Summary
初代肝細胞は、 インビトロで肝臓応答および代謝を研究するための貴重なツールである。市販の試薬を利用して、マウス初代肝細胞単離のための改善された時間効率および労力効率の高いプロトコールが開発された。
Abstract
初代肝細胞は、 インビトロ での肝臓研究、特に糖代謝研究において広く使用されている。基本技術は、時間、労力、コスト、原発性肝細胞の使用などのさまざまなニーズに基づいて適応されており、その結果、さまざまな初代肝細胞分離プロトコルが実現しています。しかしながら、初代肝細胞単離における多数のステップおよび時間のかかる試薬調製は、効率にとって大きな欠点である。それぞれの長所と短所について異なるプロトコルを比較した後、それぞれの利点が組み合わされ、迅速かつ効率的な初代肝細胞単離プロトコルが処方された。 わずか35分以内に、このプロトコルは、他のプロトコルと同じくらい、またはそれ以上ではないにしても、健康な初代肝細胞を産出する可能性があります。さらに、単離された初代肝細胞を用いて実施された糖代謝実験は、 in vitro 肝代謝研究におけるこのプロトコールの有用性を検証した。また、将来の研究者がニーズに基づいてこのプロトコルをさらに最適化できるように、この研究の各ステップの重要性と目的を広範囲にレビューおよび分析しました。
Introduction
肝臓は、食物消化、血液循環、解毒などの多数の生命維持機能において重要な役割を果たしているため、脊椎動物の体内で最も重要な器官の1つとして機能します。 体外培養における マウス初代肝細胞の使用は、炭水化物代謝および肝癌の研究においてますます人気が高まっている。したがって、マウス原発性肝細胞を先天的な生理機能を維持したまま単離するための簡便な方法を開発することが重要である。糖代謝のハブとして機能するため、肝臓はグルコース産生および貯蔵の中心でもある1。 インビトロでの 初代肝細胞を用いた実験は、ほとんどのグルコース代謝研究にとって必須である。したがって、長年にわたり、様々な研究グループがマウス原発性肝細胞単離のためのプロトコルを開発してきた。
マウス肝細胞単離の一般的な手順は、まずリン酸緩衝生理食塩水(PBS)やハンクス平衡塩溶液(HBSS)などの等月間性液体で肝臓の血液を洗い流し、次にコラゲナーゼ含有溶液を使用して肝細胞を解離させることである。これらのプロトコルは一般的な手順を共有しますが、異なるニーズに基づいて試薬と手順が異なります。しかし、必要な試薬の準備や単離工程の実行には時間がかかります。現在のプロトコルの開発では、効率を優先事項として設定し、すべての試薬をすぐに使用でき、市場から入手でき、できるだけ少ないステップで設定しました。このプロトコールの全体的な目標は、単離された初代肝細胞の純度および生存率を危険にさらすことなく、マウスから初代肝細胞を単離するための迅速かつ労働効率の高い方法を提供することである。
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Protocol
すべての手順は、ジョンズホプキンス動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。C57BL/6雌マウス(8週齢)を本試験に使用した。
1. 準備:
- ウィリアムのE培地(GlutaMAXサプリメント)を10%FBSおよび1%抗生物質 - 抗真菌溶液と混合して培養培地を作ります。
- 25 mL のコラゲナーゼ - ディスパーゼ培地(例えば、肝臓消化培地)を0.45 μmのシリンジフィルターを通してろ過し、粒子破片を除去する。
- 50mLの二重蒸留H2O(ddH2O)、35mLの灌流培地(例えば、肝臓灌流培地)(または、このプロトコールを初めて使用した時点で50mL)、および濾過したコラゲナーゼ - ディスパーゼ培地25mLを45°Cの水浴中で30分間温める。
- 滅菌組織培養フード内で、2 mL の 10x HBSS と 18 mL のパーコールを 50 mL チューブに混ぜて 20 mL の 1x Percoll-HBSS を作り、氷上または 4 °C に保ちます。
注:1x Percoll-HBSSは、少なくとも6ヶ月間4°Cに保つことができます。 - 滅菌組織培養フード内で、30mLの洗浄培地(例えば、肝細胞洗浄培地)を清潔なペトリ皿に注ぎ、氷上に保管する。
- ポンプ管を45°Cの水浴の水に浸す。結果は、室温が25°Cの場合に最も信頼性があります。
- 225 μLのケタミンHCL、93.75 μLのキシラジン、および1x PBSの1681 μLを混合して、2 mLの1x麻酔薬を調製する。
- 承認された方法を使用して1匹のマウスを麻酔する。ここで、マウスに150μLの1x麻酔薬を腹腔内注射した。つま先のつまみに対する反応などの反射神経の喪失の検査を行い、完全な麻酔を確実にします。
- マウスの背中を4本の手足で解剖パッドに固定し、防水テープを固定するか、または施設の動物愛護および使用委員会(または同等のもの)によって承認されたその他の方法を使用します。
- 殺菌された鉗子とはさみを解剖のために準備する。汚染の可能性を避けるため、滅菌フード内ですべての手順を実行します。
2. 手順:
