Summary
Primäre Hepatozyten sind ein wertvolles Werkzeug, um die Leberreaktion und den Metabolismus in vitro zu untersuchen. Unter Verwendung kommerziell erhältlicher Reagenzien wurde ein verbessertes zeit- und arbeitseffizientes Protokoll für die primäre Hepatozytenisolierung der Maus entwickelt.
Abstract
Primäre Hepatozyten werden in der Leber-in-vitro-Forschung , insbesondere in Glukosestoffwechselstudien, umfassend eingesetzt. Eine Basistechnik wurde basierend auf verschiedenen Anforderungen wie Zeit, Arbeit, Kosten und primärer Hepatozytennutzung angepasst, was zu verschiedenen primären Hepatozytenisolationsprotokollen führte. Die zahlreichen Schritte und zeitaufwändigen Reagenzienpräparate in der primären Hepatozytenisolierung sind jedoch große Nachteile für die Effizienz. Nach dem Vergleich verschiedener Protokolle für ihre Vor- und Nachteile wurden die Vorteile jedes Protokolls kombiniert und ein schnelles und effizientes primäres Hepatozytenisolationsprotokoll formuliert. Innerhalb von nur ~ 35 Minuten könnte dieses Protokoll genauso viel, wenn nicht mehr, gesunde primäre Hepatozyten liefern wie andere Protokolle. Darüber hinaus validierten Glukosestoffwechselexperimente, die mit den isolierten primären Hepatozyten durchgeführt wurden, die Nützlichkeit dieses Protokolls in In-vitro-Leberstoffwechselstudien . Wir haben auch die Bedeutung und den Zweck jedes Schritts in dieser Studie ausführlich überprüft und analysiert, damit zukünftige Forscher dieses Protokoll basierend auf den Bedürfnissen weiter optimieren können.
Introduction
Die Leber dient als eines der wichtigsten Organe im Wirbeltierkörper aufgrund der lebenswichtigen Rolle, die sie bei zahlreichen lebenserhaltenden Funktionen wie Nahrungsverdauung, Durchblutung und Entgiftung spielt. Die Verwendung von primären Hepatozyten in vitro-Kulturen der Maus wird in Studien zum Kohlenhydratstoffwechsel und zum Leberkarzinom immer beliebter. Daher ist es wichtig, eine geeignete Methode zur primären Hepatozytenisolierung der Maus zu entwickeln und gleichzeitig ihre angeborene physiologische Funktion beizubehalten. Aufgrund ihrer Funktion als Drehscheibe des Glukosestoffwechsels ist die Leber auch für die Glukoseproduktion und -speicherungvon zentraler Bedeutung 1. Experimente mit primären Hepatozyten in vitro sind ein Muss für die meisten Glukosestoffwechselstudien. Daher haben verschiedene Forschungsgruppen seit Jahren Protokolle für die primäre Hepatozytenisolierung der Maus entwickelt.
Das allgemeine Verfahren der Hepatozytenisolierung der Maus besteht darin, zuerst Blut in der Leber mit einer isosmotischen Flüssigkeit wie phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) auszuspülen und dann Kollagenase-haltige Lösung zu verwenden, um Hepatozyten zu dissoziieren. Diese Protokolle teilen sich ein allgemeines Verfahren, unterscheiden sich jedoch in Reagenzien und Schritten, die auf unterschiedlichen Anforderungen basieren. Die Vorbereitung der erforderlichen Reagenzien und die Durchführung von Isolationsschritten nehmen jedoch Zeit in Anspruch. Bei der Entwicklung des vorliegenden Protokolls wurde die Effizienz als Priorität festgelegt, wobei alle Reagenzien gebrauchsfertig und auf dem Markt erhältlich sind, und zwar in so wenigen Schritten wie möglich. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, eine schnelle und arbeitseffiziente Methode zur Isolierung primärer Hepatozyten von der Maus bereitzustellen, ohne die Reinheit und Lebensfähigkeit isolierter primärer Hepatozyten zu gefährden.
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Protocol
Alle Verfahren wurden vom Johns Hopkins Animal Care and Use Committee genehmigt. C57BL/6 weibliche Mäuse (8 Wochen alt) wurden in dieser Studie verwendet.
1. Vorbereitung:
- Mischen Sie William's E Medium (GlutaMAX Supplement) mit 10% FBS und 1% antimykotischer Lösung, um die Kultur medium zu machen.
- Filtern Sie 25 ml Kollagenase-Dispase-Medium (z. B. Leberaufschlussmedium) durch einen 0,45-μm-Spritzenfilter, um Partikelablagerungen zu entfernen.
- Erwärmen Sie 50 ml doppelt destilliertesH2O(ddH2O), 35 ml Perfusionsmedium (z. B. Leberperfusionsmedium) (oder 50 ml zum ersten Mal unter Verwendung dieses Protokolls) und 25 ml gefiltertes Kollagenase-Dispase-Medium in einem 45 ° C-Wasserbad für 30 min.
- Mischen Sie in einer sterilen Gewebekulturhaube 2 ml 10x HBSS und 18 ml Percoll in einem 50 ml Röhrchen, um 20 ml 1x Percoll-HBSS herzustellen und auf Eis oder 4 ° C zu halten.
HINWEIS: 1x Percoll-HBSS kann mindestens 6 Monate bei 4 °C gehalten werden. - In einer sterilen Gewebekulturhaube 30 ml Waschmedium (z. B. Hepatozyten-Waschmedium) in eine saubere Petrischale geben und auf Eis legen.
- Tauchen Sie das Pumprohr in das Wasser eines 45 °C warmen Wasserbades. Die Ergebnisse sind am zuverlässigsten, wenn die Raumtemperatur bei 25 °C liegt.
- Bereiten Sie 2 ml 1x Anästhetika vor, indem Sie 225 μL Ketamin HCL, 93,75 μL Xylat und 1681 μL 1x PBS mischen.
- Anästhesieren Sie eine Maus mit einer zugelassenen Methode. Hier wurde der Maus intraperitoneal 150 μL 1x Anästhetika injiziert. Führen Sie die Tests für den Verlust von Reflexen wie Reaktion auf Zehenkneifen durch, um eine Vollnarkose zu gewährleisten.
- Befestigen Sie die Maus auf dem Rücken mit vier Gliedmaßen auf dem Sezierpad, indem Sie entweder festklemmen oder wasserdichtes Klebeband oder andere vom Animal Care and Use Committee (oder gleichwertigen) der Institution genehmigte Methoden verwenden.
