Summary
Primära hepatocyter är ett värdefullt verktyg för att studera leverrespons och metabolism in vitro. Med hjälp av kommersiellt tillgängliga reagenser utvecklades ett förbättrat tids- och arbetseffektivt protokoll för musens primära hepatocytisolering.
Abstract
Primära hepatocyter används i stor utsträckning i lever in vitro-forskning , särskilt i glukosmetabolismstudier. En basteknik har anpassats baserat på olika behov, som tid, arbetskraft, kostnad och primär hepatocytanvändning, vilket resulterar i olika primära hepatocytisoleringsprotokoll. De många stegen och tidskrävande reagenspreparaten i primär hepatocytisolering är emellertid stora nackdelar för effektiviteten. Efter att ha jämfört olika protokoll för deras fördelar och nackdelar kombinerades fördelarna med var och en, och ett snabbt och effektivt primärt hepatocytisoleringsprotokoll formulerades. Inom bara ~ 35 minuter kan detta protokoll ge lika mycket, om inte mer, friska primära hepatocyter som andra protokoll. Vidare validerade glukosmetabolismexperiment utförda med användning av de isolerade primära hepatocyterna användbarheten av detta protokoll i in vitro-levermetabolismstudier. Vi granskade och analyserade också i stor utsträckning betydelsen och syftet med varje steg i denna studie så att framtida forskare ytterligare kan optimera detta protokoll baserat på behov.
Introduction
Levern fungerar som ett av de viktigaste organen i ryggradsdjurens kropp på grund av den viktiga roll den spelar i många livsuppehållande funktioner som matsmältning, blodcirkulation och avgiftning. Användning av mus primär hepatocyt in vitro-kultur blir alltmer populär i studier av kolhydratmetabolism och leverkarcinom. Därför är det viktigt att utveckla en bekväm metod för mus primär hepatocytisolering samtidigt som den bibehåller sin medfödda fysiologiska funktion. På grund av sin funktion som ett nav för glukosmetabolism är levern också central för glukosproduktion och lagring1. Experiment med primära hepatocyter in vitro är ett måste för de flesta glukosmetabolismstudier. Därför har olika forskargrupper i åratal utvecklat protokoll för musens primära hepatocytisolering.
Det allmänna förfarandet för mushepatocytisolering är att först spola ut blod i levern med en isosmotisk vätska såsom fosfatbuffrad saltlösning (PBS) eller Hanks balanserade saltlösning (HBSS) och sedan använda kollagenasinnehållande lösning för att dissociera hepatocyter. Dessa protokoll delar en allmän procedur men skiljer sig åt i reagenser och steg baserat på olika behov. Det tar dock tid att förbereda nödvändiga reagenser och utföra isoleringssteg. Vid utvecklingen av det nuvarande protokollet fastställdes effektivitet som en prioritet, med alla reagenser färdiga att använda och tillgängliga från marknaden, och så få steg som möjligt. Det övergripande målet med detta protokoll är att tillhandahålla en snabb och arbetseffektiv metod för att isolera primära hepatocyter från musen utan att äventyra den isolerade primära hepatocytrenheten och livskraften.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden godkändes av Johns Hopkins Animal Care and Use Committee. C57BL/6 honmöss (8 veckor gamla) användes i denna studie.
1. Förberedelse:
- Blanda Williams E Medium (GlutaMAX Supplement) med 10% FBS och 1% antibiotika-antimykotisk lösning för att göra odlingsmediet.
- Filtrera 25 ml kollagenas-dispasmedium (t.ex. Liver Digest Medium) genom ett 0,45 μm sprutfilter för att avlägsna partikelskräp.
- Varmt 50 ml dubbeldestilleratH2O(ddH2O), 35 ml perfusionsmedium (t.ex. leverperfusionsmedium) (eller 50 ml vid första gången med detta protokoll) och 25 ml filtrerat kollagenas-dispasmedium i ett 45 ° C vattenbad i 30 min.
- Blanda 2 ml 10x HBSS och 18 ml Percoll i ett 50 ml rör för att göra 20 ml 1x Percoll-HBSS och håll på is eller 4 ° C.
OBS: 1x Percoll-HBSS kan förvaras vid 4 ° C i minst 6 månader. - Häll 30 ml tvättmedium (t.ex. Hepatocyte Wash Medium) i en ren petriskål i en steril vävnadsodlingskåpa och håll på is.
- Sänk ner pumpröret i vattnet i ett 45 °C vattenbad. Resultaten är mest tillförlitliga om rumstemperaturen är vid 25 ° C.
- Förbered 2 ml 1x anestetika genom att blanda 225 μL ketamin HCL, 93,75 μL xylazin och 1681 μL 1x PBS.
- Bedöva en mus med en godkänd metod. Här injicerades musen intraperitonealt med 150 μL 1x anestetika. Utför testerna för förlust av reflexer som reaktion på tåklämning för att säkerställa full anestesi.
- Fäst musen på ryggen på dissektionsplattan med fyra lemmar, genom att antingen fästa eller använda vattentät tejp eller andra metoder som godkänts av institutionens djurvårds- och användningskommitté (eller motsvarande).
- Förbered steriliserade pincett och sax för dissektion. För att undvika eventuell kontaminering, utför alla steg i en steril huva.
2. Förfarande:
- Använd en peristaltisk pump och börja pumpa uppvärmd ddH2O med en hastighet av 4 ml / min i 5 minuter. Byt pumpröret från vatten till ett uppvärmt perfusionsmedium.
