Summary
Primære hepatocytter er et verdifullt verktøy for å studere leverrespons og metabolisme in vitro. Ved hjelp av kommersielt tilgjengelige reagenser ble det utviklet en forbedret tids- og arbeidseffektiv protokoll for mus primær hepatocytisolasjon.
Abstract
Primære hepatocytter brukes mye i leverin vitro forskning, spesielt i glukose metabolisme studier. En basisteknikk er tilpasset basert på ulike behov, som tid, arbeid, kostnader og primær hepatocyttbruk, noe som resulterer i ulike primære hepatocytisolasjonsprotokoller. Imidlertid er de mange trinnene og tidkrevende reagenspreparatene i primær hepatocytisolasjon store ulemper for effektivitet. Etter å ha sammenlignet forskjellige protokoller for fordeler og ulemper, ble fordelene ved hver av dem kombinert, og en rask og effektiv primær hepatocytisolasjonsprotokoll ble formulert. I løpet av bare ~ 35 min kan denne protokollen gi så mye, om ikke mer, sunne primære hepatocytter som andre protokoller. Videre validerte glukosemetabolismeforsøk utført ved hjelp av de isolerte primære hepatocyttene nytten av denne protokollen i in vitro levermetabolismestudier. Vi har også gjennomgått og analysert betydningen og formålet med hvert trinn i denne studien, slik at fremtidige forskere kan optimalisere denne protokollen ytterligere basert på behov.
Introduction
Leveren fungerer som en av de viktigste organene i virveldyrkroppen på grunn av den vitale rollen den spiller i mange livsstøttende funksjoner som mat fordøyelse, blodsirkulasjon og avgiftning. Bruk av musen primære hepatocyte in vitro kultur er stadig mer populært i studier av karbohydrat metabolisme og leverkarsinom. Derfor er det viktig å utvikle en praktisk metode for mus primær hepatocytisolasjon samtidig som den opprettholder sin medfødte fysiologiske funksjon. På grunn av sin funksjon som et knutepunkt for glukosemetabolisme, er leveren også sentral i glukoseproduksjon og lagring1. Eksperimenter med primære hepatocytter in vitro er et must for de fleste glukosemetabolismestudier. Derfor har ulike forskningsgrupper i årevis utviklet protokoller for mus primær hepatocytisolasjon.
Den generelle prosedyren for mus hepatocytisolasjon er å først skylle ut blod i leveren med en isosmotisk væske som fosfatbufret saltvann (PBS) eller Hanks ' Balansert saltoppløsning (HBSS) og deretter bruke kollagenaseholdig løsning for å dissosiere hepatocytter. Disse protokollene deler en generell prosedyre, men varierer i reagenser og trinn basert på forskjellige behov. Det tar imidlertid tid å forberede nødvendige reagenser og utføre isolasjonstrinn. I utviklingen av den nåværende protokollen ble effektivitet satt som en prioritet, med alle reagenser klare til bruk og tilgjengelig fra markedet, og så få trinn som mulig. Det overordnede målet med denne protokollen er å gi en rask og arbeidseffektiv metode for å isolere primære hepatocytter fra musen, uten å sette den isolerte primære hepatocyttrenheten og levedyktigheten i fare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer ble godkjent av Johns Hopkins Animal Care and Use Committee. C57BL/6 kvinnelige mus (8 uker gamle) ble brukt i denne studien.
1. Forberedelse:
- Bland Williams E Medium (GlutaMAX Supplement) med 10% FBS og 1% antibiotika-antimykotisk løsning for å gjøre kulturmediet.
- Filter 25 ml kollagenalisse-dispase medium (f.eks. liver digest medium) gjennom et 0,45 μm sprøytefilter for å fjerne partikkelavfall.
- Varm 50 ml dobbeltdestillert H2O (ddH2O), 35 ml perfusjonsmedium (f.eks. leverperfusjonsmedium) (eller 50 ml ved første gang ved hjelp av denne protokollen) og 25 ml filtrert kollagenalissedispasemedium i et 45 °C vannbad i 30 minutter.
- I en steril vevskultur hette blander du 2 ml 10x HBSS og 18 ml Percoll i et 50 ml rør for å lage 20 ml 1x Percoll-HBSS og holde på is eller 4 °C.
MERK: 1x Percoll-HBSS kan oppbevares ved 4 °C i minst 6 måneder. - I en steril vevskulturhette helles 30 ml vaskemedium (f.eks. Hepatocyte Wash Medium) i en ren Petri-tallerken og holder på is.
- Senk pumperøret ned i vannet i et 45 °C vannbad. Resultatene er mest pålitelige hvis romtemperaturen er ved 25 °C.
- Forbered 2 ml 1x bedøvelse ved å blande 225 μL Ketamin HCL, 93,75 μL Xylazine og 1681 μL 1x PBS.
- Bedøv én mus ved hjelp av en godkjent metode. Her ble musen intraperitonealt injisert med 150 μL 1x bedøvelse. Utfør testene for tap av reflekser som reaksjon på tåklemming for å sikre full anestesi.
- Fest musen på ryggen på disseksjonsmatten med fire lemmer, enten ved å feste eller bruke vanntett tape eller andre metoder godkjent av institusjonens dyrepleie- og brukskomité (eller tilsvarende).
- Forbered steriliserte tang og saks for disseksjon. For å unngå mulig forurensning, utfør alle trinnene i en steril hette.
2. Prosedyre:
- Bruk en peristaltisk pumpe til å begynne å pumpe opp oppvarmet ddH2O med en hastighet på 4 ml/min i 5 minutter. Bytt pumperøret fra vann til et oppvarmet perfusjonsmedium.
