Summary
الهدف من هذا البروتوكول هو تقديم وجبات الدم المشتقة من الحيوانات والاصطناعية إلى بعوض Aedes aegypti من خلال مغذي غشاء اصطناعي وتحديد حجم الوجبة التي يتم تناولها بدقة.
Abstract
يمكن للإناث من أنواع البعوض معينة أن تنشر الأمراض أثناء عض المضيفين الفقاريات للحصول على وجبات الدم الغنية بالبروتين اللازمة لتطوير البيض. في المختبر، يمكن للباحثين تقديم وجبات الدم المشتقة من الحيوانات والاصطناعية للبعوض عن طريق مغذيات الأغشية، والتي تسمح بالتلاعب في تكوين الوجبات. هنا، نقدم طرقاً لتغذية الدم ووجبات الدم الاصطناعية إلى بعوض Aedes aegypti وتحديد الحجم الذي تستهلكه الإناث الفردية.
وللتغذية المستهدفة وتحديد كمي الوجبات الاصطناعية/الدم استخدامات واسعة النطاق، بما في ذلك اختبار آثار مكونات الوجبة على سلوك البعوض وعلم وظائف الأعضاء، وإيصال المركبات الدوائية دون حقن، وتصيب البعوض بمسببات محددة. إضافة صبغة الفلورسين إلى الوجبة قبل التغذية يسمح لحجم وجبة لاحقة. يمكن قياس حجم الوجبة التي يستهلكها البعوض إما بالوزن، إذا كان من المقرر استخدام الإناث في وقت لاحق للتجارب السلوكية، أو عن طريق تجانس الإناث الفردية في 96 بئرًا وقياس مستويات الفلوريسين باستخدام قارئ لوحة كمقايسة نقطة نهاية. يمكن استخدام القياس الكمي لحجم الوجبة لتحديد ما إذا كان تغيير مكونات الوجبة يغير حجم الوجبة أو إذا كان استهلاك الوجبة يختلف بين سلالات البعوض. كما أن القياس الكمي الدقيق لحجم الوجبة أمر بالغ الأهمية بالنسبة للمقايسات المصبية، مثل تلك التأثيرات على جاذبية المضيف أو البراز. يمكن تكييف الطرق المعروضة هنا لتتبع هضم الوجبات على مدار الأيام أو لتشمل علامات مميزة متعددة تضاف إلى وجبات مختلفة (مثل الرحيق والدم) لتحديد استهلاك كل وجبة من قبل بعوضة واحدة.
هذه الطرق تسمح للباحثين بإجراء قياسات عالية الإنتاجية بشكل فردي لمقارنة حجم الوجبات التي يستهلكها مئات البعوض الفردي. ولذلك، ستكون هذه الأدوات مفيدة على نطاق واسع لمجتمع الباحثين في مجال البعوض للإجابة على أسئلة بيولوجية متنوعة.
Introduction
نقدم بروتوكولًا لتغذية وجبات الدم المعدلة إلى بعوض Aedes aegypti باستخدام وحدة تغذية غشاء اصطناعي وقياس حجم الوجبات التي يستهلكها كل بعوضة على حدة على وجه التحديد. يمكن تكييف هذا البروتوكول بمرونة لتغيير محتوى الوجبة أو للمقارنة بين حجم الوجبة التي تستهلكها مجموعات تجريبية مختلفة من البعوض.
Ae. aegypti البعوض يهدد الصحة العالمية من خلال نشر مسببات الأمراض التي تسبب الأمراض بما في ذلك الحمى الصفراء, حمى الضنك, شيكونغونيا, وزيكا1,2,3,4,5. Ae. الإناث aegypti هي ملزمة مغذيات الدم; يجب أن تستهلك الدم الفقاريات للحصول على البروتين اللازم لتطوير البيض، وكل مخلب من البيض يتطلب وجبة الدم الكامل من مضيف واحد على الأقل6،7،8. تعض البعوضة الأنثوية مضيفها أولاً عن طريق ثقب الجلد مع لعابها وحقنه ، والذي يحتوي على مركبات تؤدي إلى استجابة المضيف المناعية9. ثم تتغذى عن طريق ضخ الدم من خلال نمط لها في منتصف لها. أثناء تناول وجبة دم من مضيف مصاب ، قد تبتلع مسببات الأمراض المنقولة بالدم6،8، والتي تهاجر بعد ذلك من منتصف البعوض إلى الغدد اللعابية10. يمكن البعوض الإناث المصابة بهذه الطريقة انتشار المرض عن طريق حقن مسببات الأمراض جنبا إلى جنب مع اللعاب عند عض المضيفين اللاحقة11,12. إن فهم وقياس آليات سلوك تغذية الدم هما خطوتان حاسمتان في مكافحة انتقال الأمراض المنقولة عن طريق البعوض.
العديد من البروتوكولات المختبرية لتربية البعوض والتجريب استخدام الحيوانات الحية بما في ذلك الفئران والخنازير الغينية ، أو البشر كمصدر للدم13،14،15،16. يفرض استخدام الحيوانات الحية مخاوف أخلاقية ومتطلبات معقدة لتدريب الموظفين، والإسكان والرعاية الحيوانية، والامتثال لسياسات اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه( IACUC). كما أنه يحد من أنواع المركبات التي يمكن تسليمها إلى البعوض ، مما يحد من الدراسات التي يمكن إجراؤها17.
أجهزة تغذية الدم الاصطناعية، التي تستخدم عادة نظام الأغشية لمحاكاة الجلد المضيف، هي أدوات مفيدة لدراسة سلوكيات تغذية الدم التي تتحايل على الحاجة إلى الحفاظ على المضيفين الحية. يمكن شراء الدم الكامل من عدد من الباعة وتغذية البعوض باستخدام مغذيات غشاء اصطناعي ساخنة، والمياه سترة أو أجهزة مماثلة18،19. في هذا البروتوكول، نبرهن على استخدام مغذيات غشاء صغيرة يمكن التخلص منها يطلق عليها "غليوب". هذا الغشاء المغذي، التي نشرت سابقا من قبل كوستا دا سيلفا وآخرون (2013)20،يمكن تجميعها بسهولة من المعدات المختبرية القياسية، مما يجعلها مثالية لتقديم وجبات الدم لأعداد معتدلة من البعوض ومباشرة لتوسيع نطاق لاختبار مجموعات أكبر أو تركيبات وجبة متعددة. وGlytube هو بديل غير مكلفة وفعالة لغيرها من مغذيات اصطناعية تجارية، والتي قد تتطلب كميات أكبر وجبة وأكثر ملاءمة لدفعة تغذية مجموعات كبيرة من البعوض على صيغة وجبة واحدة21.
ويتضمن هذا البروتوكول قسمين: إعداد/تقديم وجبات اصطناعية وتحديد الاستهلاك كمياً. في القسم الأول، تستخدم Glytubes كوسيلة فعالة لتقديم الوجبات الغذائية التلاعب بها. يمكن استبدال الدم كله مع وجبة اصطناعية تماما لمقارنة آثار بدائل الدم بدلا من وجبة الدم. وصفة مقتبسة من كوغان (1990)22 وتقدم هنا, على الرغم من أن عدة تركيبات وجبة اصطناعية وقد وضعت23,24. وعلاوة على ذلك، فإن التغذية هي طريقة أقل غزواً وأقل جرأة لإدخال المركبات الدوائية من الحقن. نظرًا لانخفاض الحجم الإجمالي المطلوب لكل وجبة (1-2 مل)، يوفر هذا البروتوكول طريقة توصيل جذابة لتقليل كميات الكواشف باهظة الثمن. Ae. aegypti الإناث بسهولة تستهلك الوجبات خالية من البروتين من محلول ملحي مع أدينوسين 5′-ثلاثي الفوسفات (ATP)25,26, الذي يوفر خط الأساس لقياس آثار مكونات وجبة واحدة. على سبيل المثال ، Neuropeptide Y مثل مستقبلات 7 (NPYLR7) في Ae. ومن المعروف أن aegypti وساطة المضيف تسعى قمع بعد وجبة الدم الغنية بالبروتين ، وعندما تضاف NPYLR7 ناهضات إلى وجبة ملحية خالية من البروتين ، والإناث البعوض المعرض المضيف تسعى قمع مماثلة لتلك التي استهلكت الدم كله7.