- Desinficera den sövda musens buk med 70% EtOH och skär upp med en sax för att exponera levern, portalvenen och underlägsen vena cava (IVC).
- Stoppa den peristaltiska pumpen. Sätt i en 24 G kateter (t.ex. sluten IV-kateter, 24 G, 0,75 IN) i IVC. Börja pumpa och skär upp portalvenen.
- Fortsätt pumpa tills den utspolade vätskan är klar (cirka 3-5 min). Tryck på portalvenen varje minut för att låta vätska nå varje hörn av levern. Var försiktig så att du inte låter luftbubblor komma in i IVC.
OBS: Detta steg är att spola ut så mycket blod som möjligt från levern. - Byt pumpröret från perfusionsmediet till kollagenas-dispase-mediet. Fortsätt pumpa tills alla 25 ml av kollagenas-dispasmediet är utarmade medan du gör steg 2.6.
- Tryck på portalvenen varje minut för att låta vätska nå varje hörn av levern.
OBS: I detta skede är den fullständiga blodförlusten dödlig för musen. Musens död kan bekräftas av brist på hjärtslag efter experimentet. Kassera slaktkroppen enligt anläggningens policy. - Isolera hela levern utan gallblåsan till 30 ml tvättmedium i petriskålen på is.
- Riv upp den i bitar med pincett för att frigöra primära hepatocyter i lösning. Detta steg skulle förvandla tvättmediet till en grumlig lösning full av frigjorda primära hepatocyter och små leverbitar.
- Filtrera den grumliga lösningen i steg 2.8 genom en 70 μm cellsil i 20 ml 1x Percoll-HBSS i ett 50 ml rör på is. Blanda genom att invertera röret 20 gånger.
- Centrifug vid 300 x g i 10 min vid 4 °C.
- Inom vävnadsodlingshuven, aspirera supernatanten. Tvätta pelletsen med kallt 30 ml tvättmedium.
- Centrifug vid 50 x g i 5 min vid 4 °C.
- Ta bort supernatanten och återsuspendera pelletsen i 25 ml av odlingsmediet (eller lämpliga andra volymer) i vävnadsodlingshuven.
- Räkna cellnumret och platta cellerna på önskade odlingsplattor enligt den experimentella designen.
OBS: Primära hepatocyter som är ordentligt isolerade från en 8 veckor gammal mus är vanligtvis tillräckliga för att pläteras på fyra 6-brunnsplattor eller fyra 12-brunnsplattor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att testa effektiviteten utfördes det nuvarande primära hepatocytisoleringsprotokollet på 8 veckor gamla kvinnliga C57BL/6-möss. Bindningen och renheten hos isolerade primära hepatocyter testades. Primär hepatocytisolering används för en mängd olika experiment på leverfysiologi, såsom leverläkemedelseffekter och glukosmetabolism, farmaceutisk biomarköraktivitet2, insulinkänslighet och glukosproduktion. Därför testades aktiviteterna hos de primära hepatocyterna isolerade med detta protokoll i följande experiment.
Beläggning krävdes inte för primär hepatocytbindning i detta protokoll
Primära hepatocyter isolerade pläterades vid 5 x 105 celler / brunn på en 6-brunnsplatta. Efter 1 timme observerades en fast fastsättning och primära hepatocyter expanderade helt 12 timmar efter plätering (figur 3). Detta indikerade att 12 timmar efter plätering var cellerna redo att användas för experiment. Baserat på kärnmorfologin hos mushepatocyter i levern berikades mononukleära hepatocyter vid gränserna, medan binukleära / polynukleära hepatocyter, en signatur för terminal differentiering, var i mitten 3,4. En betydande mängd celler avbildade visade typisk dubbelkärnig (diploid) morfologi, vilket indikerar framgången med att isolera och rena levande primära hepatocyter. Detta indikerar också att kollagenbeläggning inte är ett krav för primär hepatocytbindning med detta protokoll.
Renheten berikades i den isolerade primära hepatocytpopulationen
Olika celltypsspecifika genmarkörer har använts i tidigare protokoll för att kontrollera isolerad primär hepatocytrenhet (tabell 1). TTR (Transthyretin), CD95 (Cluster of differentiation 95, även känd som Fas), ASGR1 (Asialoglycoprotein receptor 1) och ASGR2 är markörer för hepatocyter. Efter isolering ökade mRNA-nivåerna av dessa hepatocytmarkörer signifikant jämfört med hela levern (figur 4A-D,H).
Detta protokoll minskade också kraftigt störningen från andra leverceller. Närvaron av immunceller, stellatceller och endotelceller var lägre, vilket visades av den kraftiga minskningen av mRNA-nivåerna av CD45 (immuncellmarkör), COL1A1 (kollagen, typ I, alfa 1, stellatcellmarkör) och TIE2 (Tunica interna endotelcellkinas, endotelcellmarkör), jämfört med hela levern (Figur 4E-H ). Dessa tyder på att detta protokoll kan rena den primära hepatocytpopulationen från leverceller och därmed minska eventuell interferens från andra celltyper i experiment.