- Sterilisierte Pinzetten und Scheren für die Dissektion vorbereiten. Um eine mögliche Kontamination zu vermeiden, führen Sie alle Schritte in einer sterilen Haube durch.
2. Verfahren:
- Beginnen Sie mit einer Peristaltikpumpe mit dem Pumpen von erwärmtem ddH2O mit einer Geschwindigkeit von 4 ml/min für 5 min. Wechseln Sie das Pumprohr von Wasser zu einem aufgewärmten Perfusionsmedium.
- Desinfizieren Sie den Bauch der betäubten Maus mit 70% EtOH und schneiden Sie ihn mit einer Schere auf, um die Leber, die Pfortader und die untere Hohlvene (IVC) freizulegen.
- Stoppen Sie die Peristaltikpumpe. Setzen Sie einen 24-G-Katheter (z. B. geschlossener IV-Katheter, 24 G, 0,75 Zoll) in IVC ein. Beginnen Sie mit dem Pumpen und schneiden Sie die Pfortader auf.
- Pumpen Sie weiter, bis die ausgespülte Flüssigkeit klar ist (ca. 3-5 min). Drücken Sie die Pfortader jede Minute, damit Flüssigkeit jeden Winkel der Leber erreicht. Achten Sie darauf, dass keine Luftblasen in das IVC eindringen.
HINWEIS: Dieser Schritt besteht darin, so viel Blut wie möglich aus der Leber auszuspülen. - Wechseln Sie das Pumprohr vom Perfusionsmedium zum Kollagenase-Dispase-Medium. Pumpen Sie weiter, bis alle 25 ml des Kollagenase-Dispase-Mediums erschöpft sind, während Sie Schritt 2.6 ausführen.
- Drücken Sie die Pfortader jede Minute, damit Flüssigkeit jeden Winkel der Leber erreicht.
HINWEIS: In diesem Stadium ist der vollständige Blutverlust für die Maus tödlich. Der Tod der Maus kann durch einen fehlenden Herzschlag nach dem Experiment bestätigt werden. Entsorgen Sie den Kadaver gemäß den Richtlinien der Einrichtung. - Isolieren Sie die ganze Leber ohne Gallenblase auf das 30 ml Waschmedium in der Petrischale auf Eis.
- Reißen Sie es mit einer Pinzette in Stücke, um primäre Hepatozyten in Lösung freizusetzen. Dieser Schritt würde das Waschmedium in eine trüben Lösung voller freigesetzter primärer Hepatozyten und kleiner Leberstücke verwandeln.
- Filtern Sie die trüben Lösung in Schritt 2.8 durch ein 70 μm Zellsieb in das 20 mL 1x Percoll-HBSS in einem 50 mL Rohr auf Eis. Mischen Sie, indem Sie das Rohr 20 Mal umkehren.
- Zentrifuge bei 300 x g für 10 min bei 4 °C.
- Saugen Sie den Überstand innerhalb der Gewebekulturhaube ab. Waschen Sie das Pellet mit kaltem 30 ml Waschmedium.
- Zentrifuge bei 50 x g für 5 min bei 4 °C.
- Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 25 ml des Kulturmediums (oder geeigneten anderen Volumina) innerhalb der Gewebekulturhaube.
- Zählen Sie die Zellzahl und die Platte der Zellen auf den gewünschten Kulturplatten entsprechend dem Versuchsdesign.
HINWEIS: Primäre Hepatozyten, die ordnungsgemäß von einer 8 Wochen alten Maus isoliert wurden, reichen normalerweise aus, um auf vier 6-Well-Platten oder vier 12-Well-Platten plattiert zu werden.
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Representative Results
Um die Effizienz zu testen, wurde das vorliegende primäre Hepatozytenisolationsprotokoll an 8 Wochen alten weiblichen C57BL/6-Mäusen durchgeführt. Die Anheftung und Reinheit isolierter primärer Hepatozyten wurde getestet. Die primäre Hepatozytenisolierung wird für eine Vielzahl von Experimenten zur Leberphysiologie verwendet, wie z. B. hepatische Arzneimittelwirkungen und Glukosestoffwechsel, pharmazeutische Biomarkeraktivität2, Insulinsensitivität und Glukoseproduktion. Daher wurden die Aktivitäten der primären Hepatozyten, die mit diesem Protokoll isoliert wurden, in den folgenden Experimenten getestet.
Für die primäre Hepatozytenanlagerung war im vorliegenden Protokoll keine Beschichtung erforderlich.
Isolierte primäre Hepatozyten wurden mit 5 x 105 Zellen / Well auf einer 6-Well-Platte plattiert. Nach 1 h wurde eine feste Befestigung beobachtet, und die primären Hepatozyten dehnten sich 12 h nach der Beschichtung vollständig aus (Abbildung 3). Dies deutete darauf hin, dass 12 Stunden nach der Beschichtung die Zellen bereit waren, für Experimente verwendet zu werden. Basierend auf der Kernmorphologie der Maushepatozyten in der Leber wurden mononukleäre Hepatozyten an den Rändern angereichert, während binuklare/polynukleäre Hepatozyten, eine Signatur der terminalen Differenzierung, in der Mitte 3,4 lagen. Eine signifikante Anzahl der abgebildeten Zellen zeigte eine typische zweikernige (diploide) Morphologie, was auf den Erfolg der Isolierung und Reinigung lebender primärer Hepatozyten hinweist. Dies deutet auch darauf hin, dass die Kollagenbeschichtung keine Voraussetzung für die primäre Hepatozytenbindung mit diesem Protokoll ist.
Die Reinheit wurde in der isolierten primären Hepatozytenpopulation angereichert
Verschiedene zelltypspezifische Genmarker wurden in früheren Protokollen verwendet, um die Reinheit isolierter primärer Hepatozyten zu überprüfen (Tabelle 1). TTR (Transthyretin), CD95 (Cluster of differentiation 95, auch bekannt als Fas), ASGR1 (Asialoglycoprotein receptor 1) und ASGR2 sind Marker für Hepatozyten. Nach der Isolierung waren die mRNA-Spiegel dieser Hepatozytenmarker im Vergleich zur gesamten Leber signifikant erhöht (Abbildung 4A-D,H).