- ペリスタルティックポンプを使用して、ウォームアップしたddH2Oを4mL/minの速度で5分間ポンピングを開始します。ポンプチューブを水からウォームアップした灌流培地に変更します。
- 麻酔をかけたマウスの腹部を70%EtOHで消毒し、はさみで切り開いて肝臓、門脈、下大静脈(IVC)を露出させます。
- ペリスタルティックポンプを停止します。24 G カテーテル (例: クローズド IV カテーテル、24 G、0.75 IN) を IVC に挿入します。ポンピングを開始し、門脈を切断します。
- 洗い流された液体が透明になるまで(約3〜5分)ポンピングを続けます。液体が肝臓の隅々まで届くように、門脈を毎分押します。IVCに気泡が入らないように注意してください。
注:このステップは、肝臓からできるだけ多くの血液を洗い流すことです。 - ポンピングチューブを灌流培地からコラゲナーゼ-ディスパーゼ培地に変更する。ステップ 2.6 の実行中に、コラゲナーゼ - ディスパーゼ培地の 25 mL がすべて枯渇するまでポンピングを続けます。
- 液体が肝臓の隅々まで届くように、門脈を毎分押します。
注:この段階では、血液の完全な損失はマウスにとって致命的です。マウスの死は、実験後の心拍の欠如によって確認することができる。施設のポリシーに従って死体を処分してください。 - 胆嚢なしで肝臓全体を氷上のペトリ皿の30mL洗浄培地に隔離する。
- 鉗子でそれを細かく引き裂き、原発性肝細胞を溶液中に放出する。このステップは、洗浄培地を、放出された初代肝細胞および小さな肝臓片でいっぱいの濁った溶液に変えるであろう。
- ステップ 2.8 で白濁した溶液を 70 μm のセルストレーナーを通して、氷上の 50 mL チューブ内の 20 mL 1x Percoll-HBSS にろ過します。チューブを20回反転させて混合する。
- 300 x g で4°Cで10分間遠心分離する。
- 組織培養フード内で、上清を吸引する。ペレットを冷たい30mLの洗浄媒体で洗浄する。
- 50 x g で4°Cで5分間遠心分離する。
- 上清を除去し、ペレットを組織培養フード内の25mLの培養液(または適切な他の容量)に再懸濁する。
- 細胞数をカウントし、実験計画に従って所望の培養プレート上に細胞をプレートする。
注:8週齢のマウス1匹から適切に単離された初代肝細胞は、通常、4枚の6ウェルプレートまたは4枚の12ウェルプレートに播種するのに十分である。
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Representative Results
効率を試験するために、本原発性肝細胞単離プロトコールを8週齢の雌性C57BL/6マウスに対して実施した。単離された初代肝細胞の付着および純度を試験した。初代肝細胞単離は、肝薬物効果および糖代謝、医薬バイオマーカー活性2、インスリン感受性、およびグルコース産生などの肝臓生理機能に関する多種多様な実験に使用される。したがって、このプロトコールで単離された初代肝細胞の活性を、以下の実験において試験した。
本プロトコールにおける初代肝細胞付着にはコーティングは必要とされなかった
単離した初代肝細胞を、6ウェルプレート上に5 x105細胞/ウェルで播種した。1時間後、しっかりとした付着が観察され、初代肝細胞は播種後12時間で完全に膨張した(図3)。このことは、めっきの12時間後、細胞が実験に利用される準備ができていることを示した。肝臓内のマウス肝細胞の核形態に基づいて、単核球肝細胞は境界で濃縮されたが、末端分化のシグネチャーである二核/多核肝細胞は中間にあった3,4。画像化されたかなりの量の細胞は、典型的な二重核(二倍体)形態を示し、生きた初代肝細胞の単離および精製の成功を示した。これはまた、コラーゲンコーティングがこのプロトコールによる原発性肝細胞付着の要件ではないことを示している。
単離された初代肝細胞集団において純度が富化されました
単離された初代肝細胞純度を確認するために、以前のプロトコールにおいて様々な細胞型特異的遺伝子マーカーが用いられてきた(表1)。TTR(トランスサイレチン)、CD95(分化クラスター95、Fasとしても知られる)、ASGR1(アジアロ糖タンパク質受容体1)、およびASGR2は肝細胞のマーカーである。単離後、これらの肝細胞マーカーのmRNAレベルは、肝臓全体と比較して有意に増加した(図4A−D、H)。
このプロトコルはまた、他の肝細胞からの干渉を大幅に減少させた。免疫細胞、星状細胞、および内皮細胞の存在は、肝臓全体と比較して、CD45(免疫細胞マーカー)、COL1A1(コラーゲン、I型、α1、星状細胞マーカー)、およびTIE2(Tunicaインターナ内皮細胞キナーゼ、内皮細胞マーカー)のmRNAレベルの急激な減少によって示される(図4E−H).これらは、このプロトコールが肝細胞から初代肝細胞集団を精製し、したがって実験における他の細胞型からの干渉の可能性を減少させることができることを示唆している。
活性が保存された医薬バイオマーカー
