaire dans les études sur le métabolisme des glucides et le carcinome hépatique. Par conséquent, il est important de développer une méthode pratique pour l’isolement des hépatocytes primaires de souris tout en maintenant sa fonction physiologique innée. En raison de sa fonction de plaque tournante du métabolisme du glucose, le foie est également au cœur de la production et du stockage du glucose1. Les expériences avec des hépatocytes primaires in vitro sont indispensables à la plupart des études sur le métabolisme du glucose. Par conséquent, pendant des années, divers groupes de recherche ont développé des protocoles pour l’isolement des hépatocytes primaires chez la souris.
La procédure générale d’isolement des hépatocytes de souris consiste d’abord à rincer le sang dans le foie avec un liquide isosmotique tel qu’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ou la solution saline équilibrée de Hanks (HBSS), puis à utiliser une solution contenant de la collagénase pour dissocier les hépatocytes. Ces protocoles partagent une procédure générale, mais diffèrent par des réactifs et des étapes en fonction de différents besoins. Cependant, la préparation des réactifs requis et l’exécution des étapes d’isolement prennent du temps. Lors de l’élaboration du protocole actuel, l’efficacité a été une priorité, avec tous les réactifs prêts à l’emploi et disponibles sur le marché, et le moins d’étapes possible. L’objectif global de ce protocole est de fournir une méthode rapide et efficace en main-d’œuvre pour isoler les hépatocytes primaires de la souris, sans compromettre la pureté et la viabilité des hépatocytes primaires isolés.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toutes les procédures ont été approuvées par le Johns Hopkins Animal Care and Use Committee. Des souris femelles C57BL/6 (âgées de 8 semaines) ont été utilisées dans cette étude.
1. Préparation :
- Mélanger William’s E Medium (GlutaMAX Supplement) avec 10% FBS et 1% de solution antibiotique-antimycotique pour faire le milieu de culture.
- Filtrer 25 mL de milieu collagénase-dispase (p. ex. milieu de digestion du foie) à l’aide d’un filtre à seringue de 0,45 μm pour éliminer les débris de particules.
- Réchauffer 50 mL de H2O (ddH2O) double distillé, 35 mL de milieu de perfusion (p. ex. milieu de perfusion hépatique) (ou 50 mL pour la première fois en utilisant ce protocole) et 25 mL de milieu filtré à la collagénase-dispase dans un bain-marie à 45 °C pendant 30 min.
- Dans une hotte de culture tissulaire stérile, mélanger 2 mL de 10x HBSS et 18 mL de Percoll dans un tube de 50 mL pour obtenir 20 mL 1x Percoll-HBSS et garder sur la glace ou 4 °C.
REMARQUE: 1x Percoll-HBSS peut être conservé à 4 °C pendant au moins 6 mois. - Dans une cagoule de culture tissulaire stérile, versez 30 mL de milieu de lavage (p. ex. milieu de lavage des hépatocytes) dans une boîte de Pétri propre et conservez-la sur la glace.
- Immergez le tube de pompage dans l’eau d’un bain-marie à 45 °C. Les résultats sont plus fiables si la température ambiante est de 25 °C.
- Préparer 2 mL de 1x anesthésiques en mélangeant 225 μL de Kétamine HCL, 93,75 μL de Xylazine et 1681 μL de 1x PBS.
- Anesthésiez une souris à l’aide d’une méthode approuvée. Ici, la souris a été injectée par voie intrapéritonéale avec 150 μL de 1x anesthésiques. Effectuer les tests de perte de réflexes tels que la réaction au pincement des orteils pour assurer une anesthésie complète.
- Fixez la souris sur le dos sur le coussinet de dissection par quatre membres, en épinglant ou en utilisant du ruban adhésif étanche ou d’autres méthodes approuvées par le Comité des soins et de l’utilisation des animaux de l’établissement (ou des équivalents).
- Préparez des pinces stérilisées et des ciseaux pour la dissection. Pour éviter toute contamination possible, effectuez toutes les étapes à l’intérieur d’une hotte stérile.
2. Procédure :
- À l’aide d’une pompe péristaltique, commencez à pomper du ddH2O réchauffé à une vitesse de 4 mL/min pendant 5 min. Remplacez le tube de pompage de l’eau par un milieu de perfusion réchauffé.
- Désinfectez l’abdomen de la souris anesthésiée avec 70% d’EtOH et coupez-le avec un ciseau pour exposer le foie, la veine porte et la veine cave inférieure (IVC).
- Arrêtez la pompe péristaltique. Insérez un cathéter de 24 G (p. ex., cathéter IV fermé, 24 G, 0,75 PO) dans la CIV. Commencez à pomper et coupez la veine porte ouverte.
- Continuez à pomper jusqu’à ce que le liquide évacué soit clair (environ 3-5 min). Appuyez sur la veine porte toutes les minutes pour laisser le liquide atteindre tous les coins du foie. Veillez à ne pas laisser les bulles d’air pénétrer dans l’IVC.
REMARQUE: Cette étape consiste à éliminer autant de sang que possible du foie. - Changer le tube de pompage du milieu de perfusion au milieu collagénase-dispase. Continuez à pomper jusqu’à ce que les 25 mL du milieu collagénase-dispase soient épuisés pendant l’étape 2.6.
- Appuyez sur la veine porte toutes les minutes pour laisser le liquide atteindre tous les coins du foie.
REMARQUE: À ce stade, la perte complète de sang est fatale à la souris. La mort de la souris peut être confirmée par un manque de rythme cardiaque après l’expérience. Jetez la carcasse conformément aux politiques de l’établissement. - Isolez tout le foie sans vésicule biliaire dans le milieu de lavage de 30 ml dans la boîte de Pétri sur de la glace.