Dieses Protokoll reduzierte auch die Interferenz durch andere Leberzellen erheblich. Das Vorhandensein von Immunzellen, Sternzellen und Endothelzellen war geringer, was durch die starke Abnahme der mRNA-Spiegel von CD45 (Immunzellmarker), COL1A1 (Kollagen, Typ I, alpha 1, stellater Zellmarker) und TIE2 (Tunica interna Endothelzellkinase, Endothelzellmarker) im Vergleich zur gesamten Leber (Abbildung 4E-H ). Diese deuten darauf hin, dass dieses Protokoll die primäre Hepatozytenpopulation aus Leberzellen reinigen und so die mögliche Interferenz durch andere Zelltypen in Experimenten reduzieren könnte.
Aktivität von pharmazeutischen Biomarkern wurde erhalten
Biomarker auf Hepatozyten wurden in großem Umfang für das Targeting und die Verabreichung von Medikamenten verwendet. Die Aktivitätserhaltung pharmazeutischer Biomarker ist daher ein Schlüsselpunkt in der primären Hepatozytenisolierung und ein Standard, um die Nützlichkeit der primären Hepatozytenisolierungzu testen 2. Hepatozytenmarker ASGR1 und ASGR2 werden auf diese Weise verwendet2. Wir haben zuerst das Zeit-Verlaufs-Expressionsniveau dieser beiden Marker vor und nach der primären Hepatozytenplattierung getestet. Nach der Beschichtung nahm ihr mRNA-Spiegel mit der Zeit erheblich ab, aber die Spiegel blieben im Vergleich zur gesamten Leber bis zum 12-Stunden-Zeitpunkt nach der Beschichtung beträchtlich, insbesondere für ASGR1 (Abbildung 5A, B). Der Ausprägungstrend stimmte mit einem früheren Bericht2 überein und deutete auf eine vergleichbare Gesundheit der primären Hepatozyten hin. Verschiedene Krankheitserreger zielen auf CD81, ein an die Hepatozytenmembran gebundenes Protein, ab, um ihren Eintritt in Zellen und Infektionen zu erleichtern, wie Hepatitis-Virus5, Plasmodium falciparum und Plasmodium yoelii 6. Andere Hepatozytenmembran-lokalisierte Proteine, wie TLR4 (Toll-like receptor 4), werden ebenfalls von Krankheitserregern angegriffen und sind wichtig für die Immunantwort der Hepatozyten7. Nach der Beschichtung war der Ausdruckspegel von CD81 bis 48 h konstant (Abbildung 5C). Das TLR4-Expressionsniveau stieg im Allgemeinen an, jedoch erst nach 48 h, als es ein höheres Niveau als in vivo erreichte (Abbildung 5D). Diese deuten darauf hin, dass primäre Hepatozyten, die durch dieses Protokoll isoliert wurden, auch für CD81- und TLR4-Studien innerhalb von mindestens 48 h nach der Beschichtung verwendet werden können. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass isolierte primäre Hepatozyten für die Verwendung in Studien im Zusammenhang mit pharmazeutischen Biomarkern gültig sind. Es ist erwähnenswert, dass RNA- und Proteinspiegel aufgrund von Einflüssen aus posttranskriptionellen Aktivitäten wie Signalpeptid-induzierter RNA-Migration, posttranslationaler Modifikation und / oder Proteinabbau inkonsistent sein können. Daher kann die Überprüfung der Proteinebene und der Bioaktivität von pharmazeutischen Biomarkern, die durch mRNA identifiziert wurden, erforderlich sein, wenn dies nach dem experimentellen Paradigma erforderlich ist.
Isolierte primäre Hepatozyten waren insulinsensitiv
Die primäre Hepatozytenleistung in Experimenten zum Glukosestoffwechsel wurde ebenfalls analysiert. Insulin, ein Hormon, das eine zentrale Rolle im Glukosestoffwechsel spielt, senkt den Glukosespiegel und fördert die Aufnahme und Speicherung von Leberglukose durch Phosphorylierung von AKT und FOXO1 (Gabelkopfbox O1). Daher wurde ein Insulinsensitivitätstest mit isolierten primären Hepatozyten durchgeführt. Nach 16 h waren die Zellen für 3 h mit einem serumfreien Medium verhungert. Bei den letzten 0,5 h Hunger wurden dem Kulturmedium 100 nM Insulin verabreicht. Wie in Abbildung 6A-C gezeigt, förderte Insulin signifikant die Phosphorylierung sowohl von AKT bei Ser473 als auch von FOXO1 bei Ser256, was auf die Empfindlichkeit der primären Hepatozyten gegenüber Insulin hinweist. Dies deutet darauf hin, dass die isolierten primären Hepatozyten aus dem vorliegenden Protokoll in Insulin- / Glukosestoffwechselstudien nützlich sind.
Isolierte primäre Hepatozyten waren in der Lage, Glukose zu produzieren
Sie sind nicht nur ein Zentrum für die Glukosespeicherung, sondern Hepatozyten sind auch für die Glukoseproduktion verantwortlich. Um zu testen, ob die primären Hepatozyten, die wir isoliert haben, in Studien zur Glukoseproduktion nützlich sind, wurden die Zellen in Gegenwart von Glucagon 10 h lang verhungert, um die Glukoseproduktion zu stimulieren. Das Hungermedium wurde dann für den Glukosetest gesammelt, während Zellen für Western Blot geerntet wurden. Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (PEPCK) ist ein wesentlicher Bestandteil der Leberglukoseproduktion und kontrolliert ihre Rate8. Der Proteinspiegel von PEPCK war nach der Behandlung mit Glucagon signifikant erhöht, was darauf hindeutet, dass der Glukoseproduktionsweg aktiviert wurde (Abbildung 7A, B). Diese Aktivierung wurde auch durch eine erhöhte Glukoseproduktion bestätigt (Abbildung 7C). Dieses Phänomen wurde auch mit anderen Stimulatoren der Glukoseproduktion wie Forskolin plus IBMX bestätigt (Abbildung 7A-C). Aufgrund der Einschränkung dieses Experiments konnten wir jedoch nicht überprüfen, ob die Glukoseproduktion über die Glukoneogenese exklusiv war oder ob es auch eine Komponente der Glykogenolyse gibt.