وفي القسم الثاني، يتم عرض خطوات لتحديد حجم كل وجبة تستهلكها أنثى بعوضة فردية. هذا الفحص قائم على الفلور ويلتقط حالة التغذية بدقة أعلى من الطرق التي تصنف فيها الإناث على أنها "تغذية" أو "غير مغذية" استنادًا إلى التقييم البصري لارتض البطن وحده. بإضافة الفلوريسين إلى الوجبة قبل التغذية ، يمكن تحديد كميات الوجبات التي يتناولها الأفراد عن طريق تجانس كل بعوضة في طبق 96 بئرًا وقياس شدة الفلوراسك كمراء. ويمكن لهذه المقايسة أن تقيس الاختلافات في قوة التغذية استجابة لمتغيرات مثل تكوين الوجبات أو الخلفية الوراثية للبعوض. يعد التحديد الكمي الدقيق أمرًا حاسمًا لأحجام الوجبات الوسيطة ، على سبيل المثال عندما يتم تقديم وجبات دون المستوى الأمثل للإناث تحتوي على رادع غذائي أو عندما يستهلكن وجبات السكروز ذات الأحجام المتغيرة27. إذا كانت هناك حاجة إلى البعوض المغذّي للمقايسات السلوكية اللاحقة بعد تقدير حجم الوجبة ، فيمكن بدلاً من ذلك حساب حجم الوجبة عن طريق وزن الإناث المُجرّدات في مجموعات وتقدير متوسط زيادة الكتلة للفرد الواحد. على الرغم من أن أقل دقة من وضع علامات الفلورسين ، لا يزال الوزن يوفر تقديرًا مجمعًا لحجم الوجبة ويسمح بفحص تأثير الوجبة على عمليات المصب ، مثل البراز أو جاذبية المضيف اللاحقة. في حين أن حجم وجبة الدم متغير ويمكن أن يتأثر بعدد لا يحصى من العوامل11،28،29، فإن أحجام الوجبات المبتلعة تقاس بالطرق الموصوفة هنا تتفق مع القياسات الكمية السابقة7،30،31.
Protocol
لم يتم تنفيذ إجراءات التغذية بالدم باستخدام الحيوانات الحية أو المضيفين البشريين وامتثلت للمبادئ التوجيهية التي وضعتها لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة روكفلر (IACUC) ومجلس المراجعة المؤسسية (IRB).
1. إعداد وجبة
- إعداد phagostimulant, أدينوسين 5′ثلاثي الفوسفات
- إعداد حل 25 mM من NaHCO3 مائي (الوزن الجزيئي، ميغاواط = 84.006 غرام/مول). ل100 مل من 25 mM NaHCO3، أضف 210 ملغ من NaHCO3 إلى قارورة حجمية وملء بالماء المقطر المزدوج (ddH2O) إلى حجم إجمالي قدره 100 مل. باستخدام شريط التحريك المغناطيسي، اخلطي المحلول تمامًا حتى يتم حل جميع NaHCO3.
- إعادة تكوين هيدرات ملح الصوديوم الصوديوم ATP (ميغاواط = 551.14 غ/مول) في مائي 25 mM NaHCO3 إلى تركيز نهائي من ATP 200 mM. لحجم إجمالي قدره 10 مل من 200 mM ATP في 25 mM NaHCO3 العازلة، إضافة 1.1 غرام من هيدرات ملح الصوديوم ATP إلى قارورة الحجمي وملء مع 25 mM NaHCO3 العازلة إلى حجم إجمالي قدره 10 مل. باستخدام شريط التحريك المغناطيسي، اخلطي المحلّل تمامًا حتى يتم حل جميع ATP.
ملاحظة: لتقليل التحلل المائي من ATP ، يجب أن يتم تخزينه بواسطة محلول ملح مثل NaHCO3. - Aliquot حل ATP وتخزينها في -20 درجة مئوية.
ملاحظة: عادة ما يتم إجراء هذا الحل المخزون من ATP الطازجة كل ستة أشهر ويستخدم لجميع الوجبات المذكورة أدناه. لمنع التدهور، يجب أن لا تخضع ATP aliquots دورات ذوبان التجميد المتعددة أو أن يتم تسخينها مع مكونات الوجبة الأخرى.
- إعداد محلول التتبع الفلورسنت، الفلورسين
- إعداد 2٪ (ث / الخامس) حل الأسهم من الفلورسين مائي. للحصول على حجم إجمالي للأسهم حل من 10 مل، مزيج 0.2 غرام من ملح الصوديوم الفلوريسين مع 10 مل من ddH2O في أنبوب مخروطي 15 مل ملفوفة في رقائق الألومنيوم في درجة حرارة الغرفة. يمكن استخدام هذا المحلل من الفلورسين لتخفيف في جميع الوجبات الموضحة أدناه.
ملاحظة: بما أن الفلورسين حساس للضوء، تجنب التعرض للضوء عن طريق تغليف الحاويات في رقائق الألومنيوم.
- إعداد 2٪ (ث / الخامس) حل الأسهم من الفلورسين مائي. للحصول على حجم إجمالي للأسهم حل من 10 مل، مزيج 0.2 غرام من ملح الصوديوم الفلوريسين مع 10 مل من ddH2O في أنبوب مخروطي 15 مل ملفوفة في رقائق الألومنيوم في درجة حرارة الغرفة. يمكن استخدام هذا المحلل من الفلورسين لتخفيف في جميع الوجبات الموضحة أدناه.
- إعداد وجبات الدم المشتقة من الحيوانات
- حساب عدد الوجبات اللازمة لتغذية جميع البعوض؛ كل Glytube يحمل وجبة 2 مل ويغذي ما يقرب من 25 البعوض. إعداد وجبة إضافية واحدة لمعايرة منحنى القياسية للقراءات الفلورانس. ما لم يذكر خلاف ذلك، جميع الخطوات في هذا القسم وصف كميات الكاشف المطلوبة لإعداد وجبة واحدة مع حجم النهائي من 2 مل.
- بالنسبة لوجبات الدم المشتقة من الحيوانات، قم بنقل 1.98-2 مل من دم الأغنام المُحَلَّف إلى أنبوب مخروطي 15 مل (انظر الخطوة 3.3 للاطلاع على حجم الدم المطلوب).
ملاحظة: يمكن استخدام مصادر مُنَكّرة تجارياً للدم الفقاري، بما في ذلك من الأغنام والخنازير الغينية والبشر،13. قبل الاستخدام ، تأكد من أن الدم المشترى لم يمر تاريخ انتهاء صلاحيته ويخلطه جيدًا عن طريق عكس الزجاجة ، خاصة إذا كان هناك فصل واضح لمكونات الدم. - للحصول على التغذية المثلى، أضف ATP إلى تركيز نهائي من 1-2 mM بعد أن تم تسخين دم الأغنام إلى 45 درجة مئوية في حمام مائي. للحصول على تركيز نهائي من ATP 1 mM، أضف 10 ميكرولتر من محلول مخزون ATP 200 mM إلى 1.99 مل من الدم الدافئ مسبقًا ومزيج. للحصول على تركيز نهائي من 2 M ATP، إضافة 20 ميكرولتر من 200 mM ATP الأسهم إلى 1.98 مل من الدم قبل warmed ومزيج. إذا لم يتم إضافة ATP، دافئ 2 مل من دم الأغنام المُنسخة.
- إذا كان من المقرر إجراء القياس الكمي القائم على الفلورسين لحجم الوجبة في وقت لاحق، أضف محلول الفلورسين إلى تركيز نهائي 0.002٪ (2 ميكرولتر من مخزون فلوري 2٪ في حجم الوجبة الإجمالي 2 مل). خفض حجم الدم بنفس الكمية التي أضافها الفلوريسين. احتفظ بـ 1 مل من تركيبة الوجبة النهائية التي تحتوي على 0.002٪ فلورينسين لتوليد المنحنى المعياري المرجعي. معالجة الكمية المحتفظ بها بنفس الوجبة التي يتم تسليمها للبعوض؛ يعرض لنفس ظروف الضوء ودرجة الحرارة طوال مدة التجربة ، ثم تجمد هذا مع الوجبة المسلّمة.
- إعداد وجبات الدم الاصطناعي
- حساب عدد الوجبات اللازمة لتغذية جميع البعوض؛ كل Glytube يحمل وجبة 2 مل ويغذي ما يقرب من 25 البعوض. إعداد وجبة إضافية واحدة لمعايرة منحنى القياسية للقراءات الفلورانس. ما لم يذكر خلاف ذلك، جميع الخطوات في هذا القسم وصف كميات الكاشف المطلوبة لإعداد وجبة واحدة 2 مل.
- لإعداد الدم الاصطناعي (مقتبس من كوغان (1990)22)، كما هو الحال في الجدول 1،أولا جعل حل مخزون من 400 mM NaHCO3. للحصول على حجم إجمالي قدره 10 مل من 400 m M NaHCO3 (MW = 84.006 g/mol)، أضف 336 ملغ من NaHCO3 إلى قارورة حجمية وملء بالماء المقطر المزدوج (ddH2O) إلى حجم إجمالي قدره 10 مل. باستخدام شريط التحريك المغناطيسي، اخلطي المحلول تمامًا حتى يتم حل جميع NaHCO3.
