Summary
Het doel van dit protocol is om dierlijke en kunstmatige bloedmaaltijden aan Aedes aegypti-muggen te leveren via een kunstmatige membraanvoeder en het volume van de ingenomen maaltijd nauwkeurig te kwantificeren.
Abstract
Vrouwtjes van bepaalde muggensoorten kunnen ziekten verspreiden terwijl ze gewervelde gastheren bijten om eiwitrijke bloedmaaltijden te verkrijgen die nodig zijn voor de ontwikkeling van eieren. In het laboratorium kunnen onderzoekers dierlijke en kunstmatige bloedmaaltijden leveren aan muggen via membraanvoeders, die manipulatie van de mesamenstelling mogelijk maken. Hier presenteren we methoden voor het voeden van bloed en kunstmatige bloedmaaltijden aan Aedes aegypti-muggen en het kwantificeren van het volume dat door individuele vrouwtjes wordt geconsumeerd.
Gerichte voeding en kwantificering van kunstmatige/bloedmaaltijden hebben brede toepassingen, waaronder het testen van de effecten van maaltijdcomponenten op muggengedrag en fysiologie, het leveren van farmacologische verbindingen zonder injectie en het infecteren van muggen met specifieke pathogenen. Het toevoegen van fluoresceïnekleurstof aan de maaltijd voorafgaand aan de voeding maakt verdere kwantificering van de maaltijdgrootte mogelijk. Het maaltijdvolume dat door muggen wordt geconsumeerd, kan worden gemeten op gewicht, als de vrouwtjes later moeten worden gebruikt voor gedragsexperimenten, of door individuele vrouwtjes in platen van 96 putten te homogeniseren en fluorescentieniveaus te meten met behulp van een plaatlezer als eindpunttest. Maaltijdgroottekwantificering kan worden gebruikt om te bepalen of het veranderen van de maaltijdcomponenten het ingenomen maaltijdvolume verandert of dat de maaltijdconsumptie verschilt tussen muggenstammen. Nauwkeurige kwantificering van de meelgrootte is ook van cruciaal belang voor downstreamtests, zoals die welke effecten op de aantrekkingskracht of vruchtbaarheid van de gastheer meten. De hier gepresenteerde methoden kunnen verder worden aangepast om de maaltijdvertering in de loop van dagen te volgen of om meerdere onderscheidende markers op te nemen die aan verschillende maaltijden (zoals nectar en bloed) zijn toegevoegd om de consumptie van elke maaltijd door één mug te kwantificeren.
Deze methoden stellen onderzoekers in staat om eigenhandig metingen met hoge doorvoer uit te voeren om het maaltijdvolume te vergelijken dat door honderden individuele muggen wordt geconsumeerd. Deze tools zullen daarom in grote lijnen nuttig zijn voor de gemeenschap van muggenonderzoekers voor het beantwoorden van uiteenlopende biologische vragen.
Introduction
We presenteren een protocol voor het voeren van gemodificeerde bloedmaaltijden aan Aedes aegypti-muggen met behulp van een kunstmatige membraanvoeder en het nauwkeurig meten van het maaltijdvolume dat door elke individuele mug wordt geconsumeerd. Dit protocol kan flexibel worden aangepast om de inhoud van de maaltijd te wijzigen of om het maaltijdvolume te vergelijken dat door verschillende experimentele groepen muggen wordt geconsumeerd.
De Ae. aegypti mug bedreigt de wereldwijde gezondheid door het verspreiden van ziekteverwekkers die ziekten veroorzaken, waaronder gele koorts, knokkelkoorts, chikungunya en Zika1,2,3,4,5. Ae. aegypti-vrouwtjes zijn obligate bloedvoeders; zij moeten gewerveld bloed consumeren om het nodige eiwit voor de ontwikkeling van eieren te verkrijgen, en elke koppeling van eieren vereist een volledige bloedmaaltijd van ten minste één gastheer6,7,8. De vrouwelijke mug bijt eerst haar gastheer door de huid te doorboren met haar stylet en speeksel te injecteren, dat verbindingen bevat die de immuunrespons van de gastheer activeren9. Ze voedt zich dan door bloed door haar stylet in haar middenrif te pompen. Tijdens het consumeren van een bloedmaaltijd van een geïnfecteerde gastheer, kan ze door bloed overgedragen ziekteverwekkers6,8innemen, die vervolgens migreren van de muggenmuggen naar haar speekselklieren10. Vrouwelijke muggen die op deze manier zijngeïnfecteerd,kunnen ziekte verspreiden door ziekteverwekkers samen met speeksel te injecteren bij het bijten van volgende gastheren11,12. Het begrijpen en kwantificeren van de mechanismen van bloedvoedgedrag zijn cruciale stappen in het beheersen van de overdracht van door muggen overgedragen ziekten.