- Déchirez-le en morceaux avec des pinces pour libérer les hépatocytes primaires en solution. Cette étape transformerait le milieu de lavage en une solution trouble pleine d’hépatocytes primaires libérés et de petits morceaux de foie.
- Filtrer la solution trouble à l’étape 2.8 à travers une passoire cellulaire de 70 μm dans le Percoll-HBSS de 20 mL 1x dans un tube de 50 mL sur glace. Mélanger en inversant le tube 20 fois.
- Centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 °C.
- Dans la hotte de culture tissulaire, aspirez le surnageant. Laver la pastille avec 30 mL de milieu de lavage froid.
- Centrifuger à 50 x g pendant 5 min à 4 °C.
- Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 25 mL du milieu de culture (ou d’autres volumes appropriés) dans la hotte de culture tissulaire.
- Comptez le numéro de cellule et plaquez les cellules sur les plaques de culture souhaitées selon la conception expérimentale.
REMARQUE: Les hépatocytes primaires correctement isolés d’une souris de 8 semaines sont généralement suffisants pour être plaqués sur quatre plaques de 6 puits ou quatre plaques de 12 puits.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Afin de tester l’efficacité, le protocole actuel d’isolement des hépatocytes primaires a été réalisé sur des souris femelles C57BL/6 âgées de 8 semaines. La fixation et la pureté des hépatocytes primaires isolés ont été testées. L’isolement hépatocytaire primaire est utilisé pour une grande variété d’expériences sur la physiologie du foie, telles que les effets des médicaments hépatiques et le métabolisme du glucose, l’activité des biomarqueurspharmaceutiques 2, la sensibilité à l’insuline et la production de glucose. Par conséquent, les activités des hépatocytes primaires isolés avec ce protocole ont été testées dans les expériences suivantes.
Le revêtement n’était pas nécessaire pour la fixation des hépatocytes primaires dans le présent protocole
Les hépatocytes primaires isolés ont été plaqués à 5 x 105 cellules/puits sur une plaque de 6 puits. Après 1 h, un attachement ferme a été observé et les hépatocytes primaires se sont complètement dilatés 12 h après le placage (Figure 3). Cela indiquait que 12 heures après le placage, les cellules étaient prêtes à être utilisées pour des expériences. Sur la base de la morphologie du noyau des hépatocytes de souris dans le foie, les hépatocytes mononucléaires ont été enrichis aux bordures, tandis que les hépatocytes binucléaires / polynucléaires, une signature de différenciation terminale, se trouvaient au milieu 3,4. Une quantité importante de cellules imagées présentait une morphologie typique à double noyau (diploïde), indiquant le succès de l’isolement et de la purification des hépatocytes primaires vivants. Cela indique également que le revêtement de collagène n’est pas une exigence pour la fixation primaire des hépatocytes avec ce protocole.
La pureté a été enrichie dans la population d’hépatocytes primaires isolés
Divers marqueurs génétiques spécifiques au type cellulaire ont été utilisés dans les protocoles précédents pour vérifier la pureté des hépatocytes primaires isolés (tableau 1). TTR (Transthyrétine), CD95 (Cluster de différenciation 95, également connu sous le nom de Fas), ASGR1 (Asialoglycoprotein receptor 1) et ASGR2 sont des marqueurs des hépatocytes. Après isolement, les niveaux d’ARNm de ces marqueurs hépatocytaires ont été significativement augmentés, par rapport à l’ensemble du foie (Figure 4A-D,H).
Ce protocole a également considérablement réduit l’interférence d’autres cellules hépatiques. La présence de cellules immunitaires, de cellules stellaires et de cellules endothéliales était plus faible, comme en témoigne la forte diminution des taux d’ARNm de CD45 (marqueur de cellules immunitaires), de COL1A1 (collagène, type I, alpha 1, marqueur de cellules stellaires) et de TIE2 (kinase de cellules endothéliales tuniques, marqueur de cellules endothéliales), par rapport à l’ensemble du foie (figure 4E-H ). Ceux-ci suggèrent que ce protocole pourrait purifier la population d’hépatocytes primaires des cellules hépatiques et ainsi réduire l’interférence possible d’autres types de cellules dans les expériences.
L’activité des biomarqueurs pharmaceutiques a été préservée
Les biomarqueurs sur les hépatocytes ont été largement utilisés pour le ciblage et l’administration de médicaments. La préservation de l’activité des biomarqueurs pharmaceutiques est donc un point clé dans l’isolement des hépatocytes primaires et constitue une norme pour tester l’utilité de l’isolement des hépatocytesprimaires 2. Les marqueurs hépatocytaires ASGR1 et ASGR2 sont utilisés de cette manière2. Nous avons d’abord testé le niveau d’expression temporelle de ces deux marqueurs avant et après le placage primaire des hépatocytes. Après le placage, leur taux d’ARNm diminuait considérablement avec le temps, mais les niveaux restaient considérables par rapport à l’ensemble du foie jusqu’au point de temps de 12 heures après le placage, en particulier pour l’ASGR1 (Figure 5A, B). La tendance à l’expression était conforme à celle d’un rapport précédent2 et indiquait une santé comparable des hépatocytes primaires. Divers agents pathogènes ciblent CD81, une protéine liée à la membrane des hépatocytes, pour faciliter leur entrée dans les cellules et l’infection, comme le virusde l’hépatite 5, Plasmodium falciparum et Plasmodium yoelii6. D’autres protéines situées dans la membrane des hépatocytes, comme TLR4 (récepteur de type Toll 4), sont également ciblées par des agents pathogènes et importantes pour la réponse immunitaire des hépatocytes7. Après placage, le niveau d’expression de CD81 était constant jusqu’à 48 h (Figure 5C). Le niveau d’expression de TLR4 a généralement augmenté, mais pas avant 48 h, lorsqu’il a atteint un niveau plus élevé qu’in vivo (Figure 5D). Ceux-ci suggèrent que les hépatocytes primaires isolés par ce protocole peuvent également être utilisés pour les études CD81 et TLR4 dans au moins 48 heures après le placage. Ensemble, ces résultats indiquent que les hépatocytes primaires isolés sont valables pour une utilisation dans des études liées aux biomarqueurs pharmaceutiques. Il convient de noter que les niveaux d’ARN et de protéines peuvent être incohérents en raison des influences des activités post-transcriptionnelles telles que la migration de l’ARN induite par les peptides de signal, la modification post-traductionnelle et / ou la dégradation des protéines. Par conséquent, la vérification du niveau de protéines et de la bioactivité des biomarqueurs pharmaceutiques identifiés par l’ARNm peut être nécessaire si le paradigme expérimental l’exige.
