Summary
이 프로토콜의 목표는 인공 막 피더를 통해 Aedes aegypti 모기에 동물 유래 및 인공 혈액 식사를 제공하고 섭취한 식사의 양을 정확하게 정량화하는 것입니다.
Abstract
특정 모기 종의 암컷은 달걀 발달에 필요한 단백질이 풍부한 혈액 식사를 얻기 위해 척추 동물 호스트를 물면서 질병을 퍼뜨릴 수 있습니다. 실험실에서, 연구원은 식사 구성의 조작을 허용하는 막 피더를 통해 모기에 동물 유래 및 인공 혈액 식사를 제공할 수 있습니다. 여기서는 Aedes aegypti 모기에 혈액과 인공 혈액 식사를 공급하고 개별 여성이 소비하는 양을 정량화하는 방법을 제시합니다.
인공/혈액 식사의 표적 공급 및 정량화는 모기 행동과 생리학에 대한 식사 구성 요소의 효과를 테스트하고, 주입없이 약리화합물을 제공하고, 특정 병원균으로 모기를 감염시키는 등 광범위한 용도를 가지고 있습니다. 먹이주기 전에 식사에 형광염염료를 첨가하면 후속 식사 크기 정량화를 할 수 있습니다. 모기에 의해 소모된 식사 부피는 여성이 행동 실험을 위해 나중에 이용되어야 하는 경우에, 또는 96웰 플레이트에 있는 개별 적인 여성을 균질화하고 종점 분석으로 플레이트 판독기를 사용하여 형광 수준을 측정하여 무게로 측정될 수 있습니다. 식사 크기 정량화는 식사 구성 요소를 변경하는 것이 섭취된 식사 량을 변경하는지 또는 식사 소비가 모기 균주 마다 다른지 여부를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 정확한 식사 크기 정량화는 호스트 매력이나 대변에 미치는 영향을 측정하는 것과 같은 다운스트림 분석을 위해서도 중요합니다. 여기에 제시된 방법은 며칠 동안 식사 소화를 추적하거나 단일 모기에 의한 각 식사의 소비를 정량화하기 위해 다른 식사 (꿀 및 혈액 과 같은)에 추가 된 여러 구별 마커를 포함하도록 더 적응 할 수 있습니다.
이 방법을 통해 연구자들은 수백 개의 개별 모기가 소비하는 식사 량을 비교하기 위해 높은 처리량 측정을 단독으로 수행할 수 있습니다. 따라서 이러한 도구는 다양한 생물학적 질문에 대답하기 위한 모기 연구자 커뮤니티에 광범위하게 유용할 것입니다.
Introduction
우리는 인공 막 피더를 사용하여 Aedes aegypti 모기에 수정 된 혈액 식사를 공급하고 각 개별 모기가 소비하는 식사 량을 정확하게 측정하는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 식사의 내용을 변경하거나 모기의 다른 실험 단에 의해 소모된 식사 양을 비교하기 위하여 유연하게 적응될 수 있습니다.
Ae. aegypti 모기는 황열병, 뎅기열, 치쿤구냐 및지카1,2,3,4,5를포함하여 질병을 일으키는 원인이 되는 병원균을 퍼감으로써 글로벌 건강을 위협합니다. Ae. aegypti 여성은 혈액 공급자입니다. 그들은 계란 발달에 필요한 단백질을 얻기 위해 척추 동물 혈액을 소비해야하며, 계란의 각 클러치는 적어도 하나의 호스트6,7,8에서전체 혈액 식사를 필요로한다. 암컷 모기는 먼저 그녀의 스타일로 피부를 관통하고 타액을 주입하여 호스트에게 물린데, 이는 호스트의 면역 반응을 유발하는 화합물을 함유하고있습니다 9. 그런 다음 그녀는 그녀의 midgut에 그녀의 스타일을 통해 혈액을 펌핑하여 공급. 감염된 호스트에게서 혈액 식사를 소모하는 동안, 그녀는 그 때 그녀의 타액 선지로 모기의 midgut에서 이동하는 혈액 매개 병원체6,8을섭취할 수 있습니다10. 이러한 방식으로 감염된 여성 모기는 후속숙주(11,12)를물릴 때 타액과 함께 병원균을 주입하여 질병을 확산시킬 수 있다. 혈액 공급 행동의 메커니즘을 이해하고 정량화하는 것은 모기 매개 질병의 전염을 통제하는 중요한 단계입니다.
모기 사육 및 실험을 위한 많은 실험실 프로토콜은 마우스, 기니피그 또는 인간을 포함한 살아있는 동물을 혈액원13,14,15,16으로사용한다. 살아있는 동물의 사용은 윤리적 우려뿐만 아니라 인사 훈련, 동물 주거 및 관리에 대한 복잡한 요구 사항, 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 정책을 준수합니다. 또한 모기에 전달 될 수 있는 화합물의 종류를 제한, 수행 될 수 있는 연구를 제한17.
일반적으로 호스트 피부를 시뮬레이션하기 위해 멤브레인 시스템을 사용하는 인공 혈액 공급 장치는 살아있는 호스트의 유지 보수의 필요성을 우회하는 혈액 공급 행동을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 전혈은 여러 공급 업체에서 구입하고 가열, 물 자켓 인공 멤브레인 피더 또는 유사한 장치를 사용하여 모기에 공급 할 수 있습니다18,19. 이 프로토콜에서는 "글리튜브"라고 불리는 작은 일회용 멤브레인 피더의 사용을 보여줍니다. 이전에 코스타 다 실바 외(2013)20에의해 간행된 이 멤브레인 피더는 표준 실험실 장비에서 쉽게 조립될 수 있어, 적당한 수의 모기에게 혈액 식사를 전달하고 더 큰 그룹 또는 다중 식사 제제를 테스트하기 위해 간단하게 확장할 수 있습니다. 글리튜브는 다른 상업용 인공 피더에 대한 저렴하고 효율적인 대안으로, 더 큰 식사 량이 필요할 수 있으며 단일 식사제형(21)에대규모 모기 그룹을 일괄 공급하는 데 더 적합합니다.
이 프로토콜에는 인공 식사 준비/제공 및 소비 정량화의 두 섹션이 포함되어 있습니다. 첫 번째 섹션에서 Glytube는 조작 된 식단을 제공하는 효율적인 수단으로 사용됩니다. 전혈은 혈액 식사 대신 혈액 대체물의 효과를 비교하기 위해 완전히 인공 식사로 대체 될 수 있습니다. 여러 인공 식사 공식이 개발되었지만 Kogan (1990)22에서 적응 된 조리법이 여기에 제시된다23,24. 또한, 수유는 주입보다 약리학적 화합물을 도입하는 덜 침습적이고 덜 힘든 방법입니다. 이 프로토콜은 각 식사(1-2mL)에 필요한 총 부피수가 적기 때문에 고가의 시약의 양을 줄이는 매력적인 전달 방법을 제공합니다. Ae. aegypti 여성은 아데노신 5′-triphosphate (ATP)25,26을사용하여 식염수 용액의 단백질이 없는 식사를 쉽게 섭취하며, 이는 단일 식사 구성 요소의 효과를 측정하기위한 기준을 제공합니다. 예를 들어, Ae. aegypti의 Neuropeptide Y-like receptor 7(NPYLR7)은 단백질이 풍부한 혈액 식사 후 숙주 추구 억제를 중재하는 것으로 알려져 있으며, NPYLR7 작용제가 단백질이 없는 식염수 식사에 첨가되면 여성 모기는 전체 혈액7을소비한 것과 유사한 호스트 를 찾는 억제를 나타낸다.