Veel laboratoriumprotocollen voor het fokken en experimenteren van muggen gebruiken levende dieren, waaronder muizen, cavia's of mensen als bloedbron13,14,15,16. Het gebruik van levende dieren legt ethische zorgen op, evenals complexe vereisten voor personeelstraining, dierenhuisvesting en -verzorging, en naleving van het beleid van de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Het beperkt ook de soorten verbindingen die aan muggen kunnen worden geleverd, wat de studies beperkt die kunnen worden uitgevoerd17.
Kunstmatige bloedvoedapparatuur, die meestal een membraansysteem gebruikt om de gastheerhuid te simuleren, zijn nuttige hulpmiddelen voor het bestuderen van bloedvoedgedrag dat de noodzaak van het onderhoud van levende gastheren omzeilt. Volbloed kan bij een aantal leveranciers worden gekocht en aan muggen worden gevoerd met behulp van verwarmde kunstmatige membraanvoeders met watermantel of soortgelijke apparaten18,19. In dit protocol demonstreren we het gebruik van kleine, wegwerpmembraanvoeders die "Glytubes" worden genoemd. Deze membraanvoeder, eerder gepubliceerd door Costa-da-Silva et al. (2013)20, kan eenvoudig worden samengesteld uit standaard laboratoriumapparatuur, waardoor het ideaal is voor het leveren van bloedmaaltijden aan matige aantallen muggen en eenvoudig op te schalen voor het testen van grotere groepen of meerdere maaltijdformuleringen. De Glytube is een goedkoop en efficiënt alternatief voor andere commerciële kunstmatige feeders, die grotere maaltijdvolumes kunnen vereisen en meer geschikt zijn voor het batchvoeding van grote groepen muggen op een enkele maaltijdformulering21.
Dit protocol omvat twee secties: het bereiden/leveren van kunstmatige maaltijden en het kwantificeren van consumptie. In het eerste deel worden Glytubes gebruikt als een efficiënt middel om gemanipuleerde diëten te leveren. Volbloed kan worden vervangen door een volledig kunstmatige maaltijd om de effecten van bloedvervangers in plaats van een bloedmaaltijd te vergelijken. Een recept aangepast van Kogan (1990)22 wordt hier gepresenteerd, hoewel meerdere kunstmatige maaltijdformuleringen zijn ontwikkeld23,24. Bovendien is voeding een minder invasieve en minder bewerkelijke methode om farmacologische verbindingen in te voeren dan injectie. Vanwege het lage totale volume dat nodig is voor elke maaltijd (1-2 ml), biedt dit protocol een aantrekkelijke leveringsmethode om de hoeveelheden dure reagentia te verminderen. Ae. aegypti-vrouwtjes consumeren gemakkelijk eiwitvrije maaltijden van zoutoplossing met adenosine 5′-trifosfaat (ATP)25,26,wat een basislijn biedt voor het meten van de effecten van enkelvoudige maaltijdcomponenten. Bijvoorbeeld, Neuropeptide Y-achtige receptor 7 (NPYLR7) in Ae. aegypti is bekend om te bemiddelen gastheer-zoekende onderdrukking na een eiwitrijke bloedmaaltijd, en wanneer NPYLR7 agonisten worden toegevoegd aan een eiwitvrije zoutoplossing maaltijd, vrouwelijke muggen vertonen gastheer-zoekende onderdrukking vergelijkbaar met degenen die volbloed hebben geconsumeerd7.