Les hépatocytes primaires isolés étaient sensibles à l’insuline
La performance des hépatocytes primaires dans les expériences de métabolisme du glucose a également été analysée. L’insuline, une hormone jouant un rôle central dans le métabolisme du glucose, diminue le taux de glucose, favorisant l’absorption et le stockage hépatiques du glucose grâce à la phosphorylation AKT et FOXO1 (Boîte à fourche O1). Par conséquent, un test de sensibilité à l’insuline a été effectué avec des hépatocytes primaires isolés. Après 16 h, les cellules ont été affamées pendant 3 heures, avec un milieu sans sérum. Au dernier 0,5 h de famine, 100 nM d’insuline ont été administrés au milieu de culture. Comme le montre la figure 6A-C, l’insuline a significativement favorisé la phosphorylation de l’AKT à Ser473 et du FOXO1 à Ser256, indiquant la sensibilité des hépatocytes primaires à l’insuline. Cela suggère que les hépatocytes primaires isolés du présent protocole sont utiles dans les études sur le métabolisme de l’insuline et du glucose.
Des hépatocytes primaires isolés étaient capables de produire du glucose
Non seulement ils sont un centre de stockage du glucose, mais les hépatocytes sont également responsables de la production de glucose. Pour tester si les hépatocytes primaires que nous avons isolés sont utiles dans les études de production de glucose, les cellules ont été affamées pendant 10 heures en présence de glucagon pour stimuler la production de glucose. Le milieu de famine a ensuite été recueilli pour le dosage du glucose, tandis que les cellules ont été récoltées pour le transfert western. La phosphoénolpyruvate carboxykinase (PEPCK) est un composant essentiel de la production de glucose hépatique, contrôlant son taux8. Le niveau de protéines de PEPCK a été significativement augmenté après le traitement au glucagon, ce qui suggère que la voie de production de glucose a été activée (Figure 7A, B). Cette activation a été confirmée par une augmentation de la production de glucose (figure 7C). Ce phénomène a également été confirmé avec d’autres stimulateurs de production de glucose comme la forskoline plus IBMX (Figure 7A-C). Cependant, en raison de la limitation de cette expérience, nous n’avons pas pu vérifier si la production de glucose était exclusive via la gluconéogenèse ou s’il existe également un composant de la glycogénolyse.
Figure 1 : Configuration du banc. (A) Configuration du banc pour l’isolement primaire des hépatocytes. (B) La configuration du banc caricatural pour l’isolement primaire des hépatocytes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Dissection de souris, perfusion et purification primaire des hépatocytes. (A) La souris disséquée, avec des flèches pointant vers le foie, la CIV et la veine porte. (B) Insertion du cathéter dans la CIV. (C) Pression sur la veine porte provoquant un élargissement et une raideur des pentes hépatiques, indiquant une perfusion réussie. (D) Lopes hépatiques ramollies après perfusion, indiquant le succès de la digestion de la collagénase. (E) La position de la vésicule biliaire dans le foie isolé (flèche pointant vers la vésicule biliaire). (F) Ablation de la vésicule biliaire. (G) Foie déchiré dans un milieu de lavage hépatocytaire. (H) Mélange de 1x Percoll-HBSS avec un hépatocyte primaire filtré avant centrifugeuse. (I, J) pastille d’hépatocyte primaire après centrifugeuse. (K) Remise en suspension primaire des hépatocytes dans le milieu de lavage des hépatocytes. (L, M) Pastille d’hépatocyte primaire formée dans le milieu de lavage des hépatocytes après la centrifugeuse. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Hépatocytes primaires après placage. Les images ont été prises après (A)1 h, (B, C) 12 h, (D) 24 h, (E) 36 h, (F) 48 h, (G) 72 h et (H) 96 h de placage hépatocytaire primaire. Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Amélioration de la pureté des hépatocytes primaires après isolement. L’ARN a été isolé avant (à partir de l’ensemble du foie) et après (à partir d’hépatocytes primaires isolés) l’isolement primaire des hépatocytes, suivi d’une PCR à transcription inverse, selon un protocole précédent9. La pureté des hépatocytes primaires a été évaluée par PCR en temps réel avec des amorces pour les marqueurs hépatocytaires (A) TTR, (B) CD95, (C) ASGR1 et (D) ASGR2, ainsi qu’avec le marqueur cellulaire immunitaire (E) CD45, (F) marqueur cellulaire stellaire COL1A1 et (G) marqueur cellulaire endothélial TIE2. (H) Une carte thermique a été générée pour les changements d’expression des marqueurs de type cellulaire avant et après l’isolement primaire des hépatocytes. La GAPDH (Glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase) a été utilisée comme contrôle interne. Les amorces utilisées ici étaient pour les gènes (les séquences d’amorces sont dans le tableau 2. Les références de séquence sont citées ici) : TTR10; CD9511; ASGR112; ASGR213; CD4514; COL1A115; TIE216; GAPDH17. Les graphiques et les cartes thermiques ont été générés avec GraphPad Prism 8. La barre d’erreur indique l’écart-type, et la signification du test t à deux queues non appariées (puisque les échantillons primaires d’hépatocytes et de foie entier n’ont pas été appariés parce que ce protocole exige un foie intact pour commencer) est indiquée par des astérisques (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001). N=7. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Expression des biomarqueurs pharmaceutiques. L’ARN a été isolé de l’ensemble du foie et de l’hépatocyte primaire après le placage, suivi d’une PCR à transcription inverse. L’expression des biomarqueurs pharmaceutiques a été évaluée par PCR en temps réel avec des amorces pour (A) ASGR1, (B) ASGR2, (C) CD81 et (D) TLR4. Le GAPDH a été utilisé comme contrôle interne. Les nouveaux amorces utilisés ici étaient pour les gènes (les séquences d’amorces sont dans le tableau 2. Les références de séquence sont citées ici) : CD8118; TLR419. Les graphiques ont été générés avec GraphPad Prism 8. N = 5. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Sensibilité à l’insuline préservée après isolement hépatocytaire primaire. (A) Transfert western de p-AKT (S473), AKT, p-FOXO1 (S256), FOXO1 et GAPDH après traitement à l’insuline. (B) p-AKT (S473)/AKT en densitométrie du transfert western. (C) p-FOXO1 (S256)/FOXO1 en densitométrie du transfert western. Le test de sensibilité à l’insuline a été effectué 16 h après le placage primaire des hépatocytes. Les hépatocytes primaires ont été affamés pendant 3 h dans le milieu E de William (supplément GlutaMAX) sans FBS mais avec une solution antibiotique-antimycotique à 1% et avec un traitement à l’insuline de 100 nM au cours des 30 dernières minutes, avant d’être récoltés pour la lyse des protéines avec 1x tampon RIPA. Les graphiques ont été générés avec GraphPad Prism 8. L’imagerie par transfert Western a été réalisée avec LI-COR Odyssey CLx. La barre d’erreur indique l’écart type et la signification du test t apparié à deux queues est indiquée par des astérisques (* p < 0,05; ** p < 0,01). N = 4. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Essai de production de glucose. (A) Transfert western de PEPCK et de GAPDH après traitement au glucagon ou à la forskoline + IBMX pendant 10 h. (B) Densitométrie du niveau de protéine PEPCK par rapport au GAPDH après un traitement au glucagon ou à la forskoline + IBMX pendant 10 h. (C) Taux de glucose par rapport au niveau de protéines après un traitement au glucagon ou à la forskoline + IBMX pendant 10 h. Le test de production de glucose a été effectué 16 h après le placage primaire des hépatocytes. Les hépatocytes primaires ont été affamés pendant 10 h dans le DMEM sans glucose et sans phénol rouge (ajouté avec 2 mM de L-Glutamine, 2 mM de pyruvate de sodium, 20 mM de L-Lactate de sodium, 1 % de streptocoque de stylo), avec 50 nM de glucagon ou 20 μM de forskoline et 200 μM d’IBMX. Le milieu a été récolté pour la mesure de la concentration de glucose avec glucose Assay Kit, tandis que les protéines ont été récoltées pour le transfert western. L’imagerie par transfert Western a été réalisée avec LI-COR Odyssey CLx. La barre d’erreur indique l’écart type, et la signification du test t apparié à deux queues est indiquée par des astérisques (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001). N = 4. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Temps de centrifugation | Enlèvement de la cage thoracique | Tampons de perfusion auto-fabriqués | Nœud chirurgical | Chauffage de la lampe | Revêtement de plaque | Quantité de cellules isolées/souris | Gradient Centrifugation | Gènes marqueurs de pureté | |
| Protocole actuel | 2 | Non | Non | Non | Non | Non | 2,5–4 x 107 | Oui | TTR, CD95, ASGR1, ASGR2, CD45, COL1A1, TIE2 |
| Severgnini et al.2. | 4 | Oui | Oui | Oui | Oui | Oui | 1,8–2 x 107 | Non | TTR, CD45, COL1A1, TIE2 |
| Gonçalves et al.24. | 5 ou 6 | Non | Non | Non | Non | Oui | 1–3 x 106 | Oui | CD45, CD95 |
| Li et al.20. | 4 ou 5 | Non | Oui | Oui | Non | Non mentionné | 1–4 x 107 | Non | N/A |
| Salem et al.21. | 3 | Non | Oui | Non | Non | Non mentionné | 2 x 107 | Oui | N/A |
| Cabral et coll.22. | 3 ou 6 (avec centrifugation en dégradé) | Non | Oui | Oui | Non | Oui/Recommandé | N/A | Optionnel | S.O. (Pureté évaluée par microscopie optique) |
| Korelova et al.23. | 3 | Non | Oui | Oui | Non | Oui | N/A | Oui | N/A |
Tableau 1 : Comparaison des protocoles hépatocytaires primaires.