肝細胞上のバイオマーカーは、薬物の標的化および送達のために広く使用されている。したがって、医薬バイオマーカーの活性保存は、初代肝細胞単離における重要なポイントであり、初代肝細胞単離2の有用性を試験するための標準である。肝細胞マーカーASGR1およびASGR2は、このようにして使用される2。まず、初代肝細胞プレーティングの前後でこれら2つのマーカーの経時変化発現量を試験した。プレーティング後、それらのmRNAレベルは時間とともにかなり減少したが、レベルは、特にASGR1について、プレーティング後12時間の時点まで肝臓全体と比較してかなり残っていた(図5A、B)。発現傾向は以前の報告2 と一致し、同等の原発性肝細胞の健康状態を示した。肝細胞膜結合タンパク質であるCD81を標的とする様々な病原体は、肝炎ウイルス5、熱帯 熱マラリア原虫 、 ヨエリイ6形症のように、細胞への侵入と感染を促進する。TLR4(Toll様受容体4)のような他の肝細胞膜に位置するタンパク質も、病原体によって標的とされ、肝細胞免疫応答に重要である7。めっき後、CD81の発現量は48時間まで一貫していた(図5C)。TLR4発現レベルは一般に増加したが、 インビボで より高いレベルに達したのは48時間後までではなかった(図5D)。これらは、このプロトコールによって単離された初代肝細胞が、プラッティング後少なくとも48時間以内にCD81およびTLR4研究にも使用できることを示唆している。一緒に、これらの結果は、単離された初代肝細胞が、医薬バイオマーカーに関連する研究における使用に有効であることを示している。RNAおよびタンパク質レベルは、シグナルペプチド誘発RNA遊走、翻訳後修飾および/またはタンパク質分解などの転写後活性の影響のために矛盾する可能性があることは注目に値します。したがって、mRNAによって同定される医薬バイオマーカーのタンパク質レベルおよび生理活性の検証は、実験パラダイムによって必要とされる場合に必要であり得る。
単離された初代肝細胞はインスリン感受性であった
グルコース代謝の実験における初代肝細胞性能も解析した。グルコース代謝において中心的な役割を果たすホルモンであるインスリンは、AKTおよびFOXO1(フォークヘッドボックスO1)をリン酸化することによって、グルコースレベルを低下させ、肝グルコースの取り込みおよび貯蔵を促進する。したがって、単離された初代肝細胞を用いてインスリン感受性アッセイを実施した。16時間後、細胞を無血清培地で3時間飢餓状態にした。飢餓の最後の0.5時間で、100nMインスリンを培養培地に投与した。 図6A−Cに示すように、インスリンはSer473におけるAKTおよびSer256におけるFOXO1の両方のリン酸化を有意に促進し、インスリンに対する初代肝細胞の感受性を示す。このことは、本プロトコールから単離された初代肝細胞がインスリン/糖代謝研究において有用であることを示唆している。
単離された初代肝細胞はグルコース産生が可能であった
それらはグルコース貯蔵の中心であるだけでなく、肝細胞もグルコース産生の原因である。我々が単離した初代肝細胞がグルコース産生の研究に有用であるかどうかを試験するために、細胞をグルカゴンの存在下で10時間飢えさせ、グルコース産生を刺激した。次いで、飢餓培地をグルコースアッセイのために回収し、一方、細胞をウェスタンブロットのために回収した。ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(PEPCK)は、肝グルコース産生において必須の成分であり、その速度を制御する8。PEPCKのタンパク質レベルはグルカゴン処理後に有意に増加し、グルコース産生経路が活性化されたことを示唆している(図7A、B)。この活性化は、グルコース産生のレベルの増加によってさらに確認された(図7C)。この現象は、フォルスコリンとIBMXのような他のグルコース産生刺激剤でも確認された(図7A-C)。しかし、この実験の限界により、糖産生が糖新生による排他的であったのか、あるいはグリコーゲン分解の成分が存在するのかを検証することはできなかった。
図1:ベンチセットアップ。(A)初代肝細胞分離のためのベンチセットアップ。(B)原発性肝細胞単離のための漫画化されたベンチセットアップ。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:マウス解剖、灌流、および初代肝細胞の精製 (A)解剖したマウスを、矢印が肝臓、IVC、および門脈を指し示す。(b)IVCへのカテーテル挿入。(C)門脈を加圧して肝臓の股関節の拡大およびこわばりを引き起こし、灌流が成功したことを示す。(d)灌流後の軟化した肝臓ロペの、コラゲナーゼ消化の成功を示す。(E)単離された肝臓における胆嚢の位置(胆嚢を指す矢印)。(F)胆嚢除去。(g)肝細胞洗浄培地で肝臓を引き裂いた。(h)遠心分離機の前に1x Percoll-HBSSを濾過した初代肝細胞と混合する。(I,J)遠心分離後の初代肝細胞ペレット。 (k)肝細胞洗浄培地内の初代肝細胞再懸濁液。(L, M)初代肝細胞ペレットは、遠心分離後の肝細胞洗浄培地内に形成された。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:プレーティング後の初代肝細胞。 画像は、(A)1時間、(B、 C)12時間、(D)24時間、(E)36時間、(F)48時間、(G)72時間、および(H)96時間の初代肝細胞めっき後に撮影した。