In het tweede deel worden stappen gepresenteerd voor het kwantificeren van het volume van elke maaltijd die door een individuele vrouwelijke mug wordt geconsumeerd. Deze test is gebaseerd op fluorescentie en vangt de voedingsstatus in een hogere resolutie dan methoden waarbij vrouwtjes worden geclassificeerd als "gevoed" of "ongefed" op basis van visuele beoordeling van alleen opgezette buik. Door fluoresceïne aan de maaltijd toe te voegen voorafgaand aan de voeding, kunnen maaltijdvolumes die door individuen worden ingenomen, worden gekwantificeerd door elke mug in een plaat van 96 putten te homogeniseren en fluorescentie-intensiteit als uitlezing te meten. Deze test kan verschillen in voedingskracht meten als reactie op variabelen zoals de samenstelling van de maaltijd of de genetische achtergrond van de muggen. Nauwkeurige kwantificering is van cruciaal belang voor tussenliggende maaltijdmaten, bijvoorbeeld wanneer vrouwen suboptimale maaltijden worden aangeboden die voedings afschrikmiddelen bevatten of wanneer ze sacharosemaaltijden van variabele grootte27consumeren. Als gevoede muggen nodig zijn voor latere gedragstests na kwantificering van de maaltijdgrootte, kan de grootte van de maaltijd in plaats daarvan worden berekend door verdoofde vrouwtjes in groepen te wegen en de gemiddelde verhoogde massa per persoon te schatten. Hoewel minder nauwkeurig dan fluoresceïnemarkering, biedt wegen nog steeds een geaggregeerde schatting van het maaltijdvolume en maakt het mogelijk om het effect van de maaltijd op downstreamprocessen, zoals vruchtbaarheid of daaropvolgende gastheeraantrekkelijkheid, te onderzoeken. Hoewel de grootte van bloedmeel variabel is en kan worden beïnvloed door een groot aantalfactoren 11,28,29, zijn ingenomen meelgrootten, gemeten met de hier beschreven methoden , consistent met eerdere kwantificeringen7,30,31.
Protocol
Bloedtoevoerprocedures werden niet uitgevoerd met levende dieren of menselijke gastheren en voldeden aan de richtlijnen van de Rockefeller University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) en Institutional Review Board (IRB).
1. Maaltijdbereiding
- Bereiding van het fagostimulant, adenosine 5′-trifosfaat
- Bereid een 25 mM oplossing van waterige NaHCO3 (molecuulgewicht, MW = 84.006 g/mol). Voeg voor 100 ml van 25 mM NaHCO3210 mg NaHCO3 toe aan een volumetrische kolf en vul met dubbel gedestilleerd water (ddH2O) tot een totaal volume van 100 ml. Meng de oplossing met behulp van een magnetische roerstaaf grondig totdat alle NaHCO3 is opgelost.
- Reconstitueer ATP-dinatriumzouthydraat (MW = 551,14 g/mol) in het waterige 25 mM NaHCO3 tot een uiteindelijke concentratie van 200 mM ATP. Voeg voor een totaal volume van 10 ml atp van 200 mM in 25 mM NaHCO3-buffer 1,1 g ATP-dinatriumzouthydraat toe aan een volumetrische kolf en vul met 25 mM NaHCO3-buffer tot een totaal volume van 10 ml. Meng de oplossing met behulp van een magnetische roerstaaf grondig totdat alle ATP is opgelost.
OPMERKING: Om hydrolyse van ATP te minimaliseren, moet het worden gebufferd door een zoutoplossing zoals NaHCO3. - Aliquot de ATP-oplossing en bewaren bij -20 °C.
OPMERKING: Deze voorraadoplossing van ATP wordt meestal om de zes maanden vers gemaakt en wordt gebruikt voor alle hieronder beschreven maaltijden. Om afbraak te voorkomen, mogen ATP-aliquots niet meerdere vriesdooicycli ondergaan of samen met andere maaltijdcomponenten worden verwarmd.
- Bereiding van de fluorescerende traceroplossing, fluoresceïne
- Bereid een 2% (w/v) voorraadoplossing van waterige fluoresceïne. Meng voor een totaal voorraadoplossingsvolume van 10 ml 0,2 g fluoresceïne dinatriumzout met 10 ml ddH2O in een conische buis van 15 ml die bij kamertemperatuur in aluminiumfolie is gewikkeld. Deze voorraadoplossing fluoresceïne kan worden gebruikt voor verdunning in alle hieronder beschreven maaltijden.