두 번째 섹션에서는 개별 여성 모기가 소비하는 각 식사의 양을 정량화하는 단계가 제시됩니다. 이 분석법은 형광에 기반을 두고 있으며 여성이 복부 팽만성에 대한 시각적 평가에 기초하여 "먹이" 또는 "fed"로 분류되는 방법보다 더 높은 해상도의 수유 상태를 캡처합니다. 먹이주기 전에 식사에 형광을 첨가함으로써 개인이 섭취한 식사 량은 각 모기를 96웰 플레이트에 균질화하고 형광 강도를 판독제로 측정하여 정량화될 수 있습니다. 이 분석은 식사 구성 또는 모기의 유전 배경과 같은 변수에 대한 응답으로 활력을 먹이기의 차이를 측정 할 수 있습니다. 정확한 정량화는 중간 식사 크기에 대 한 중요 한, 예를 들어 여성이 먹이 억제를 포함 하는 최적이 아닌 식사를 제공 하는 경우 또는 그들은 변수 크기의 자당 식사를 소비 하는 경우(27). 식사 크기 정량화 후 후속 행동 적 측정에 필요한 경우, 식사 크기는 대신 그룹에서 마취 된 여성을 무게와 개인 당 평균 증가 질량을 추정하여 계산 할 수 있습니다. 형광 표시보다 덜 정확하지만 계량은 여전히 식사 량의 집계 된 추정을 제공하고 fecundity 또는 후속 호스트 매력과 같은 다운 스트림 프로세스에 대한 식사의 영향을 검사 할 수 있습니다. 혈액 식사 크기는 가변적이고 무수한요인(11,28,29)에의해 영향을 받을 수 있지만, 여기에 기재된 방법으로 측정된 섭취식 크기는 이전 정량화7,30,31과일치한다.
Protocol
혈액 공급 절차는 살아있는 동물 또는 인간 호스트를 사용하여 수행되지 않았고 록펠러 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 및 기관 검토 위원회 (IRB)에 의해 설정 된 지침을 준수했다.
1. 식사 준비
- 충고 자극제의 준비, 아데노신 5′트리호스페이트
- 수성 NaHCO3 (분자량, MW = 84.006 g/ mol)의 25 mM 솔루션을 준비하십시오. 25m MM NaHCO3의100mL의 경우, 210 mg의 NaHCO3을 체적 플라스크에 넣고 이중 증류수(ddH2O)를 총 100mL에 채웁니다. 마그네틱 스터드 바를 사용하여 모든 NaHCO3이 용해될 때까지 용액을 철저히 혼합합니다.
- 수성 25m M M NaHCO3에서 ATP 디나트륨 염 수화물(MW = 551.14 g/mol)을 200mM ATP의 최종 농도로 재구성한다. 총 부피 10mL 의 200 mM ATP 25 mM NaHCO3 버퍼의 경우, 1.1 g의 ATP 디나트륨 염수염을 체적 플라스크에 넣고 총 부피 10mL에 25m M NaHCO3 버퍼로 채웁니다. 마그네틱 스터드 바를 사용하여 모든 ATP가 용해될 때까지 용액을 철저히 혼합합니다.
참고: ATP의 가수분해를 최소화하려면 NaHCO3과같은 염용액에 의해 버퍼링되어야 합니다. - ATP 용액을 알리쿼트하고 -20 °C에 저장합니다.
참고: ATP의 이 스톡 솔루션은 일반적으로 6개월마다 신선하게 만들어지며 아래에 설명된 모든 식사에 사용됩니다. 저하를 방지하기 위해 ATP 알리쿼트는 여러 번의 동결 해동 주기를 거치거나 다른 식사 구성 요소와 함께 가열해서는 안됩니다.
- 형광 추적제 용액, 형광액의 준비
- 수성 형광액의 2 % (w / v) 재고 용액을 준비하십시오. 총 스톡 용액 부피 10mL의 경우, 실온에서 알루미늄 호일로 감싼 15mL 원뿔튜브에 10mL의 ddH 2 O와 형광디나트륨 소금0.2g을섞는다. 형광체의 이 주식 용액은 아래에 설명된 모든 식사에서 희석에 사용될 수 있습니다.
참고: 형광은 빛에 민감하기 때문에 알루미늄 호일에 용기를 래핑하여 빛에 노출되지 마십시오.
- 수성 형광액의 2 % (w / v) 재고 용액을 준비하십시오. 총 스톡 용액 부피 10mL의 경우, 실온에서 알루미늄 호일로 감싼 15mL 원뿔튜브에 10mL의 ddH 2 O와 형광디나트륨 소금0.2g을섞는다. 형광체의 이 주식 용액은 아래에 설명된 모든 식사에서 희석에 사용될 수 있습니다.
- 동물 유래 혈액 식사 준비
- 모든 모기를 먹이는 데 필요한 식사 수를 계산합니다. 각 글리튜브는 2mL 식사를 하고 약 25마리의 모기를 먹이고 있습니다. 형광 측정값에 대한 표준 곡선을 보정하기 위해 한 끼 를 추가로 준비합니다. 달리 명시되지 않는 한, 이 섹션의 모든 단계는 최종 2mL의 한 끼를 준비하는 데 필요한 시약 금액을 설명합니다.
- 동물 유래 혈액 식사의 경우 1.98-2 mL의 양피를 15mL 원뿔 관으로 옮기십시오(원하는 혈액 부피의 경우 3.3단계 참조).
참고: 양, 기니피그 및 인간을 포함한 상업적으로 무시된 척추혈액공급원은13마리를사용할 수 있다. 사용하기 전에 구입 한 혈액이 만료 날짜를 통과하지 않았는지 확인하고 병을 반전시켜 잘 섞는지 확인하십시오. - 최적의 수유를 위해 양피가 수조에서 45°C로 따뜻해진 후 ATP를 1-2mM의 최종 농도에 추가하십시오. 1mM ATP의 최종 농도를 위해 200m ATP 스톡 용액의 10 μL을 1.99mL에 미리 데워진 혈액과 혼합에 추가합니다. 최종 농도 2m ATP의 경우 200m ATP 스톡의 20 μL을 1.98mL에 미리 데워진 혈액과 혼합을 추가합니다. ATP를 첨가하지 않으면, 2mL의 양피를 따뜻하게 한다.
- 식용 크기의 형광계 정량화가 이후에 수행될 경우, 최종 농도0.002%(2μL의 2μL 의 2μL 총 식사량)에 형광액용액을 첨가한다. 추가된 형광체와 동일한 양으로 혈액의 양을 감소시면 됩니다. 기준 표준 곡선을 생성하기 위해 0.002% 형광을 함유한 최종 식사 제형의 1mL을 유지한다. 유지 된 볼륨을 모기에 전달 되는 식사와 동일 하 게 치료; 실험 기간 동안 동일한 빛과 온도 조건에 노출시키고 전달된 식사와 함께 이를 동결합니다.
- 인공 혈액 식사 준비
- 모든 모기를 먹이는 데 필요한 식사 수를 계산합니다. 각 글리튜브는 2mL 식사를 하고 약 25마리의 모기를 먹이고 있습니다. 형광 측정값에 대한 표준 곡선을 보정하기 위해 한 끼 를 추가로 준비합니다. 달리 명시되지 않는 한, 이 섹션의 모든 단계는 1개의 2mL 식사를 준비하는 데 필요한 시약 양을 설명합니다.
- 표 1과같이 인공 혈액(코간(1990년)22개에서적응하여 먼저 400m MM NaHCO 3의 스톡 용액을만듭니다. 총 10mL의 400mM MM NaHCO3(MW = 84.006 g/mol)의 총 부피의 경우, 336 mg의 NaHCO3을 체적 플라스크에 넣고 이중 증류수(ddH2O)로 채워 총 10mL의 부피로 채웁니다. 마그네틱 스터드 바를 사용하여 모든 NaHCO3이 용해될 때까지 용액을 철저히 혼합합니다.
- 인공 혈액의 단백질 성분의 경우, 400m MM NaHCO3,ddH2O의 헤모글로빈 35 mg/mL, ddH2O. Protein 스톡 솔루션의 300 mg/mL에서 최대 2개월 동안 저장할 수 있는 γ 50 mg/mL의 스톡 솔루션을 준비합니다. 인공 혈액에서 총 인간 단백질의 최종 농도는 125 mg/mL입니다. 여기에는 15 mg/mL γ-글로불린, 8 mg/mL 헤모글로빈 및 102 mg/mL 알부민의 최종 농도가 포함됩니다.