スケール バー = 100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:単離後の初代肝細胞純度の増強。 RNAは、初代肝細胞単離の前(肝臓全体から)および後(単離された初代肝細胞から)に単離し、続いて逆転写PCRを、以前のプロトコル9に従って単離した。初代肝細胞純度は、肝細胞マーカー(A)TTR、(B)CD95、(C)ASGR1および(D)ASGR2のプライマーを用いたリアルタイムPCRによって評価し、免疫細胞マーカー(E)CD45、(F)星状細胞マーカーCOL1A1、および(G)内皮細胞マーカーTIE2も用いた。(h)初代肝細胞単離前後の細胞型マーカーの発現変化についてヒートマップを作成した。GAPDH(グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ)を内部コントロールとして用いた。ここで用いたプライマーは遺伝子用であった(プライマー配列は 表2に示す。配列参照はここに引用されている): TTR10; CD9511; ASGR112; ASGR213; CD4514; COL1A115; TIE216; GAPDH17.グラフとヒートマップは、GraphPad Prism 8で生成されました。エラーバーは標準偏差を示し、両側非対(このプロトコルはそもそも無傷の肝臓を必要とするため、原発性肝細胞および肝臓サンプル全体が不対であったため)t検定有意性はアスタリスクで示される(* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001)。N = 7。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:医薬バイオマーカーの発現 レーティング後に肝臓全体および初代肝細胞からRNAを単離し、続いて逆転写PCRを行った。医薬バイオマーカーの発現を、(A)ASGR1、(B)ASGR2、(C)CD81、および(D)TLR4のプライマーを用いたリアルタイムPCRによって評価した。GAPDHは内部統制として使用された。ここで用いた新規プライマーは遺伝子用であった(プライマー配列は 表2に示す。配列参照はここに引用される): CD8118; TLR419。グラフはGraphPad Prism 8で生成した。N = 5。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
(A)インスリン治療後のp-AKT(S473)、AKT、p-FOXO1(S256)、FOXO1、およびGAPDHのウェスタンブロット。(B)ウェスタンブロットのデンシトメトリーにおけるp−AKT(S473)/AKT。(c)p-FOXO1(S256)/FOXO1をウェスタンブロットのデンシトメトリーで示す。インスリン感受性アッセイは、初代肝細胞めっきの16時間後に実施した。初代肝細胞は、FBSを含まないウィリアムのE培地(GlutaMAXサプリメント)で3時間飢餓状態にされたが、1%抗生物質 - 抗真菌剤溶液および最後の30分間に100nMインスリン処理で、1x RIPA緩衝液によるタンパク質溶解のために回収された。グラフはGraphPad Prism 8で生成した。ウエスタンブロットイメージングは、LI-CORオデッセイCLxを用いて実施した。 エラーバーは標準偏差を示し、両側対応のt検定有意性はアスタリスクで示<(*p<0.05;**p0.01)。N = 4。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:グルコース産生アッセイ。 (A)グルカゴンまたはフォルスコリン+IBMX処理後10時間後のPEPCKおよびGAPDHのウェスタンブロット(B)グルカゴンまたはフォルスコリン+IBMX処理のいずれか10時間後のGAPDHと比較したPEPCKタンパク質レベルのデンシト測定。 (C)グルカゴンまたはフォルスコリン+IBMX処理のいずれかを10時間処理した後のタンパク質レベルと比較したグルコースレベル。グルコース産生アッセイは、初代肝細胞めっきの16時間後に行った。初代肝細胞は、グルコースおよびフェノールレッドを含まないDMEM(2mM L-グルタミン、2mMピルビン酸ナトリウム、20mML-乳酸ナトリウム、1%ペンストレップ添加)、50nMグルカゴンまたは20μMフォルスコリンおよび200μM IBMXのいずれかで10時間飢餓状態にした。グルコースアッセイキットを用いてグルコース濃度測定のために培地を回収し、一方、ウェスタンブロットのためにタンパク質を回収した。ウエスタンブロットイメージングはLI-CORオデッセイCLxを用いて実施した。エラーバーは標準偏差を示し、両側対応のt検定有意性はアスタリスクで示<(*p<0.05;**p<0.001)。N = 4。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 遠心分離時間 | 胸郭の取り外し | 灌流バッファー自作 | 外科用結び目 | ランプ加熱 | プレートコーティング | 単離細胞量/マウス | グラジエント遠心分離 | 純度マーカー遺伝子 | |