| Amorce (avant) | Amorce (inverse) | Référence | ||
| TTR Forward 5'-3': AGCCCTTTGCCTCTGGGAAGAC | TTR Reverse 5'-3': TGCGATGGTGTAGTGGCGATGG | 10 | ||
| CD95 Forward 5'-3': ATGCACACTCTGCGATGAAG | CD95 Reverse 5'-3': CAGTGTTCACAGCCAGGAGA | 11 | ||
| ASGR1 Forward 5'-3': GAGTCGAAGCTGGAAAAACAG | ASGR1 Reverse 5'-3': CCTTCATACTCCACCCAGTTG | 12 | ||
| ASGR2 Forward 5'-3': CTACTGGTTTTCTCGGGATGG | ASGR2 Reverse 5'-3': CAAATATGAAACTGGCTCCTGTG | 13 | ||
| CD45 Forward 5'-3': GAACATGCTGCCAATGGTTCT | CD45 Reverse 5'-3': TGTCCCACATGACTCCTTTCC | 14 | ||
| COL1A1 Avant 5'-3': GAAGCACGTCTGGTTTGGA | COL1A1 Reverse 5'-3': ACTCGAACGGGAATCCATC | 15 | ||
| TIE2 Forward 5'-3': ATGTGGAAGTCGAGAGGCGAT | TIE2 Reverse 5'-3': CGAATAGCCATCCACTATTGTCC | 16 | ||
| GAPDH Forward 5'-3': CGACTTCAACAGCAACTCCCACTCTTCC | GAPDH Reverse 5'-3': TGGGTGGTCCAGGGTTTCTTACTCCTT | 17 | ||
| CD81 Forward 5'-3': CCAAGGCTGTGGTGAAGACTTTC | CD81 Reverse 5'-3': GGCTGTTCCTCAGTATGGTGGTAG | 18 | ||
| TLR4 Forward 5'-3': ACCTGGCTGGTTTACACGTC | TLR4 Reverse 5'-3': CTGCCAGAGACATTGCAGAA | 19 | ||
Tableau 2 : Liste des amorces : Amorces utilisées pour les gènes TTR, CD95, ASGR1, ASGR2, CD45, COL1A1, TIE2, GAPDH, CD81 et TLR4
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Divers protocoles d’isolement des hépatocytes primaires ont été développés. Ils ont également été optimisés et adaptés en fonction des différents besoins (tableau 1). Les protocoles d’isolement sont généralement composés de deux parties : la perfusion (y compris la digestion enzymatique) et la purification.
La perfusion peut être réalisée avec l’ensemble du foie in vivo 2,20,21,22,23 ou avec des lobes hépatiques disséqués 24. La perfusion des lobes disséqués était généralement limitée aux lobes gauche et moyen pour une facilité technique. Théoriquement, la perfusion in vivo devrait produire plus d’hépatocytes primaires en raison de l’utilisation de l’ensemble du foie avec tous les lobes. Garder le foie en place pendant la perfusion peut également réduire la mort cellulaire puisque les hépatocytes in vivo peuvent être baignés dans du liquide, soit du sang ou des tampons de perfusion, à tout moment au cours de cette étape.
Le maintien de conditions stériles joue également un rôle important dans cette étape. Si la condition le permet, il est préférable de procéder à la perfusion dans une hotte propre. Tous les outils avec un contact direct avec les tissus doivent être stériles, ce qui peut être réalisé par autoclave. Afin d’éviter toute contamination par des bactéries et des champignons, une solution antibiotique-antimycotique a été ajoutée dans le milieu de culture.
La CIV et la veine porte sont deux vaisseaux principaux reliant le foie à d’autres organes. La plupart des protocoles utilisent l’une ou l’autre de ces veines pour insérer des aiguilles pour la perfusion: IVC 2,20,21,23, veine porte22. La position de la veine porte est à un angle incliné, ce qui entraîne des difficultés à positionner et à stabiliser l’aiguille insérée. Une suture est donc généralement nécessaire pour attacher l’aiguille en place avec un nœud chirurgical, ce qui doit être fait très soigneusement car la veine est sujette à des dommages. Généralement, le diamètre de la veine porte est également plus petit que la CIV, ce qui complique l’insertion de l’aiguille. Compte tenu de cela, l’utilisation de la CIV peut être plus pratique, bien que dans certains protocoles, l’aiguille soit également nouée chirurgicalement à l’IVC20. Il a été rapporté que la perfusion par insertion de CIV entraînait des hépatocytes primaires moins viables que la veine porte25. Cependant, dans le présent protocole, nous avons utilisé avec succès l’insertion de CIV, et la viabilité hépatocytaire primaire isolée (>96% dans des conditions optimisées, mesurée avec la coloration Trypan Blue selon le protocole du fabricant) était aussi élevée, sinon plus, que les autres protocoles (varie entre 80% et 96% en fonction des protocoles et des conditions 2,22,23,24).
Il y a deux objectifs pour l’étape de perfusion: éliminer le sang des lobes du foie et digérer le foie pour libérer les hépatocytes primaires. Afin d’atteindre ces objectifs, au moins deux tampons doivent être utilisés, l’un pour la circulation sanguine (Tampon de flux) et l’autre pour la digestion (Tampon de digestion). La plupart des protocoles préparent un tampon de flux à base de HBSS et ajoutent de la collagénase à l’intérieur pour le rendre capable de digestion, en tant que tampon de digestion. La préparation de ces tampons prend beaucoup de temps, et les tampons peuvent varier légèrement dans certaines propriétés délicates, comme le pH, d’un lot à l’autre, introduisant ainsi des variables non invitées. Compte tenu de cela, l’utilisation de tampons disponibles dans le commerce permet d’économiser du travail et du temps précieux tout en minimisant ces variables. Gibco a développé un protocole pour l’isolement des hépatocytes primaires chez les rats adultes26, basé sur l’utilisation d’un milieu de perfusion hépatique disponible dans le commerce (comme tampon de flux) et d’un milieu de digestion hépatique (comme tampon de digestion). La souris et le rat, en tant que rongeurs, partagent de grandes similitudes dans les propriétés corporelles; on peut intégrer ces deux tampons optimisés pour le rat dans l’isolement des hépatocytes primaires de souris. En effet, Gonçalves et al. 24, a réalisé avec succès la perfusion de lobes hépatiques disséqués avec ces tampons, ce qui a permis de promettre leur utilisation dans la perfusion hépatique in vivo. Ici, nous avons testé avec succès le milieu de perfusion hépatique et le milieu de digestion hépatique dans le protocole actuel d’hépatocytes primaires de souris, qui ont donné des hépatocytes primaires viables de haute qualité (Figure 3 et Figure 4).