OPMERKING: Omdat fluoresceïne lichtgevoelig is, vermijd blootstelling aan licht door containers in aluminiumfolie te wikkelen.
- Bereid een 2% (w/v) voorraadoplossing van waterige fluoresceïne. Meng voor een totaal voorraadoplossingsvolume van 10 ml 0,2 g fluoresceïne dinatriumzout met 10 ml ddH2O in een conische buis van 15 ml die bij kamertemperatuur in aluminiumfolie is gewikkeld. Deze voorraadoplossing fluoresceïne kan worden gebruikt voor verdunning in alle hieronder beschreven maaltijden.
- Bereiding van van dieren afgeleide bloedmaaltijden
- Bereken het aantal maaltijden dat nodig is om alle muggen te voeden; elke Glytube bevat een maaltijd van 2 ml en voedt ongeveer 25 muggen. Bereid nog een maaltijd om de standaardcurve voor fluorescentiemetingen te kalibreren. Tenzij anders vermeld, beschrijven alle stappen in deze sectie reagenshoeveelheden die nodig zijn om één maaltijd met een eindvolume van 2 ml te bereiden.
- Breng voor van dieren afgeleide bloedmaaltijden 1,98–2 ml gedefibrineerd schapenbloed over in een conische buis van 15 ml (zie stap 3.3 voor het gewenste bloedvolume).
OPMERKING: Commercieel gedefibrineerde bronnen van gewerveld bloed, waaronder van schapen, cavia's en mensen, mogen worden gebruikt13. Zorg er voor gebruik voor dat het gekochte bloed de vervaldatum niet heeft overschreden en meng het goed door de fles om te wenden, vooral als er zichtbare scheiding van bloedbestanddelen is. - Voeg voor een optimale voeding ATP toe aan een uiteindelijke concentratie van 1-2 mM nadat het schapenbloed is opgewarmd tot 45 °C in een waterbad. Voeg voor een uiteindelijke concentratie van 1 mM ATP 10 μL van de ATP-voorraadoplossing van 200 mM toe aan 1,99 ml voorverwarmd bloed en meng. Voeg voor een uiteindelijke concentratie van 2 mM ATP 20 μL van de ATP-voorraad van 200 mM toe aan 1,98 ml voorverwarmd bloed en meng. Als ATP niet mag worden toegevoegd, verwarm dan 2 ml gedefibrineerd schapenbloed.
- Als vervolgens op fluorescentie gebaseerde kwantificering van de meelgrootte moet worden uitgevoerd, voegt u fluoresceïneoplossing toe aan een uiteindelijke concentratie van 0,002% (2 μL van 2% fluoresceïnevoorraad in 2 ml totaal meelvolume). Verminder het bloedvolume met dezelfde hoeveelheid als de toegevoegde fluoresceïne. Behoud 1 ml van de uiteindelijke maaltijdformulering die 0,002% fluoresceïne bevat om de referentiestandaardcurve te genereren. Behandel het vastgehouden volume identiek aan de maaltijd die aan muggen wordt geleverd; gedurende de hele duur van het experiment blootstellen aan dezelfde licht- en temperatuuromstandigheden en dit vervolgens samen met de geleverde maaltijd invriezen.
- Bereiding van kunstmatige bloedmaaltijden
- Bereken het aantal maaltijden dat nodig is om alle muggen te voeden; elke Glytube bevat een maaltijd van 2 ml en voedt ongeveer 25 muggen. Bereid nog een maaltijd om de standaardcurve voor fluorescentiemetingen te kalibreren. Tenzij anders vermeld, beschrijven alle stappen in deze sectie reagenshoeveelheden die nodig zijn om één maaltijd van 2 ml te bereiden.
- Maak voor de bereiding van kunstmatig bloed (aangepast aan Kogan (1990)22), zoals in tabel 1,eerst een voorraadoplossing van 400 mM NaHCO3. Voeg voor een totaal volume van 10 ml van 400 mM NaHCO3 (MW = 84.006 g/mol) 336 mg NaHCO3 toe aan een volumetrische kolf en vul met dubbel gedestilleerd water (ddH2O) tot een totaal volume van 10 ml. Meng de oplossing met behulp van een magnetische roerstaaf grondig totdat alle NaHCO3 is opgelost.