- بالنسبة لمكونات البروتين في الدم الاصطناعي، أعد حلول مخزون 50 ملغ/مل من γ-الجلوبيولين في 400 mM NaHCO3،35 ملغ/مل من الهيموغلوبين في ddH2O، و300 ملغم/مل من الألبومين في ddH2O. يمكن تخزين حلول مخزون البروتين عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 2 أشهر. التركيز النهائي للبروتينات البشرية الإجمالية في الدم الاصطناعي هو 125 ملغ / مل. وهذا يشمل التركيزات النهائية من 15 ملغم / مل γ- الجلوبيولين, 8 ملغ / مل الهيموغلوبين, و 102 ملغ /مل الألبومين.
- لكل وجبة 2 مل، والجمع بين 600 ميكرولتر من γ-الجلوبيولين، 460 ميكرولتر من الهيموغلوبين، 680 ميكرولتر من الألبومين، و 250 ميكرولتر من ddH2O من حلول الأسهم المدرجة في الجدول 1. انتظر لإضافة 10 ميكرولتر من 200 mM ATP حل الأسهم حتى بعد أن تم تسخين وجبة إلى 45 درجة مئوية، مباشرة قبل تقديم وجبة.
- إذا كان من المقرر إجراء القياس الكمي القائم على الفلورسين لحجم الوجبة في وقت لاحق، أضف محلول الفلورسين إلى تركيز نهائي 0.002٪ (2 ميكرولتر من مخزون فلوري 2٪ في حجم الوجبة الإجمالي 2 مل). تقليل حجم ddH2O في الخطوة 4.4 بنفس الكمية التي تمت إضافة الفلورسين. احتفظ بما لا يقل عن 1 مل من تركيبة الوجبة النهائية التي تحتوي على 0.002٪ فلوريسين لتوليد المنحنى القياسي المرجعي. معالجة الكمية المحتفظ بها بنفس الوجبة التي يتم تسليمها للبعوض؛ يعرض لنفس ظروف الضوء ودرجة الحرارة طوال مدة التجربة ، ثم تجمد هذا مع الوجبة المسلّمة.
- إعداد الوجبات المالحة الخالية من البروتين (المقتبسة من دوفال وآخرون (2019)7)
ملاحظة: يمكن إعداد وجبات ملحية خالية من البروتين بطرق متعددة7،27،32. الوجبة المالحة المعروضة هنا هي نسخة خالية من البروتين من وصفة الدم الاصطناعي المذكورة أعلاه.- حساب عدد الوجبات اللازمة لتغذية جميع البعوض؛ كل Glytube يحمل وجبة 2 مل ويغذي ما يقرب من 25 البعوض إعداد وجبة إضافية واحدة لمعايرة منحنى قياسي لقياسات الفلورانس. ما لم يذكر خلاف ذلك، جميع الخطوات في هذا القسم وصف كميات الكاشف المطلوبة لإعداد وجبة واحدة 2 مل.
- لإعداد وجبة ملحية، وجعل حل الأسهم من 400 mM NaHCO3. للحصول على حجم إجمالي قدره 10 مل من 400 m M NaHCO3 (MW = 84.006 غ/مول)، أضف 336 ملغ من NaHCO3 إلى قارورة حجمية وملء مع ddH2O إلى حجم إجمالي قدره 10 مل. باستخدام شريط التحريك المغناطيسي، اخلطي المحلول تمامًا حتى يتم حل جميع NaHCO3.
- لكل وجبة 2 مل، والجمع في 15 مل أنبوب مخروطي 600 ميكرولتر من 400 مل M NaHCO3 مع 1.39 مل من ddH2O. انتظر لإضافة 10 ميكرولتر من 200 مل ATP حل المخزون حتى بعد أن يتم تسخين وجبة إلى 45 درجة مئوية في حمام مائي.
- إذا كان من المقرر إجراء القياس الكمي القائم على الفلورسين لحجم الوجبة في وقت لاحق، أضف محلول الفلورسين إلى تركيز نهائي بنسبة 0.002٪ (2 ميكرولتر من مخزون الفلوريسين 2٪ في 2 مل من إجمالي حجم الوجبة). تقليل حجم ddH2O في الخطوة 5.3 بنفس الكمية التي تمت إضافة الفلورسين. احتفظ بما لا يقل عن 1 مل من تركيبة الوجبة النهائية التي تحتوي على 0.002٪ فلوريسين لتوليد المنحنى القياسي المرجعي. معالجة الكمية المحتفظ بها بنفس الوجبة التي يتم تسليمها للبعوض؛ يعرض لنفس ظروف الضوء ودرجة الحرارة طوال مدة التجربة ، ثم تجمد هذا مع الوجبة المسلّمة.
2. توصيل الوجبات للبعوض
- إعداد حاويات البعوض للتغذية
ملاحظة: يمكن تغذية البعوض في مجموعة متنوعة من الحاويات طالما تم استيفاء المعايير التالية. تأكد من أن الحاوية كبيرة بما يكفي للبعوض ليطير حولها ، ولكن ليس كبيرًا جدًا بحيث سيكون من الصعب على البعوض تحديد موقع سطح الشبكة والبدء في التغذية. يمكن أن تختلف الشبكة المستخدمة لتغطية الحاوية في حجم المواد والحفرة. يجب أن تكون الثقوب كبيرة بما يكفي لنمط البعوض الأنثوي لاختراقه ، ولكن ليس كبيرًا جدًا بحيث يمكن للبعوضة الهروب. تأمين شبكة بحزم بحيث مشدود، ويمكن أن تستريح غليتوب بشكل ثابت على سطحه طوال فترة التغذية.- على سبيل المثال الحاويات (الشكل 1) هو تعديل 946 مل (32 أوقية) عالية الكثافة البولي ايثيلين (HDPE) دلو من البلاستيك. لتكرار هذا الإعداد، استخدم شفرة حلاقة لقطع ثقب مركزي يبلغ قطره 10 سم تقريبًا في غطاء الدلو. لتجميع الحاوية للاحتلال عن طريق البعوض ، وتأمين ~ 400 سم2 قطعة مربعة من الأبيض 0.8 ملماموسة البوليستر المعاوضة على رأس دلو ، ودفع بشكل آمن الغطاء مثقبة أسفل عليه لالتقاط بإحكام.
- جمع البعوض الإناث التي لا تقل عن 3 أيام بعد انهيار للتأكد من أنها ناضجة بما فيه الكفاية لتغذية الدم. يتم ملاحظة معدلات التغذية المثلى بعد 7 أيام33.
- وضع البعوض الإناث في الحاوية وتغطية مع شبكة. إذا كانت الحاوية مكتظة بالبعوض ، فزاد عدد العبوات المستخدمة. يتم تحقيق التغذية المثلى مع ~ 25 البعوض / Glytube. وهذا يقلل من المنافسة على الوصول إلى غشاء التغذية.
- خصص مجموعة مراقبة من البعوض غير المُرفَت الذي لن يتم تقديم وجبة طعام. في بروتوكول قياس الوزن، قم بوزن المجموعة غير المُرَكَّمة بشكل منفصل واستخدم هذا الوزن لتقدير زيادة الوزن في المجموعة التجريبية التي تتغذى على وجبة. في بروتوكول القياس الكمي القائم على الفلور، يضاف مجموعة البعوض غير المُعَفَّرة إلى الآبار لحسابات المنحنى القياسية وللضوابط السلبية. لمطابقة فلورة الأنسجة البعوضية الأساسية في المجموعة التجريبية، تأكد من احتواء الآبار القياسية وآبار التحكم السلبي على بعوضة غير مُعَفَّرة.
- بناء وإنشاء Glytube (مقتبس من كوستا دا سيلفا وآخرون (2013)20)
- كما هو مبين في الشكل 1، لتوليد مصدر الحرارة ، وملء أنبوب مخروطي 50 مل مع 40 مل من 100 ٪ الجلسرين. اختم الأنبوب المخروطي المفتوح بقطعة 5 سم × 5 سم من البارا فيلم وكررها بقطعة إضافية 5 سم × 5 سم للحد من فرصة التسرب. اختياريا، يمكن عقد البارا فيلم في مكان باستخدام أشرطة مطاطية. عكس أنبوب لضمان عدم وجود ثقوب أو ثغرات.
- لإنشاء جهاز توصيل الوجبات، قم بقطع ثقب مركز يبلغ قطره 2.5 سم في الغطاء المسماري للأنبوب المخروطي باستخدام شفرة حلاقة حادة أو، لتحسين الاتساق، مخريط. تمتد 5 سم × 5 سم قطعة من parafilm بالتساوي بحيث يتضاعف تقريبا في الحجم. يجب أن يكون البارا فيلم رقيقًا بما يكفي بحيث يمكن للبعوض اختراقه بسهولة ، ولكن يجب ألا يكون هناك تسرب. ختم على السطح الخارجي للغطاء المسمار لتغطية تماما حفرة ووضع غطاء جانبا.