- 각 2mL 식사에 대해, γ 글로불린600 μL, 헤모글로빈 460 μL, 알부민 680 μL, 표 1에나열된 재고 용액에서 ddH2O의 250 μL을 결합한다. 식사가 45 °C로 따뜻해질 때까지 200 m ATP 스톡 솔루션의 10 μL을 추가 하십시오.
- 식용 크기의 형광계 정량화가 이후에 수행될 경우, 최종 농도0.002%(2μL의 2μL 의 2μL 총 식사량)에 형광액용액을 첨가한다. ddH2O의부피를 4.4 단계에서 형광체첨가와 동일한 양으로 감소시다. 기준 표준 곡선을 생성하기 위해 0.002% 형광을 함유한 최종 식사 제제의 최소 1mL를 유지한다. 유지 된 볼륨을 모기에 전달 되는 식사와 동일 하 게 치료; 실험 기간 동안 동일한 빛과 온도 조건에 노출시키고 전달된 식사와 함께 이를 동결합니다.
- 예의 단백질없는 식염수 식사 준비 (듀발 등에서 적응) (2019)7)
참고: 단백질이 없는 식염수 식사는7,27,32로여러 가지 방법으로 제조할 수 있다. 여기에 제시 된 식염수 식사는 위에서 설명 한 인공 혈액 조리법의 단백질이없는 버전입니다.- 모든 모기를 먹이는 데 필요한 식사 수를 계산합니다. 각 Glytube는 2mL 식사를 보유하고 있으며 약 25마리의 모기에게 1개의 추가 식사를 공급하여 형광 측정을 위한 표준 곡선을 보정합니다. 달리 명시되지 않는 한, 이 섹션의 모든 단계는 1개의 2mL 식사를 준비하는 데 필요한 시약 양을 설명합니다.
- 식염수 식사를 준비하려면 400 mM NaHCO3의재고 용액을 만듭니다. 총 10mL의 400mM MM NaHCO3(MW = 84.006 g/mol)의 총 부피의 경우, 336 mg의 NaHCO3을 볼륨 플라스크에 넣고 총 10mL의 총 부피인 ddH2O로 채웁니다. 마그네틱 스터드 바를 사용하여 모든 NaHCO3이 용해될 때까지 용액을 철저히 혼합합니다.
- 2mL 식사당 400mM MM NaHCO3의 15mL 원문 튜브 600 μL에 ddH2O.의 1.39mL을 결합하여 식사 후 수조에서 45°C로 따뜻해질 때까지 200m ATP 스톡 솔루션의 10μL을 추가하십시오.
- 식용 크기의 형광계 정량화가 이후에 수행될 경우, 최종 농도0.002%(2μL의 2μL의 총 식수량 2mL)에 형광용액을 첨가한다. ddH2O의부피를 5.3 단계에서 형광체첨가와 동일한 양으로 감소시다. 기준 표준 곡선을 생성하기 위해 0.002% 형광을 함유한 최종 식사 제제의 최소 1mL를 유지한다. 유지 된 볼륨을 모기에 전달 되는 식사와 동일 하 게 치료; 실험 기간 동안 동일한 빛과 온도 조건에 노출시키고 전달된 식사와 함께 이를 동결합니다.
2. 모기에 식사 배달
- 수유를 위한 모기 용기 설치
참고: 모기는 다음과 같은 기준을 충족하는 한 다양한 용기에서 공급될 수 있습니다. 용기가 모기가 날아다니기에 충분히 크지만 너무 크지 않아 모기가 메쉬 표면을 찾고 먹이를 주기 가 어렵습니다. 컨테이너를 덮는 데 사용되는 메쉬는 재료와 구멍 크기가 다를 수 있습니다. 구멍은 여성 모기의 스타일이 관통할 만큼 충분히 커야 하지만 모기가 탈출할 수 있는 것은 그리 크지 않습니다. 메쉬가 팽팽하게 유지되도록 단단히 고정하고 글리튜브는 먹이 주기 동안 표면에 안정적으로 휴식을 취할 수 있습니다.- 예시용기(도 1)는수정된 946mL(32온스) 고밀도 폴리에틸렌(HDPE) 플라스틱 버킷이다. 이 설정을 복제하려면 면도날을 사용하여 버킷 뚜껑에서 직경 ~10cm의 중앙 구멍을 잘라냅니다. 모기에 의한 직업용 용기를 조립하려면 양동이 위에 0.8mm 폴리에스테르 모기 그물을 넣고 ~ 400cm2 평방 피스를 고정하여 천공 된 뚜껑을 단단히 밀어 단단히 스냅하십시오.
- 적어도 3 일 이상 인 여성 모기를 수집하여 혈액 공급에 충분히 성숙하도록 하십시오. 최적의 급식율은 7일33일후에 관찰된다.
- 여성 모기를 용기에 넣고 메쉬로 덮습니다. 용기가 모기로 채워지면 사용되는 글리튜브 의 수를 늘립니다. 최적의 수유는 ~25 마리의 모기 / 글리튜브로 달성됩니다. 이것은 먹이 막에 접근을 위한 경쟁을 감소시킵니다.
- 식사를 제공하지 않는 먹이없는 모기의 대조군을 따로 두십시오. 체중 측정 프로토콜에서, 별도로 공급되지 않은 그룹을 무게와 식사에 공급 실험 그룹에서 체중 증가를 추정하기 위해이 무게를 사용합니다. 형광 기반 정량화 프로토콜에서 표준 곡선 계산 및 음의 제어를 위해 유정에 공급되지 않은 모기 그룹을 추가합니다. 실험 군의 기준선 모기 조직 자동 형광과 일치하려면 표준 곡선 및 음성 제어 우물에 공급되지 않은 모기가 포함되어 있는지 확인하십시오.
- 글리튜브 구축 및 설정 (코스타 다 실바 등에서 적응) (2013)20)
- 도 1에묘사된 바와 같이, 열원을 생성하기 위해, 100% 글리세롤의 40mL로 50mL 원전관을 채우십시오. 5cm × 5cm 의 파라필름으로 열린 원문 튜브를 밀봉하고 5cm × 5cm 파라필름으로 반복하여 누출 가능성을 최소화합니다. 선택적으로, 파라필름은 고무 밴드를 사용하여 제자리에 고정될 수 있다. 튜브를 뒤집어 구멍이나 틈새가 없는지 확인합니다.
- 식사 배달 장치를 만들려면 날카로운 면도날을 사용하여 원적 튜브의 나사 캡에 직경 2.5cm의 중앙 구멍을 잘라 내거나, 더 나은 일관성을 위해 선반을 만듭니다. 5cm × 5cm의 파라필름을 고르게 펴서 크기가 두 배가 됩니다. 파라필름은 모기가 쉽게 관통할 수 있을 만큼 얇아야 하지만 누출은 없어야 합니다. 나사 캡의 바깥쪽 표면에 밀봉하여 구멍을 완전히 덮고 캡을 옆으로 놓습니다.
참고: 패럴림픽을 스트레칭하기 전에 글리튜브에 대한 매력을 높이기 위해 화장품이 적용되지 않은 인간의 피부 패치에 부드럽게 문지르며 구멍이 만들어지지 않는 것을 주의하여 인간의 냄새로 향수를 피하십시오. 실험이 모기가 식사에 접근하는 데 필요한 감각 단서를 조사하기위한 것이 아니라면 권장됩니다. - 글리세롤의 밀봉 된 튜브와 식사 (ATP를 제외한 모든 구성 요소 포함)를 42-45 °C 수조에서 적어도 15 분 동안 가열합니다. ATP를 예열하지 마십시오. 실험을 시작하기 직전에 추가합니다.