- Bereid voor de eiwitcomponenten van kunstmatig bloed voorraadoplossingen van 50 mg/ml γ-globulinen in 400 mM NaHCO3,35 mg/ml hemoglobine in ddH2O en 300 mg/ml albumine in ddH2O. Eiwitvoorraadoplossingen kunnen tot 2 maanden bij 4 °C worden bewaard. De uiteindelijke concentratie van totale menselijke eiwitten in kunstmatig bloed is 125 mg/ml. Dit omvat eindconcentraties van 15 mg/ml γ-globulines, 8 mg/ml hemoglobine en 102 mg/ml albumine.
- Combineer voor elke maaltijd van 2 ml 600 μL γ-globulines, 460 μL hemoglobine, 680 μL albumine en 250 μL ddH2O uit de in tabel 1vermelde voorraadoplossingen . Wacht met het toevoegen van 10 μL atp-voorraadoplossing van 200 mM tot na de maaltijd is opgewarmd tot 45 °C, onmiddellijk voordat u de maaltijd presenteert.
- Als vervolgens op fluorescentie gebaseerde kwantificering van de meelgrootte moet worden uitgevoerd, voegt u fluoresceïneoplossing toe aan een uiteindelijke concentratie van 0,002% (2 μL van 2% fluoresceïnevoorraad in 2 ml totaal meelvolume). Verminder het volume van ddH2O in stap 4.4 met dezelfde hoeveelheid als de toegevoegde fluoresceïne. Behoud ten minste 1 ml van de uiteindelijke maaltijdformulering die 0,002% fluoresceïne bevat om de referentiestandaardcurve te genereren. Behandel het vastgehouden volume identiek aan de maaltijd die aan muggen wordt geleverd; gedurende de hele duur van het experiment blootstellen aan dezelfde licht- en temperatuuromstandigheden en dit vervolgens samen met de geleverde maaltijd invriezen.
- Bereiding van voorbeeld eiwitvrije zoutoplossingsmaaltijden (aangepast van Duvall et al. (2019)7)
OPMERKING: Eiwitvrije zoutmaaltijden kunnen op meerdere manieren worden bereid7,27,32. De zoutoplossingmaaltijd die hier wordt gepresenteerd, is een eiwitvrije versie van het hierboven beschreven kunstmatige bloedrecept.- Bereken het aantal maaltijden dat nodig is om alle muggen te voeden; elke Glytube bevat een maaltijd van 2 ml en voedt ongeveer 25 muggen Bereid een extra maaltijd voor om de standaardcurve voor fluorescentiemetingen te kalibreren. Tenzij anders vermeld, beschrijven alle stappen in deze sectie reagenshoeveelheden die nodig zijn om één maaltijd van 2 ml te bereiden.
- Om de zoutoplossing te bereiden, maakt u een voorraadoplossing van 400 mM NaHCO3. Voeg voor een totaal volume van 10 ml van 400 mM NaHCO3 (MW = 84.006 g/mol) 336 mg NaHCO3 toe aan een volumetrische kolf en vul met ddH2O tot een totaal volume van 10 ml. Meng de oplossing met behulp van een magnetische roerstaaf grondig totdat alle NaHCO3 is opgelost.
- Combineer voor elke maaltijd van 2 ml in een conische buis van 15 ml 600 μL van 400 mM NaHCO3 met 1,39 ml ddH2O. Wacht met het toevoegen van 10 μL van de ATP-voorraadoplossing van 200 mM totdat de maaltijd is opgewarmd tot 45 °C in een waterbad.
- Als vervolgens op fluorescentie gebaseerde kwantificering van de meelgrootte moet worden uitgevoerd, voegt u fluoresceïneoplossing toe aan een uiteindelijke concentratie van 0,002% (2 μL van 2% fluoresceïnevoorraad in 2 ml van het totale maaltijdvolume). Verminder het volume van ddH2O in stap 5.3 met dezelfde hoeveelheid als de toegevoegde fluoresceïne. Behoud ten minste 1 ml van de uiteindelijke maaltijdformulering die 0,002% fluoresceïne bevat om de referentiestandaardcurve te genereren. Behandel het vastgehouden volume identiek aan de maaltijd die aan muggen wordt geleverd; gedurende de hele duur van het experiment blootstellen aan dezelfde licht- en temperatuuromstandigheden en dit vervolgens samen met de geleverde maaltijd invriezen.