| 現在のプロトコル | 2 | いいえ | いいえ | いいえ | いいえ | いいえ | 2.5–4 x 107 | はい | TTR, CD95, ASGR1, ASGR2, CD45, COL1A1, TIE2 |
| Severgnini et al.2. | 4 | はい | はい | はい | はい | はい | 1.8–2 x 107 | いいえ | TTR, CD45, COL1A1, TIE2 |
| Gonçalves et al.24. | 5 または 6 | いいえ | いいえ | いいえ | いいえ | はい | 1–3 x 106 | はい | CD45, CD95 |
| 李ら20. | 4 または 5 | いいえ | はい | はい | いいえ | 言及されていない | 1–4 x 107 | いいえ | 該当なし |
| セイラムら21. | 3 | いいえ | はい | いいえ | いいえ | 言及されていない | 2 × 107 | はい | 該当なし |
| カブラルら22. | 3 または 6 (グラジエント遠心分離を使用) | いいえ | はい | はい | いいえ | はい/推奨 | 該当なし | 随意 | N/A(光学顕微鏡で評価された純度) |
| コレロワら23. | 3 | いいえ | はい | はい | いいえ | はい | 該当なし | はい | 該当なし |
表1:初代肝細胞プロトコルの比較。
| プライマー(フォワード) | プライマー(リバース) | 参考 | ||
| TTR Forward 5'-3': AGCCCTTTGCCTCTGGGAAGAC | TTR リバース 5'-3': TGCGATGGTGTAGTGGCGATGG | 10 | ||
| CD95 フォワード 5'-3': ATGCACACTCTGCGATGAAG | CD95リバース5'-3':CAGTGTTCACAGCCAGGAGAGA | 11 | ||
| ASGR1 Forward 5'-3': GAGTCGAAGCTGGAAAAACAG | ASGR1 Reverse 5'-3': CCTTCATACTCCACCCAGTTG | 12 | ||
| ASGR2 Forward 5'-3': CTACTGGTTTTTTCTCGGGATGG | ASGR2 Reverse 5'-3': CAAATATGAAACTGGCTCCTGTG | 13 | ||
| CD45 Forward 5'-3': GAACATGCTGCCAATGGTTCT | CD45 Reverse 5'-3': TGTCCCACATGACTCCTTTCC | 14 | ||
| COL1A1 フォワード 5'-3': GAAGCACGTCTGGTTTGGA | COL1A1 リバース 5'-3': ACTCGAACGGGAATCCATC | 15 | ||
| TIE2 フォワード 5'-3': ATGTGGAAGTCGAGGCGAT | TIE2 Reverse 5'-3': CGAATAGCCATCCACTATTGTCC | 16 | ||
| GAPDH Forward 5'-3': CGACTTCAACAGCAACTCCCACTCTTCC | GAPDH Reverse 5'-3': TGGGTGGTCCAGGGTTTCTTACTCCTT | 17 | ||
| CD81 Forward 5'-3': CCAAGGCTGTGGTGAAGACTTTC | CD81 Reverse 5'-3': GGCTGTTCCTCAGTATGGTGGTAG | 18 | ||
| TLR4 Forward 5'-3': ACCTGGCTGGTTTACACGTC | TLR4 リバース 5'-3': CTGCCAGAGACATTGCAGAA | 19 | ||
表2:プライマーのリスト: 遺伝子TTRに用いたプライマー、CD95、ASGR1、ASGR2、CD45、COL1A1、TIE2、GAPDH、CD81、TLR4
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Discussion
様々な初代肝細胞単離プロトコルが開発されている。また、さまざまなニーズに基づいて最適化および適応されています(表1)。単離プロトコルは、一般に、灌流(酵素消化を含む)および精製の2つの部分からなる。
灌流は、インビボ2、20、21、22、23で肝臓全体に対して、または解剖された肝葉24を用いて行うことができる。解剖された葉の灌流は、技術的容易さのために一般に左葉および中葉に限定されていた。理論的には、インビボ灌流は、すべての葉を有する肝臓全体の使用のために、より多くの初代肝細胞を生じるはずである。灌流中に肝臓を所定の位置に保つことは、インビボの肝細胞をこのステップの間常に血液または灌流緩衝液のいずれかに浸すことができるので、細胞死を減少させることもできる。
無菌状態の維持もまた、このステップにおいて重要な役割を果たす。条件が許せば、きれいなフードで灌流を行う方が良いです。組織に直接触れるすべてのツールは滅菌でなければならず、オートクレーブによって達成することができます。細菌および真菌からの汚染を防止するために、抗生物質 - 抗真菌溶液を培地に添加した。