- 따뜻하게 데운 식사와 소용돌이에 ATP를 철저히 넣습니다. 파이펫 2 mL의 따뜻한 식사는 나사 캡의 내부 챔버에 넣고 반전되고 따뜻하며 글리세롤이 채워진 50 mL 원추형 튜브를 부드럽게 배치합니다. 식사와 함께 뚜껑을 글리세롤이 채워진 튜브에 부분적으로 나사로 끼워 서 식사 나 글리세롤의 누출을 방지 할 수 있습니다.
참고: 사용되는 식사 량은 1mL에서 2.5mL 사이일 수 있습니다. 식사가 부족하거나 비싼 화합물을 제공하는 데 사용될 때 더 적은 볼륨이 특히 유용 할 수 있습니다. 식사가 주변 온도로 식히지 않고 최대 급수의 가능성을 감소시키지 않도록이 단계에서 신속하게 작업하는 것이 중요합니다. 냉각 속도는 이러한 단계가 수행되는 실내의 주변 온도에 따라 다르지만 일반적으로 25 °C에서 5 분 이내에 완료해야합니다. - 조립된 글리튜브를 모기 용기 위에 놓고 모기가 최대 급식률을 달성하기 위해 최소 15분 동안 먹이를 먹을 수 있도록 합니다.
- 최적의 수유를 위해 CO2 패드가 장착된 챔버 내부에 모기 용기를 놓고 식사 전에 25-28°C 및 70-80% 습도에서 최소 15분 이상의 적응을 허용하십시오. 여기에 사용되는 분석 챔버는 이전에 게시 된 설정(16)의간단하고 저렴한 비용 수정이다. 36cm L × 31cm W × 32cm H의 반투명 폴리프로필렌 수납 박스를 탈착식 뚜껑을 사용합니다. 챔버 벽에 만들어진 직경 1.5cm의 구멍은 실리콘 튜브를 통해 CO2 전달을 허용합니다. CO2 확산 패드는 정제된 공기및CO2의 전달을 위해 뚜껑의 내부 중앙에 부착되어 시험 기간 동안 챔버 분위기를 조절한다.
참고: 모기가 멤브레인 피더에 끌리도록 호스트 큐(열 및 CO2,선택적 숙주 냄새16)가있는지 확인하십시오. 글리튜브 아래에 모기가 몰려들지 않는 경우 CO2가 제대로 전달되고 식사와 글리튜브가 충분히 따뜻하다는 것을 확인하십시오. 외부 CO2 소스를 사용할 수없는 경우, CO2는 숨을 내쉬는 인간의 호흡의 퍼프를 통해 전달 될 수있다. - 먹이를 얻은 후 글리튜브 캡은 생체 위험 폐기물로 폐기하거나 낮은 비율의 표백제 용액에 담그고 물에 완전히 헹구면 재사용할 수 있습니다.
3. 소비된 식사의 정량화
- 추가 실험에 사용할 모기 의 계량
참고: 모기를 계량하여 식사 크기를 정량화하면 더 생생한 실험을 위해 사용할 수 있지만이 방법은 5 마리의 모기 그룹에서 체중 측정을 받아야합니다. 개별 모기의 무게는 대부분의 실험실 균형을 사용하여 정확하게 측정하기 어렵기 때문에, 개별 식사 크기의 가변성은 무게를 측정하여 쉽게 정량화 될 수 없습니다. 계량은 여성이 눈에 띄게 식사에 engorge 하는 상황에서만 권장 됩니다.- 차가운 마취는 용기를 4°C 의 차가운 방으로 옮기거나 얼음 위에 놓아 모기를 마취시합니다.
- 공급되지 않은 코호트 (즉, 식사를 제공하지 않은 모기)에서 5 명의 여성의 그룹을 계량하고 "사전 먹이"체중의 추정치로 평균 체중을 계산합니다. 미혼 모기의 평균 무게는 유전자형, 성별 및 양육 조건에 달려 있습니다. 자당에 대한 광고 리비툼 액세스로 사육 된 여성 Ae. aegypti 모기는 일반적으로 약 2 mg의 무게를 달았다.
- 실험 코호트(즉, 식사를 제공한 모기)에서 여성은 눈으로 관찰할 수 있는 복부 팽팽을 기반으로 "먹이기"와 "먹이지 않는" 더미로분류한다. 각각의 "먹이"와 "먹이지 않는" 더미를 각각 5마리의 모기 그룹으로 나누어 계량합니다. 5의 각 단 내의 모기는 그룹 체중 측정을 취하기위한 동일한 실험 코호트에서 파생되어야한다. 실험 군의 각 "먹이"와 "먹이지 않음" 더미에서 여성당 평균 중량을 계산합니다.
- 엔드포인트 분석을 위한 형광 측정7,27,34
참고: 더 이상 살아있는 실험을 위해 더 이상 필요하지 않은 개별 모기로부터 정확한 식사 크기 측정을 얻으려면, 모기와 0.002% 형광을 함유한 나머지 1mL의 식사를 먹이 직후 -20°C에 보관하십시오. 실험은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 이 메서드는 그림 2.- 기준 표준 곡선을 생성하려면, 모기의 실험 그룹에 제공된 0.002% 형광체를 포함하는 동일한 식사의 직렬 희석을 준비한다. 총 8개의 표준 곡선 솔루션이 있을 것입니다. 이러한 각 솔루션에서 0.002% 형광을 함유한 최종 식사량은 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125, 0.15625, 0.078125 또는 0 μL, 각각 100 μL(예:, 5 μL)의 총 부피에 대해 1x 인산염 완충식식염(PBS)에 있을 것이다(예: 0.002%의 PBL).
- 표준 곡선의 첫 번째 용액을 만들기 위해 0.002% 형광을 함유한 50μL을 1x PBS의 950 μL에 950 μL에 추가하고 소용돌이를 철저히 추가하십시오(최종 부피: 1x PBS의 95 μL에서 0.002% 형광을 함유한 식사5 μL). 표준 곡선 용액의 나머지 부분을 만들기 위해 이전 튜브에서 500 μL을 복용하고 1x PBS의 500 μL을 포함하는 새로운 튜브에 추가하여 각 단계에 대해 2 배 희석을 수행합니다. 다음 2 배 희석을 준비하기 전에 소용돌이.
- 기준 표준 곡선을 생성하는 데 사용되는 웰을 준비하기 위해 각 표준 곡선 솔루션의 파이펫 100 μL을 96웰 PCR 플레이트의 첫 번째 열에 있는 8개의 우물에 각각 들어올 수 있습니다. 플레이트의 첫 번째 열에 동일한 8 개의 우물 각각에 1 개의 미공급 제어 모기를 추가합니다. 복제 측정을 위해 플레이트의 두 번째 열에서 반복합니다.
참고: 실험 그룹이 서로 다른 식사 유형을 제공하는 경우 각 식사 유형에 대해 별도의 기준 표준 곡선을 준비해야 합니다. - 남은 1x PBS 100 μL을 추가하여 미공급 제어 및 실험 그룹을 위해 잘 남아 있습니다. 비드 밀 균질화 또는 소용돌이를 사용하여 후속 단계에서 조직이 중단되는 경우, 각 우물에 1 3mm borosilicate 고체 유리 구슬을 추가합니다.
- 음의 대조군으로서, 접시의 다음 2개의 열에 있는 각 우물에 1개의 미공급 모기를 추가합니다. 이 그룹에서 측정된 형광은 조직 자동 형광을 설명하기 위해 기준선 차단을 설정하고 식사에 공급된 실험 군에서 모기가 있는지 여부를 결정하는 데 사용될 것입니다.
- 식사를 제공 한 실험 그룹에서 나머지 우물에 잘 당 1 모기를 추가합니다.
- 플레이트를 조심스럽게 밀봉하고 수동 연삭으로 조직을 방해합니다. 복부는 철저하게 균질화하여 식사를 풀어주어야합니다. 조직을 방해하는 방법에는 3mm borosilicate 고체 유리 구슬 (30 초 동안 30 Hz) 구슬을 사용하는 구슬 밀 균질화증, 3mm borosilicate 고체 유리 구슬, 또는 구슬이없는 유봉 분쇄기를 포함하는 방법이 포함됩니다.