Aktiviteten hos farmaceutiska biomarkörer bevarades
Biomarkörer på hepatocyter har använts i stor utsträckning för läkemedelsinriktning och leverans. Aktivitetsbevarandet av farmaceutiska biomarkörer är således en nyckelpunkt i primär hepatocytisolering och är en standard för att testa användbarheten av primär hepatocytisolering2. Hepatocytmarkörer ASGR1 och ASGR2 används på detta sätt2. Vi testade först tidsförloppets uttrycksnivå för dessa två markörer före och efter primär hepatocytplätering. Efter plätering minskade deras mRNA-nivå avsevärt med tiden, men nivåerna förblev betydande jämfört med hela levern fram till 12 timmars tidpunkt efter plätering, särskilt för ASGR1 (figur 5A,B). Uttryckstrenden överensstämde med en tidigare rapport2 och indikerade jämförbar primär hepatocythälsa. Olika patogener riktar sig mot CD81, ett hepatocytmembranbundet protein, för att underlätta deras inträde i celler och infektion, som hepatitvirus5, Plasmodium falciparum och Plasmodium yoelii6. Andra hepatocytmembranbelägna proteiner, som TLR4 (Toll-like receptor 4), är också riktade mot patogener och viktiga för hepatocytimmunsvar7. Efter plätering var uttrycksnivån för CD81 konsekvent fram till 48 timmar (figur 5C). TLR4-uttrycksnivån ökade i allmänhet, men inte förrän efter 48 timmar, när den nådde en nivå högre än in vivo (figur 5D). Dessa tyder på att primära hepatocyter isolerade av detta protokoll också kan användas för CD81- och TLR4-studier inom minst 48 timmar efter plätering. Tillsammans indikerar dessa resultat att isolerade primära hepatocyter är giltiga för användning i studier relaterade till farmaceutiska biomarkörer. Det är värt att notera att RNA- och proteinnivåer kan vara inkonsekventa på grund av påverkan från posttranskriptionsaktiviteter som signalpeptidinducerad RNA-migration, posttranslationell modifiering och / eller proteinnedbrytning. Därför kan verifiering av proteinnivå och bioaktivitet av farmaceutiska biomarkörer som identifieras av mRNA vara nödvändig om det experimentella paradigmet kräver det.
Isolerade primära hepatocyter var insulinkänsliga
Primär hepatocytprestanda i experiment med glukosmetabolism analyserades också. Insulin, ett hormon som spelar en central roll i glukosmetabolismen, minskar glukosnivån, främjar leverglukosupptag och lagring genom fosforylerande AKT och FOXO1 (Forkhead box O1). Därför utfördes en insulinkänslighetsanalys med isolerade primära hepatocyter. Efter 16 timmar svältes cellerna i 3 timmar, med ett serumfritt medium. Vid de sista 0,5 h av svält administrerades 100 nM insulin till odlingsmediet. Som visas i figur 6A-C främjade insulin signifikant fosforyleringen av både AKT vid Ser473 och FOXO1 vid Ser256, vilket indikerar känsligheten hos primära hepatocyter för insulin. Detta tyder på att de isolerade primära hepatocyterna från det nuvarande protokollet är användbara i insulin / glukosmetabolismstudier.
Isolerade primära hepatocyter kunde glukosproduktion
De är inte bara ett centrum för glukoslagring, men hepatocyter är också ansvariga för glukosproduktionen. För att testa om de primära hepatocyterna vi isolerade är användbara i studier av glukosproduktion, svältes cellerna i 10 timmar i närvaro av glukagon för att stimulera glukosproduktionen. Svältmediet samlades sedan in för glukosanalys, medan celler skördades för western blot. Fosfoenolpyruvatkarboxykinas (PEPCK) är en viktig komponent i leverglukosproduktionen och kontrollerar dess hastighet8. Proteinnivån för PEPCK ökade signifikant efter glukagonbehandling, vilket tyder på att glukosproduktionsvägen aktiverades (figur 7A,B). Denna aktivering bekräftades ytterligare av en ökad nivå av glukosproduktion (figur 7C). Detta fenomen bekräftades också med andra glukosproduktionsstimulatorer som forskolin plus IBMX (Figur 7A-C). På grund av begränsningen av detta experiment kunde vi emellertid inte verifiera om glukosproduktionen var exklusiv via glukoneogenes eller om det också finns en komponent i glykogenolys.