- Desinfiser den bedøvede musens underliv med 70% EtOH og kutt åpen med en saks for å eksponere leveren, portalvenen og dårligere vena cava (IVC).
- Stopp den peristaltiske pumpen. Sett inn et 24 G kateter (f.eks. lukket IV-kateter, 24 G, 0,75 IN) i IVC. Begynn å pumpe og kutt portalvenen åpen.
- Fortsett pumpingen til den utfelte væsken er klar (ca. 3-5 min). Trykk på portalvenen hvert minutt for å la væsken nå hvert hjørne av leveren. Pass på at du ikke lar luftbobler komme inn i IVC.
MERK: Dette trinnet er å skylle ut så mye blod som mulig fra leveren. - Bytt pumperøret fra perfusjonsmediet til kollagen-dispasemediet. Fortsett å pumpe til alle 25 ml av kollagen-dispase-mediet er utladet mens du gjør trinn 2.6.
- Trykk på portalvenen hvert minutt for å la væsken nå hvert hjørne av leveren.
MERK: På dette stadiet er det totale tapet av blod dødelig for musen. Musens død kan bekreftes av mangel på hjerteslag etter eksperimentet. Kast slaktkroppen i henhold til anleggets retningslinjer. - Isoler hele leveren ut uten galleblæren til 30 ml vaskemediet i Petri-parabolen på is.
- Riv den opp i stykker med tang for å frigjøre primære hepatocytter i løsningen. Dette trinnet ville gjøre vaskemediet til en overskyet løsning full av frigjorte primære hepatocytter og små leverstykker.
- Filtrer den uklare løsningen i trinn 2.8 gjennom en 70 μm cellesil inn i 20 ml 1x Percoll-HBSS i et 50 ml rør på is. Bland ved å invertere røret 20 ganger.
- Sentrifuge ved 300 x g i 10 min ved 4 °C.
- Innenfor vevskulturhetten aspirerer du supernatanten. Vask pelletsen med kaldt 30 ml vaskemedium.
- Sentrifuge ved 50 x g i 5 min ved 4 °C.
- Fjern supernatanten og resuspend pellet i 25 ml av kulturmediet (eller passende andre volumer) i vevskulturhetten.
- Tell cellenummeret og plate cellene på ønskede kulturplater i henhold til eksperimentell design.
MERK: Primære hepatocytter som er riktig isolert fra en 8 uker gammel mus, er vanligvis tilstrekkelig til å være belagt på fire 6-brønnsplater eller fire 12-brønnsplater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å teste effektiviteten ble den nåværende primære hepatocytisolasjonsprotokollen utført på 8 uker gamle kvinnelige C57BL / 6 mus. Vedlegget og renheten til isolerte primære hepatocytter ble testet. Primær hepatocytisolasjon brukes til et bredt spekter av eksperimenter på leverfysiologi, for eksempel levermedisinske effekter og glukosemetabolisme, farmasøytisk biomarkøraktivitet2, insulinfølsomhet og glukoseproduksjon. Derfor ble aktivitetene til de primære hepatocyttene isolert med denne protokollen testet i følgende eksperimenter.
Belegg var ikke nødvendig for primær hepatocyttfeste i gjeldende protokoll
Primære hepatocytter isolert ble belagt ved 5 x 105 celler/brønn på en 6-brønns plate. Etter 1 time ble det observert et fast vedlegg, og primære hepatocytter utvidet seg fullt ut 12 timer etter plating (figur 3). Dette indikerte at 12 timer etter plating var cellene klare til å bli brukt til eksperimenter. Basert på kjernen morfologi av mus hepatocytter i leveren, mononukleære hepatocytter ble beriket ved grenser, mens binuclear / polynukleære hepatocytter, en signatur av terminal differensiering, var i midten 3,4. En betydelig mengde celler avbildet viste typisk dual-nucleus (diploid) morfologi, noe som indikerer suksessen med å isolere og rense levende primære hepatocytter. Dette indikerer også at kollagenbelegg ikke er et krav for primær hepatocyttfeste med denne protokollen.
Renhet ble beriket i den isolerte primære hepatocyttpopulasjonen
Ulike celletypespesifikke genmarkører har blitt brukt i tidligere protokoller for å kontrollere isolert primær hepatocyttrrenhet (tabell 1). TTR (Transthyretin), CD95 (Cluster of differensiering 95, også kjent som Fas), ASGR1 (Asialoglycoprotein reseptor 1) og ASGR2 er markører for hepatocytter. Etter isolasjon ble mRNA-nivåene av disse hepatocyttmarkørene betydelig økt, sammenlignet med hele leveren (figur 4A-D,H).
Denne protokollen reduserte også forstyrrelsen fra andre leverceller sterkt. Tilstedeværelsen av immunceller, stellateceller og endotelceller var lavere, vist ved den kraftige reduksjonen av mRNA-nivåer av CD45 (immuncellemarkør), COL1A1 (Kollagen, type I, alfa 1, stellatecellemarkør) og TIE2 (Tunica interna endotelcellekinase, endotelcellemarkør), sammenlignet med hele leveren (figur 4E-H ). Disse antyder at denne protokollen kan rense den primære hepatocyttpopulasjonen fra leverceller og dermed redusere mulig interferens fra andre celletyper i eksperimenter.