- 2000 rpm에서 1-2 분 동안 플레이트를 원심 분리하여 lysate를 수집합니다.
- 각 우물에 1x PBS180 μL로 검은색 96웰 플레이트를 준비합니다.
- 1x PBS의 180 μL로 각각 의 20 μL을 각각 잘 옮기고 혼합합니다. 사용 가능한 경우 이 단계에서 다중 채널 파이펫을 사용하여 속도와 일관성을 향상시킵니다.
- 485/520 여기/방출 채널의 플레이트 리더를 사용하여 각 우물의 형광 강도를 측정합니다. 해당 형광 강도 측정에 대해 알려진 양의 식사량을 플로팅하여 기준 표준 곡선을 생성합니다.
- 생성된 기준 표준 곡선을 사용하여 각 실험군 모기에 의해 섭취되는 식사 량을 추정한다. 각 실험군 개인의 형광 강도 판독에서 미혼 모기의 음성 대조군의 평균 형광 강도 판독을 빼서 기준선 조직 자동 형광을 교정한다.
Representative Results
도 1은 글리튜브조립을 위한 회로도를 제시하는 반면, 도 2는 여기에 설명된 형광계 분석기를 이용하여 식사 크기를 측정하는 실험설계에 대한 개요를 나타낸다. 도 3은 혈액 공급 실험에서 대표적인 형광식 식사 크기 측정을 제공한다. 도 4, 도 5및 도 6은 이 프로토콜을 사용하여 해결할 수 있는 생물학적 질문의 샘플링을 도시한다. 프로토콜의 응용 프로그램은 광범위하고 혈액 식사 구성변경, 약리학적 화합물 을 공급, 정확하게 최적 이하의 혈액 식사 또는 작은 꿀 식사를 정량화하고, 모기 유전자형에 걸쳐 먹이 행동을 비교 포함.
식사 량 계산에 대한 표준 곡선을 생성하기 위해, 형광 수치는 각각 0.002 % 형광액을 함유한 지정된 기준 우물과 알려진 식사 부피를 포함하는 지정된 기준 우물에서 플롯됩니다(그림3A). 남은 우물에서 의형 수치는, 미공급 모기의 부정적인 대조군 또는 식사를 제안한 모기의 실험단으로부터 모기를 포함하는, 각 모기에 의해 소비되는 식사 량(μL)을 정량화하기 위하여 이 표준 곡선과 비교된다(그림 3B). 이 분석에서 기준선 판독값을 검증하려면, 미혼 음성 대조군에서 모기가 소비된 μL의 양수 값을 할당하지 않는 것을 확인되어야한다(도 3B, 왼쪽). 실험군의 모든 암컷이 혈액식을 제공받았지만, 일부 모기는 먹이지않았다(도 3B, 중간)일부는 하지 않았다(그림3B, 오른쪽). 이 결과는 이 프로토콜에서 두 가지 유형의 데이터를 얻을 수 있음을 보여줍니다: 1) 주어진 식사에 공급하는 총 여성의 비율, 2) 주어진 식사에 먹이 는 여성에 의해 섭취 볼륨.
이 프로토콜은 다양한 단백질 조성물로 식사를 제공하고 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 그림 4A, B는 형광이 첨가된 식사를 사용하여 수집된 데이터를 표시합니다. 먹이는 모기의 비율과 섭취한 식사 량은 각각 형광 수치에서 계산되었습니다. 이 수치는 매우 민감하고 μL의 정확한 정량화를 허용하지만, 모기가 미래의 라이브 실험에 사용할 수 없다는 한계가 있습니다. 그림 4C,D는 형광없이 식사를 제공 한 후 눈에 먹이 또는 공급으로 득점 된 모기와 독립적 인 실험에서 수집 된 데이터를 보여줍니다. 식사 크기는 5 모기의 그룹에서 평균 체중 / 여성으로 계산되었다. 이러한 중량 측정은 형광 측정보다 덜 민감하지만, 암컷을 회수하고 더 라이브 실험을 위해 사용될 수 있습니다. 사료를 먹는 모기의 비율은 그림 4A 및 도 4C에반영된 것과 같이 다른 실험일에 따라 다를 수 있습니다.
그림 5는 모기 호스트 추구 행동을 통제하는 약을 포함하는 식사의 양을 보여줍니다. 이러한 실험에서, 암컷은 인간 NPY Y2 수용체 작용제, TM30338의 100 μM을 가진 혈액, 식염수 + ATP 식사, 식염수 + ATP 식사를 제공하였다. 이 약은 Ae. aegypti NPY 같이 수용체 7의 활성화를 통해 호스트 를 찾는 행동을 변경합니다. 식사 크기를 측정하는 것은 연구원이 각 여성에 의해 소비된 복용량을 계산하는 것을 허용하기 때문에 포스트 혈액 공급 행동에 이 약의 효력을 평가하기 위하여 실험의 해석을 위해 중요합니다.
이전 예에서, 여성은 혈액 또는 대체 혈액 식사를 공급했다, 모두는 3-5 μL 식사 결과(그림 3, 도 4, 도 5). 이 형광 기반 분석은 또한 평균 그룹 체중 측정에서 정확하게 분별할 수 없는 더 작은 및/또는 더 많은 가변 식사 크기를 측정하는 데 사용될 수 있습니다. 도 6에서,동일한 형광 정량화 프로토콜은 0.002% 형광을 함유한 10%의 자당으로 포화된 면공에 대한 글리튜브를 교환하여 넥타 공급 거동을 측정하는 데 사용되었다. 여성스타일로 넥타 설탕의 존재를 감지할 수 없고27의수유를 시작하지 않기 때문에 넥타 설탕은 글리튜브 분석에서 제시될 수 없다. 이 데이터는 연구원이 설탕 식사가 이전 작업34 (그림 6)와합의하여 혈액 식사보다 일관되게 작다는 것을 결정할 수 있게 합니다.