La température du tampon de perfusion détermine dans quelle mesure les hépatocytes primaires survivent à l’isolement. Si la température est trop élevée, la collagénase dans le tampon de digestion peut avoir une activité réduite; s’ils sont trop bas, les hépatocytes primaires peuvent subir un choc froid, ce qui peut compromettre le rendement de l’isolement. Le temps nécessaire à ce tampon pour s’écouler dans les tubes de perfusion détermine également la température du tampon lorsqu’il atteint le foie. Dans les protocoles précédents, un bain-marie à 40 °C2 ou42 °C 21 était utilisé. Cette température peut être sujette à changement en fonction des conditions de laboratoire, comme la température ambiante, la longueur du tube de perfusion et le type de pompe péristaltique. Dans le présent protocole, après plusieurs tests, nous avons optimisé la température du bain-marie à 45 °C pour réchauffer les tampons.
La pureté des hépatocytes primaires isolés joue un rôle important dans les expériences ultérieures, car plus le rapport de pureté est élevé, moins il y a d’interférences possibles. Bien que le foie soit principalement composé d’hépatocytes, représentant 60% à 80% en masse27, divers types d’autres cellules sont également présents, comme les cellules immunitaires, les cellules stellaires et les cellules endothéliales, qui sont importantes pour les activités immunologiques hépatiques. Chacune de ces cellules pourrait afficher une interférence potentielle dans des expériences ultérieures28. Par exemple, les cellules stellaires dans le foie répondent également aux invasions d’agents pathogènes et aux lésions hépatiques, impliquant la formation decicatrices 29. En chiffres, 5% à 8% de la population totale de cellules hépatiques est fournie par les cellules stellaires30. Normalement, les cellules stellaires sont en quiescence, mais cet état peut être brisé lorsque des stress sont présents. Par conséquent, les activités des cellules stellaires peuvent être déclenchées par des stress introduits pendant l’isolement ou le traitement ultérieur si certaines de ces cellules restent dans le pool final d’hépatocytes primaires isolés. D’autres types de cellules contribuent également à une partie considérable de la population de cellules hépatiques, comme les cellules endothéliales sinusoïdales du foie (CSL), représentant 20 % de la population totale de cellules hépatiques31. Comment éliminer la présence de ces cellules a été une partie déroutante dans le processus d’isolement des hépatocytes primaires. Par conséquent, la purification est un élément clé de l’isolement des hépatocytes primaires, qui tire généralement parti des différences de poids et de taille entre les différents types de cellules. En optimisant la vitesse de la centrifugeuse et/ou le tampon de purification, les hépatocytes primaires peuvent être granulés jusqu’au fond du tube.
La séparation des cellules vivantes des cellules mortes est également essentielle pour obtenir des hépatocytes primaires sains et un comptage précis des cellules. Habituellement, le comptage du nombre de cellules est un must après la purification, car les résultats de nombreuses expériences varient à mesure que la confluence cellulaire change. Les réactifs de centrifugeuse à gradient peuvent être utilisés dans cette étape pour remplir cette mission, comme Percoll. 36% à 40% de Percoll dans la centrifugeuse granule les cellules vivantes et maintient les cellules mortes en surnageant. Nous avons réussi à optimiser la vitesse et le temps de centrifugation pour réduire la population de cellules hépatocytaires non primaires dans le présent protocole. Des marqueurs spécifiques au type cellulaire ont été utilisés pour tester la pureté des hépatocytes primaires isolés ici, comme d’autres protocoles. Les marqueurs hépatocytaires utilisés ici étaient TTR2, CD95 24,32, ASGR133 et ASGR234. Les marqueurs pour d’autres types de cellules comprennent CD45 (marqueur de cellules immunitaires), COL1A1 (marqueur de cellules stellaires), TIE2 (marqueur de cellules endothéliales)2,35. Avec ces marqueurs, les hépatocytes primaires isolés avec le présent protocole ont montré un niveau élevé de pureté (Figure 4), comparable aux protocoles précédents 2,24.
Pendant la perfusion, la collagénase dans le tampon de digestion détend l’attachement entre les cellules en décomposant le collagène dans la matrice extracellulaire. Cela conduit à des difficultés dans l’obtention cellulaire pendant le placage. La plupart des protocoles précédents exigent / recommandent un pré-revêtement des plaques avec du collagène 2,22 ou de la gélatine24 pour une meilleure fixation des hépatocytes primaires. À notre connaissance, alors que Salem et al. 21 et Li et coll. 20 n’a pas discuté de cette étape, d’autres protocoles évalués dans cette étude ont clairement indiqué / recommandé l’utilisation de plaques pré-revêtues 2,22,23,24. Dans le présent protocole, nous avons constaté que le revêtement des plaques n’était pas requis pour les plaques de certains types. Bien que nous ne sachions pas si c’est parce que différents types de plaques, surtout si elles proviennent de différents fabricants, ont une douceur de surface différente, et si cette douceur variée, si jamais existe, joue un rôle important dans la fixation primaire des hépatocytes, il est bénéfique de noter afin qu’une autre étape (revêtement de plaque) puisse être sautée pour l’efficacité. Il est également important de noter que ce protocole génère une proportion importante d’hépatocytes diploïdes différenciés en phase terminale, par exemple, ainsi que des hépatocytes mononucléaires, similaires à la sinusoïde hépatique in vivo.