Abbildung 1: Bench-Setup . (A) Das Bench-Setup für die primäre Hepatozyten-Isolierung. (B) Die karikaturierte Tischeinrichtung für die primäre Hepatozytenisolierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Mausdissektion, Perfusion und primäre Hepatozytenreinigung. (A) Die sezierte Maus, mit Pfeilen, die auf die Leber, IVC und Pfortader zeigen. (B) Kathetereinführung in IVC. (C) Druckpfortader mit Vergrößerung und Steifigkeit der Leberlopen, was auf eine erfolgreiche Perfusion hinweist. (D) Erweichte Leberlopen nach der Perfusion, was auf den Erfolg der Kollagenase-Verdauung hinweist. (E) Die Position der Gallenblase in der isolierten Leber (Pfeil, der auf die Gallenblase zeigt). (F) Entfernung der Gallenblase. (G) Aufgerissene Leber in Hepatozyten-Waschmedium. (H) Mischen von 1x Percoll-HBSS mit gefiltertem primärem Hepatozyten vor der Zentrifuge. (I, J) primäres Hepatozytenpellet nach der Zentrifuge. (K) Primäre Hepatozyten-Resuspension im Hepatozyten-Waschmedium. (L, M) Primäres Hepatozytenpellet, das nach der Zentrifuge im Hepatozyten-Waschmedium gebildet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Primäre Hepatozyten nach der Beschichtung. Die Bilder wurden nach (A)1 h, (B, C) 12 h, (D) 24 h, (E) 36 h, (F) 48 h, (G) 72 h und (H) 96 h primärer Hepatozytenbeschichtung aufgenommen. Maßstabsleiste = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Verbesserte Reinheit der primären Hepatozyten nach der Isolierung. RNA wurde vor (aus der gesamten Leber) und danach (aus isolierten primären Hepatozyten) primärer Hepatozytenisolation isoliert, gefolgt von einer umgekehrten Transkriptions-PCR gemäß einem früheren Protokoll9. Die primäre Hepatozytenreinheit wurde mittels real-time PCR mit Primern für Hepatozytenmarker (A) TTR, (B) CD95, (C) ASGR1 und (D) ASGR2 sowie mit Immunzellmarker (E) CD45, (F) Sternzellmarker COL1A1 und (G) Endothelzellmarker TIE2 bewertet. (H) Für die Expressionsänderungen von Zelltypmarkern vor und nach der primären Hepatozytenisolierung wurde eine Heatmap generiert. GAPDH (Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase) wurde als interne Kontrolle verwendet. Primer, die hier verwendet wurden, waren für Gene (Primersequenzen sind in Tabelle 2 aufgeführt. Sequenzreferenzen werden hier zitiert): TTR10; CD9511; ASGR112; ASGR213; CD4514; COL1A115; TIE216; GAPDH17 Graphen und Heatmap wurden mit GraphPad Prism 8 generiert. Fehlerbalken zeigt Standardabweichung an, und zweischwänzige ungepaarte (da primäre Hepatozyten- und ganze Leberproben ungepaart waren, da dieses Protokoll zunächst intakte Leber erfordert) t-Testsignifikanz wird durch Sternchen angezeigt (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001). N=7. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Expression von pharmazeutischen Biomarkern. RNA wurde nach der Beschichtung aus der gesamten Leber und dem primären Hepatozyten isoliert, gefolgt von einer Reverse-Transkriptions-PCR. Die Expression von pharmazeutischen Biomarkern wurde mittels real-time PCR mit Primern für (A) ASGR1, (B) ASGR2, (C) CD81 und (D) TLR4 bewertet. GAPDH wurde als interne Kontrolle verwendet. Neue Primer, die hier verwendet wurden, waren für Gene (Primer-Sequenzen sind in Tabelle 2 aufgeführt. Sequenzreferenzen werden hier zitiert): CD8118; TLR419 Graphen wurden mit GraphPad Prism 8 generiert. N = 5. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Insulinsensitivität nach primärer Hepatozytenisolierung . (A) Western Blot von p-AKT (S473), AKT, p-FOXO1 (S256), FOXO1 und GAPDH nach Insulinbehandlung. (B) p-AKT (S473)/AKT in der Densitometrie von Western Blot. (C) p-FOXO1 (S256)/FOXO1 in der Densitometrie von Western Blot. Der Insulinsensitivitätstest wurde 16 h nach der primären Hepatozyten-Beschichtung durchgeführt. Primäre Hepatozyten wurden für 3 h in Williams E Medium (GlutaMAX Supplement) ohne FBS, aber mit 1% antimykotischer Lösung und mit 100 nM Insulinbehandlung in den letzten 30 Minuten verhungert, bevor sie für die Proteinlyse mit 1x RIPA-Puffer geerntet wurden. Graphen wurden mit GraphPad Prism 8 generiert. Western Blot Imaging wurde mit LI-COR Odyssey CLx durchgeführt. Der Fehlerbalken zeigt die Standardabweichung an, und die zweiseitig gepaarte t-Testsignkanz wird durch Sternchen angezeigt (* p < 0,05; ** p < 0,01). N = 4. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7: Glukoseproduktionsassay. (A) Western Blot von PEPCK und GAPDH nach Glucagon oder Forskolin+IBMX Behandlung für 10 h. (B) Densitometrie des PEPCK-Proteinspiegels im Vergleich zu GAPDH nach Behandlung mit Glucagon oder Forskolin+IBMX für 10 h. (C) Glukosespiegel im Vergleich zum Proteinspiegel nach einer Behandlung mit Glucagon oder Forskolin+IBMX für 10 h. Der Glukoseproduktionstest wurde 16 h nach der primären Hepatozytenplattierung durchgeführt. Primäre Hepatozyten wurden für 10 h in glukose- und phenolrotfreiem DMEM (zugegeben mit 2 mM L-Glutamin, 2 mM Natriumpyruvat, 20 mM Natrium-L-Lactat, 1% Pen Strep), entweder mit 50nM Glucagon oder 20 μM Forskolin und 200 μM IBMX. Das Medium wurde für die Glukosekonzentrationsmessung mit dem Glucose Assay Kit geerntet, während Protein für Western Blot geerntet wurde. Western Blot Imaging wurde mit LI-COR Odyssey CLx durchgeführt. Der Fehlerbalken zeigt die Standardabweichung an, und die zweiseitige gepaarte t-Testsignkanz wird durch Sternchen angezeigt (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001). N = 4. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Zentrifugationszeiten | Entfernung des Brustkorbs | Perfusion Buffers macht sich selbst | Chirurgischer Knoten | Lampenheizung | Plattenbeschichtung | Isolierte Zellmenge/Maus | Gradientenzentrifugation | Reinheitsmarker-Gene | |
| Derzeitiges Protokoll | 2 | Nein | Nein | Nein | Nein | Nein | 2,5–4 x 107 | Ja | TTR, CD95, ASGR1, ASGR2, CD45, COL1A1, TIE2 |
| Severgnini et al.2. | 4 | Ja | Ja | Ja | Ja | Ja | 1,8–2 x 107 | Nein | TTR, CD45, COL1A1, TIE2 |
| Gonçalves et al.24. | 5 oder 6 | Nein | Nein | Nein | Nein | Ja | 1–3 x 106 | Ja | CD45, CD95 |
| Li et al.20 | 4 oder 5 | Nein | Ja | Ja | Nein | Nicht erwähnt | 1–4 x 107 | Nein | N/A |
| Salem et al.21. | 3 | Nein | Ja | Nein | Nein | Nicht erwähnt | 2 x 107 | Ja | N/A |
| Cabral et al.22. | 3 oder 6 (mit Gradientenzentrifugation) | Nein | Ja | Ja | Nein | Ja/Empfohlen | N/A | Wahlfrei | N/A (Reinheit durch Lichtmikroskopie beurteilt) |
| Korelova et al.23. | 3 | Nein | Ja | Ja | Nein | Ja | N/A | Ja | N/A |
Tabelle 1: Vergleich der primären Hepatozytenprotokolle.