그림 1: 모기에게 식사를 공급하는 데 사용되는 글리튜브 방법의 설정. (A)모기에게 혈액 과 다른 식사를 공급하는 데 사용되는 해체 된 글리튜브의 회로도. (B)글리튜브의 회로도는 메쉬 뚜껑이 있는 모기 의 용기 위에 제시하였다. 암컷 모기는 메쉬 뚜껑을 관통하여 먹이를 줄 수 있습니다. (C)글리튜브(위) 및 여성 Aedes aegypti 모기의 사진은 글리튜브가 배달한 식사에서 전, 도중, 그리고 먹이를 주고(아래, 왼쪽에서 오른쪽으로) 모기는 멤브레인 피더에 액세스하기 위해 용기를 덮고 있는 메쉬를 관통하는 것으로 나타났습니다. (D)여성 Ae. aegypti 모기의 출현을 보여주는 사진 (왼쪽) 인공 혈액 식사 (오른쪽, 위) 또는 식염수 + ATP 식사 (오른쪽, 아래)에 유혹한. 글리튜브 방법은 이전에 코스타 다 실바 외에 게시되었습니다. (2013)20. 사진 제공(C)및(D)알렉스 와일드의 호의입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 글리튜브 혈액 공급 프로토콜 후 식사 크기를 정량화하는 방법의 회로도. (A)모기는 형광체(상단, 실험군)가 있거나 식사 가 없는 식사(바닥, 미혼 음성 대조군)로 식사를 제공합니다. (B)개별 모기는 수유 실험을 종료한 후 96웰 플레이트에 첨가된다. (C)표준 곡선은 0.002% 형광을 함유한 고액의 식사량을 사용하여 생성됩니다. (D)모기는 모든 소비형형광을 방출하기 위해 균질화되고, 각 우물의 형광 수준은 플레이트 판독기를 사용하여 정량화된다. 이러한 형광 정량화 방법은 Liesch 외에서 수정됩니다. (2013)34. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 형광계 정량화를 위한 글리튜브 혈액 공급 실험. (A)미공급 대조군으로부터 모기가 0.002% 형광실(y축 스케일 = 임의 단위)을 함유한 식사의 공지된 수량에 첨가된 우물에서 얻은 표준 곡선 측정. (B)미지급 대조군(왼쪽, 검은색, n=40), 혈액에 공급된 실험군(중간, 빨강, n=37) 및 혈액(오른쪽, 빨강, n=23)에 공급되지 않은 실험군에서 여성에 대한 형광 측정값을 사용하여 계산된 식사 부피. 각 점은 개별 여성의 측정값을 나타냅니다. 데이터는 범위가 있는 중앙값으로 표시됩니다. 편지는 통계적으로 구별되는 그룹, 던의 다중 비교와 크루스칼- 월리스 테스트, p&0.01을 나타냅니다. 이러한 데이터는 Jové 외(2020)27에게시되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 단백질 구성이 다른 식사의 정량화. 암컷은 양혈액(적색), 인간의 혈액 단백질(Kogan (1990)22)(오렌지), 또는 단백질이 없는 식염수 + ATP 식사(아쿠아)7의식사를 제공하였다. (A)형광 수치를 사용하여 득점한 여성의 비율. 각 포인트는 12-16 여성의 그룹을 나타냅니다. 데이터는 범위, n = 12의 중앙값으로 표시됩니다. (B)형광 수치를 사용하여 계산된 식사 량. 각 점은 그림 4A에서단일 시험에서 개별 여성의 측정값을 나타냅니다. 데이터는 범위, n = 12의 중앙값으로 표시됩니다. (C)인공막 수유 후 완전히 채광된 암컷의 백분율이 눈으로 채점하였다. 각 점은 20-30 명의 여성 그룹에서 유혹 된 여성의 퍼센트를 나타냅니다. 데이터는 범위, n = 23의 중앙값으로 표시됩니다. (D)수유 후 체중/여성으로 득점된 식사 사이즈는 눈으로 채점하였다. 무게는 5 모기의 단의 평균으로 계산되었습니다. 데이터는 범위, n = 23의 중앙값으로 표시됩니다. A–D: 편지는 통계적으로 구별 그룹을 나타냅니다, 던의 여러 비교와 크루스칼 - 월리스 테스트, p&0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 약리학적 화합물이 있는 식사의 정량화. 여성은 양 혈액 (빨강), 식염수 + ATP (아쿠아), 식염수 + ATP + 인간 NPY Y2 수용체 작용제 TM30338 (다크 블루)의 100 μM 용량의 식사를 소비합니다. 형광 수치를 사용하여 계산된 식사 량. 각 점은 개별 여성의 측정값을 나타냅니다. 데이터는 범위, n = 12의 중앙값으로 표시됩니다. 편지는 통계적으로 구별되는 그룹, 던의 다중 비교와 크루스칼- 월리스 테스트, p&0.05를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 작은 꿀 식사의 정량화. (A)꿀 먹이 분석의 회로도. (B)야생형 암컷에 대한 형광 측정값을 사용하여 계산된 식사 부피는 물(파란색, n=36) 또는 10% 자당(녹색, n =53)의 식사를 제공하며, 각각 0.002% 형광액을 가진 넥타 수유 분석서이다. 각 점은 개별 여성의 측정값을 나타냅니다. 데이터는 범위가 있는 중앙값으로 표시됩니다. 편지는 통계적으로 구별되는 그룹, Mann-Whitney 시험, p&05를 나타냅니다. 이러한 데이터는 Jové 외(2020)27에게시되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 인공 혈액 식사 | |||
| 주식 용액의 농도 (mg / mL) | 식사 중 재고 용액량 (μL/mL) | 최종 식사 농도 (mg/mL) | |
| 단백질 성분* | |||
| γ 글로불린 | 50 | 300 | 15 |
| 헤모글로빈 | 35 | 230 | 8 |
| 알부민 | 300 | 340 | 102 |
| 총 단백질 | - | - | 125 |
| 비 단백질 성분 | |||
| 주식 용액의 농도 (mM) | 식사 중 재고 용액량 (μL/mL) | 최종 식사 농도 (mM) | |
| Nacl | γ 글로불린 재고 | - | 5-10 |
| 나에코3 | γ 글로불린 재고 | - | 120 |
| Atp | 200 | 5 | 1 |
| 물 | - | 125 | - |
| *단백질 성분은 400mM NaHCO3에 용해되고 가변량인 NaCl(2-4%)을 포함하는 γ-글로불린을 제외한 이중 증류수의 재고 용액으로 제조됩니다. 상품에. | |||
표 1: 인공 혈액 식사 준비 를 위한 레시피 (코간 (1990)22에서적응). 인공 혈액은 인간의 혈액에서 정기적으로 발견되는 단백질과 비 단백질 성분으로 구성되며 이러한 구성 요소의 비율을 변경할 수있는 옵션을 제공합니다. 모기는 인공 혈액7,22에먹이 후 계란을 생산할 수 있습니다.
| 식염수 | |||
| 구성 요소 | 주식 용액의 농도 (mM) | 식사 중 재고 용액량 (μL/mL) | 최종 식사 농도 (mM) |
| Nacl | - | - | - |
| 나에코3 | 400 | 300 | 120 |
| Atp | 200 | 5 | 1 |
| 물 | - | 695 | - |
표 2: ATP와 식염수 식사 레시피 (듀발 등에서 적응) (2019)7). 단백질이 없는 식염수 식사는 여전히 혈액 공급 후 발생하는 복부 팽창을 모방하면서 모기에 관심있는 화합물을 전달하는 데 사용할 수 있지만 단백질을 섭취 할 때 발생하는 계란 발달을 유발하지 는 않습니다.
Discussion
많은 실험실 응용 분야에서 인공 멤브레인 피더는 연구원이 식사 내용을 직접 조작 할 수있는 능력을 허용함으로써 라이브 호스트에 비해 뚜렷한 이점을 제공합니다. 인공 멤브레인 공급에 여러 가지 방법을 사용할 수 있지만, 여기에 설명 된 방법은 유연성, 비용 및 처리량의 장점을 제공합니다. 다른 상용 멤브레인 피더와 비교하여 Glytube 분석법은 소량의 식사 량이 필요하며, 약물이나 병원균을 포함한 비용이 많이 드는 시약에 대한 효율적인 전달 메커니즘으로7,35에필요한총 부피를 최소화한다. 단백질이 없는 식염수와 인공 혈액 식사가 모두 포진을 촉진하기 때문에 화합물 이나 병원균은 주사에 대한 높은 처리량 및 비 침습적 대안으로 어느 식사에 첨가 될 수 있습니다. 또한, 글리튜브의 각 성분은 쉽게 세척, 교체 또는 스케일업하여 수유 장치의 교차 오염 없이 여러 식사 유형을 전달하고 정량화할 수 있다.
모기에 의해 소비되는 식사 량을 정량화하기 위하여는, 형광 기지를 둔 방법은 먹이기 전후에 모기를 무게보다는 더 정확한 식사 크기 정량화를 가능하게 합니다. 이 방법은 엔드 포인트 분석이라는 점에 유의해야 합니다. 대조적으로, 계량은 추가 실험을 위해 모기를 살아 있게 할 수 있게 합니다. 플레이트 판독기를 사용하여, 형광 계 의 방법은 개별 여성의 수백에 의해 소비 식사의 높은 처리량 정량화를 위해 쉽게 확장 될 수있다.