Aktiviteten til farmasøytiske biomarkører ble bevart
Biomarkører på hepatocytter har blitt mye brukt til narkotikamålretting og levering. Aktivitetsbevaring av farmasøytiske biomarkører er dermed et sentralt punkt i primær hepatocytisolasjon og er en standard for å teste nytten av primær hepatocytisolasjon2. Hepatocytmarkører ASGR1 og ASGR2 brukes på denne måten2. Vi testet først tidskursuttrykksnivået til disse to markørene før og etter primær hepatocyt plating. Etter plating gikk mRNA-nivået betydelig ned med tiden, men nivåene forble betydelige sammenlignet med hele leveren til 12-timers tidspunktet etter plating, spesielt for ASGR1 (figur 5A, B). Uttrykksutviklingen var i samsvar med en tidligere rapport2 og indikerte sammenlignbar primær hepatocytthelse. Ulike patogener retter seg mot CD81, et hepatocyttmembranbundet protein, for å lette inngangen til celler og infeksjon, som hepatittvirus5, Plasmodium falciparum og Plasmodium yoelii6. Andre hepatocytmembran-lokaliserte proteiner, som TLR4 (Toll-lignende reseptor 4), er også målrettet av patogener og viktig for hepatocytt immunrespons7. Etter plating var uttrykksnivået til CD81 konsistent til 48 timer (figur 5C). TLR4-uttrykksnivået økte generelt, men ikke før etter 48 timer, da det nådde et nivå høyere enn in vivo (figur 5D). Disse antyder at primære hepatocytter isolert av denne protokollen også kan brukes til CD81- og TLR4-studier innen minst 48 timer etter plating. Sammen indikerer disse resultatene at primære hepatocytter isolert er gyldige for bruk i studier relatert til farmasøytiske biomarkører. Det er verdt å merke seg at RNA og proteinnivåer kan være inkonsekvente på grunn av påvirkninger fra posttrans transcriptionale aktiviteter som signalpeptidindusert RNA-migrasjon, posttranslasjonsmodifisering og / eller proteinforringelse. Derfor kan proteinnivå og bioaktivitetsverifisering av farmasøytiske biomarkører identifisert av mRNA være nødvendig hvis det kreves av det eksperimentelle paradigmet.
Isolerte primære hepatocytter var insulinfølsomme
Primær hepatocyttytelse i eksperimenter med glukosemetabolisme ble også analysert. Insulin, et hormon som spiller en sentral rolle i glukosemetabolismen, reduserer glukosenivået, fremmer leverglukoseopptak og lagring gjennom fosforylering AKT og FOXO1 (Forkhead box O1). Derfor ble det utført en insulinfølsomhetsanalyse med isolerte primære hepatocytter. Etter 16 timer ble cellene sultet i 3 timer, med et serumfritt medium. Ved siste 0,5 timers sult ble 100 nM insulin administrert til kulturmediet. Som vist i figur 6A-C, fremmet insulin signifikant fosforylering av både AKT ved Ser473 og FOXO1 ved Ser256, noe som indikerer følsomheten til primære hepatocytter til insulin. Dette antyder at de isolerte primære hepatocyttene fra den nåværende protokollen er nyttige i insulin / glukosemetabolismestudier.
Isolerte primære hepatocytter var i stand til glukoseproduksjon
Ikke bare er de et senter for glukoselagring, men hepatocytter er også ansvarlige for glukoseproduksjon. For å teste om de primære hepatocyttene vi isolerte er nyttige i studier av glukoseproduksjon, ble cellene sultet i 10 timer i nærvær av glukagon for å stimulere glukoseproduksjonen. Sultmediet ble deretter samlet inn for glukoseanalyse, mens celler ble høstet for vestlig blott. Fosfoenolpyruvat karboksykinase (PEPCK) er en viktig komponent i leverglukoseproduksjonen, og kontrollerer hastigheten8. Proteinnivået til PEPCK ble betydelig økt etter glukagonbehandling, noe som tyder på at glukoseproduksjonsveien ble aktivert (figur 7A,B). Denne aktiveringen ble ytterligere bekreftet av et økt nivå av glukoseproduksjon (figur 7C). Dette fenomenet ble også bekreftet med andre glukoseproduksjonstimulatorer som forskolin pluss IBMX (Figur 7A-C). På grunn av begrensningen av dette eksperimentet kunne vi imidlertid ikke bekrefte om glukoseproduksjonen var eksklusiv via glukoneogenese eller om det også er en komponent av glykogenolyse.