Dans cette étude, les avantages des protocoles d’isolement des hépatocytes primaires précédents ont été combinés et le processus a été simplifié autant que possible, en utilisant des réactifs disponibles dans le commerce et en éliminant les étapes inutiles. Les étapes de centrifugation ont été réduites avec succès à deux, ce qui est, à notre connaissance, le moins nombreux dans les protocoles publiés. Pour confirmer la pureté et la bioactivité des hépatocytes primaires isolés, le niveau de divers marqueurs cellulaires hépatiques a été évalué, confirmant que le présent protocole pourrait grandement améliorer la pureté des hépatocytes primaires et réduire d’autres populations de cellules hépatiques, telles que les cellules immunitaires, les cellules stellaires et les cellules endothéliales. L’activité des biomarqueurs pharmaceutiques comme ASGR1, ASGR2, CD81 et TLR4 a été bien préservée dans les hépatocytes primaires isolés avec le protocole actuel, qui avaient également confirmé la sensibilité à l’insuline et l’activité de production de glucose. La principale limite de ce protocole est la dépense puisque tous les réactifs ont été achetés commercialement pour plus d’efficacité. Nous n’avons pas spécifiquement vérifié que la glycogénose était intacte dans les hépatocytes primaires isolés à l’aide du présent protocole, ce qui pourrait nécessiter des recherches supplémentaires pour des études connexes. Ce protocole a des étapes de perfusion similaires aux précédentes, comme Salem et al.21, Severgnini et al.2 et Li et al.20, et Korelova et al.23, en utilisant l’insertion IVC. Leurs tampons de perfusion et de digestion, qui peuvent nécessiter un travail supplémentaire pour se préparer, peuvent également fonctionner avec le protocole actuel avec peu de modification du temps de digestion enzymatique. Par conséquent, la combinaison de réactifs de protocoles antérieurs avec des étapes du présent protocole peut également être bénéfique, à la fois rapide et économique.
En résumé, un protocole amélioré d’efficacité en termes de temps et de main-d’œuvre pour l’isolement primaire des hépatocytes du foie de souris a été développé. Ce protocole utilise entièrement des réactifs disponibles dans le commerce et peut être complété en environ 35 minutes, de la dissection de la souris au placage des hépatocytes primaires, fournissant ainsi une technique utile aux études primaires liées aux hépatocytes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (Subvention 5R01HD095512-02 à S.W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Gibco | 10010023 | |
| 10x HBSS | Gibco | 14065-056 | |
| 12-well Plate | FALCON | 353043 | Coating not required |
| 6-well Plate | FALCON | 353046 | Coating not required |
| anti-AKT | Cell Signaling | 2920S | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x), Stabilized | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| anti-FOXO1 | Cell Signaling | 97635S | |
| anti-GAPDH | Cell Signaling | 2118S | |
| anti-p-AKT (S473) | Cell Signaling | 9271L | |
| anti-PEPCK | Santa Cruz | SC-166778 | |
| anti-p-FOXO1 (S256) | Cell Signaling | 84192S | |
| Cell Strainer, 70 µm | CELLTREAT | 229483 | |
| Closed IV Catheter, 24 Gauge 0.75 IN | Becton Dickinson | 383511 | |
| DMEM, no glucose, no glutamine, no phenol red | ThermoFisher Scientific | A1443001 | |
| EnzyChrom Glucose Assay Kit | BioAssay Systems | EBGL-100 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
| Forskolin | MilliporeSigma | F3917-10MG | |
| Glucagon | Sigma-Aldrich | G2044 | |
| Goat Anti-mouse IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-68070 | |
| Goat Anti-rabbit IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-32211 | |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Software | NA | |
| Hepatocyte Wash Medium | Gibco | 17704-024 | |
| IBMX | Cell Signaling | 13630S | |
| Insulin | Lilly | NDC 0002-8215-01 | |
| Ketamine HCL (100 mg/mL) | Hospira Inc | NDC 0409-2051-05 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Liver Digest Medium | Gibco | 17703-034 | Aliquot within tissue culture hood to 25 mL each in 50 mL tube, and keep in -20 °C freezer |
| Liver Perfusion Medium | Gibco | 17701-038 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140122 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Peristaltic Pump | Gilson | Minipuls 2 | Capable of pumping at 4 mL/min |
| Petri Dish | Fisherbrand | 08-757-12 | |
| Refrigerated Centrifuge | Sorvall | Legend RT | Capable to centrifuge 50 mL tube at 4 °C |
| Sodium L-Lactate | Sigma-Aldrich | L7022 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| Syringe Filter, PVDF 0.45 µm 30mm diameter | CELLTREAT | 229745 | |
| Syringe, 0.5 mL | Becton Dickinson | 329461 | |
| Syringe, 60 mL | Becton Dickinson | 309653 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Tube, 15 mL | Corning | 430052 | |
| Tube, 50 mL | Corning | 430290 | |
| Water Bath Tank | Corning | CLS6783 | Or any water bath tank capable of heating up to 45 °C |
| William’s E Medium (GlutaMAX Supplement) | Gibco | 32551020 | |
| Xylozine (100 mg/mL) | Vetone Anased LA | NDC13985-704-10 |
References
- Han, H. S., Kang, G., Kim, J. S., Choi, B. H., Koo, S. H. Regulation of glucose metabolism from a liver-centric perspective. Experimental and Molecular Medicine. 48, 218 (2016).
- Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
- Guidotti, J. E., et al. Liver cell polyploidization: a pivotal role for binuclear hepatocytes. Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).
- Morales-Navarrete, H., et al. A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture. Elife. 4, 11214 (2015).
- Bruening, J., et al. Hepatitis C virus enters liver cells using the CD81 receptor complex proteins calpain-5 and CBLB. PLoS Pathogens. 14 (7), 1007111 (2018).
- Silvie, O., et al. Hepatocyte CD81 is required for Plasmodium falciparum and Plasmodium yoelii sporozoite infectivity. Nature Medicine. 9 (1), 93-96 (2003).
- Crispe, I. N.
- Liu, N. C., et al. Loss of TR4 orphan nuclear receptor reduces phosphoenolpyruvate carboxykinase-mediated gluconeogenesis. Diabetes. 56 (12), 2901-2909 (2007).
- Wang, Z., et al. Gonadotrope androgen receptor mediates pituitary responsiveness to hormones and androgen-induced subfertility. JCI Insight. 5 (17), 127817 (2019).
- Santos, S. D., et al. CSF transthyretin neuroprotection in a mouse model of brain ischemia. Journal of Neurochemistry. 115 (6), 1434-1444 (2010).
- Pinhu, L., et al. Overexpression of Fas and FasL is associated with infectious complications and severity of experimental severe acute pancreatitis by promoting apoptosis of lymphocytes. Inflammation. 37 (4), 1202-1212 (2014).
- Mi, Y., Lin, A., Fiete, D., Steirer, L., Baenziger, J. U. Modulation of mannose and asialoglycoprotein receptor expression determines glycoprotein hormone half-life at critical points in the reproductive cycle. Journal of Biological Chemistry. 289 (17), 12157-12167 (2014).
- Tanowitz, M., et al. Asialoglycoprotein receptor 1 mediates productive uptake of N-acetylgalactosamine-conjugated and unconjugated phosphorothioate antisense oligonucleotides into liver hepatocytes. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12388-12400 (2017).
- Manczak, M., et al. Neutralization of granulocyte macrophage colony-stimulating factor decreases amyloid beta 1-42 and suppresses microglial activity in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Human Molecular Genetics. 18 (20), 3876-3893 (2009).
- Zhang, Y., et al. JAK1-dependent transphosphorylation of JAK2 limits the antifibrotic effects of selective JAK2 inhibitors on long-term treatment. Annals of the Rheumatic Diseases. 76 (8), 1467-1475 (2017).
- Shih, S. C., et al.
- Liu, G., et al. miR-147, a microRNA that is induced upon Toll-like receptor stimulation, regulates murine macrophage inflammatory responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15819-15824 (2009).
- Ding, Q., et al. Mice expressing minimally humanized CD81 and occludin genes support Hepatitis C virus uptake in vivo. Journal of Virology. 91 (4), 01799 (2017).
- Renshaw, M., et al. Cutting edge: impaired Toll-like receptor expression and function in aging. Journal of Immunology. 169 (9), 4697-4701 (2002).
- Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
- Salem, E. S. B., et al. Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323 (2018).
- Cabral, F., et al. Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507 (2019).
- Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies. Malar Journal. 6, 169 (2007).
- Yin, Z., Ellis, E. C., Nowak, G. Isolation of mouse hepatocytes for transplantation: a comparison between antegrade and retrograde liver perfusion. Cell Transplant. 16 (8), 859-865 (2007).
- Hepatocyte media, Thermofisher. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/Hepatocyte_Media_UG.pdf (2021).
- Sia, D., Villanueva, A., Friedman, S. L., Llovet, J. M. Liver cancer cell of origin, molecular class, and effects on patient prognosis. Gastroenterology. 152 (4), 745-761 (2017).
- Freitas-Lopes, M. A., Mafra, K., David, B. A., Carvalho-Gontijo, R., Menezes, G. B. Differential location and distribution of hepatic immune cells. Cells. 6 (4), 48 (2017).
- Schachtrup, C., Le Moan, N., Passino, M. A., Akassoglou, K. Hepatic stellate cells and astrocytes: Stars of scar formation and tissue repair. Cell Cycle. 10 (11), 1764-1771 (2011).
- Geerts, A. History, heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells. Seminars in Liver Disease. 21 (3), 311-335 (2001).
- Poisson, J., et al. Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases. Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).
- Peter, M. E., et al. The CD95 receptor: apoptosis revisited. Cell. 129 (3), 447-450 (2007).
- Peters, D. T., et al. Asialoglycoprotein receptor 1 is a specific cell-surface marker for isolating hepatocytes derived from human pluripotent stem cells. Development. 143 (9), 1475-1481 (2016).
- Willoughby, J. L. S., et al. Evaluation of GalNAc-siRNA conjugate activity in pre-clinical animal models with reduced asialoglycoprotein receptor expression. Molecular Therapy. 26 (1), 105-114 (2018).
- Hutchins, N. A., Chung, C. S., Borgerding, J. N., Ayala, C. A., Ayala, A. Kupffer cells protect liver sinusoidal endothelial cells from Fas-dependent apoptosis in sepsis by down-regulating gp130. American Journal of Pathology. 182 (3), 742-754 (2013).