ملاحظة: لزيادة جاذبية لGlytube، قبل أن تمتد البارا فيلم، والعطر مع رائحة الإنسان عن طريق فرك بلطف على رقعة من الجلد البشري مع عدم تطبيق مستحضرات التجميل، مع الحرص على عدم خلق ثقوب. ويوصى بذلك إذا لم تكن التجربة تهدف إلى التحقيق في الإشارات الحسية اللازمة للبعوض للاقتراب من الوجبة. - سخني كل من أنبوب الجلسرين المختوم والوجبة (مع جميع المكونات باستثناء ATP) في حمام مائي 42-45 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل. لا قبل الحرارة ATP; قم بإضافتها مباشرة قبل بدء التجربة.
- أضف ATP إلى الوجبة الدافئة ودوامة جيدا. Pipette 2 مل من وجبة دافئة في الغرفة الداخلية للقبعة المسمار ووضع بلطف المقلوب، الدفء، الجلسرين مليئة 50 مل أنبوب مخروطي في ذلك. المسمار جزئيا الغطاء مع وجبة على أنبوب الغليسيرول مليئة - فقط بما فيه الكفاية لمنع تسرب من وجبة أو الجلسرين.
ملاحظة: يمكن أن يتراوح حجم الوجبات المستخدمة بين 1 مل و 2.5 مل. قد تكون كميات أقل مفيدة بشكل خاص عندما يتم استخدام وجبات الطعام لتقديم المركبات التي هي نادرة أو مكلفة. من المهم العمل بسرعة في هذه الخطوة بحيث لا تبرد الوجبة إلى درجة الحرارة المحيطة وتقلل من احتمال التغذية القصوى. يعتمد معدل التبريد على درجة الحرارة المحيطة للغرفة التي يتم فيها إجراء هذه الخطوات ، ولكن يجب أن تكتمل عادة في غضون 5 دقائق عند 25 درجة مئوية. - ضع Glytube المجمعة على قمة حاوية البعوض واسمح للبعوض بالوصول إلى التغذية لمدة 15 دقيقة على الأقل لتحقيق معدلات التغذية القصوى.
- للتغذية المثلى، ضع حاويات البعوض داخل غرفة مجهزة بمنصة CO2، واسمحوا 15 دقيقة على الأقل من التأقلم عند 25-28 درجة مئوية و 70-80٪ الرطوبة قبل تقديم الوجبة. غرفة الفحص المستخدمة هنا هو تعديل بسيط ومنخفض التكلفة من الإعداد نشرت سابقا16. ويستخدم صندوق تخزين البولي بروبلين شفاف الحجم 36 سم L × 31 سم × 32 سم H مع غطاء قابل للإزالة. A 1.5 ثقب قطرها 1.5 سم المحرز في جدار الغرفة يسمح CO2 التسليم من خلال أنابيب السيليكون. تم تثبيت لوحة نشر CO2 على المركز الداخلي للغطاء لتسليم الهواء النقي وCO2 لتكييف الغلاف الجوي للغرفة أثناء المحاكمة.
ملاحظة: تأكد من وجود إشارات المضيف (الحرارة CO2، مع رائحة المضيف الاختياري16) بحيث ينجذب البعوض إلى وحدة التغذية بالغشاء. إذا لم يزدحم البعوض تحت Glytube ، فتحقق من أن ثاني أكسيد الكربون2 يتم تسليمه بشكل صحيح وأن الوجبة وGlytube دافئان بما فيه الكفاية. إذا لم يتوفر مصدر خارجي CO2، CO2 يمكن أن يتم تسليمها عن طريق نفث من التنفس البشري زفير. - بعد التغذية، يمكن التخلص من غطاء غليوب كنفايات الخطر البيولوجي أو إعادة استخدامها بعد نقع محلول التبييض في نسبة مئوية منخفضة والشطف التام في الماء.
3- تحديد كمية الوجبات المستهلكة
- البعوض الوزن لاستخدامها في مزيد من التجارب
ملاحظة: يسمح وزن البعوض لتحديد حجم الوجبة باستخدامه لإجراء المزيد من التجارب الحية، ولكن هذه الطريقة تتطلب أخذ قياسات الوزن من مجموعة من 5 بعوض. وبما أن من الصعب قياس أوزان البعوض الفردي بدقة باستخدام معظم الأرصدة المختبرية، فإن التباين في حجم الوجبة الفردية لا يمكن قياسه بسهولة عن طريق قياس الأوزان. ينصح فقط لوزن للحالات التي الإناث engorge واضح على وجبة.- تخدير البعوض البارد عن طريق نقل حاويته إلى غرفة باردة 4 °C أو وضعه على الجليد.
- وزن مجموعات من 5 إناث من الفوج غير المُعَفَّن (أي البعوض الذي لم يُقدم له وجبة) وحساب متوسط وزنهن كتقدير لوزن "ما قبل التغذية". متوسط وزن البعوض غير المُرَفَف يعتمد على النمط الجيني والجنس وظروف التربية. Unfed الإناث Ae. aegypti البعوض تربى مع وصول libitum الإعلانية إلى السكروز عادة ما تزن حوالي 2 ملغ لكل من.
- من الفوج التجريبي (أي البعوض الذي قدم وجبة)، فرز الإناث في أكوام "تغذية" و "لا يتغذى" على أساس انتفاخ البطن التي يمكن ملاحظتها عن طريق العين7. تقسيم كل من "تغذية" و "لا تتغذى" أكوام، على التوالي، إلى مجموعات من 5 البعوض لوزن. وينبغي أن يستمد البعوض داخل كل مجموعة من 5 من نفس الفوج التجريبي لأخذ قياسات وزن المجموعة. حساب متوسط الوزن لكل أنثى من كل من أكوام "تغذية" و "لا تغذيتها" من المجموعة التجريبية.
- قياس الفلورل لتحليل نقطة النهاية7,27,34
ملاحظة: للحصول على قياسات دقيقة لحجم الوجبة من البعوض الفردي الذي لم يعد مطلوبا لمزيد من التجارب الحية، وتخزين البعوض و1 مل المتبقية من وجبة تحتوي على 0.002٪ الفلوريسين في -20 درجة مئوية مباشرة بعد الرضاعة. يمكن إيقاف التجربة مؤقتًا هنا. يتم توضيح هذا الأسلوب في الشكل 2.- لتوليد منحنى قياسي مرجعي ، قم بإعداد تخفيف تسلسلي لنفس الوجبة التي تحتوي على 0.002٪ فلوريسين تم تقديمه إلى المجموعة التجريبية للبعوض. سيكون هناك ما مجموعه 8 حلول منحنى القياسية. في كل من هذه الحلول ، فإن الحجم النهائي للوجبة التي تحتوي على 0.002 ٪ fluorescein سيكون 5 ، 2.5 ، 1.25 ، 0.625 ، 0.3125 ، 0.15625، 0.078125، أو 0 ميكرولتر، وسيكون كل منها في محلول ملحي 1x من الفوسفات (PBS) بحجم إجمالي قدره 100 ميكرولتر (على سبيل المثال، 5 ميكرولتر من الوجبة التي تحتوي على 0.002٪ فلوريسين في 95 ميكرولتر من 1x PBS).
- لجعل الحل الأول من منحنى قياسي، إضافة 50 ميكرولتر من وجبة تحتوي على 0.002٪ الفلوريسين إلى 950 ميكرولتر من 1X PBS ودوامة شاملة (الحجم النهائي: 5 ميكرولتر من وجبة تحتوي على 0.002٪ الفلوريسين في 95 μL من 1X PBS). لجعل بقية حلول منحنى القياسية، أداء تخفيف 2 أضعاف لكل خطوة عن طريق اتخاذ 500 ميكرولتر من الأنبوب السابق وإضافته إلى أنبوب جديد يحتوي على 500 ميكرولتر من 1X PBS. دوامة جيدا قبل إعداد التخفيف المقبل 2 أضعاف.
- لإعداد الآبار لاستخدامها لتوليد منحنى قياسي مرجعي، ماصة 100 ميكرولتر من كل من حلول المنحنى القياسية في كل من الآبار 8 في العمود الأول من لوحة PCR 96 جيدا. أضف بعوضة واحدة غير مُكَرَكَرة إلى كل بئر من الآبار الثمانية نفسها في العمود الأول من الطبق. كرر في العمود الثاني من لوحة لقياس النسخ المتماثل.
ملاحظة: إذا تم تقديم مجموعات تجريبية أنواع مختلفة من الوجبات، يجب إعداد منحنى قياسي مرجعي منفصل لكل نوع وجبة. - إضافة 100 μL من 1X برنامج تلفزيوني في كل ما تبقى جيدا لمراقبة unfed والمجموعات التجريبية. إذا كان الأنسجة هو أن تتعطل في الخطوات اللاحقة باستخدام هجنات طاحونة حبة أو دوامة، إضافة واحد 3 مم بوروسيليكات حبة الزجاج الصلب إلى كل بئر.