Figur 1: Bänkinställning. (A) Bänkinställningen för primär hepatocytisolering. (B) Den tecknade bänkuppsättningen för primär hepatocytisolering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Musdissektion, perfusion och primär hepatocytrening. (A) Den dissekerade musen, med pilar som pekar på levern, IVC och portalvenen. (B) Kateterinsättning i IVC. (C) Tryckande portalven som orsakar förstoring och styvhet i leverloper, vilket indikerar framgångsrik perfusion. (D) Mjukade leverlopes efter perfusion, vilket indikerar framgången med kollagenas matsmältning. (E) Gallblåsans position i den isolerade levern (pil som pekar mot gallblåsan). (F) Borttagning av gallblåsan. (G) Riven lever i hepatocyttvättmedium. (H) Blandning av 1x Percoll-HBSS med filtrerad primär hepatocyt före centrifug. (I, J) primär hepatocytpellet efter centrifug. (K) Primär hepatocytåtersuspension inom hepatocyttvättmediet. (L, M) Primär hepatocytpellet bildad i hepatocyttvättmedium efter centrifug. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Primära hepatocyter efter plätering. Bilderna togs efter (A)1 h, (B, C) 12 h, (D) 24 h, (E) 36 h, (F) 48 h, (G) 72 h och (H) 96 h primär hepatocytplätering. Skala bar = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Förbättrad primär hepatocytrenhet efter isolering. RNA isolerades före (från hela levern) och efter (från isolerade primära hepatocyter) primär hepatocytisolering, följt av omvänd transkription PCR, enligt ett tidigare protokoll9. Den primära hepatocytrenheten bedömdes genom PCR i realtid med primrar för hepatocytmarkörer (A) TTR, (B) CD95, (C) ASGR1 och (D) ASGR2, samtidigt som den med immuncellsmarkör (E) CD45, (F) Stellatcellmarkör COL1A1 och (G) endotelcellmarkör TIE2. (H) Värmekarta genererades för uttrycksförändringar av celltypsmarkörer före och efter primär hepatocytisolering. GAPDH (glyceraldehyd 3-fosfatdehydrogenas) användes som intern kontroll. Primers som användes här var för gener (Primersekvenser finns i tabell 2. Sekvensreferenser citeras här): TTR10; CD9511; ASGR112; ASGR213; CD4514; COL1A115; SLIPS216; GAPDH17. Grafer och värmekarta genererades med GraphPad Prism 8. Felfältet indikerar standardavvikelse och två-tailed unpaired (eftersom primära hepatocyter och hela leverprover var oparade eftersom detta protokoll kräver intakt lever till att börja med) t-test signifikans indikeras med asterisker (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001). N = 7. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Uttryck av farmaceutiska biomarkörer. RNA isolerades från hela levern och primär hepatocyt efter plätering, följt av omvänd transkription PCR. Uttrycket av farmaceutiska biomarkörer bedömdes genom PCR i realtid med primers för (A) ASGR1, (B) ASGR2, (C) CD81 och (D) TLR4. GAPDH användes som intern kontroll. Nya primers som användes här var för gener (Primersekvenser finns i tabell 2. Sekvensreferenser citeras här): CD8118; TLR419. Grafer genererades med GraphPad Prism 8. N = 5. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Insulinkänslighet bevarad efter primär hepatocytisolering. (A) Western blot av p-AKT (S473), AKT, p-FOXO1 (S256), FOXO1 och GAPDH efter insulinbehandling. (B) p-AKT (S473)/AKT i densitometri av western blot. (C) p-FOXO1 (S256)/FOXO1 i densitometri av western blot. Insulinkänslighetsanalysen utfördes 16 timmar efter primär hepatocytplätering. Primära hepatocyter svältes i 3 timmar i Williams E Medium (GlutaMAX Supplement) utan FBS men med 1% antibiotika-antimykotisk lösning och med 100 nM insulinbehandling under de sista 30 min, innan de skördades för proteinlys med 1x RIPA-buffert. Grafer genererades med GraphPad Prism 8. Western blot imaging utfördes med LI-COR Odyssey CLx. Felfältet indikerar standardavvikelse, och två-tailed parade t-test signifikans indikeras av asterisker (* p < 0,05; ** p < 0,01). N = 4. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Analys av glukosproduktion. (A) Western blot av PEPCK och GAPDH efter glukagon eller forskolin + IBMX behandling för 10 timmar. (B) Densitometri av PEPCK proteinnivå jämfört med GAPDH efter antingen glukagon eller forskolin + IBMX behandling för 10 timmar. (C) Glukosnivå jämfört med proteinnivå efter antingen glukagon eller forskolin + IBMX behandling i 10 timmar. Glukosproduktionsanalys utfördes 16 timmar efter primär hepatocytplätering. Primära hepatocyter svältes i 10 timmar i glukos- och fenolrödfri DMEM (tillsatt med 2 mM L-glutamin, 2 mM natriumpyruvat, 20 mM natrium L-laktat, 1% Pen Strep), med antingen 50nM glukagon eller 20 μM forskolin och 200 μM IBMX. Mediet skördades för glukoskoncentrationsmätning med Glukosanalys kit, medan protein skördades för western blot. Western blot imaging utfördes med LI-COR Odyssey CLx. Felfältet indikerar standardavvikelse och två-tailed parade t-test signifikans indikeras av asterisker (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001). N = 4. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Centrifugeringstider | Borttagning av bröstkorg | Perfusion Buffers självskapande | Kirurgisk knut | Lampa uppvärmning | Platt beläggning | Isolerad cellmängd/mus | Gradient centrifugering | Gener för renhetsmarkörer | |
| Nuvarande protokoll | 2 | Nej | Nej | Nej | Nej | Nej | 2,5–4 x 107 | Ja | TTR, CD95, ASGR1, ASGR2, CD45, COL1A1, SLIPS2 |
| Severgnini et al.2. | 4 | Ja | Ja | Ja | Ja | Ja | 1,8–2 x 107 | Nej | TTR, CD45, COL1A1, TIE2 |
| Gonçalves et al.24. | 5 eller 6 | Nej | Nej | Nej | Nej | Ja | 1–3 x 106 | Ja | CD45, CD95 |
| Li et al.20. | 4 eller 5 | Nej | Ja | Ja | Nej | Nämns inte | 1–4 x 107 | Nej | Ej tidigare 2019 |
| Salem et al.21. | 3 | Nej | Ja | Nej | Nej | Nämns inte | 2 x 107 | Ja | Ej tidigare 2019 |
| Cabral et al.22. | 3 eller 6 (med gradientcentrifugering) | Nej | Ja | Ja | Nej | Ja/Rekommenderas | Ej tidigare 2019 | Valfri | N/A (Renhet bedömd med ljusmikroskopi) |
| Korelova et al.23. | 3 | Nej | Ja | Ja | Nej | Ja | Ej tidigare 2019 | Ja | Ej tidigare 2019 |
Tabell 1: Jämförelse av primära hepatocytprotokoll.