2. Maaltijdbezorging aan muggen
- Het opzetten van muggencontainers voor het voeden
OPMERKING: Muggen kunnen in verschillende containers worden gevoerd zolang aan de volgende criteria is voldaan. Zorg ervoor dat de container groot genoeg is voor muggen om in rond te vliegen, maar niet zo groot dat het moeilijk zal zijn voor de muggen om het gaasoppervlak te lokaliseren en te beginnen met voeden. Het gaas dat wordt gebruikt om de container te bedekken, kan variëren in materiaal en gatgrootte. De gaten moeten groot genoeg zijn om de stijl van de vrouwelijke mug door te prikken, maar niet zo groot dat de mug kan ontsnappen. Bevestig het gaas stevig zodat het strak zit en de Glytube gedurende de voedingsperiode stabiel op het oppervlak kan rusten.- Een voorbeeldcontainer (figuur 1) is een gemodificeerde plastic emmer van 946 ml (32 oz) met hoge dichtheid polyethyleen (HDPE). Om deze opstelling te repliceren, gebruikt u een scheermesje om een centraal gat van ~ 10 cm diameter in het deksel van de emmer te snijden. Om de container voor gebruik door muggen te monteren, bevestigt u een ~ 400 cm2 vierkant stuk witte 0,8 mm polyester muskietengaas bovenop de emmer en duwt u het geperforeerde deksel er stevig overheen om stevig te breken.
- Verzamel vrouwelijke muggen die ten minste 3 dagen na de eclosie zijn om ervoor te zorgen dat ze volwassen genoeg zijn om bloed te geven. Optimale voedingssnelheden worden waargenomen na 7 dagen33.
- Plaats vrouwelijke muggen in de container en dek af met gaas. Als de container dichtbevolkt is met muggen, verhoog dan het aantal Glytubes dat wordt gebruikt. Optimale voeding wordt bereikt met ~25 muggen/Glytube. Dit vermindert de concurrentie voor toegang tot het voedingsmembraan.
- Zet een controlegroep van ongefeerde muggen opzij die geen maaltijd wordt aangeboden. Weeg in het gewichtsmeetprotocol de niet-gefed groep afzonderlijk en gebruik dit gewicht om gewichtstoename te schatten in de experimentele groep die zich voedde met een maaltijd. Voeg in het op fluorescentie gebaseerde kwantificeringsprotocol de niet-gefeerde groep muggen toe aan de putten voor de standaardcurveberekeningen en voor negatieve controles. Om de automatische fluorescentie van muggenweefsel in de experimentele groep aan te passen, moet u ervoor zorgen dat de standaardcurve en negatieve controleputten een niet-gefeerde mug bevatten.
- Bouwen en opzetten van de Glytube (aangepast aan Costa-da-Silva et al. (2013)20)
- Zoals afgebeeld in figuur 1, om een warmtebron te genereren, vul een conische buis van 50 ml met 40 ml 100% glycerol. Sluit de open conische buis af met een 5 cm × 5 cm stuk parafilm en herhaal dit met een extra stuk van 5 cm × 5 cm parafilm om de kans op lekkage te minimaliseren. Optioneel kan de parafilm op zijn plaats worden gehouden met behulp van elastiekjes. Omk de buis om ervoor te zorgen dat er geen gaten of openingen zijn.
- Om het maaltijdbezorgapparaat te maken, snijdt u een gecentreerd gat met een diameter van 2,5 cm in de schroefdop van de conische buis met behulp van een scherp scheermesje of, voor een betere consistentie, een draaibank. Strek een stuk parafilm van 5 cm × 5 cm gelijkmatig, zodat het ongeveer verdubbelt in grootte. De parafilm moet dun genoeg zijn dat muggen er gemakkelijk doorheen kunnen prikken, maar er mogen geen lekken zijn. Sluit af over het buitenoppervlak van de schroefdop om het gat volledig te bedekken en zet de dop opzij.