- كتحكم سلبي، أضف بعوضة لا يُنفَّم إلى كل بئر في العمودين التاليين من الصفيحة. الفلوريسنس الذي يقاس في هذه المجموعة يحدد قطع خط الأساس لحساب فلورة الأنسجة التلقائية وسيتم استخدامها لتحديد ما إذا كان البعوض في المجموعة التجريبية التي تتغذى على الوجبة.
- إضافة 1 بعوضة في البئر إلى الآبار المتبقية من المجموعات التجريبية التي قدمت وجبة.
- ختم لوحة بعناية وتعطيل الأنسجة عن طريق طحن دليل. يجب أن يكون البطن متجانسًا تمامًا لإطلاق الوجبة. وتشمل أساليب تعطيل الأنسجة استخدام التجانس طاحونة حبة مع 3 مم borosilicate حبات الزجاج الصلب (30 هرتز لمدة 30 ثانية)، خلاط دوامة مع 3 مم borosilicate حبات الزجاج الصلب، أو طاحونة الحشرات دون الخرز.
- الطرد المركزي لوحة في 2000 دورة في الدقيقة لمدة 1-2 دقيقة لجمع lysate.
- إعداد لوحة سوداء 96-جيدا مع 180 ميكرولتر من 1X برنامج تلفزيوني في كل بئر.
- نقل 20 ميكرولتر من lysate إلى كل بئر مع 180 ميكرولتر من 1X برنامج تلفزيوني ومزيج. إذا كان متوفراً، استخدم ماصة متعددة القنوات في هذه الخطوة لزيادة السرعة والاتساق بشكل أفضل.
- قياس كثافة الفلورنس لكل بئر باستخدام قارئ لوحة على قناة 485/520 الإثارة / الانبعاثات. توليد منحنى القياسية المرجعية عن طريق رسم حجم المعروفة من وجبة ضد قياس كثافة الفلورانس المقابلة.
- باستخدام المنحنى القياسي المرجعي المتولد، استقراء حجم الوجبة التي يتناولها كل من البعوض المجموعة التجريبية. طرح متوسط قراءة كثافة الفلوريسنس لمجموعة التحكم السلبية للبعوض غير المُعَفَّر من قراءة شدة الفلورس من كل فرد من المجموعات التجريبية لتصحيح الفلورس النسيجي الأساسي.
Representative Results
1 يقدم التخطيطي لتجميع Glytube، في حين أن الشكل 2 يظهر لمحة عامة عن التصميم التجريبي لقياس حجم وجبة باستخدام مقايسة القائمة على الفلوريس الموصوفة هنا. 3- ويقدم الشكل 3 قياسات لأحجام الفلوريسين الممثّل من تجربة تغذية الدم. الشكل 4، الشكل 5، والشكل 6 يوضح عينة من الأسئلة البيولوجية التي يمكن معالجتها باستخدام هذا البروتوكول. تطبيقات البروتوكول واسعة النطاق وتشمل تغيير تكوين وجبة الدم، وتغذية المركبات الدوائية، وتحديد كمي دقيق لوجبات الدم دون المستوى الأمثل أو وجبات الرحيق الأصغر، ومقارنة سلوك التغذية عبر الأنماط الجينية للبعوض.
لتوليد منحنى قياسي لحسابات حجم الوجبات ، يتم رسم قراءات الفلوريسنس من الآبار المرجعية المعينة التي تحتوي كل منها على بعوضة غير مُلقَمة وحجم معروف من الوجبة مع 0.002٪ فلوريسين(الشكل 3A). قراءات الفلوريسنس من الآبار المتبقية، التي تحتوي على البعوض من مجموعة التحكم السلبية للبعوض غير المُعَفَّن أو المجموعة التجريبية للبعوض التي تقدم وجبة، تُقارن بهذا المنحنى القياسي لتحديد حجم الوجبة (μL) الذي يستهلكه كل بعوضة(الشكل 3B). للتحقق من صحة قراءات خط الأساس في هذا الفحص ، يجب التأكد من أن البعوض من مجموعة التحكم السلبي غير المُعرفة لا يتم تخصيص قيمة إيجابية للμL المستهلكة (الشكل 3B، اليسار). على الرغم من أن جميع الإناث في المجموعة التجريبية عرضت على وجبة الدم، وبعض البعوض تغذية (الشكل 3B، الأوسط) وبعضها لم (الشكل 3B، والحق). وتبين هذه النتيجة أنه يمكن الحصول على نوعين من البيانات من هذا البروتوكول: 1) النسبة المئوية لمجموع الإناث اللائي تتغذى على وجبة معينة، و 2) الحجم الذي تبتلعه الإناث اللائي تتغذى على وجبة معينة.
يمكن استخدام هذا البروتوكول لتقديم وتحديد الوجبات مع تكوينات البروتين المختلفة. الشكل 4A,B تظهر البيانات التي تم جمعها باستخدام وجبات الطعام مع الفلورسين المضافة. تم حساب نسبة البعوض الذي يتغذى وحجم الوجبات التي ابتلعها ، على التوالي ، من قراءات الفلوريسنس. وهذه القراءات شديدة الحساسية وتسمح بتحديد كمي دقيق للميكللتر، ولكن لها حدود مفادها أنه لا يمكن استخدام البعوض في التجارب الحية في المستقبل. ويبين الشكل 4C,D البيانات التي تم جمعها من تجربة مستقلة مع البعوض التي تم تسجيلها كغذاء أو لا يتغذى بالعين بعد أن عرضت عليهم وجبات الطعام دون الفلورسين. تم حساب حجم الوجبة كمتوسط وزن/أنثى من مجموعات من 5 بعوضة. على الرغم من أن قياسات الوزن هذه أقل حساسية من قياسات الفلورانس ، إلا أنها تسمح باستعادة الإناث واستخدامها لمزيد من التجارب الحية. يمكن أن تختلف نسبة البعوض الذي يتغذى عبر أيام تجريبية مختلفة ، كما هو مبين في الشكل 4A والشكل 4C.
ويبين الشكل 5 حجم الوجبات المستهلكة من الأدوية التي تنظم سلوك البعوض الذي يسعى إلى استضافة الطعام. في هذه التجارب، وقدمت الإناث الدم، المالحة + ATP، أو المالحة + ATP وجبات مع 100 μM من ناهض مستقبلات NPY Y2 الإنسان، TM30338. هذا الدواء يغير السلوك الذي يسعى إلى المضيف من خلال تفعيل Ae. aegypti NPY مثل مستقبلات 7. قياس أحجام الوجبات أمر بالغ الأهمية لتفسير التجارب لتقييم تأثير هذا الدواء على سلوك ما بعد التغذية بالدم لأنه يسمح للباحث بحساب الجرعة التي تستهلكها كل أنثى.
في الأمثلة السابقة، تم تغذية الإناث إما الدم أو وجبات الدم البديلة، وكلها أسفرت عن 3-5 ميكرولتر وجبات(الشكل 3، الشكل 4، الشكل 5). ويمكن أيضاً استخدام هذا المقايس القائم على الفلور لقياس أحجام الوجبات الصغيرة و/أو المتغيرة التي لا يمكن تمييزها بدقة من قياسات متوسط وزن المجموعة. في الشكل 6، تم استخدام نفس بروتوكول القياس الكمي الفلوري لقياس سلوك تغذية الرحيق عن طريق تبادل Glytube لكرة القطن المشبعة مع 10 ٪ السكروز التي تحتوي على 0.002 ٪ الفلوريسين. لا يمكن تقديم السكريات الرحيق في مقايسة غليتوب لأن الإناث لا يمكن الكشف عن وجود السكريات الرحيق مع stylet ولا تبدأ تغذية27. هذه البيانات تسمح للباحث أن يقرر أن وجبات السكر هي باستمرار أصغر من وجبات الدم، بالاتفاق مع العمل السابق34 (الشكل 6).