| Primer (framåt) | Primer (omvänd) | Hänvisning | ||
| TTR Forward 5'-3': AGCCCTTTGCCTCTGGGAAGAC | TTR Omvänd 5'-3': TGCGATGGTGTAGTGGCGATGG | 10 | ||
| CD95 Framåt 5'-3': ATGCACACTCTGCGATGAAG | CD95 Omvänd 5'-3': CAGTGTTCACAGCCAGGAGA | 11 | ||
| ASGR1 Framåt 5'-3': GAGTCGAAGCTGGAAAAACAG | ASGR1 Omvänd 5'-3': CCTTCATACTCCACCCAGTTG | 12 | ||
| ASGR2 Framåt 5'-3': CTACTGGTTTTCTCGGGGGGGG | ASGR2 Omvänd 5'-3': CAAATATGAAACTGGCTCCTGTG | 13 | ||
| CD45 Framåt 5'-3': GAACATGCTGCCAATGGTTCT | CD45 Omvänd 5'-3': TGTCCCACATGACTCCTTTCC | 14 | ||
| COL1A1 Forward 5'-3': GAAGCACGTCTGGTTTGGA | COL1A1 Omvänd 5'-3': ACTCGAACGGGAATCCATC | 15 | ||
| TIE2 Forward 5'-3': ATGTGGAAGTCGAGAGGCGAT | TIE2 Omvänd 5'-3': CGAATAGCCATCCACTATTGTCC | 16 | ||
| GAPDH Forward 5'-3': CGACTTCAACAGCAACTCCCACTCTTCC | GAPDH Omvänd 5'-3': TGGGTGGTCCAGGGTTTCTTACTCCTT | 17 | ||
| CD81 Framåt 5'-3': CCAAGGCTGTGGTGAAGACTTTC | CD81 Omvänd 5'-3': GGCTGTTCCTCAGTATGGTGGTAG | 18 | ||
| TLR4 Framåt 5'-3': ACCTGGCTGGTTTACACGTC | TLR4 Omvänd 5'-3': CTGCCAGAGACATTGCAGAA | 19 | ||
Tabell 2: Förteckning över primers: Primers som används för gener TTR, CD95, ASGR1, ASGR2, CD45, COL1A1, TIE2, GAPDH, CD81 och TLR4
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Olika primära hepatocytisoleringsprotokoll har utvecklats. De har också hållits optimerade och anpassade utifrån olika behov (tabell 1). Isoleringsprotokoll består i allmänhet av två delar: perfusion (inklusive enzymförtunning) och rening.
Perfusionen kan utföras med hela levern in vivo 2,20,21,22,23 eller med dissekerade leverlober 24. Perfusionen av dissekerade lober var i allmänhet begränsad till vänster och medium lobes för teknisk lätthet. Teoretiskt sett bör in vivo-perfusion ge mer primära hepatocyter på grund av användningen av hela levern med alla lober. Att hålla levern på plats under perfusion kan också minska celldöden eftersom hepatocyter in vivo kan badas i vätska, antingen blod eller perfusionsbuffertar, hela tiden under detta steg.
Underhållet av sterila förhållanden spelar också en viktig roll i detta steg. Om tillståndet tillåter är det bättre att genomföra perfusion i en ren huva. Alla verktyg med direkt beröring av vävnader ska vara sterila, vilket kan uppnås genom autoklav. För att förhindra kontaminering från bakterier och svampar tillsattes en antibiotika-antimykotisk lösning i odlingsmediet.
IVC- och portalvenen är två huvudkärl som förbinder levern med andra organ. De flesta protokoll använder någon av dessa vener för att sätta in nålar för perfusion: IVC 2,20,21,23, portalven22. Portalvenens position är i en sned vinkel, vilket leder till svårigheter att positionera och stabilisera den införda nålen. En sutur behövs därför vanligtvis för att binda nålen på plats med en kirurgisk knut, vilket måste göras mycket noggrant eftersom venen är benägen att skada. I allmänhet är portalvenens diameter också mindre än IVC, vilket komplicerar nåminsättning. Med tanke på detta kan användningen av IVC vara bekvämare, men i vissa protokoll är nålen också kirurgiskt knuten till IVC20. Det har rapporterats att perfusion med IVC-insättning resulterade i mindre livskraftiga primära hepatocyter än portalven25. Men i det nuvarande protokollet använde vi framgångsrikt IVC-insättning, och den isolerade primära hepatocytviabiliteten (>96% under optimerade förhållanden, mätt med Trypan Blue-färgning enligt tillverkarens protokoll) var lika hög, om inte mer, som andra protokoll (varierar mellan 80% och 96% baserat på protokoll och förhållanden 2,22,23,24).