IVCと門脈は、肝臓と他の臓器をつなぐ2つの主要な血管です。ほとんどのプロトコルは、灌流用の針を挿入するためにこれらの静脈のいずれかを利用する:IVC 2、20、21、23、門脈22。門脈の位置は歪んだ角度にあり、挿入された針の位置決めと安定化が困難になります。したがって、縫合糸は、通常、静脈が損傷を受けやすいので非常に慎重に行わなければならない外科的結び目で針を所定の位置に結ぶために必要とされる。一般に、門脈の直径もIVCよりも小さく、針の挿入を複雑にする。これを考慮すると、IVCの使用はより便利であり得るが、いくつかのプロトコルでは、針もIVC20に外科的に結び付けられる。IVC挿入による灌流は、門脈よりも生存率の低い初代肝細胞をもたらしたことが報告されている25。しかしながら、本プロトコールでは、IVC挿入の使用に成功し、単離された初代肝細胞の生存率(最適化された条件下で>96%、製造業者のプロトコールに従ってトリパンブルー染色で測定)は、他のプロトコール(プロトコルおよび条件2、22、23、24に基づいて80%〜96%の間で変化する)と同じくらい高かった。
灌流ステップには2つの目的があります:肝葉から血液を洗い流し、肝臓を消化して初代肝細胞を放出することです。これらの目的を達成するためには、少なくとも2つの緩衝液、1つは血液流束用(フラックス緩衝液)、もう1つは消化用(消化緩衝液)を使用する必要があります。ほとんどのプロトコルは、HBSSベースのフラックスバッファーを準備し、その中にコラゲナーゼを追加して、消化バッファーとして消化できるようにします。これらのバッファーの調製には時間がかかり、バッファーはバッチごとにpHなどのいくつかの繊細な特性がわずかに異なる可能性があるため、招かれない変数が導入されます。これを考慮すると、市販のバッファを利用すると、これらの変数を最小限に抑えながら、貴重な労力と時間を節約できます。Gibco は、市販の肝臓灌流培地 (フラックスバッファーとして) および肝臓消化培地 (消化バッファーとして) の使用に基づいて、成体ラット26 からの初代肝細胞単離のプロトコールを開発しました。マウスとラットは、げっ歯類として、身体特性において高い類似性を共有する。これら2つのラット最適化バッファーをマウス初代肝細胞単離に統合してもよい。実際、ゴンサルベスら。図24は、これらの緩衝液を用いて解剖した肝葉の灌流を首尾よく実施し、 インビボでの肝臓灌流におけるそれらの使用の約束を提起する。ここでは、現在のマウス原発性肝細胞プロトコールで肝臓灌流培地および肝臓消化培地の試験に成功し、高品質の生存可能な初代肝細胞が得られた(図3 および 図4)。
灌流バッファーの温度は、初代肝細胞が単離をどの程度良好に生存するかを決定します。温度が高すぎると、消化バッファー内のコラゲナーゼの活性が低下する可能性があります。低すぎると、初代肝細胞がコールドショックを受け、単離収率が低下する可能性があります。バッファーが灌流チューブを流れるのにかかる時間は、バッファーが肝臓に到達したときの温度も決定します。以前のプロトコールでは、40°C2 または42°C21 水浴が用いられた。この温度は、環境温度、灌流チューブの長さ、ペリスタルティックポンプの種類など、ラボ条件に基づいて変更される可能性があります。本議定書では、複数回の試験の後、バッファーを温めるために水浴温度を45°Cに最適化しました。
単離された初代肝細胞の純度は、その後の実験において重要な役割を果たし、純度比が高いほど、干渉の可能性は低い。肝臓は主に肝細胞で構成されており、質量の60~80%を占めていますが27、肝免疫活性にとって重要な免疫細胞、星細胞、内皮細胞など、様々な種類の細胞も存在します。これらの細胞の各々は、後の実験28において潜在的な干渉を計上し得る。例えば、肝臓の星状細胞は病原体の侵入や肝障害にも反応し、瘢痕形成に関与する29。数字では、全肝細胞集団の5%〜8%が星状細胞30によって寄与されている。通常、星状細胞は静止状態にありますが、応力が存在するとこの状態が壊れる可能性があります。したがって、星状細胞活動は、これらの細胞の一部が最終的に単離された初代肝細胞プールに残っている場合、単離またはその後の治療中に導入されたストレスによって誘発され得る。他のタイプの細胞も、肝正弦波内皮細胞(LSEC)のように、肝細胞集団のかなりの部分を占め、肝細胞集団全体の20%を占める31。これらの細胞の存在を排除する方法は、初代肝細胞単離プロセスにおいて不可解な部分であった。したがって、精製は初代肝細胞単離において重要な部分であり、これは通常、異なるタイプの細胞間の重量およびサイズの違いを利用する。遠心分離速度および/または精製バッファーを最適化することにより、初代肝細胞をチューブの底までペレット化することができます。