높은 공급 비율을 달성하기 위해, 충분한 호스트 단서의 조합은 여성 호스트 추구 행동을 활성화하고 피더에 여성을 유치하기 위해 존재해야합니다. 글리튜브 아래에 모기가 몰려들어 있지 않으면 식사가 제대로 따뜻해지지 않거나 CO2 배달이 충분하지 않을 수 있습니다. 막 표면에 인간의 냄새를 첨가하여 인공 막의 매력을 안정적으로 증가시킵니다. 글리튜브 아래에서 모기가 관찰되지만 먹이지 못하면 식사 구성이 잘못될 수 있습니다. 식사 자체가 따뜻하지 않거나, 혈액이 너무 오래되거나, 식사에 첨가제가 본질적으로 역경적이거나 바람직하지 않은 화학 반응을 유발하는 경우 여성은 먹이를 하지 않을 수있습니다(36). 추가 ATP는 또한 안정적으로 공급 속도를 증가시키고 제공된 각 조리법에서 2mM의 최종 농도까지 확장 될 수 있습니다. 여성은 파라필름이 글리튜브 캡을 가로질러 팽팽하게 당기지 않으면 먹이를 줄 수 없습니다. 파라필름은 균일하게 투명해야 하며, 여성이 파라필름을 스타일으로 효과적으로 관통할 수 없도록 하기 때문에 버클해서는 안 됩니다. 식사가 글리튜브를 통해 메쉬로 누출되는 경우, 파라필름은 스트레칭 과정에서 찢어졌을 수 있으며 교체해야 합니다.
식사 구성을 변경하면 연구원은 미드구트에서 식사를 지우는 데 필요한 시간의 길이뿐만 아니라 후속 호스트 추구 행동을 조작 할 수 있습니다. 여기에 제시 된 식사는 동물 유래 혈액과 유사한 소화7을 위해 24-36 h가 필요합니다. 이러한 식사 중 어느 한 식에도 먹이 후, 여성은 소화 시간 창 동안 호스트 추구를 억제 합니다. 식염수 식사는 단백질이 부족하기 때문에, 여성은 식사가 지워진 후 호스트 찾기로 돌아갑니다. 빠른 반환이 바람직한 경우, 연구원은 약 6 시간27에서배설되는 대체 "빠른 청산"식염수 식사를 선택할 수 있습니다. 여기에 제시 된 식염수 식사의 구성은 인공 혈액 식사와 직접 결과를 비교하기 위해 일치하지만, "빠른 지우기"식사는 척추 동물 혈액에서 발견되는 생리적 소금 수준과 더 밀접하게 일치합니다.
여기에 설명된 방법은 연구원의 실험 목표에 가장 적합한 분석법을 선택하기 전에 고려해야 할 한계가 있습니다. 설명된 형광량 측정은 추가 실험을 위해 모기를 다시 사용하는 것을 허용하지 않습니다. 그러나, 형광분석기를 이용하여 식사 크기 정량화 전에 중량 측정을 할 수 있다. 주어진 식사에 대 한 여러 실험에 걸쳐 무게와 식사 크기는 일관 된 경우, 무게는 향후 실험에서 프록시로 사용할 수 있습니다. 더욱이, 이 프로토콜은 호스트 추구에 있는 적자 대 혈액 공급 행동 사이에서 구별하지 않습니다; 막 피더를 찾는 데 장애를 보이는 모기는 수유 율 및 /또는 식사 크기가 감소할 것입니다. 분석 전반에 걸쳐 행동을 기록하는 카메라를 추가함으로써 연구자들은 여성이 Glytube를 찾을 수 있는지 또는 글리튜브를 찾을 수 있는지 여부를 결정할 수 있지만 먹이를 제공하지 는 않습니다.
여기에 설명된 분석체는 모기의 먹이 행동과 관련된 많은 뛰어난 질문을 탐구하기 위해 적응할 수 있습니다. 예를 들어, 특정 혈액 단백질의 기여는 인공 혈액 식사에서 구성 단백질 또는 총 단백질 농도의 비율을 변경하여 탐구될 수 있다. 여러 먹이 이벤트에서 식사 크기를 평가하기 위해, 독특한 소스(37)에서식사를 차별화하기 위해 뚜렷한 형광 스펙트럼염료를 추가 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 혈액을 검출하고 섭취(즉, stylet)에 사용되는 내부 구강 부와 모기가 혈액을먹이기 시작하는 모기 대지(즉, 라듐, 다리)에 접촉하는 화학 감각 부속물을 별도로 자극하도록 수정될 수 있다. 예를 들어, 리간드가 식사에 직접 첨가되는 경우 멤브레인이 스타일에 의해서만 관통되기 때문에 라비움과 다리에 접촉하지 않습니다. 리간드가 파라필름의 바깥쪽에 첨가되면, 그(것)들은 식사에서 분리된 남아 있고 라듐과 다리에 의해 접촉될 수 있습니다(36). 마지막으로, 혈액 공급 행동의 상세한 운동은 잘 이해되지 않으며 여기에 제시된 방법은 운동, 자세 및 공급 역학의 행동 판독을 추출하기 위해 기계 학습 도구와 고해상도 추적을 결합하도록 수정될 수 있다38.
이 프로토콜은 모기 혈액 공급 및 혈액 먹이 후 행동을 연구하기 위해 약리학 및 유전 조작을 사용하는 연구원에게 서비스를 제공하는 능력으로 사용자 친화적이고 비용 효율적이기 위한 것입니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
니펀 바스루르, 아드리아나 K. 로사스 빌가스, 나다브 샤이, 트레버 소렐스에게 원고에 대한 의견을 전하고, 중얀 공과 키롤로스 바르소움에게 기술 지원을 부탁드립니다. 그림 1에사용된 사진에 대해 알렉스 와일드에게 감사드립니다. K.V.는 보링거 잉겔하임 폰드 박사 학위 펠로우십의 지원을 받았습니다. V.J.는 NIH T32-MH095246에 의해 부분적으로 지원되었다. 이 작품은 V.J에 고급 연구 프로그램에 대한 제임스 H. 길리엄 펠로우십을 통해 하워드 휴즈 의학 연구소에서 록펠러 대학에 보조금에 의해 부분적으로 지원되었다. 이 자료는 그랜트 번호에서 국립 과학 재단 대학원 연구 펠로우십 프로그램에 의해 지원 되는 작업을 기반으로 합니다. NSF DGE-1325261에서 V.J. 이 자료에 표현된 의견, 사실 인정 및 결론 또는 권고사항은 저자의 의견이며 반드시 국립 과학 재단의 견해를 반영하지는 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 3 mm diameter borosilicate solid-glass bead | MilliporeSigma | Z143928 | For use for bead mill homogenizer; not required if using pellet pestle grinder |
| 32 oz. high-density polyethylene (HDPE) plastic cup | VWR | 89009-668 | Example mosquito container used for feeding assays shown; alternate options can be used |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 96-well black polystyrene plate | ThermoFisher | 12-566-09 | |
| 96-well PCR plate sealing film | Bio-Rad | MSB1001 | Alternate options can be used |
| 96-well PCR plates | Bio-Rad | HSP9621 | Alternate options can be used |
| Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | MilliporeSigma | A6419 | |
| Albumin (human serum) | MilliporeSigma | A9511 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213 | Alternate options can be used to block light entering fluorescein container |
| Balance | Fisher Scientific | 01-911 | Alternate options can be used |
| Bead mill homogenizer | Qiagen | 85300 | Not required if using pellet pestle grinder |
| Cotton ball | Fisher Scientific | 22456880 | For nectar-feeding; alternate options can be used |
| Defibrinated sheep blood | Hemostat Laboratories | DSB100 | Alternate options can be used |
| Drosophila CO2 fly pad | Tritech Research | MINJ-DROS-FP | Alternate options can be used |
| Fluorescein | MilliporeSigma | F6377 | |
| Fluorescence plate-reader | ThermoFisher | VL0000D0 | Alternate options can be used |
| Gamma-globulin (human blood) | MilliporeSigma | H7379 | |
| Glycerol | MilliporeSigma | G7893 | |
| Hemoglobin (human) | MilliporeSigma | G4386 | |
| Laboratory wrapping film - parafilm | Fisher Scientific | 13-374 | |
| Magnetic stirrer | Fisher Scientific | 90-691 | Alternate magnetic stirrers can be used |
| Microcentrifuge for 96-well plate | VWR | 80094-180 | Alternate options can be used |
| Microcentrifuge Tubes | MilliporeSigma | 2236412 | Alternate options can be used |
| Pellet pestle grinder | VWR | KT749521-1500 | Not required if using bead mill homogenizer |
| Phosphate buffered solution (PBS) | Fisher Scientific | BW17-516F | Optional |
| Razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | Alternate options can be used, such as a lathe for better consistency of cutting |
| Rubber bands | |||
| Silicone tubing | McMaster Carr | Needed if using a fly pad for CO2 delivery | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | S233 | |
| Sodium chloride (NaCl) | MilliporeSigma | S9888 | |
| Stir bars | Fisher Scientific | 14-512 | Alternate magnetic stir bars can be used |
| Translucent polypropylene storage box with removable lid | Example box used for feeding assays shown | ||
| Vortex mixer | |||
| Water bath | Alternate heating device may be used | ||
| White 0.8 mm polyester mosquito netting | American Home & Habit Inc. | F03A-PONO-MOSQ-M008-WT | Alternate options can be used |
References
- Bhatt, S., et al. The global distribution and burden of dengue. Nature. 496 (7446), 504-507 (2014).