Det finns två mål för perfusionssteget: att spola blod ur leverloberna och smälta levern för att frigöra primära hepatocyter. För att uppnå dessa mål bör minst två buffertar användas, en för blodflöde (Flux Buffer) och en för matsmältning (Digestion Buffer). De flesta protokollen förbereder HBSS-baserad Flux Buffer och lägger till kollagenas inuti för att göra det kapabelt för matsmältning, som Digestion Buffer. Beredningen av dessa buffertar är tidskrävande, och buffertarna kan variera något i vissa känsliga egenskaper, som pH, från sats till sats, vilket introducerar oinbjudna variabler. Med tanke på detta sparar användningen av kommersiellt tillgängliga buffertar värdefull arbetskraft och tid samtidigt som dessa variabler minimeras. Gibco utvecklade ett protokoll för primär hepatocytisolering från vuxna råttor26, baserat på användning av kommersiellt tillgängligt leverperfusionsmedium (som flödesbuffert) och leverförtunningsmedium (som matsmältningsbuffert). Mus och råtta, som gnagare, delar höga likheter i kroppsegenskaper; man kan integrera dessa två råttoptimerade buffertar i musens primära hepatocytisolering. Faktum är att Gonçalves et al. 24, framgångsrikt genomfört perfusion av dissekerade leverlober med dessa buffertar, vilket ökar löftet om deras användning vid leverperfusion in vivo. Här testade vi framgångsrikt Liver Perfusion Medium och Liver Digestion Medium i det nuvarande mus primära hepatocytprotokollet, vilket gav högkvalitativa livskraftiga primära hepatocyter (figur 3 och figur 4).
Temperaturen på perfusionsbufferten bestämmer hur väl primära hepatocyter överlever isoleringen. Om temperaturen är för hög kan kollagenaset i digestionsbufferten ha minskad aktivitet; Om de är för låga kan de primära hepatocyterna drabbas av kall chock, vilket orsakar eventuellt äventyrat isoleringsutbyte. Den tid det tar att flöda genom perfusionsslangar bestämmer också buffertens temperatur när den når levern. I tidigare protokoll användes 40 ° C2 eller 42 ° C21 vattenbad. Denna temperatur kan komma att ändras baserat på laboratorieförhållanden, som miljötemperaturen, perfusionsrörets längd och typen av peristaltisk pump. I det nuvarande protokollet, efter flera gånger av testning, optimerade vi vattenbadtemperaturen till 45 ° C för att värma upp buffertarna.
Renheten hos isolerade primära hepatocyter spelar en viktig roll i efterföljande experiment, eftersom ju högre renhetsförhållande desto mindre möjlig interferens. Även om levern huvudsakligen består av hepatocyter, som står för 60%-80% med massa27, är olika typer av andra celler också närvarande, som immunceller, stellatceller och endotelceller, som är viktiga för hepatisk immunologiska aktiviteter. Var och en av dessa celler kan lägga upp en potentiell störning i senare experiment28. Till exempel svarar stellatceller i levern också på patogeninvasioner och leverskador, som involverar i ärrbildning29. I siffror bidrar 5% -8% av den totala levercellpopulationen av stellatceller30. Normalt är stellatceller i lugn, men denna status kan brytas när spänningar är närvarande. Därför kan stellatcellsaktiviteter utlösas av påfrestningar som införs under isolering eller efterföljande behandling om några av dessa celler förblir i den slutliga isolerade primära hepatocytpoolen. Andra typer av celler bidrar också till en betydande del av levercellpopulationen, som lever sinusformade endotelceller (LSECs), som står för 20% av den totala levercellpopulationen31. Hur man eliminerar närvaron av dessa celler har varit en förbryllande del i primär hepatocytisoleringsprocess. Därför är rening en viktig del i primär hepatocytisolering, som vanligtvis drar nytta av vikt- och storleksskillnaderna mellan olika typer av celler. Genom att optimera centrifughastigheten och/eller reningsbufferten kan primära hepatocyter pelleteras ner till botten av röret.
Att separera levande celler från döda celler är också avgörande för att erhålla friska primära hepatocyter och noggrann cellräkning. Vanligtvis är räkning av cellnummer ett måste efter rening eftersom resultaten av många experiment varierar när cellkonfluensen förändras. Gradientcentrifugreagens kan användas i detta steg för att uppfylla detta uppdrag, som Percoll. 36%-40% av Percoll i centrifugpellets ner levande celler och håller döda celler i supernatant. Vi optimerade framgångsrikt centrifugeringshastighet och tid för att minska den icke-primära hepatocytcellpopulationen i det nuvarande protokollet. Celltypsspecifika markörer användes för att testa renheten hos isolerade primära hepatocyter här, liksom andra protokoll. De hepatocytmarkörer som användes här var TTR2, CD9524,32, ASGR133 och ASGR234. Markörer för andra typer av celler inkluderar CD45 (immuncellsmarkör), COL1A1 (Stellatcellmarkör), TIE2 (Endotelcellmarkör)2,35. Med dessa markörer visade de primära hepatocyterna isolerade med detta protokoll en hög renhetsnivå (figur 4), jämförbar med de tidigare protokollen 2,24.
Under perfusion lossar kollagenas i digestionsbufferten bindningen mellan celler genom att bryta ner kollagen i den extracellulära matrisen. Detta leder till svårigheter att uppnå celler under plätering. De flesta av de tidigare protokollen kräver/rekommenderar förbeläggning av plattor med kollagen 2,22 eller gelatin24 för bättre fastsättning av primära hepatocyter. Såvitt vi vet, medan Salem et al. 21 och Li et al. 20 diskuterade inte detta steg, andra protokoll som bedömdes i denna studie angav tydligt / rekommenderade användningen av förbelagda plattor 2,22,23,24. I det nuvarande protokollet fann vi att plattbeläggningen inte krävdes för plattor av vissa typer. Även om vi inte är säkra på om detta berodde på att olika typer av plattor, särskilt om de kommer från olika tillverkare, har olika ytjämnhet, och om denna varierade jämnhet, om den någonsin existerar, spelar en viktig roll vid primär hepatocytfästning, är det fördelaktigt att notera så att ett annat steg (plattbeläggning) kan hoppas över för effektivitet. Det är också viktigt att notera att detta protokoll genererar en betydande andel terminalt differentierade, t.ex. diploida hepatocyter, tillsammans med mononukleära hepatocyter, liknande in vivo lever-sinusoid.