Figur 1: Benkoppsett. (A) Benkoppsettet for primær hepatocytisolasjon. (B) Det tegneseriede benkoppsettet for primær hepatocytisolasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Mus disseksjon, perfusjon og primær hepatocyttrensing. (A) Den dissekerte musen, med piler som peker mot leveren, IVC og portalvenen. (B) Kateterinnsetting i IVC. (C) Presserende portal vene forårsaker utvidelse og stivhet av leverloper, noe som indikerer vellykket perfusjon. (D) Mykede leverloper etter perfusjon, noe som indikerer suksessen med kollagenalisse fordøyelse. (E) Galleblærens posisjon i den isolerte leveren (pil som peker mot galleblæren). (F) Fjerning av galleblæren. (G) Revet lever i hepatocyttvaskemedium. (H) Blanding av 1x Percoll-HBSS med filtrert primær hepatocytt før sentrifuge. (I, J) primær hepatocytt pellet etter sentrifuge. (K) Primær hepatocytt resuspension i hepatocyttvaskemedium. (L, M) Primær hepatocytpellet dannet i hepatocyttvask medium etter sentrifuge. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Primære hepatocytter etter plating. Bilder ble tatt etter (A)1 t, (B, C) 12 h, (D) 24 h, (E) 36 h, (F) 48 h, (G) 72 h og (H) 96 h primær hepatocytt plating. Skalalinje = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Forbedret primær hepatocyttrenhet etter isolasjon. RNA ble isolert før (fra hele leveren) og etter (fra isolerte primære hepatocytter) primær hepatocytisolasjon, etterfulgt av omvendt transkripsjon PCR, i henhold til en tidligere protokoll9. Den primære hepatocyttrenheten ble vurdert av sanntids PCR med primere for hepatocytmarkører (A) TTR , (B) CD95, (C) ASGR1 og (D) ASGR2, samtidig som de var med immuncellemarkør (E) CD45, (F) Stellate cellemarkør COL1A1 og (G) endotelcellemarkør TIE2. (H) Varmekart ble generert for uttrykket endringer av celle type markører før og etter primær hepatocytisolasjon. GAPDH (Glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase) ble brukt som internkontroll. Primere som ble brukt her var for gener (Primer-sekvenser er i tabell 2. Sekvensreferanser er sitert her): TTR10; CD9511; ASGR112; ASGR213; CD4514; COL1A115; TIE216; GAPDH17. Grafer og varmekart ble generert med GraphPad Prism 8. Feillinjen angir standardavvik og tosidig uparret (siden primære hepatocytt- og hele leverprøver ble unpaired fordi denne protokollen krever intakt lever til å begynne med) t-test signifikans er indikert av stjerner (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001). N=7. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Uttrykk for farmasøytiske biomarkører. RNA ble isolert fra hele leveren og primær hepatocytt etter plating, etterfulgt av omvendt transkripsjon PCR. Uttrykket av farmasøytiske biomarkører ble vurdert av sanntids PCR med primere for (A) ASGR1, (B) ASGR2, (C) CD81 og (D) TLR4. GAPDH ble brukt som internkontroll. Nye primere som ble brukt her var for gener (Primer-sekvenser er i tabell 2. Sekvensreferanser er sitert her): CD8118; TLR419. Grafer ble generert med GraphPad Prism 8. N = 5. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Insulinfølsomhet bevart etter primær hepatocytisolasjon. (A) Vestlig flekk av p-AKT (S473), AKT, p-FOXO1 (S256), FOXO1 og GAPDH etter insulinbehandling. (B) p-AKT (S473)/AKT i densitometri av vestlig flekk. (C) p-FOXO1 (S256)/FOXO1 i densitometri av vestlig flekk. Insulinfølsomhetsanalyse ble utført 16 timer etter primær hepatocyttbelegg. Primære hepatocytter ble sultet i 3 timer i Williams E Medium (GlutaMAX Supplement) uten FBS, men med 1% antibiotika-antimykotisk løsning og med 100 nM insulinbehandling på de siste 30 min, før de ble høstet for proteinlys med 1x RIPA buffer. Grafer ble generert med GraphPad Prism 8. Western blot avbildning ble utført med LI-COR Odyssey CLx. Feillinjen indikerer standardavvik, og to-tailed parret t-test signifikans er indikert av stjerner (* p < 0,05; ** p < 0,01). N = 4. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Glukoseproduksjonsanalyse. (A) Vestlig blott av PEPCK og GAPDH etter glukagon eller forskolin +IBMX behandling i 10 h. (B) Densitometri av PEPCK proteinnivå sammenlignet med GAPDH etter enten glukagon eller forskolin + IBMX behandling i 10 h. (C) Glukosenivå sammenlignet med proteinnivå etter enten glukagon eller forskolin + IBMX behandling i 10 t. Glukoseproduksjonsanalyse ble utført 16 timer etter primær hepatocyttbelegg. Primære hepatocytter ble sultet i 10 timer i glukose- og fenol rødfri DMEM (tilsatt med 2 mM L-Glutamin, 2 mM natriumpyuvatt, 20 mM natrium L-laktat, 1% pen strep), med enten 50nM glukagon eller 20 μM forskolin og 200 μM IBMX. Mediet ble høstet for glukosekonsentrasjonsmåling med glukoseanalysesett, mens protein ble høstet for vestlig blott. Western blot imaging ble utført med LI-COR Odyssey CLx. Feillinjen indikerer standardavvik, og to-tailed parvis t-test signifikans er indikert av stjerner (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001). N = 4. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Sentrifugeringstider | Fjerning av ribbeinbur | Perfusjonsbuffere selvfremlegging | Kirurgisk knute | Lampe Oppvarming | Plate belegg | Isolert celleantall/mus | Gradert sentrifugering | Renhetsmarkørgener | |
| Gjeldende protokoll | 2 | Nei | Nei | Nei | Nei | Nei | 2,5–4 x 107 | Ja | TTR, CD95, ASGR1, ASGR2, CD45, COL1A1, TIE2 |
| Severgnini et al.2. | 4 | Ja | Ja | Ja | Ja | Ja | 1,8–2 x 107 | Nei | TTR, CD45, COL1A1, TIE2 |
| Gonçalves et al.24. | 5 eller 6 | Nei | Nei | Nei | Nei | Ja | 1–3 x 106 | Ja | CD45, CD95 |
| Li et al.20. | 4 eller 5 | Nei | Ja | Ja | Nei | Ikke nevnt | 1–4 x 107 | Nei | N/A |
| Salem et al.21. | 3 | Nei | Ja | Nei | Nei | Ikke nevnt | 2 x 107 | Ja | N/A |
| Cabral et al.22. | 3 eller 6 (med gradient sentrifugering) | Nei | Ja | Ja | Nei | Ja/anbefalt | N/A | Valgfri | I/T (Renhet vurdert ved lysmikroskopi) |
| Korelova et al.23. | 3 | Nei | Ja | Ja | Nei | Ja | N/A | Ja | N/A |
Tabell 1: Sammenligning av primære hepatocyttprotokoller.