OPMERKING: Om de aantrekkingskracht op de Glytube te vergroten, voordat u de parafilm uitrekt, parfumeert u deze met menselijke geur door deze voorzichtig op een stukje menselijke huid te wrijven zonder cosmetica aan te brengen, waarbij u ervoor zorgt dat er geen gaten worden gemaakt. Dit wordt aanbevolen als het experiment niet gericht is op het onderzoeken van de zintuiglijke signalen die nodig zijn voor muggen om de maaltijd te benaderen. - Verwarm zowel de verzegelde tube glycerol als de maaltijd (met alle componenten behalve ATP) gedurende ten minste 15 minuten in een waterbad van 42-45 °C. Verwarm ATP niet voor; voeg het onmiddellijk toe voordat u met het experiment begint.
- Voeg ATP toe aan de opgewarmde maaltijd en vortex grondig. Pipet 2 ml van de verwarmde maaltijd in de binnenkamer van de schroefdop en plaats er voorzichtig de omgekeerde, verwarmde, met glycerol gevulde conische buis van 50 ml in. Schroef de dop gedeeltelijk met de maaltijd op de met glycerol gevulde buis - net genoeg om lekkage van de maaltijd of de glycerol te voorkomen.
OPMERKING: Het gebruikte maaltijdvolume kan variëren tussen 1 ml en 2,5 ml. Lagere volumes kunnen vooral nuttig zijn wanneer maaltijden worden gebruikt om verbindingen te leveren die schaars of duur zijn. Het is belangrijk om snel te werken bij deze stap, zodat de maaltijd niet afkoelt tot omgevingstemperatuur en de kans op maximale voeding vermindert. De snelheid van koeling is afhankelijk van de omgevingstemperatuur van de ruimte waar deze stappen worden uitgevoerd, maar ze moeten meestal binnen 5 minuten bij 25 °C worden voltooid. - Plaats de geassembleerde Glytube op de muggencontainer en geef de muggen minstens 15 minuten toegang tot voer om maximale voedersnelheden te bereiken.
- Voor een optimale voeding plaatst u muggencontainers in een kamer die is uitgerust met een CO2-pad en laat u ten minste 15 minuten acclimatiseren bij 25-28 °C en 70-80% luchtvochtigheid voordat u de maaltijd aflevert. De hier gebruikte testkamer is een eenvoudige en goedkope wijziging van een eerder gepubliceerde opstelling16. Het maakt gebruik van een doorschijnende polypropyleen opbergdoos van maat 36 cm L × 31 cm B × 32 cm H met een afneembaar deksel. Een gat met een diameter van 1,5 cm in de kamerwand maakt co2-levering door siliconen buizen mogelijk. De CO2 diffusie pad wordt aangebracht op het binnenste midden van het deksel voor de levering van gezuiverde lucht en CO2 om de kameratmosfeer tijdens de proef te conditioneren.
OPMERKING: Zorg ervoor dat gastheersignalen (warmte en CO2, met optionele gastheergeur16) aanwezig zijn, zodat de muggen worden aangetrokken door de membraanaanvoer. Als muggen niet onder de Glytube verdringen, controleer dan of CO2 goed wordt geleverd en of de maaltijd en Glytube voldoende warm zijn. Als er geen externe CO2-bron beschikbaar is, kan CO2 worden geleverd via rookwolken van uitgeademde menselijke adem. - Na het voeren kan de Glytube-dop worden weggegooid als biogevaarlijk afval of worden hergebruikt na weken in een bleekoplossing met een laag percentage en grondig spoelen in water.
3. Kwantificering van geconsumeerde maaltijden
- Wegen van muggen die moeten worden gebruikt voor verdere experimenten
OPMERKING: Door muggen te wegen om de grootte van de maaltijd te kwantificeren, kunnen ze worden gebruikt voor verdere live experimenten, maar deze methode vereist het nemen van gewichtsmetingen van een groep van 5 muggen. Omdat gewichten van individuele muggen moeilijk nauwkeurig te meten zijn met behulp van de meeste laboratoriumbalansen, kan variabiliteit in individuele meelgrootte niet gemakkelijk worden gekwantificeerd door gewichten te meten. Wegen wordt alleen aanbevolen voor situaties waarin vrouwtjes zichtbaar op de maaltijd engorge.- Verdoof muggen door hun container naar een koude ruimte van 4 °C te verplaatsen of op ijs te plaatsen.