| Primer (vorwärts) | Primer (Rückseite) | Referenz | ||
| TTR Vorwärts 5'-3': AGCCCTTTGCCTCTGGGAAGAC | TTR Rückwärtsgang 5'-3': TGCGATGGTGTAGTGGCGATGG | 10 | ||
| CD95 Vorwärts 5'-3': ATGCACACTCTGCGATGAAG | CD95 Reverse 5'-3': CAGTGTTCACAGCCAGGAGA | 11 | ||
| ASGR1 Vorwärts 5'-3': GAGTCGAAGCTGGAAAAACAG | ASGR1 Umkehrung 5'-3': CCTTCATACTCCACCCAGTTG | 12 | ||
| ASGR2 Vorwärts 5'-3': CTACTGGTTTTCTCGGGATGG | ASGR2 Rückwärtsgang 5'-3': CAAATATGAAACTGGCTCCTGTG | 13 | ||
| CD45 Vorwärts 5'-3': GAACATGCTGCCAATGGTTCT | CD45 Rückwärts 5'-3': TGTCCCACATGACTCCTTTCC | 14 | ||
| COL1A1 Vorwärts 5'-3': GAAGCACGTCTGGTTTGGA | COL1A1 Rückwärts 5'-3': ACTCGAACGGGAATCCATC | 15 | ||
| TIE2 Vorwärts 5'-3': ATGTGGAAGTCGAGAGGCGAT | TIE2 Reverse 5'-3': CGAATAGCCATCCACTATTGTCC | 16 | ||
| GAPDH Vorwärts 5'-3': CGACTTCAACAGCAACTCCCACTCTTCC | GAPDH Umkehrung 5'-3': TGGGTGGTCCAGGGTTTCTTACTCCTT | 17 | ||
| CD81 Vorwärts 5'-3': CCAAGGCTGTGGTGAAGACTTTC | CD81 Reverse 5'-3': GGCTGTTCCTCAGTATGGTGGTAG | 18 | ||
| TLR4 Vorwärts 5'-3': ACCTGGCTGGTTTACACGTC | TLR4 Reverse 5'-3': CTGCCAGAGACATTGCAGAA | 19 | ||
Tabelle 2: Liste der Primer: Primer für die Gene TTR, CD95, ASGR1, ASGR2, CD45, COL1A1, TIE2, GAPDH, CD81 und TLR4
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Discussion
Verschiedene primäre Hepatozytenisolationsprotokolle wurden entwickelt. Sie wurden auch optimiert und an unterschiedliche Bedürfnisse angepasst (Tabelle 1). Isolationsprotokolle bestehen im Allgemeinen aus zwei Teilen: Perfusion (einschließlich Enzymaufschluss) und Reinigung.
Die Perfusion kann mit der gesamten Leber in vivo 2,20,21,22,23 oder mit sezierten Leberlappen 24 durchgeführt werden. Die Durchblutung von sezierten Lappen war zur technischen Erleichterung im Allgemeinen auf die linken und mittleren Lappen beschränkt. Theoretisch sollte die In-vivo-Perfusion aufgrund der Verwendung der gesamten Leber mit allen Lappen mehr primäre Hepatozyten ergeben. Die Leber während der Perfusion an Ort und Stelle zu halten, kann auch den Zelltod reduzieren, da Hepatozyten in vivo während dieses Schritts jederzeit in Flüssigkeit, entweder Blut oder Perfusionspuffern, gebadet werden können.
Auch die Aufrechterhaltung steriler Bedingungen spielt bei diesem Schritt eine wichtige Rolle. Wenn die Bedingung es zulässt, ist es besser, die Durchblutung in einer sauberen Haube durchzuführen. Alle Werkzeuge mit direkter Berührung des Gewebes sollten steril sein, was durch Autoklav erreicht werden kann. Um eine Kontamination durch Bakterien und Pilze zu verhindern, wurde dem Kulturmedium eine antibiotisch-antimykotische Lösung zugesetzt.
Die IVC und die Pfortader sind zwei Hauptgefäße, die die Leber mit anderen Organen verbinden. Die meisten Protokolle verwenden eine dieser Venen, um Nadeln für die Perfusion einzuführen: IVC 2,20,21,23, Pfortader 22. Die Position der Pfortader ist in einem schiefen Winkel, was zu Schwierigkeiten bei der Positionierung und Stabilisierung der eingeführten Nadel führt. Eine Naht wird daher normalerweise benötigt, um die Nadel mit einem chirurgischen Knoten an Ort und Stelle zu binden, was sehr vorsichtig gemacht werden muss, da die Vene anfällig für Schäden ist. Im Allgemeinen ist der Durchmesser der Pfortader auch kleiner als IVC, was das Einführen der Nadel erschwert. In Anbetracht dessen kann die Verwendung von IVC bequemer sein, obwohl in einigen Protokollen die Nadel auch chirurgisch mit dem IVC20 verknotet wird. Es wurde berichtet, dass die Perfusion mit IVC-Insertion zu weniger lebensfähigen primären Hepatozyten führte als die Pfortader25. Im vorliegenden Protokoll haben wir jedoch erfolgreich IVC-Insertion verwendet, und die isolierte primäre Hepatozytenlebensfähigkeit (>96% unter optimierten Bedingungen, gemessen mit Trypan Blue-Färbung gemäß dem Protokoll des Herstellers) war genauso hoch, wenn nicht mehr, als andere Protokolle (variiert zwischen 80% und 96% basierend auf Protokollen und Bedingungen 2,22,23,24).