| Primer (forover) | Primer (motsatt) | Referanse | ||
| TTR Fremover 5'-3': AGCCCTTTGCCTCTGGGAAGAC | TTR Revers 5'-3': TGCGATGGTGTAGTGGCGATGG | 10 | ||
| CD95 Fremover 5'-3': ATGCACACTCTGCGATGAAG | CD95 Omvendt 5'-3': CAGTGTTCACAGCCAGGAGA | 11 | ||
| ASGR1 Fremover 5'-3': GAGTCGAAGCTGGAAAAACAG | ASGR1 Omvendt 5'-3': CCTTCATACTCCACCCAGTTG | 12 | ||
| ASGR2 Fremover 5'-3': CTACTGGTTTTCTCGGGATGG | ASGR2 Omvendt 5'-3': CAAATATGAAACTGGCTCCTGTG | 13 | ||
| CD45 Fremover 5'-3': GAACATGCTGCCAATGGTTCT | CD45 Omvendt 5'-3': TGTCCCACATGACTCCTTTCC | 14 | ||
| COL1A1 Fremover 5'-3': GAAGCACGTCTGGTTTGGA | COL1A1 Omvendt 5'-3': ACTCGAACGGGAATCCATC | 15 | ||
| TIE2 Fremover 5'-3': ATGTGGAAGTCGAGAGGCGAT | TIE2 Omvendt 5'-3': CGAATAGCCATCCACTATTGTCC | 16 | ||
| GAPDH Fremover 5'-3': CGACTTCAACAGCAACTCCCACTCTTCC | GAPDH Revers 5'-3': TGGGTGGTCCAGGGTTTCTTACTCCTT | 17 | ||
| CD81 Fremover 5'-3': CCAAGGCTGTGGTGAAGACTTTC | CD81 Omvendt 5'-3': GGCTGTTCCTCAGTATGGTGGTAG | 18 | ||
| TLR4 Fremover 5'-3': ACCTGGCTGGTTTACACGTC | TLR4 Omvendt 5'-3': CTGCCAGAGACATTGCAGAA | 19 | ||
Tabell 2: Liste over primere: Primere som brukes til gener TTR, CD95, ASGR1, ASGR2, CD45, COL1A1, TIE2, GAPDH, CD81 og TLR4
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ulike primære hepatocytisolasjonsprotokoller er utviklet. De har også blitt holdt optimalisert og tilpasset basert på ulike behov (tabell 1). Isolasjonsprotokoller består vanligvis av to deler: perfusjon (inkludert enzym fordøyelse) og rensing.
Perfusjonen kan utføres med hele leveren in vivo 2,20,21,22,23 eller med dissekert leverlober 24. Perfusjonen av dissekerte lober var generelt begrenset til venstre og mellomstore lober for teknisk letthet. Teoretisk sett bør in vivo perfusjon gi mer primære hepatocytter på grunn av bruk av hele leveren med alle lober. Å holde leveren på plass under perfusjon kan også redusere celledød siden hepatocytter in vivo kan bades i væske, enten blod eller perfusjonsbuffere, til enhver tid i løpet av dette trinnet.
Vedlikehold av sterile forhold spiller også en viktig rolle i dette trinnet. Hvis tilstanden tillater det, er det bedre å utføre perfusjon i en ren hette. Alle verktøyene med direkte berøring til vev skal være sterile, noe som kan oppnås ved autoklav. For å forhindre forurensning fra bakterier og sopp ble en antibiotika-antimykotisk løsning tilsatt i kulturmediet.
IVC og portalvenen er to hovedfartøy som forbinder leveren med andre organer. De fleste protokoller bruker en av disse venene til å sette inn nåler for perfusjon: IVC 2,20,21,23, portal vene 22. Plasseringen av portalvenen er i skrå vinkel, noe som fører til vanskeligheter med å posisjonere og stabilisere den innsatte nålen. En sutur er derfor vanligvis nødvendig for å knytte nålen på plass med en kirurgisk knute, som må gjøres veldig nøye da venen er utsatt for skade. Vanligvis er diameteren på portalvenen også mindre enn IVC, noe som kompliserer nåleinnsetting. Tatt i betraktning dette kan bruken av IVC være mer praktisk, men i noen protokoller er nålen også kirurgisk knutet til IVC20. Det har blitt rapportert at perfusjon med IVC-innsetting resulterte i mindre levedyktige primære hepatocytter enn portalåre25. I den nåværende protokollen brukte vi imidlertid vellykket IVC-innsetting, og den isolerte primære hepatocytt levedyktigheten (>96% under optimaliserte forhold, målt med Trypan Blue-farging i henhold til produsentens protokoll) var like høy, om ikke mer, som andre protokoller (varierer mellom 80% og 96% basert på protokoller og forhold 2,22,23,24).