الشكل 1: إعداد طريقة غليوب المستخدمة لتغذية وجبات البعوض. (أ) التخطيطي لGlytube تفكيكها تستخدم لتغذية الدم وغيرها من الوجبات للبعوض. (ب) مخطط من Glytube المقدمة فوق حاوية من البعوض مع غطاء شبكة. يمكن أن تخترق البعوض الأنثوي غطاء الشبكة لإطعامه. (C) صور فوتوغرافية لـ Glytube (أعلى) ، وأنثى Aedes aegypti البعوض قبل وأثناء وبعد التغذية (أسفل ، من اليسار إلى اليمين) على وجبة سلمت غليوب. تظهر البعوض ثقب من خلال شبكة تغطي الحاوية الخاصة بهم للوصول إلى التغذية الغشاء. (D) صور تظهر ظهور أنثى Ae. aegypti البعوض التي هي unfed (يسار) والتي قد engorged على إما وجبة الدم الاصطناعي (يمين، أعلى) أو المالحة + وجبة ATP (يمين، أسفل). وقد سبق أن نشرت طريقة غليتوب في كوستا دا سيلفا وآخرون (2013)20. الصور في (C) و (D) هي مجاملة من اليكس وايلد. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تخطيطي لكيفية قياس حجم الوجبة بعد بروتوكول تغذية الدم غليوب. (A) يتم تقديم البعوض وجبة مع الفلوريسين (أعلى، مجموعة تجريبية) أو لا وجبة (أسفل، مجموعة مكافحة سلبية غير مُعوَّرة). (ب)يتم إضافة البعوض الفردي إلى طبق 96-جيدا بعد إنهاء تجربة التغذية. (C) يتم إنشاء منحنى قياسي باستخدام كميات معروفة من وجبة تحتوي على 0.002٪ فلوريسين. (د)البعوض متجانس لإطلاق أي فلوريسين مستهلك، ومستويات الفلوريسين في كل بئر يتم قياسها كميا باستخدام قارئ لوحة. يتم تعديل هذا الأسلوب القياس الكمي fluorescence من ليرش وآخرون (2013)34. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تجربة تغذية الدم غليوب مع القياس الكمي القائم على الفلورسين. أ)قياسات منحنى قياسي تم الحصول عليها من الآبار حيث تمت إضافة بعوضة من مجموعة التحكم غير المُعَرَف إلى كمية معروفة من الوجبة التي تحتوي على 0.002٪ فلوريسين (مقياس المحور y = وحدات عشوائية). (B)حجم الوجبات المحتسبة باستخدام قراءات الفلوريسنس للإناث في مجموعة التحكم غير الخاضعة للرقابة (اليسار، الأسود، ن = 40)، المجموعة التجريبية التي تتغذى على الدم (الأوسط، الأحمر، ن = 37)، والمجموعة التجريبية التي لم تتغذى على الدم (يمين، أحمر، ن = 23). وتمثل كل نقطة قياسا من أنثى فردية. وتظهر البيانات على أنها متوسطة مع النطاق. رسائل تشير إلى مجموعات متميزة إحصائيا، اختبار كروسكال واليس مع المقارنة متعددة دن، P<0.01. وقد نشرت هذه البيانات في Jové et al. (2020)27. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: القياس الكمي للوجبات ذات التركيب البروتيني المتباين. وقدمت الإناث وجبات إما من دم الأغنام (الأحمر)، والدم الاصطناعي مع بروتينات الدم البشري (كوغان (1990)22) (البرتقال)، أو المالحة خالية من البروتين + وجبة ATP (أكوا)7. (أ) نسبة الإناث اللائي تم تغذيةهم يسجلن باستخدام قراءات الفلوريسنس. كل نقطة تمثل مجموعة من 12-16 الإناث. وتظهر البيانات على أنها توسطات لها نطاقات، n = 12. (B) حجم الوجبات المحتسبة باستخدام قراءات الفلوريسنس. كل نقطة تمثل قياس من أنثى فردية في تجربة واحدة من الشكل 4A. وتظهر البيانات على أنها توسطات لها نطاقات، n = 12. (C) النسبة المئوية للإناث المنهمكين بالكامل بعد تغذية الغشاء الاصطناعي ، التي سجلت بالعين. كل نقطة تمثل النسبة المئوية للإناث من الإناث من مجموعات من 20-30 الإناث. وتظهر البيانات على أنها وسيطات ذات نطاقات، n = 23. (D) الوجبات الأحجام التي سجلت كالوزن / الإناث بعد أن سجل حالة التغذية بالعين. تم حساب الأوزان على أنها متوسط مجموعات من 5 البعوض. وتظهر البيانات على أنها وسيطات ذات نطاقات، n = 23. A–D: رسائل تشير إلى مجموعات متميزة إحصائيا, Kruskal-واليس اختبار مع المقارنة متعددة دن, P<0.05. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: القياس الكمي للوجبات مع المركبات الدوائية. تستهلك الإناث وجبات من نفس الحجم من دم الأغنام (الأحمر)، المالحة + ATP (أكوا)، وملوحة ملحية + ATP + 100 جرعة μM من الإنسان NPY Y2 مستقبلات ناهض TM30338 (الأزرق الداكن). حجم الوجبة المحتسبة باستخدام قراءات الفلوريسنس. وتمثل كل نقطة قياسا من أنثى فردية. وتظهر البيانات على أنها توسطات لها نطاقات، n = 12. رسائل تشير إلى مجموعات متميزة إحصائيا، اختبار كروسكال واليس مع المقارنة متعددة دن، P<0.05. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: القياس الكمي لوجبات الرحيق الأصغر. (أ) التخطيطي من الرحيق تغذية المقايسة. (B) حجم الوجبات المحسوبة باستخدام قراءات الفلوريسنس للإناث من النوع البري التي تقدم وجبات إما من الماء (الأزرق، ن = 36) أو 10٪ السكروز (الأخضر، ن = 53)، مع كل 0.002٪ الفلورسين، في المقايسة تغذية الرحيق. وتمثل كل نقطة قياسا من أنثى فردية. يتم عرض البيانات على أنها وسيطات ذات نطاقات. وتشير الرسائل إلى مجموعات متميزة إحصائياً، اختبار مان ويتني، p<0.05. وقد نشرت هذه البيانات في Jové et al. (2020)27. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| وجبة الدم الاصطناعي | |||
| تركيز من الأسهم الحل (ملغ / مل) | حجم الأسهم الحل في وجبة (μL / مل) | تركيز الوجبة النهائية (ملغ / مل) | |
| مكونات البروتين* | |||
| γ- غلوبولينس | 50 | 300 | 15 |
| الهيموغلوبين | 35 | 230 | 8 |
| الزلال | 300 | 340 | 102 |
| مجموع البروتين | - | - | 125 |
| مكونات غير البروتين | |||
| تركيز من الأسهم الحل (mM) | حجم الأسهم الحل في وجبة (μL / مل) | تركيز الوجبة النهائية (mM) | |
| NaCl | في γ-globulin الأسهم | - | 5-10 |
| NaHCO3 | في γ-globulin الأسهم | - | 120 |
| Atp | 200 | 5 | 1 |
| الماء | - | 125 | - |
| * يتم إعداد مكونات البروتين في محلول المخزون من الماء المقطر المزدوج، باستثناء γ-الجلبولينات، والتي تذوب في 400 mM NaHCO3 وتشمل كمية متغيرة من كلوريد الناول (2-4٪) في المنتج. | |||
الجدول 1: وصفة لإعداد وجبات الدم الاصطناعي (مقتبسة من كوغان (1990)22). يتكون الدم الاصطناعي من البروتين والمكونات غير البروتينية الموجودة بانتظام في دم الإنسان ويوفر خيار تغيير نسب هذه المكونات. يمكن للبعوض إنتاج البيض بعد تغذيته بالدم الاصطناعي7،22.
| وجبة ملحية | |||
| مكون | تركيز من الأسهم الحل (mM) | حجم الأسهم الحل في وجبة (μL / مل) | تركيز الوجبة النهائية (mM) |
| NaCl | - | - | - |
| NaHCO3 | 400 | 300 | 120 |
| Atp | 200 | 5 | 1 |
| الماء | - | 695 | - |
الجدول 2: وصفة لتناول وجبة ملحية مع ATP (مقتبسة من دوفال وآخرون (2019)7). يمكن استخدام الوجبات المالحة الخالية من البروتين لتوصيل المركبات ذات الأهمية للبعوض مع محاكاة انتفاخ البطن الذي يحدث بعد تغذية الدم ، ولكن دون التسبب في تطور البيض الذي يحدث عندما يتم تناول البروتينات.
Discussion
بالنسبة للعديد من التطبيقات المختبرية، تقدم مغذيات الأغشية الاصطناعية فوائد متميزة مقارنة بالمضيفين المباشرين من خلال السماح للباحثين بالقدرة على التلاعب مباشرة بمحتويات الوجبة. على الرغم من أن هناك طرق متعددة متاحة لتغذية الغشاء الاصطناعي، فإن الطريقة الموصوفة هنا توفر مزايا في المرونة والتكلفة والإنتاجية. بالمقارنة مع غيرها من مغذيات الأغشية التجارية، والتهمة غليوب يتطلب حجم وجبة صغيرة، مما يجعلها آلية فعالة لتوصيل الكواشف مكلفة، بما في ذلك الأدوية أو مسببات الأمراض، عن طريق تقليل الحجم الإجمالي المطلوب7،35. وبما أن كل من الوجبات المالحة الخالية من البروتين ووجبات الدم الاصطناعية تعزز من الاحتقان، يمكن إضافة المركبات أو مسببات الأمراض إلى أي وجبة كبديل عالي الإنتاجية وغير جراحي للحقن. بالإضافة إلى ذلك، يمكن بسهولة غسل كل مكون من مكونات Glytube أو استبداله أو توسيع نطاقه لتقديم وتحديد أنواع الوجبات المتعددة دون تلوث جهاز التغذية.