Es gibt zwei Ziele für den Perfusionsschritt: Blut aus den Leberlappen zu spülen und die Leber zu verdauen, um primäre Hepatozyten freizusetzen. Um diese Ziele zu erreichen, sollten mindestens zwei Puffer verwendet werden, einer für den Blutfluss (Flux Buffer) und einer für die Verdauung (Digestion Buffer). Die meisten Protokolle bereiten HBSS-basierten Flussmittelpuffer vor und fügen Kollagenase hinzu, um ihn als Verdauungspuffer für die Verdauung geeignet zu machen. Die Herstellung dieser Puffer ist zeitaufwendig, und die Puffer können in einigen empfindlichen Eigenschaften, wie dem pH-Wert, von Charge zu Charge leicht variieren, wodurch ungebetene Variablen eingeführt werden. In Anbetracht dessen spart die Verwendung kommerziell verfügbarer Puffer wertvolle Arbeit und Zeit bei gleichzeitiger Minimierung dieser Variablen. Gibco entwickelte ein Protokoll zur primären Hepatozytenisolierung von erwachsenen Ratten26, basierend auf der Verwendung von kommerziell erhältlichem Leberperfusionsmedium (als Flussmittel) und Leberverdauungsmedium (als Verdauungspuffer). Maus und Ratte haben als Nagetiere hohe Ähnlichkeiten in den Körpereigenschaften; Man kann diese beiden rattenoptimierten Puffer in die primäre Hepatozytenisolierung der Maus integrieren. In der Tat, Gonçalves et al. 24, führte erfolgreich die Perfusion von sezierten Leberlappen mit diesen Puffern durch und erhöhte das Versprechen ihrer Verwendung bei der Leberperfusion in vivo. Hier testeten wir erfolgreich Leberperfusionsmedium und Leberverdauungsmedium im vorliegenden primären Hepatozytenprotokoll der Maus, das qualitativ hochwertige lebensfähige primäre Hepatozyten ergab (Abbildung 3 und Abbildung 4).
Die Temperatur des Perfusionspuffers bestimmt, wie gut primäre Hepatozyten die Isolierung überleben. Wenn die Temperatur zu hoch ist, kann die Kollagenase im Verdauungspuffer eine verminderte Aktivität haben; Wenn sie zu niedrig sind, können die primären Hepatozyten einen Kälteschock erleiden, was zu einer möglicherweise beeinträchtigten Isolationsausbeute führt. Die Zeit, die Puffer benötigt, um durch Perfusionsschläuche zu fließen, bestimmt auch die Temperatur des Puffers, wenn er die Leber erreicht. In früheren Protokollen wurden 40 °C2 oder 42 °C21 Wasserbäder verwendet. Diese Temperatur kann sich je nach Laborbedingungen wie Umgebungstemperatur, Länge des Perfusionsrohrs und Art der Peristaltikpumpe ändern. Im vorliegenden Protokoll haben wir nach mehrmaligem Testen die Wasserbadtemperatur auf 45 °C optimiert, um die Puffer aufzuwärmen.
Die Reinheit isolierter primärer Hepatozyten spielt in nachfolgenden Experimenten eine wichtige Rolle, denn je höher das Reinheitsverhältnis, desto weniger Interferenzen sind möglich. Obwohl die Leber hauptsächlich aus Hepatozyten besteht, die 60% -80% der Masse27 ausmachen, sind auch verschiedene Arten anderer Zellen vorhanden, wie Immunzellen, Sternzellen und Endothelzellen, die für die immunologischen Aktivitäten der Leber wichtig sind. Jede dieser Zellen könnte in späteren Experimenten eine potenzielle Interferenzposten 28. Zum Beispiel reagieren Sternzellen in der Leber auch auf Erregerinvasionen und Leberverletzungen, die an der Narbenbildung beteiligt sind29. In Zahlen werden 5% -8% der gesamten Leberzellpopulation von Sternzellen30 beigetragen. Normalerweise befinden sich stellare Zellen in Ruhe, aber dieser Status kann unterbrochen werden, wenn Spannungen vorhanden sind. Daher können Sternzellaktivitäten durch Spannungen ausgelöst werden, die während der Isolierung oder der anschließenden Behandlung auftreten, wenn einige dieser Zellen im endgültigen isolierten primären Hepatozytenpool verbleiben. Andere Zelltypen tragen ebenfalls zu einem beträchtlichen Teil der Leberzellpopulation bei, wie Lebersinusförmige Endothelzellen (LSECs), die 20% der gesamten Leberzellpopulationausmachen 31. Wie man das Vorhandensein dieser Zellen eliminiert, war ein rätselhafter Teil des primären Hepatozyten-Isolationsprozesses. Daher ist die Reinigung ein Schlüsselelement bei der primären Hepatozytenisolierung, die in der Regel die Gewichts- und Größenunterschiede zwischen verschiedenen Zelltypen ausnutzt. Durch die Optimierung der Zentrifugengeschwindigkeit und/oder des Reinigungspuffers können primäre Hepatozyten bis zum Boden des Röhrchens pelletiert werden.
Die Trennung von lebenden Zellen von toten Zellen ist auch entscheidend für die Gewinnung gesunder primärer Hepatozyten und eine genaue Zellzählung. Normalerweise ist das Zählen der Zellzahl nach der Reinigung ein Muss, da die Ergebnisse zahlreicher Experimente variieren, wenn sich der Zellzusammenfluss ändert. Gradientenzentrifugenreagenzien können in diesem Schritt verwendet werden, um diese Mission zu erfüllen, wie Percoll. 36%-40% von Percoll in Zentrifugenpellets reduzieren lebende Zellen und halten tote Zellen im Überstand. Wir haben die Zentrifugationsgeschwindigkeit und -zeit erfolgreich optimiert, um die nicht-primäre Hepatozytenzellpopulation im vorliegenden Protokoll zu reduzieren. Zelltypspezifische Marker wurden verwendet, um die Reinheit isolierter primärer Hepatozyten hier zu testen, wie bei anderen Protokollen. Die hier verwendeten Hepatozytenmarker waren TTR2, CD95 24,32, ASGR1 33 und ASGR2 34. Marker für andere Zelltypen sind CD45 (Immunzellmarker), COL1A1 (Stellatzellmarker), TIE2 (Endothelzellmarker)2,35. Mit diesen Markern zeigten die primären Hepatozyten, die mit dem vorliegenden Protokoll isoliert wurden, einen hohen Reinheitsgrad (Abbildung 4), vergleichbar mit den vorherigen Protokollen 2,24.