- Rogers, D. J., Wilson, A. J., Hay, S. I., Graham, A. J. The global distribution of yellow fever and dengue. Advances in Parasitology. 62 (05), 181-220 (2006).
- Chouin-Carneiro, T., et al. Differential susceptibilities of Aedes aegypti and Aedes albopictus from the Americas to Zika virus. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (3), (2016).
- Guerbois, M., et al. Outbreak of Zika virus infection, Chiapas State, Mexico, 2015, and first confirmed transmission by Aedes aegypti mosquitoes in the Amercias. Journal of Infectious Diseases. 214 (9), 1349-1356 (2016).
- Weaver, S. C., et al. Zika virus: history, emergence, biology, and prospects for control. Antiviral Research. 130, 69-80 (2016).
- Attardo, G. M., Hansen, I. A., Raikhel, A. S. Nutritional regulation of vitellogenesis in mosquitoes: implications for anautogeny. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 35 (7), 661-675 (2005).
- Duvall, L. B., Ramos-Espiritu, L., Barsoum, K. E., Glickman, J. F., Vosshall, L. B. Small-molecule agonists of Ae. aegypti neuropeptide Y receptor block mosquito biting. Cell. 176 (4), 687-701 (2019).
- Dimond, J. B., Lea, A. O., Hahnert, W. F., DeLong, D. M. The amino acids required for egg production in Aedes aegypti. The Canadian Entomologist. 88 (2), 57-62 (1956).
- Guerrero, D., Cantaert, T., Missé, D. Aedes mosquito salivary components and their effect on the immune response to arboviruses. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 1-11 (2020).
- Raquin, V., Lambrechts, L. Dengue virus replicates and accumulates in Aedes aegypti salivary glands. Virology. 507, 75-81 (2017).
- Farjana, T., Tuno, N. Multiple blood feeding and host-seeking behavior in Aedes aegypti and Aedes albopictus (diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 50 (4), 838-846 (2013).
- Scott, T. W., Takken, W. Feeding strategies of anthropophilic mosquitoes result in increased risk of pathogen transmission. Trends in Parasitology. 28 (3), 114-121 (2012).
- Ross, P. A., Lau, M. J., Hoffmann, A. A. Does membrane feeding compromise the quality of Aedes aegypti mosquitoes. PLoS ONE. 14 (11), 1-19 (2019).
- Ross, P. A., Axford, J. K., Richardson, K. M., Endersby-Harshman, N. M., Hoffmann, A. A. Maintaining Aedes aegypti mosquitoes infected with wolbachia. Journal of Visualized Experiments. 2017 (126), 1-8 (2017).
- Briegel, H., Hefti, M., DiMarco, E. Lipid metabolism during sequential gonotrophic cycles in large and small female Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 48 (5), 547-554 (2002).
- McMeniman, C. J., Corfas, R. A., Matthews, B. J., Ritchie, S. A. S., Vosshall, L. B. Multimodal integration of carbon dioxide and other sensory cues drives mosquito attraction to humans. Cell. 156 (5), 1060-1071 (2014).
- Pakes, S. P., et al. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , National Academic Press. Washington, DC, USA. (2011).
- Deng, L., Koou, S. Y., Png, A. B., Ng, L. C., Lam-Phua, S. G. A novel mosquito feeding system for routine blood-feeding of Aedes aegypti and Aedes albopictus. Tropical Biomedicine. 29 (1), 169-174 (2012).
- Gunathilaka, N., Ranathunge, T., Udayanga, L., Abeyewickreme, W. Efficacy of blood sources and artificial blood feeding methods in rearing of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) for sterile insect technique and incompatible insect technique approaches in Sri Lanka. BioMed Research International. 2017, 3196924 (2017).
- Costa-da-Silva, A. L., et al. Glytube: a conical tube and parafilm M-based method as a simplified device to artificially blood-feed the Dengue vector mosquito, Aedes aegypti. PLoS ONE. 8 (1), 53816 (2013).
- Carvalho, D. O., et al. Mass production of genetically modified Aedes aegypti for field releases in Brazil. Journal of Visualized Experiments. 83 (83), 1-10 (2014).
- Kogan, P. H. H. Substitute blood meal for investigating and maintaining Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 27 (4), 1-4 (1990).
- Gonzales, K. K., Hansen, I. A.
- Baughman, T., et al. A highly stable blood meal alternative for rearing Aedes and Anopheles mosquitoes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (12), 0006142 (2017).
- Galun, R. Feeding stimuli and artificial feeding. Bulletin of the World Health Organization. 36, 590-593 (1967).
- Galun, R. Feeding response in Aedes aegypti: stimulation by adenosine triphosphate. Science. 142, 1674-1675 (1963).
- Jové, V., et al. Sensory Discrimination of Blood and Floral Nectar by Aedes aegypti Mosquitoes. Neuron. 108, 1-18 (2020).
- Petersen, M. T., et al. The impact of the age of first blood meal and Zika virus infection on Aedes aegypti egg production and longevity. PLoS ONE. 13 (7), 1-15 (2018).
- Sissoko, F., et al. Frequent sugar feeding behavior by Aedes aegypti in Bamako, Mali makes them ideal candidates for control with Attractive Toxic Sugar Baits (ATSB). PLoS ONE. 14 (6), 0214170 (2019).
- Houseman, J. G., Downe, A. E. R. Methods of measuring blood meal size and proteinase activity for determining the effects of mated state of digestive processes of female Aedes aegypti (L.) (Diperta: Culicidae). The Canadian Entomologist. 18, 241-248 (1986).
- Redington, B. C., Hockmeyer, W. T. A method for estimating blood meal volume in Aedes aegypti using a radioisotope. Journal of Insect Physiology. 22 (7), 961-966 (1976).
- Gonzales, K. K., et al. The effect of SkitoSnack, an artificial blood meal replacement, on Aedes aegypti life history traits and gut microbiota. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
- Klowden, M. J. The endogenous regulation of mosquito reproductive behavior. Experientia. 46 (7), 660-670 (1990).
- Liesch, J., Bellani, L. L., Vosshall, L. B. Functional and genetic characterization of neuropeptide Y-like receptors in Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (10), 22486 (2013).
- Frances, S. P., Sithiprasasna, R., Linthicum, K. J. Laboratory evaluation of the response of Aedes aegypti and Aedes albopictus uninfected and infected with Dengue virus to Deet. Journal of Medical Entomology. 48 (2), (2011).
- Dennis, E. J., Goldman, O. V., Vosshall, L. B. Aedes aegypti mosquitoes use their legs to sense DEET on contact. Current Biology. 29 (9), 1551-1556 (2019).
- Harrington, L. C., et al. Heterogeneous feeding patterns of the Dengue vector, Aedes aegypti, on individual human hosts in rural Thailand. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (8), 3048 (2014).
- Hol, F. J., Lambrechts, L., Prakash, M. BiteOscope, an open platform to study mosquito biting behavior. eLife. 9, 1-24 (2020).