لتحديد حجم الوجبات التي يستهلكها البعوض ، تمكن الطريقة القائمة على الفلورسينس من تحديد حجم الوجبة أكثر دقة من وزن البعوض قبل وبعد التغذية. وتجدر الإشارة إلى أن هذه الطريقة هي نقطة النهاية. في المقابل ، يسمح الوزن بإبقاء البعوض على قيد الحياة لمزيد من التجارب. باستخدام قارئ لوحة، يمكن بسهولة توسيع الطريقة القائمة على الفلورسينس للحصول على كمية عالية الإنتاجية من الوجبات التي تستهلكها مئات الإناث الفردية.
لتحقيق معدلات تغذية عالية، يجب أن يكون هناك مزيج من العظة المضيف كافية أن تكون موجودة لتنشيط سلوك الإناث المضيف تسعى وجذب الإناث إلى المغذية. إذا لم يزدحم البعوض تحت Glytube ، فقد لا يتم تسخين الوجبة بشكل صحيح ، أو قد لا تكون عملية توصيل ثاني أكسيد الكربون2 كافية. إضافة رائحة الإنسان إلى سطح الغشاء بشكل موثوق يزيد من جاذبية الغشاء الاصطناعي. إذا لوحظ البعوض تحت Glytube ولكن فشل في التغذية ، قد يكون تركيب الوجبة على خطأ. قد لا تتغذى الإناث إذا كانت الوجبة نفسها ليست دافئة، والدم قديمة جدا، أو إذا كانت إضافات إلى وجبة هي في جوهرها aversive أو تسبب تفاعلا كيميائيا غير مرغوب فيه36. يزيد ATP الإضافي أيضًا بشكل موثوق من معدلات التغذية ويمكن زيادته إلى تركيز نهائي 2 mM في كل من الوصفات المقدمة. الإناث قد لا تتغذى إذا لم يتم سحب البارا فيلم مشدود عبر غطاء غليتوب; وينبغي أن تكون شفافة بشكل موحد parafilm وينبغي عدم مشبك، وهذا يمنع الإناث من أن تكون قادرة على اختراق فعال parafilm مع stylet لها. إذا تسربت الوجبة من خلال Glytube على شبكة, قد تمزقت parafilm خلال عملية تمتد وينبغي استبدالها.
تغيير تكوين وجبة يمكن أيضا أن تسمح للباحثين للتلاعب طول الوقت اللازم لمسح وجبة من منتصف، فضلا عن السلوك اللاحقة المضيف البحث. وجبات الطعام المقدمة هنا تتطلب 24-36 ساعة للهضم7 مماثلة للدم المستمد من الحيوانات. بعد التغذية على أي من هذه الوجبات، وسوف الإناث قمع المضيف تسعى خلال فترة الهضم النافذة الزمنية. منذ وجبة المالحة تفتقر إلى البروتين، والإناث العودة إلى المضيف تسعى بعد مسح وجبة. إذا كان من المرغوب فيه عودة أسرع، يمكن للباحثين اختيار بديل "سريعة المقاصة" وجبات الملح التي تفرز في حوالي 6 ح27. في حين أن تكوين وجبة الملحية المعروضة هنا مطابق لمقارنة النتائج مباشرة مع وجبة الدم الاصطناعي ، فإن وجبة "المقاصة السريعة" تتطابق بشكل وثيق مع مستويات الملح الفسيولوجية الموجودة في الدم الفقاري.
الأساليب المذكورة هنا لها حدود يجب مراعاتها قبل اختيار الفحص الأكثر ملاءمة لأهداف الباحث التجريبية. ولا تسمح قياسات الفلورسين الموصوفة باستخدام البعوض مرة أخرى لإجراء تجارب إضافية. ومع ذلك، يمكن أن تؤخذ قياسات الوزن قبل كمية حجم وجبة باستخدام مقايسة الفلورسين. إذا كان الوزن وحجم الوجبة متسقين عبر تجارب متعددة لوجبة معينة، يمكن استخدام الوزن كوكيل في التجارب المستقبلية. وعلاوة على ذلك، فإن هذا البروتوكول لا يميز بين العجز في سلوك البحث عن المضيفين مقابل التغذية بالدم؛ بل إنه لا يميز بين العجز في سلوك التغذية بالدم؛ بل إنه لا يميز بين العجز في سلوك التغذية بالدم؛ بل إنه لا يميز بين العجز في سلوك التغذية بالدم؛ بل إنه لا يُعَد في الواقع من الـ 1 البعوض الذي يظهر ضعف في العثور على تغذية الغشاء سيكون لها انخفاض في معدلات التغذية و / أو حجم وجبة. من خلال إضافة كاميرا لتسجيل السلوك في جميع أنحاء الفحص ، يمكن للباحثين تحديد ما إذا كانت الإناث لا تستطيع العثور على Glytube ، أو ما إذا كانت تجد Glytube ، ولكن لا تتغذى.
يمكن تكييف الفحص الموصوف هنا لاستكشاف العديد من الأسئلة المعلقة المتعلقة بسلوك التغذية في البعوض. على سبيل المثال، يمكن استكشاف مساهمة بروتينات الدم محددة عن طريق تغيير نسبة البروتينات المكونة أو تركيز البروتين الكلي في وجبة الدم الاصطناعي. لتقييم أحجام الوجبات من أحداث التغذية المتعددة ، يمكن إضافة الأصباغ مع أطياف الفلورانس المتميزة للتمييز بين الوجبات من مصادر فريدة37. ويمكن أيضا تعديل هذا البروتوكول لتحفيز بشكل منفصل على الفم الداخلية التي تكشف عن الدم التي تستخدم للابتلاع (أي stylet)، والزوائد الكيميائية التي الاتصال الجلد (أي، اللافيوم والساقين) كما أراضي البعوض لبدء تغذية الدم36. على سبيل المثال ، إذا تم إضافة اليغاندات مباشرة إلى الوجبة ، فإنها لا تتصل باللبيوم والساقين ، حيث يتم ثقب الغشاء فقط من قبل النمط. إذا تم إضافة يغاندس إلى السطح الخارجي للبارا فيلم بدلا من ذلك، فإنها تبقى منفصلة عن وجبة ويمكن الاتصال بها من قبل labium والساقين36. وأخيرا ، فإن الحركية مفصلة من سلوك التغذية بالدم ليست مفهومة جيدا والأسلوب المعروض هنا يمكن تعديلها للجمع بين تتبع عالية الدقة مع أدوات التعلم الآلي لاستخراج قراءات السلوك من الحركة ، والموقف ، وديناميات التغذية38.
ويهدف هذا البروتوكول إلى أن يكون سهل الاستعمال وفعالا من حيث التكلفة، مع القدرة على خدمة الباحثين الذين يستخدمون التلاعب الدوائي والجيني لدراسة تغذية دم البعوض وسلوك ما بعد تغذية الدم.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
نشكر نيبون باسرور، وأدريانا ك. روساس فيليغاس، ونداف شاي، وتريفور سوريلس على تعليقاتهم على المخطوطات، وزونغيان غونغ وكيرولوس بارسوم على المساعدة التقنية. نشكر أليكس وايلد على الصور المستخدمة في الشكل 1. وقد تم دعم ك. ف. من قبل زمالة PhD Boehringer Ingelheim Fonds. وقد تم دعم V.J. جزئيا من قبل المعاهد القومية للصحة T32-MH095246. وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منحة لجامعة روكفلر من معهد هوارد هيوز الطبي من خلال برنامج جيمس ه. جيليام للزمالات للدراسة المتقدمة إلى V.J. تستند هذه المادة إلى العمل المدعوم من قبل برنامج زمالة أبحاث الدراسات العليا للمؤسسة الوطنية للعلوم تحت المنحة رقم NSF DGE-1325261 إلى V.J. وأي آراء واستنتاجات واستنتاجات أو توصيات مُعرب عنها في هذه المادة هي آراء المؤلف (المؤلفين) ولا تعكس بالضرورة آراء المؤسسة الوطنية للعلوم.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 3 mm diameter borosilicate solid-glass bead | MilliporeSigma | Z143928 | For use for bead mill homogenizer; not required if using pellet pestle grinder |
| 32 oz. high-density polyethylene (HDPE) plastic cup | VWR | 89009-668 | Example mosquito container used for feeding assays shown; alternate options can be used |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 96-well black polystyrene plate | ThermoFisher | 12-566-09 | |
| 96-well PCR plate sealing film | Bio-Rad | MSB1001 | Alternate options can be used |
| 96-well PCR plates | Bio-Rad | HSP9621 | Alternate options can be used |
| Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | MilliporeSigma | A6419 | |
| Albumin (human serum) | MilliporeSigma | A9511 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213 | Alternate options can be used to block light entering fluorescein container |
| Balance | Fisher Scientific | 01-911 | Alternate options can be used |
| Bead mill homogenizer | Qiagen | 85300 | Not required if using pellet pestle grinder |
| Cotton ball | Fisher Scientific | 22456880 | For nectar-feeding; alternate options can be used |
| Defibrinated sheep blood | Hemostat Laboratories | DSB100 | Alternate options can be used |
| Drosophila CO2 fly pad | Tritech Research | MINJ-DROS-FP | Alternate options can be used |
| Fluorescein | MilliporeSigma | F6377 | |
| Fluorescence plate-reader | ThermoFisher | VL0000D0 | Alternate options can be used |
| Gamma-globulin (human blood) | MilliporeSigma | H7379 | |
| Glycerol | MilliporeSigma | G7893 | |
| Hemoglobin (human) | MilliporeSigma | G4386 | |
| Laboratory wrapping film - parafilm | Fisher Scientific | 13-374 | |
| Magnetic stirrer | Fisher Scientific | 90-691 | Alternate magnetic stirrers can be used |
| Microcentrifuge for 96-well plate | VWR | 80094-180 | Alternate options can be used |
| Microcentrifuge Tubes | MilliporeSigma | 2236412 | Alternate options can be used |
| Pellet pestle grinder | VWR | KT749521-1500 | Not required if using bead mill homogenizer |
| Phosphate buffered solution (PBS) | Fisher Scientific | BW17-516F | Optional |
| Razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | Alternate options can be used, such as a lathe for better consistency of cutting |
| Rubber bands | |||
| Silicone tubing | McMaster Carr | Needed if using a fly pad for CO2 delivery | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | S233 | |
| Sodium chloride (NaCl) | MilliporeSigma | S9888 | |
| Stir bars | Fisher Scientific | 14-512 | Alternate magnetic stir bars can be used |
| Translucent polypropylene storage box with removable lid | Example box used for feeding assays shown | ||
| Vortex mixer | |||
| Water bath | Alternate heating device may be used | ||
| White 0.8 mm polyester mosquito netting | American Home & Habit Inc. | F03A-PONO-MOSQ-M008-WT | Alternate options can be used |
References
- Bhatt, S., et al. The global distribution and burden of dengue. Nature. 496 (7446), 504-507 (2014).