Det er to mål for perfusjonstrinnet: å skylle blod ut av leverlober og fordøye leveren for å frigjøre primære hepatocytter. For å oppnå disse målene, bør minst to buffere brukes, en for blodfluks (Flux Buffer) og en for fordøyelsen (fordøyelsesbuffer). De fleste protokollene forbereder HBSS-basert fluksbuffer og legger til kollagen i for å gjøre den i stand til fordøyelsen, som fordøyelsesbuffer. Utarbeidelsen av disse bufferne er tidkrevende, og bufferne kan variere noe i noen delikate egenskaper, som pH, fra batch til batch, og introduserer derfor ubudne variabler. Tatt i betraktning dette sparer bruk av kommersielt tilgjengelige buffere verdifull arbeidskraft og tid samtidig som disse variablene minimeres. Gibco utviklet en protokoll for primær hepatocytisolasjon fra voksne rotter26, basert på bruk av kommersielt tilgjengelig leverperfusjonsmedium (som fluxbuffer) og lever fordøyelsesmedium (som fordøyelsesbuffer). Mus og rotte, som gnagere, deler høye likheter i kroppsegenskaper; man kan integrere disse to rotteoptimaliserte bufferne i musens primære hepatocytisolasjon. Gonçalves et al. 24, vellykket utført perfusjon av dissekerte leverlober med disse bufferne, noe som øker løftet om bruk i leverperfusjon in vivo. Her testet vi vellykket Liver Perfusion Medium og Liver Digestion Medium i den nåværende musen primære hepatocyttprotokollen, som ga levedyktige primære hepatocytter av høy kvalitet (figur 3 og figur 4).
Temperaturen på perfusjonsbufferen bestemmer hvor godt primære hepatocytter overlever isolasjonen. Hvis temperaturen er for høy, kan kollagenasen i fordøyelsesbufferen ha redusert aktivitet; Hvis de er for lave, kan de primære hepatocyttene få kaldt støt og forårsake mulig kompromittert isolasjonsutbytte. Tiden bufferen tar å strømme gjennom perfusjonsrør bestemmer også temperaturen på bufferen når den når leveren. I tidligere protokoller ble det brukt 40 °C2 eller 42 °C21 vannbad. Denne temperaturen kan endres basert på laboratorieforhold, som miljøtemperatur, lengde på perfusjonsrøret og typen peristaltisk pumpe. I den nåværende protokollen, etter flere ganger testing, optimaliserte vi vannbadtemperaturen til å være 45 °C for å varme opp bufferne.
Renheten av isolerte primære hepatocytter spiller en viktig rolle i etterfølgende eksperimenter, da jo høyere renhetsforholdet er, jo mindre mulig forstyrrelser. Selv om leveren hovedsakelig består av hepatocytter, som står for 60% -80% ved masse27, er ulike typer andre celler også til stede, som immunceller, stellateceller og endotelceller, som er viktige for leverimmunologiske aktiviteter. Hver av disse cellene kan legge ut en potensiell interferens i senere eksperimenter28. For eksempel reagerer stellateceller i leveren også på patogeninvasjoner og leverskader, som involverer i arrdannelse29. I antall er 5%-8% av den totale levercellepopulasjonen bidratt av stellate celler30. Normalt er stellate celler i passiv, men denne statusen kan brytes når stress er til stede. Derfor kan stellate celleaktiviteter utløses av påkjenninger som innføres under isolasjon eller etterfølgende behandling hvis noen av disse cellene forblir i det endelige isolerte primære hepatocyttbassenget. Andre typer celler bidrar også til en betydelig del av levercellepopulasjonen, som lever sinusformede endotelceller (LSECs), som står for 20% av den totale levercellepopulasjonen31. Hvordan eliminere tilstedeværelsen av disse cellene har vært en forvirrende del i primær hepatocytisolasjonsprosess. Derfor er rensing en nøkkelrolle i primær hepatocytisolasjon, som vanligvis drar nytte av vekt- og størrelsesforskjellene mellom ulike typer celler. Ved å optimalisere sentrifugehastigheten og/eller rensebufferen, kan primære hepatocytter pelleteres ned til bunnen av røret.
Å skille levende celler fra døde celler er også avgjørende for å oppnå sunne primære hepatocytter og nøyaktig celletelling. Vanligvis er telling av cellenummer et must etter rensing siden resultatene av mange eksperimenter varierer etter hvert som cellesamløpet endres. Gradient sentrifuge reagenser kan brukes i dette trinnet for å oppfylle dette oppdraget, som Percoll. 36%-40% av Percoll i sentrifugepellets ned levende celler og holder døde celler i supernatant. Vi optimaliserte sentrifugeringshastigheten og tiden for å redusere den ikke-primære hepatocytcellepopulasjonen i den nåværende protokollen. Celletypespesifikke markører ble brukt til å teste renheten til isolerte primære hepatocytter her, som andre protokoller. Hepatocytmarkørene som ble brukt her var TTR2, CD9524,32, ASGR133 og ASGR234. Markører for andre typer celler inkluderer CD45 (immuncellemarkør), COL1A1 (Stellate cellemarkør), TIE2 (endotelcellemarkør)2,35. Med disse markørene viste de primære hepatocyttene isolert med den nåværende protokollen et høyt renhetsnivå (figur 4), som kan sammenlignes med de tidligere protokollene 2,24.
Under perfusjon løsner kollagen i fordøyelsesbufferen vedlegg mellom celler ved å bryte ned kollagen i den ekstracellulære matrisen. Dette fører til vanskeligheter med celleoppnåelse under plating. De fleste av de tidligere protokollene krever / anbefaler pre-belegg av plater med kollagen 2,22 eller gelatin24 for bedre festing av primære hepatocytter. Så vidt vi vet, mens Salem et al. 21 og Li et al. 20 diskuterte ikke dette trinnet, andre protokoller vurdert i denne studien uttalte tydelig / anbefalte bruk av forhåndsbelagte plater 2,22,23,24. I den nåværende protokollen fant vi ut at platebelegget ikke var nødvendig for plater av visse typer. Selv om vi ikke er sikre på om dette var fordi forskjellige typer plater, spesielt hvis de er fra forskjellige produsenter, har forskjellig overflateutjevning, og om denne varierte glattheten, hvis den noen gang eksisterer, spiller en viktig rolle i primært hepatocyttfeste, er det gunstig å merke seg slik at et annet trinn (platebelegg) kan hoppes over for effekt. Det er også viktig å merke seg at denne protokollen genererer en betydelig andel terminalt differensierte, for eksempel diploide hepatocytter, sammen med mononukleære hepatocytter, som ligner på in vivo lever sinusoid.