I denna studie kombinerades fördelarna med tidigare primära hepatocytisoleringsprotokoll, och processen förenklades så mycket som möjligt, med användning av kommersiellt tillgängliga reagenser och eliminering av onödiga steg. Centrifugeringsstegen reducerades framgångsrikt till två, vilket såvitt vi vet är det minsta i publicerade protokoll. För att bekräfta renheten och bioaktiviteten hos isolerade primära hepatocyter bedömdes nivån av olika levercellmarkörer, vilket bekräftade att det nuvarande protokollet kraftigt kunde förbättra primär hepatocytrenhet och minska andra levercellpopulationer, såsom immunceller, stellatceller och endotelceller. Aktiviteten hos farmaceutiska biomarkörer som ASGR1, ASGR2, CD81 och TLR4 var välbevarad i primära hepatocyter isolerade med nuvarande protokoll, vilket också hade bekräftat insulinkänslighet och glukosproduktionsaktivitet. Huvudbegränsningen i detta protokoll är kostnaden eftersom alla reagenser köptes kommersiellt för effektivitet. Vi verifierade inte specifikt att glykogenos var intakt i primära hepatocyter isolerade med hjälp av detta protokoll, och detta kan behöva ytterligare forskning för relaterade studier. Detta protokoll har liknande perfusionssteg som tidigare, som Salem et al.21, Severgnini et al.2 och Li et al.20, och Korelova et al.23, med IVC-insättning. Deras perfusions- och matsmältningsbuffertar, som kan kräva extra arbete för att förbereda, kan också fungera med det nuvarande protokollet med liten modifiering av enzymets matsmältningstid. Därför kan det också vara fördelaktigt att kombinera reagenser av tidigare protokoll med steg i detta protokoll, både tids- och ekonomiskt vänligt.
Sammanfattningsvis utvecklades ett förbättrat tids- och arbetseffektivt protokoll för primär hepatocytisolering från muslever. Detta protokoll använder kommersiellt tillgängliga reagenser helt och kan slutföras på ~ 35 minuter, från dissekering av mus till plätering av primära hepatocyter, vilket ger en användbar teknik för primära hepatocytrelaterade studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (Grant 5R01HD095512-02 till S.W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Gibco | 10010023 | |
| 10x HBSS | Gibco | 14065-056 | |
| 12-well Plate | FALCON | 353043 | Coating not required |
| 6-well Plate | FALCON | 353046 | Coating not required |
| anti-AKT | Cell Signaling | 2920S | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x), Stabilized | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| anti-FOXO1 | Cell Signaling | 97635S | |
| anti-GAPDH | Cell Signaling | 2118S | |
| anti-p-AKT (S473) | Cell Signaling | 9271L | |
| anti-PEPCK | Santa Cruz | SC-166778 | |
| anti-p-FOXO1 (S256) | Cell Signaling | 84192S | |
| Cell Strainer, 70 µm | CELLTREAT | 229483 | |
| Closed IV Catheter, 24 Gauge 0.75 IN | Becton Dickinson | 383511 | |
| DMEM, no glucose, no glutamine, no phenol red | ThermoFisher Scientific | A1443001 | |
| EnzyChrom Glucose Assay Kit | BioAssay Systems | EBGL-100 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
| Forskolin | MilliporeSigma | F3917-10MG | |
| Glucagon | Sigma-Aldrich | G2044 | |
| Goat Anti-mouse IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-68070 | |
| Goat Anti-rabbit IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-32211 | |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Software | NA | |
| Hepatocyte Wash Medium | Gibco | 17704-024 | |
| IBMX | Cell Signaling | 13630S | |
| Insulin | Lilly | NDC 0002-8215-01 | |
| Ketamine HCL (100 mg/mL) | Hospira Inc | NDC 0409-2051-05 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Liver Digest Medium | Gibco | 17703-034 | Aliquot within tissue culture hood to 25 mL each in 50 mL tube, and keep in -20 °C freezer |
| Liver Perfusion Medium | Gibco | 17701-038 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140122 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Peristaltic Pump | Gilson | Minipuls 2 | Capable of pumping at 4 mL/min |
| Petri Dish | Fisherbrand | 08-757-12 | |
| Refrigerated Centrifuge | Sorvall | Legend RT | Capable to centrifuge 50 mL tube at 4 °C |
| Sodium L-Lactate | Sigma-Aldrich | L7022 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| Syringe Filter, PVDF 0.45 µm 30mm diameter | CELLTREAT | 229745 | |
| Syringe, 0.5 mL | Becton Dickinson | 329461 | |
| Syringe, 60 mL | Becton Dickinson | 309653 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Tube, 15 mL | Corning | 430052 | |
| Tube, 50 mL | Corning | 430290 | |
| Water Bath Tank | Corning | CLS6783 | Or any water bath tank capable of heating up to 45 °C |
| William’s E Medium (GlutaMAX Supplement) | Gibco | 32551020 | |
| Xylozine (100 mg/mL) | Vetone Anased LA | NDC13985-704-10 |
References
- Han, H. S., Kang, G., Kim, J. S., Choi, B. H., Koo, S. H. Regulation of glucose metabolism from a liver-centric perspective. Experimental and Molecular Medicine. 48, 218 (2016).
- Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
- Guidotti, J. E., et al. Liver cell polyploidization: a pivotal role for binuclear hepatocytes. Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).
- Morales-Navarrete, H., et al. A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture. Elife. 4, 11214 (2015).
- Bruening, J., et al. Hepatitis C virus enters liver cells using the CD81 receptor complex proteins calpain-5 and CBLB. PLoS Pathogens. 14 (7), 1007111 (2018).
- Silvie, O., et al. Hepatocyte CD81 is required for Plasmodium falciparum and Plasmodium yoelii sporozoite infectivity. Nature Medicine. 9 (1), 93-96 (2003).
- Crispe, I. N.
- Liu, N. C., et al. Loss of TR4 orphan nuclear receptor reduces phosphoenolpyruvate carboxykinase-mediated gluconeogenesis. Diabetes. 56 (12), 2901-2909 (2007).
- Wang, Z., et al. Gonadotrope androgen receptor mediates pituitary responsiveness to hormones and androgen-induced subfertility. JCI Insight. 5 (17), 127817 (2019).
- Santos, S. D., et al. CSF transthyretin neuroprotection in a mouse model of brain ischemia. Journal of Neurochemistry. 115 (6), 1434-1444 (2010).
- Pinhu, L., et al. Overexpression of Fas and FasL is associated with infectious complications and severity of experimental severe acute pancreatitis by promoting apoptosis of lymphocytes. Inflammation. 37 (4), 1202-1212 (2014).
- Mi, Y., Lin, A., Fiete, D., Steirer, L., Baenziger, J. U. Modulation of mannose and asialoglycoprotein receptor expression determines glycoprotein hormone half-life at critical points in the reproductive cycle. Journal of Biological Chemistry. 289 (17), 12157-12167 (2014).
- Tanowitz, M., et al. Asialoglycoprotein receptor 1 mediates productive uptake of N-acetylgalactosamine-conjugated and unconjugated phosphorothioate antisense oligonucleotides into liver hepatocytes. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12388-12400 (2017).
- Manczak, M., et al. Neutralization of granulocyte macrophage colony-stimulating factor decreases amyloid beta 1-42 and suppresses microglial activity in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Human Molecular Genetics. 18 (20), 3876-3893 (2009).
- Zhang, Y., et al. JAK1-dependent transphosphorylation of JAK2 limits the antifibrotic effects of selective JAK2 inhibitors on long-term treatment. Annals of the Rheumatic Diseases. 76 (8), 1467-1475 (2017).
- Shih, S. C., et al.
- Liu, G., et al. miR-147, a microRNA that is induced upon Toll-like receptor stimulation, regulates murine macrophage inflammatory responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15819-15824 (2009).
- Ding, Q., et al. Mice expressing minimally humanized CD81 and occludin genes support Hepatitis C virus uptake in vivo. Journal of Virology. 91 (4), 01799 (2017).
- Renshaw, M., et al. Cutting edge: impaired Toll-like receptor expression and function in aging. Journal of Immunology. 169 (9), 4697-4701 (2002).
- Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
- Salem, E. S. B., et al. Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323 (2018).
- Cabral, F., et al. Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507 (2019).
- Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies. Malar Journal. 6, 169 (2007).
- Yin, Z., Ellis, E. C., Nowak, G. Isolation of mouse hepatocytes for transplantation: a comparison between antegrade and retrograde liver perfusion. Cell Transplant. 16 (8), 859-865 (2007).
- Hepatocyte media, Thermofisher. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/Hepatocyte_Media_UG.pdf (2021).
- Sia, D., Villanueva, A., Friedman, S. L., Llovet, J. M. Liver cancer cell of origin, molecular class, and effects on patient prognosis. Gastroenterology. 152 (4), 745-761 (2017).
- Freitas-Lopes, M. A., Mafra, K., David, B. A., Carvalho-Gontijo, R., Menezes, G. B. Differential location and distribution of hepatic immune cells. Cells. 6 (4), 48 (2017).
- Schachtrup, C., Le Moan, N., Passino, M. A., Akassoglou, K. Hepatic stellate cells and astrocytes: Stars of scar formation and tissue repair. Cell Cycle. 10 (11), 1764-1771 (2011).
- Geerts, A. History, heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells. Seminars in Liver Disease. 21 (3), 311-335 (2001).
- Poisson, J., et al. Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases. Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).
- Peter, M. E., et al. The CD95 receptor: apoptosis revisited. Cell. 129 (3), 447-450 (2007).
- Peters, D. T., et al. Asialoglycoprotein receptor 1 is a specific cell-surface marker for isolating hepatocytes derived from human pluripotent stem cells. Development. 143 (9), 1475-1481 (2016).
- Willoughby, J. L. S., et al. Evaluation of GalNAc-siRNA conjugate activity in pre-clinical animal models with reduced asialoglycoprotein receptor expression. Molecular Therapy. 26 (1), 105-114 (2018).
- Hutchins, N. A., Chung, C. S., Borgerding, J. N., Ayala, C. A., Ayala, A. Kupffer cells protect liver sinusoidal endothelial cells from Fas-dependent apoptosis in sepsis by down-regulating gp130. American Journal of Pathology. 182 (3), 742-754 (2013).