生細胞を死細胞から分離することも、健康な初代肝細胞を取得し、正確な細胞計数を行う上で重要です。通常、細胞数の計数は、多数の実験の結果が細胞合流点の変化に応じて変化するため、精製後に必須である。勾配遠心分離機試薬は、Percollのように、この使命を果たすためにこのステップで使用することができます。遠心分離機ペレット中のPercollの36%〜40%は生細胞をダウンさせ、死細胞を上清に保持します。我々は、本プロトコールにおいて、非初代肝細胞細胞集団を減少させるために遠心分離速度および時間を最適化することに成功した。細胞型特異的マーカーを用いて、他のプロトコールと同様に、ここで単離された初代肝細胞の純度を試験した。ここで使用した肝細胞マーカーは、TTR2、CD9524、32、ASGR1 33、およびASGR2 34であった。他のタイプの細胞のマーカーには、CD45(免疫細胞マーカー)、COL1A1(星状細胞マーカー)、TIE2(内皮細胞マーカー)2、35が含まれる。これらのマーカーを用いて、本プロトコールで単離された初代肝細胞は、以前のプロトコール2,24に匹敵する高レベルの純度(図4)を示した。
灌流中、消化バッファー中のコラゲナーゼは、細胞外マトリックス内のコラーゲンを分解することによって細胞間の結合を緩めます。これは、めっき中の細胞達成の困難さにつながる。以前のプロトコルのほとんどは、初代肝細胞のより良い付着のためにコラーゲン2,22またはゼラチン24によるプレートの事前コーティングが必要/推奨する。我々の知る限りでは、セイラムらが21およびLiら20はこのステップについて議論しなかったが、この研究で評価された他のプロトコルは、プレコートプレート2,22,23,24の使用を明確に述べ/推奨した。現在のプロトコルでは、特定のタイプのプレートにはプレートコーティングが必要ではないことがわかりました。これは、異なるタイプのプレート、特に異なるメーカーのプレートが異なる表面平滑性を有するためであり、この多様な平滑性が存在するとしても、原発肝細胞の付着に重要な役割を果たしているかどうかはわかりませんが、有効性のために別のステップ(プレートコーティング)をスキップできるように注意することは有益です。このプロトコルは、生体内肝正弦波に類似した単核球肝細胞とともに、最終分化、例えば二倍体肝細胞のかなりの割合を生成することに注意することも重要である。
この研究では、以前の初代肝細胞単離プロトコルの利点を組み合わせ、市販の試薬を使用し、不要なステップを排除して、プロセスを可能な限り簡素化しました。遠心分離ステップは2つに削減され、私たちの知る限り、公開されたプロトコルの中で最も少なかった。単離された初代肝細胞の純度および生理活性を確認するために、様々な肝細胞マーカーのレベルを評価し、本プロトコールが初代肝細胞純度を大幅に高め、免疫細胞、星状細胞、および内皮細胞などの他の肝細胞集団を減少させることができることを確認した。ASGR1、ASGR2、CD81、およびTLR4のような医薬バイオマーカーの活性は、本プロトコールで単離された初代肝細胞において良好に保存され、インスリン感受性およびグルコース産生活性も確認されていた。このプロトコルの主な制限は、すべての試薬が効率のために商業的に購入されたため、費用です。我々は、グリコーゲン症が本プロトコールを用いて単離された初代肝細胞において無傷であることを具体的に検証しておらず、これは関連する研究のためにさらなる研究を必要とするかもしれない。このプロトコルは、IVC挿入を用いたSalem et al.21、Severgnini et al.2およびLi et al.20、およびKorelova et al.23のような以前のものと同様の灌流ステップを有する。それらの灌流および消化バッファーは、調製に余分な労力を必要とするかもしれないが、酵素消化時間のほとんど変更なしで現在のプロトコルでも機能する可能性がある。したがって、以前のプロトコルの試薬を本プロトコールのステップと組み合わせることも、時間的および経済的に友好的であり、有益であり得る。
要約すると、マウス肝臓からの初代肝細胞単離のための改善された時間効率および労力効率の高いプロトコルが開発された。このプロトコールは、市販の試薬を完全に利用し、マウスの解剖から初代肝細胞のプレーティングまで、約35分で完了することができ、したがって、初代肝細胞関連研究に有用な技術を提供する。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、国立衛生研究所(Grant 5R01HD095512-02 to S.W.)の支援を受けた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Gibco | 10010023 | |
| 10x HBSS | Gibco | 14065-056 | |
| 12-well Plate | FALCON | 353043 | Coating not required |
| 6-well Plate | FALCON | 353046 | Coating not required |
| anti-AKT | Cell Signaling | 2920S | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x), Stabilized | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| anti-FOXO1 | Cell Signaling | 97635S | |