Während der Perfusion lockert Kollagenase im Verdauungspuffer die Bindung zwischen den Zellen, indem Kollagen in der extrazellulären Matrix abgebaut wird. Dies führt zu Schwierigkeiten bei der Zellerreichung während der Beschichtung. Die meisten der bisherigen Protokolle erfordern / empfehlen eine Vorbeschichtung von Platten mit Kollagen 2,22 oder Gelatine 24 für eine bessere Befestigung der primären Hepatozyten. Unseres Wissens nach haben Salem et al. 21 und Li et al. 20 diskutierten diesen Schritt nicht, andere in dieser Studie bewertete Protokolle erklärten / empfahlen eindeutig die Verwendung von vorbeschichteten Platten 2,22,23,24. Im vorliegenden Protokoll stellten wir fest, dass die Plattenbeschichtung für Platten bestimmter Typen nicht erforderlich war. Während wir nicht sicher sind, ob dies daran lag, dass verschiedene Arten von Platten, insbesondere wenn sie von verschiedenen Herstellern stammen, unterschiedliche Oberflächenglätte aufweisen und ob diese unterschiedliche Glätte, wenn überhaupt, eine wichtige Rolle bei der primären Hepatozytenbindung spielt, ist es vorteilhaft zu beachten, dass ein weiterer Schritt (Plattenbeschichtung) für die Wirksamkeit übersprungen werden kann. Es ist auch wichtig zu beachten, dass dieses Protokoll einen signifikanten Anteil an terminaldifferenzierten, z. B. diploiden Hepatozyten, zusammen mit mononukleären Hepatozyten erzeugt, ähnlich wie in vivo hepatisches Sinusoid.
In dieser Studie wurden die Vorteile früherer primärer Hepatozytenisolationsprotokolle kombiniert, und der Prozess wurde so weit wie möglich vereinfacht, indem kommerziell erhältliche Reagenzien verwendet und unnötige Schritte eliminiert wurden. Die Zentrifugationsschritte konnten erfolgreich auf zwei reduziert werden, was unseres Wissens die wenigsten in den veröffentlichten Protokollen ist. Um die Reinheit und Bioaktivität isolierter primärer Hepatozyten zu bestätigen, wurde das Niveau verschiedener Leberzellmarker bewertet, was bestätigt, dass das vorliegende Protokoll die Reinheit der primären Hepatozyten erheblich verbessern und andere Leberzellpopulationen wie Immunzellen, Sternzellen und Endothelzellen reduzieren könnte. Die Aktivität von pharmazeutischen Biomarkern wie ASGR1, ASGR2, CD81 und TLR4 war in primären Hepatozyten, die mit dem vorliegenden Protokoll isoliert wurden, gut erhalten, das auch die Insulinsensitivität und die Glukoseproduktionsaktivität bestätigte. Die Haupteinschränkung dieses Protokolls sind die Kosten, da alle Reagenzien aus Effizienzgründen kommerziell gekauft wurden. Wir haben nicht speziell überprüft, dass die Glykogenose in primären Hepatozyten, die mit dem vorliegenden Protokoll isoliert wurden, intakt war, und dies könnte weitere Forschung für verwandte Studien erfordern. Dieses Protokoll hat ähnliche Perfusionsschritte wie frühere, wie Salem et al.21, Severgnini et al.2 und Li et al.20 und Korelova et al.23, unter Verwendung von IVC-Insertion. Ihre Perfusions- und Verdauungspuffer, deren Vorbereitung zusätzliche Arbeit erfordern kann, können auch mit dem vorliegenden Protokoll mit geringer Modifikation der Enzymaufschlusszeit arbeiten. Daher kann die Kombination von Reagenzien früherer Protokolle mit Schritten des vorliegenden Protokolls ebenfalls von Vorteil sein, sowohl zeit- als auch wirtschaftlich freundlich.
Zusammenfassend wurde ein verbessertes zeit- und arbeitseffizientes Protokoll für die primäre Hepatozytenisolierung aus der Mausleber entwickelt. Dieses Protokoll verwendet vollständig kommerziell erhältliche Reagenzien und kann in ~ 35 Minuten abgeschlossen werden, von der Sezierung der Maus bis zur Beschichtung primärer Hepatozyten, wodurch eine nützliche Technik für primäre Hepatozyten-bezogene Studien bereitgestellt wird.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (Grant 5R01HD095512-02 to S.W.) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Gibco | 10010023 | |
| 10x HBSS | Gibco | 14065-056 | |
| 12-well Plate | FALCON | 353043 | Coating not required |
| 6-well Plate | FALCON | 353046 | Coating not required |
| anti-AKT | Cell Signaling | 2920S | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x), Stabilized | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| anti-FOXO1 | Cell Signaling | 97635S | |
| anti-GAPDH | Cell Signaling | 2118S | |
| anti-p-AKT (S473) | Cell Signaling | 9271L | |
| anti-PEPCK | Santa Cruz | SC-166778 | |
| anti-p-FOXO1 (S256) | Cell Signaling | 84192S | |
| Cell Strainer, 70 µm | CELLTREAT | 229483 | |
| Closed IV Catheter, 24 Gauge 0.75 IN | Becton Dickinson | 383511 | |
| DMEM, no glucose, no glutamine, no phenol red | ThermoFisher Scientific | A1443001 | |
| EnzyChrom Glucose Assay Kit | BioAssay Systems | EBGL-100 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
| Forskolin | MilliporeSigma | F3917-10MG | |
| Glucagon | Sigma-Aldrich | G2044 | |
| Goat Anti-mouse IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-68070 | |
| Goat Anti-rabbit IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-32211 | |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Software | NA | |
| Hepatocyte Wash Medium | Gibco | 17704-024 | |
| IBMX | Cell Signaling | 13630S | |
| Insulin | Lilly | NDC 0002-8215-01 | |
| Ketamine HCL (100 mg/mL) | Hospira Inc | NDC 0409-2051-05 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Liver Digest Medium | Gibco | 17703-034 | Aliquot within tissue culture hood to 25 mL each in 50 mL tube, and keep in -20 °C freezer |
| Liver Perfusion Medium | Gibco | 17701-038 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140122 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Peristaltic Pump | Gilson | Minipuls 2 | Capable of pumping at 4 mL/min |
| Petri Dish | Fisherbrand | 08-757-12 | |
| Refrigerated Centrifuge | Sorvall | Legend RT | Capable to centrifuge 50 mL tube at 4 °C |
| Sodium L-Lactate | Sigma-Aldrich | L7022 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| Syringe Filter, PVDF 0.45 µm 30mm diameter | CELLTREAT | 229745 | |
| Syringe, 0.5 mL | Becton Dickinson | 329461 | |
| Syringe, 60 mL | Becton Dickinson | 309653 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Tube, 15 mL | Corning | 430052 | |
| Tube, 50 mL | Corning | 430290 | |
| Water Bath Tank | Corning | CLS6783 | Or any water bath tank capable of heating up to 45 °C |
| William’s E Medium (GlutaMAX Supplement) | Gibco | 32551020 | |
| Xylozine (100 mg/mL) | Vetone Anased LA | NDC13985-704-10 |
References
- Han, H. S., Kang, G., Kim, J. S., Choi, B. H., Koo, S. H. Regulation of glucose metabolism from a liver-centric perspective. Experimental and Molecular Medicine. 48, 218 (2016).
- Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
- Guidotti, J. E., et al. Liver cell polyploidization: a pivotal role for binuclear hepatocytes. Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).
- Morales-Navarrete, H., et al. A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture. Elife. 4, 11214 (2015).
- Bruening, J., et al. Hepatitis C virus enters liver cells using the CD81 receptor complex proteins calpain-5 and CBLB. PLoS Pathogens. 14 (7), 1007111 (2018).
- Silvie, O., et al. Hepatocyte CD81 is required for Plasmodium falciparum and Plasmodium yoelii sporozoite infectivity. Nature Medicine. 9 (1), 93-96 (2003).
- Crispe, I. N.
- Liu, N. C., et al. Loss of TR4 orphan nuclear receptor reduces phosphoenolpyruvate carboxykinase-mediated gluconeogenesis. Diabetes. 56 (12), 2901-2909 (2007).
- Wang, Z., et al. Gonadotrope androgen receptor mediates pituitary responsiveness to hormones and androgen-induced subfertility. JCI Insight. 5 (17), 127817 (2019).
- Santos, S. D., et al. CSF transthyretin neuroprotection in a mouse model of brain ischemia. Journal of Neurochemistry. 115 (6), 1434-1444 (2010).
- Pinhu, L., et al. Overexpression of Fas and FasL is associated with infectious complications and severity of experimental severe acute pancreatitis by promoting apoptosis of lymphocytes. Inflammation. 37 (4), 1202-1212 (2014).
- Mi, Y., Lin, A., Fiete, D., Steirer, L., Baenziger, J. U. Modulation of mannose and asialoglycoprotein receptor expression determines glycoprotein hormone half-life at critical points in the reproductive cycle. Journal of Biological Chemistry. 289 (17), 12157-12167 (2014).
- Tanowitz, M., et al. Asialoglycoprotein receptor 1 mediates productive uptake of N-acetylgalactosamine-conjugated and unconjugated phosphorothioate antisense oligonucleotides into liver hepatocytes. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12388-12400 (2017).
- Manczak, M., et al. Neutralization of granulocyte macrophage colony-stimulating factor decreases amyloid beta 1-42 and suppresses microglial activity in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Human Molecular Genetics. 18 (20), 3876-3893 (2009).
- Zhang, Y., et al. JAK1-dependent transphosphorylation of JAK2 limits the antifibrotic effects of selective JAK2 inhibitors on long-term treatment. Annals of the Rheumatic Diseases. 76 (8), 1467-1475 (2017).
- Shih, S. C., et al.
- Liu, G., et al. miR-147, a microRNA that is induced upon Toll-like receptor stimulation, regulates murine macrophage inflammatory responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15819-15824 (2009).
- Ding, Q., et al. Mice expressing minimally humanized CD81 and occludin genes support Hepatitis C virus uptake in vivo. Journal of Virology. 91 (4), 01799 (2017).
- Renshaw, M., et al. Cutting edge: impaired Toll-like receptor expression and function in aging. Journal of Immunology. 169 (9), 4697-4701 (2002).
- Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
- Salem, E. S. B., et al. Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323 (2018).
- Cabral, F., et al. Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507 (2019).
- Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies. Malar Journal. 6, 169 (2007).
- Yin, Z., Ellis, E. C., Nowak, G. Isolation of mouse hepatocytes for transplantation: a comparison between antegrade and retrograde liver perfusion. Cell Transplant. 16 (8), 859-865 (2007).
- Hepatocyte media, Thermofisher. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/Hepatocyte_Media_UG.pdf (2021).
- Sia, D., Villanueva, A., Friedman, S. L., Llovet, J. M. Liver cancer cell of origin, molecular class, and effects on patient prognosis. Gastroenterology. 152 (4), 745-761 (2017).
- Freitas-Lopes, M. A., Mafra, K., David, B. A., Carvalho-Gontijo, R., Menezes, G. B. Differential location and distribution of hepatic immune cells. Cells. 6 (4), 48 (2017).
- Schachtrup, C., Le Moan, N., Passino, M. A., Akassoglou, K. Hepatic stellate cells and astrocytes: Stars of scar formation and tissue repair. Cell Cycle. 10 (11), 1764-1771 (2011).
- Geerts, A. History, heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells. Seminars in Liver Disease. 21 (3), 311-335 (2001).
- Poisson, J., et al. Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases. Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).
- Peter, M. E., et al. The CD95 receptor: apoptosis revisited. Cell. 129 (3), 447-450 (2007).
- Peters, D. T., et al. Asialoglycoprotein receptor 1 is a specific cell-surface marker for isolating hepatocytes derived from human pluripotent stem cells. Development. 143 (9), 1475-1481 (2016).
- Willoughby, J. L. S., et al. Evaluation of GalNAc-siRNA conjugate activity in pre-clinical animal models with reduced asialoglycoprotein receptor expression. Molecular Therapy. 26 (1), 105-114 (2018).
- Hutchins, N. A., Chung, C. S., Borgerding, J. N., Ayala, C. A., Ayala, A. Kupffer cells protect liver sinusoidal endothelial cells from Fas-dependent apoptosis in sepsis by down-regulating gp130. American Journal of Pathology. 182 (3), 742-754 (2013).