- Rogers, D. J., Wilson, A. J., Hay, S. I., Graham, A. J. The global distribution of yellow fever and dengue. Advances in Parasitology. 62 (05), 181-220 (2006).
- Chouin-Carneiro, T., et al. Differential susceptibilities of Aedes aegypti and Aedes albopictus from the Americas to Zika virus. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (3), (2016).
- Guerbois, M., et al. Outbreak of Zika virus infection, Chiapas State, Mexico, 2015, and first confirmed transmission by Aedes aegypti mosquitoes in the Amercias. Journal of Infectious Diseases. 214 (9), 1349-1356 (2016).
- Weaver, S. C., et al. Zika virus: history, emergence, biology, and prospects for control. Antiviral Research. 130, 69-80 (2016).
- Attardo, G. M., Hansen, I. A., Raikhel, A. S. Nutritional regulation of vitellogenesis in mosquitoes: implications for anautogeny. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 35 (7), 661-675 (2005).
- Duvall, L. B., Ramos-Espiritu, L., Barsoum, K. E., Glickman, J. F., Vosshall, L. B. Small-molecule agonists of Ae. aegypti neuropeptide Y receptor block mosquito biting. Cell. 176 (4), 687-701 (2019).
- Dimond, J. B., Lea, A. O., Hahnert, W. F., DeLong, D. M. The amino acids required for egg production in Aedes aegypti. The Canadian Entomologist. 88 (2), 57-62 (1956).
- Guerrero, D., Cantaert, T., Missé, D. Aedes mosquito salivary components and their effect on the immune response to arboviruses. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 1-11 (2020).
- Raquin, V., Lambrechts, L. Dengue virus replicates and accumulates in Aedes aegypti salivary glands. Virology. 507, 75-81 (2017).
- Farjana, T., Tuno, N. Multiple blood feeding and host-seeking behavior in Aedes aegypti and Aedes albopictus (diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 50 (4), 838-846 (2013).
- Scott, T. W., Takken, W. Feeding strategies of anthropophilic mosquitoes result in increased risk of pathogen transmission. Trends in Parasitology. 28 (3), 114-121 (2012).
- Ross, P. A., Lau, M. J., Hoffmann, A. A. Does membrane feeding compromise the quality of Aedes aegypti mosquitoes. PLoS ONE. 14 (11), 1-19 (2019).
- Ross, P. A., Axford, J. K., Richardson, K. M., Endersby-Harshman, N. M., Hoffmann, A. A. Maintaining Aedes aegypti mosquitoes infected with wolbachia. Journal of Visualized Experiments. 2017 (126), 1-8 (2017).
- Briegel, H., Hefti, M., DiMarco, E. Lipid metabolism during sequential gonotrophic cycles in large and small female Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 48 (5), 547-554 (2002).
- McMeniman, C. J., Corfas, R. A., Matthews, B. J., Ritchie, S. A. S., Vosshall, L. B. Multimodal integration of carbon dioxide and other sensory cues drives mosquito attraction to humans. Cell. 156 (5), 1060-1071 (2014).
- Pakes, S. P., et al. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , National Academic Press. Washington, DC, USA. (2011).
- Deng, L., Koou, S. Y., Png, A. B., Ng, L. C., Lam-Phua, S. G. A novel mosquito feeding system for routine blood-feeding of Aedes aegypti and Aedes albopictus. Tropical Biomedicine. 29 (1), 169-174 (2012).
- Gunathilaka, N., Ranathunge, T., Udayanga, L., Abeyewickreme, W. Efficacy of blood sources and artificial blood feeding methods in rearing of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) for sterile insect technique and incompatible insect technique approaches in Sri Lanka. BioMed Research International. 2017, 3196924 (2017).
- Costa-da-Silva, A. L., et al. Glytube: a conical tube and parafilm M-based method as a simplified device to artificially blood-feed the Dengue vector mosquito, Aedes aegypti. PLoS ONE. 8 (1), 53816 (2013).
- Carvalho, D. O., et al. Mass production of genetically modified Aedes aegypti for field releases in Brazil. Journal of Visualized Experiments. 83 (83), 1-10 (2014).
- Kogan, P. H. H. Substitute blood meal for investigating and maintaining Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 27 (4), 1-4 (1990).
- Gonzales, K. K., Hansen, I. A.
- Baughman, T., et al. A highly stable blood meal alternative for rearing Aedes and Anopheles mosquitoes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (12), 0006142 (2017).
- Galun, R. Feeding stimuli and artificial feeding. Bulletin of the World Health Organization. 36, 590-593 (1967).
- Galun, R. Feeding response in Aedes aegypti: stimulation by adenosine triphosphate. Science. 142, 1674-1675 (1963).
- Jové, V., et al. Sensory Discrimination of Blood and Floral Nectar by Aedes aegypti Mosquitoes. Neuron. 108, 1-18 (2020).
- Petersen, M. T., et al. The impact of the age of first blood meal and Zika virus infection on Aedes aegypti egg production and longevity. PLoS ONE. 13 (7), 1-15 (2018).
- Sissoko, F., et al. Frequent sugar feeding behavior by Aedes aegypti in Bamako, Mali makes them ideal candidates for control with Attractive Toxic Sugar Baits (ATSB). PLoS ONE. 14 (6), 0214170 (2019).
- Houseman, J. G., Downe, A. E. R. Methods of measuring blood meal size and proteinase activity for determining the effects of mated state of digestive processes of female Aedes aegypti (L.) (Diperta: Culicidae). The Canadian Entomologist. 18, 241-248 (1986).
- Redington, B. C., Hockmeyer, W. T. A method for estimating blood meal volume in Aedes aegypti using a radioisotope. Journal of Insect Physiology. 22 (7), 961-966 (1976).
- Gonzales, K. K., et al. The effect of SkitoSnack, an artificial blood meal replacement, on Aedes aegypti life history traits and gut microbiota. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
- Klowden, M. J. The endogenous regulation of mosquito reproductive behavior. Experientia. 46 (7), 660-670 (1990).
- Liesch, J., Bellani, L. L., Vosshall, L. B. Functional and genetic characterization of neuropeptide Y-like receptors in Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (10), 22486 (2013).
- Frances, S. P., Sithiprasasna, R., Linthicum, K. J. Laboratory evaluation of the response of Aedes aegypti and Aedes albopictus uninfected and infected with Dengue virus to Deet. Journal of Medical Entomology. 48 (2), (2011).
- Dennis, E. J., Goldman, O. V., Vosshall, L. B. Aedes aegypti mosquitoes use their legs to sense DEET on contact. Current Biology. 29 (9), 1551-1556 (2019).
- Harrington, L. C., et al. Heterogeneous feeding patterns of the Dengue vector, Aedes aegypti, on individual human hosts in rural Thailand. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (8), 3048 (2014).
- Hol, F. J., Lambrechts, L., Prakash, M. BiteOscope, an open platform to study mosquito biting behavior. eLife. 9, 1-24 (2020).