| anti-GAPDH | Cell Signaling | 2118S | |
| anti-p-AKT (S473) | Cell Signaling | 9271L | |
| anti-PEPCK | Santa Cruz | SC-166778 | |
| anti-p-FOXO1 (S256) | Cell Signaling | 84192S | |
| Cell Strainer, 70 µm | CELLTREAT | 229483 | |
| Closed IV Catheter, 24 Gauge 0.75 IN | Becton Dickinson | 383511 | |
| DMEM, no glucose, no glutamine, no phenol red | ThermoFisher Scientific | A1443001 | |
| EnzyChrom Glucose Assay Kit | BioAssay Systems | EBGL-100 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
| Forskolin | MilliporeSigma | F3917-10MG | |
| Glucagon | Sigma-Aldrich | G2044 | |
| Goat Anti-mouse IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-68070 | |
| Goat Anti-rabbit IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-32211 | |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Software | NA | |
| Hepatocyte Wash Medium | Gibco | 17704-024 | |
| IBMX | Cell Signaling | 13630S | |
| Insulin | Lilly | NDC 0002-8215-01 | |
| Ketamine HCL (100 mg/mL) | Hospira Inc | NDC 0409-2051-05 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Liver Digest Medium | Gibco | 17703-034 | Aliquot within tissue culture hood to 25 mL each in 50 mL tube, and keep in -20 °C freezer |
| Liver Perfusion Medium | Gibco | 17701-038 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140122 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Peristaltic Pump | Gilson | Minipuls 2 | Capable of pumping at 4 mL/min |
| Petri Dish | Fisherbrand | 08-757-12 | |
| Refrigerated Centrifuge | Sorvall | Legend RT | Capable to centrifuge 50 mL tube at 4 °C |
| Sodium L-Lactate | Sigma-Aldrich | L7022 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| Syringe Filter, PVDF 0.45 µm 30mm diameter | CELLTREAT | 229745 | |
| Syringe, 0.5 mL | Becton Dickinson | 329461 | |
| Syringe, 60 mL | Becton Dickinson | 309653 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Tube, 15 mL | Corning | 430052 | |
| Tube, 50 mL | Corning | 430290 | |
| Water Bath Tank | Corning | CLS6783 | Or any water bath tank capable of heating up to 45 °C |
| William’s E Medium (GlutaMAX Supplement) | Gibco | 32551020 | |
| Xylozine (100 mg/mL) | Vetone Anased LA | NDC13985-704-10 |
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