I denne studien ble fordelene ved tidligere primære hepatocytisolasjonsprotokoller kombinert, og prosessen ble forenklet så mye som mulig, ved hjelp av kommersielt tilgjengelige reagenser og eliminering av unødvendige trinn. Sentrifugeringstrinnene ble vellykket redusert til to, noe som er, så vidt vi vet, færrest i publiserte protokoller. For å bekrefte renheten og bioaktiviteten til isolerte primære hepatocytter ble nivået av ulike levercellemarkører vurdert, og bekreftet at den nåværende protokollen i stor grad kunne forbedre primær hepatocyttrenhet og redusere andre levercellepopulasjoner, for eksempel immunceller, stellateceller og endotelceller. Aktiviteten til farmasøytiske biomarkører som ASGR1, ASGR2, CD81 og TLR4 var godt bevart i primære hepatocytter isolert med nåværende protokoll, som også hadde bekreftet insulinfølsomhet og glukoseproduksjonsaktivitet. Hovedbegrensningen i denne protokollen er utgiftene siden alle reagenser ble kjøpt kommersielt for effektivitet. Vi bekreftet ikke spesifikt at glykogenose var intakt i primære hepatocytter isolert ved hjelp av den nåværende protokollen, og dette kan trenge ytterligere forskning for relaterte studier. Denne protokollen har lignende perfusjonstrinn som tidligere, som Salem et al.21, Severgnini et al.2 og Li et al.20, og Korelova et al.23, ved hjelp av IVC-innsetting. Deres perfusjons- og fordøyelsesbuffere, som kan kreve ekstra arbeidskraft for å forberede seg, kan også fungere med den nåværende protokollen med liten modifikasjon av enzym fordøyelsestid. Derfor kan det også være gunstig å kombinere reagenser av tidligere protokoller med trinn i den nåværende protokollen, både tids- og økonomisk vennlig.
Oppsummert ble det utviklet en forbedret tids- og arbeidseffektiv protokoll for primær hepatocytisolasjon fra muselever. Denne protokollen benytter kommersielt tilgjengelige reagenser helt og kan fullføres på ~ 35 min, fra dissekering av mus til plating primære hepatocytter, og gir dermed en nyttig teknikk til primære hepatocyttrelaterte studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (Grant 5R01HD095512-02 til S.W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Gibco | 10010023 | |
| 10x HBSS | Gibco | 14065-056 | |
| 12-well Plate | FALCON | 353043 | Coating not required |
| 6-well Plate | FALCON | 353046 | Coating not required |
| anti-AKT | Cell Signaling | 2920S | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x), Stabilized | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| anti-FOXO1 | Cell Signaling | 97635S | |
| anti-GAPDH | Cell Signaling | 2118S | |
| anti-p-AKT (S473) | Cell Signaling | 9271L | |
| anti-PEPCK | Santa Cruz | SC-166778 | |
| anti-p-FOXO1 (S256) | Cell Signaling | 84192S | |
| Cell Strainer, 70 µm | CELLTREAT | 229483 | |
| Closed IV Catheter, 24 Gauge 0.75 IN | Becton Dickinson | 383511 | |
| DMEM, no glucose, no glutamine, no phenol red | ThermoFisher Scientific | A1443001 | |
| EnzyChrom Glucose Assay Kit | BioAssay Systems | EBGL-100 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
| Forskolin | MilliporeSigma | F3917-10MG | |
| Glucagon | Sigma-Aldrich | G2044 | |
| Goat Anti-mouse IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-68070 | |
| Goat Anti-rabbit IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-32211 | |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Software | NA | |
| Hepatocyte Wash Medium | Gibco | 17704-024 | |
| IBMX | Cell Signaling | 13630S | |
| Insulin | Lilly | NDC 0002-8215-01 | |
| Ketamine HCL (100 mg/mL) | Hospira Inc | NDC 0409-2051-05 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Liver Digest Medium | Gibco | 17703-034 | Aliquot within tissue culture hood to 25 mL each in 50 mL tube, and keep in -20 °C freezer |
| Liver Perfusion Medium | Gibco | 17701-038 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140122 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Peristaltic Pump | Gilson | Minipuls 2 | Capable of pumping at 4 mL/min |
| Petri Dish | Fisherbrand | 08-757-12 | |
| Refrigerated Centrifuge | Sorvall | Legend RT | Capable to centrifuge 50 mL tube at 4 °C |
| Sodium L-Lactate | Sigma-Aldrich | L7022 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| Syringe Filter, PVDF 0.45 µm 30mm diameter | CELLTREAT | 229745 | |
| Syringe, 0.5 mL | Becton Dickinson | 329461 | |
| Syringe, 60 mL | Becton Dickinson | 309653 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Tube, 15 mL | Corning | 430052 | |
| Tube, 50 mL | Corning | 430290 | |
| Water Bath Tank | Corning | CLS6783 | Or any water bath tank capable of heating up to 45 °C |
| William’s E Medium (GlutaMAX Supplement) | Gibco | 32551020 | |
| Xylozine (100 mg/mL) | Vetone Anased LA | NDC13985-704-10 |
References
- Han, H. S., Kang, G., Kim, J. S., Choi, B. H., Koo, S. H. Regulation of glucose metabolism from a liver-centric perspective. Experimental and Molecular Medicine. 48, 218 (2016).
- Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
- Guidotti, J. E., et al. Liver cell polyploidization: a pivotal role for binuclear hepatocytes. Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).
- Morales-Navarrete, H., et al. A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture. Elife. 4, 11214 (2015).
- Bruening, J., et al. Hepatitis C virus enters liver cells using the CD81 receptor complex proteins calpain-5 and CBLB. PLoS Pathogens. 14 (7), 1007111 (2018).
- Silvie, O., et al. Hepatocyte CD81 is required for Plasmodium falciparum and Plasmodium yoelii sporozoite infectivity. Nature Medicine. 9 (1), 93-96 (2003).
- Crispe, I. N.
- Liu, N. C., et al. Loss of TR4 orphan nuclear receptor reduces phosphoenolpyruvate carboxykinase-mediated gluconeogenesis. Diabetes. 56 (12), 2901-2909 (2007).
- Wang, Z., et al. Gonadotrope androgen receptor mediates pituitary responsiveness to hormones and androgen-induced subfertility. JCI Insight. 5 (17), 127817 (2019).
- Santos, S. D., et al. CSF transthyretin neuroprotection in a mouse model of brain ischemia. Journal of Neurochemistry. 115 (6), 1434-1444 (2010).
- Pinhu, L., et al. Overexpression of Fas and FasL is associated with infectious complications and severity of experimental severe acute pancreatitis by promoting apoptosis of lymphocytes. Inflammation. 37 (4), 1202-1212 (2014).
- Mi, Y., Lin, A., Fiete, D., Steirer, L., Baenziger, J. U. Modulation of mannose and asialoglycoprotein receptor expression determines glycoprotein hormone half-life at critical points in the reproductive cycle. Journal of Biological Chemistry. 289 (17), 12157-12167 (2014).
- Tanowitz, M., et al. Asialoglycoprotein receptor 1 mediates productive uptake of N-acetylgalactosamine-conjugated and unconjugated phosphorothioate antisense oligonucleotides into liver hepatocytes. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12388-12400 (2017).
- Manczak, M., et al. Neutralization of granulocyte macrophage colony-stimulating factor decreases amyloid beta 1-42 and suppresses microglial activity in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Human Molecular Genetics. 18 (20), 3876-3893 (2009).
- Zhang, Y., et al. JAK1-dependent transphosphorylation of JAK2 limits the antifibrotic effects of selective JAK2 inhibitors on long-term treatment. Annals of the Rheumatic Diseases. 76 (8), 1467-1475 (2017).
- Shih, S. C., et al.
- Liu, G., et al. miR-147, a microRNA that is induced upon Toll-like receptor stimulation, regulates murine macrophage inflammatory responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15819-15824 (2009).
- Ding, Q., et al. Mice expressing minimally humanized CD81 and occludin genes support Hepatitis C virus uptake in vivo. Journal of Virology. 91 (4), 01799 (2017).
- Renshaw, M., et al. Cutting edge: impaired Toll-like receptor expression and function in aging. Journal of Immunology. 169 (9), 4697-4701 (2002).
- Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
- Salem, E. S. B., et al. Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323 (2018).
- Cabral, F., et al. Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507 (2019).
- Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies. Malar Journal. 6, 169 (2007).
- Yin, Z., Ellis, E. C., Nowak, G. Isolation of mouse hepatocytes for transplantation: a comparison between antegrade and retrograde liver perfusion. Cell Transplant. 16 (8), 859-865 (2007).
- Hepatocyte media, Thermofisher. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/Hepatocyte_Media_UG.pdf (2021).
- Sia, D., Villanueva, A., Friedman, S. L., Llovet, J. M. Liver cancer cell of origin, molecular class, and effects on patient prognosis. Gastroenterology. 152 (4), 745-761 (2017).
- Freitas-Lopes, M. A., Mafra, K., David, B. A., Carvalho-Gontijo, R., Menezes, G. B. Differential location and distribution of hepatic immune cells. Cells. 6 (4), 48 (2017).
- Schachtrup, C., Le Moan, N., Passino, M. A., Akassoglou, K. Hepatic stellate cells and astrocytes: Stars of scar formation and tissue repair. Cell Cycle. 10 (11), 1764-1771 (2011).
- Geerts, A. History, heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells. Seminars in Liver Disease. 21 (3), 311-335 (2001).
- Poisson, J., et al. Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases. Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).
- Peter, M. E., et al. The CD95 receptor: apoptosis revisited. Cell. 129 (3), 447-450 (2007).
- Peters, D. T., et al. Asialoglycoprotein receptor 1 is a specific cell-surface marker for isolating hepatocytes derived from human pluripotent stem cells. Development. 143 (9), 1475-1481 (2016).
- Willoughby, J. L. S., et al. Evaluation of GalNAc-siRNA conjugate activity in pre-clinical animal models with reduced asialoglycoprotein receptor expression. Molecular Therapy. 26 (1), 105-114 (2018).
- Hutchins, N. A., Chung, C. S., Borgerding, J. N., Ayala, C. A., Ayala, A. Kupffer cells protect liver sinusoidal endothelial cells from Fas-dependent apoptosis in sepsis by down-regulating gp130. American Journal of Pathology. 182 (3), 742-754 (2013).