- Weeg groepen van 5 vrouwtjes uit het niet-gefed cohort (d.w.z. muggen die nooit een maaltijd werden aangeboden) en bereken hun gemiddelde gewicht als de schatting van het "pre-feeding" gewicht. Het gemiddelde gewicht van een niet-gefed mug hangt af van genotypen, geslacht en opfokomstandigheden. Unfed vrouwelijke Ae. aegypti muggen gekweekt met ad libitum toegang tot sacharose wegen meestal ongeveer 2 mg per stuk.
- Van het experimentele cohort (d.w.z. muggen die een maaltijd kregen aangeboden), sorteer vrouwtjes in "gevoede" en "niet gevoede" stapels op basis van de opgezette buik waarneembaar door oog7. Verdeel elk van de "gevoede" en "niet gevoede" stapels respectievelijk in groepen van 5 muggen om te wegen. Muggen binnen elke groep van 5 moeten worden afgeleid van hetzelfde experimentele cohort voor het uitvoeren van groepsgewichtmetingen. Bereken het gemiddelde gewicht per vrouw van elk van de "gevoede" en "niet gevoede" stapels van de experimentele groep.
- Fluorescentiemeting voor eindpuntanalyse7,27,34
OPMERKING: Om nauwkeurige maaltijdgroottemetingen te verkrijgen van individuele muggen die niet langer nodig zijn voor verdere live experimenten, bewaart u de muggen en de resterende 1 ml meel met 0,002% fluoresceïne bij -20 °C onmiddellijk na het voeren. Het experiment kan hier worden gepauzeerd. Deze methode wordt beschreven in Figuur 2.- Om een referentiestandaardcurve te genereren, bereidt u een seriële verdunning van hetzelfde meel met 0,002% fluoresceïne dat werd aangeboden aan de experimentele groep muggen. Er komen in totaal 8 standaard curve oplossingen. In elk van deze oplossingen zal het uiteindelijke volume meel met 0,002% fluoresceïne 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,3125, 0,15625, 0,078125 of 0 μL, en elk in 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voor een totaal volume van 100 μL (bijv. 5 μL meel met 0,002% fluoresceïne in 95 μL van 1x PBS).
- Om de eerste oplossing van de standaardcurve te maken, voegt u 50 μL meel met 0,002% fluoresceïne tot 950 μL 1x PBS en vortex grondig toe (eindvolume: 5 μL meel met 0,002% fluoresceïne in 95 μL 1x PBS). Om de rest van de standaard curve-oplossingen te maken, voert u voor elke stap een 2-voudige verdunning uit door 500 μL van de vorige buis te nemen en deze toe te voegen aan een nieuwe buis met 500 μL 1x PBS. Vortex ruim voor het voorbereiden van de volgende 2-voudige verdunning.
- Om putten voor te bereiden die moeten worden gebruikt voor het genereren van een referentiestandaardcurve, pipetteert u 100 μL van elk van de standaardcurveoplossingen in elk van de 8 putten in de eerste kolom van een PCR-plaat met 96 putten. Voeg 1 niet-gefed bestrijdingsmug toe aan elk van dezelfde 8 putten in de eerste kolom van de plaat. Herhaal dit in de tweede kolom van de plaat voor een repliceermeting.
OPMERKING: Als experimentele groepen verschillende maaltijdtypen worden aangeboden, moet voor elk maaltijdtype een afzonderlijke referentiestandaardcurve worden bereid. - Voeg 100 μL 1x PBS toe aan elke resterende put voor de niet-gefed controle- en experimentele groepen. Als het weefsel in de volgende stappen moet worden verstoord met behulp van een parelmolenhomogenisator of vortex, voeg dan aan elke put een borosilicaat massief glaskraal van 3 mm toe.
- Voeg als negatieve controle 1 ongefeerde mug toe aan elke put in de volgende 2 kolommen van de plaat. De fluorescentie gemeten in deze groep stelt een baseline cutoff in om rekening te houden met weefsel autofluorescentie en zal worden gebruikt om te bepalen of een mug in de experimentele groep gevoed met de maaltijd.
- Voeg 1 mug per put toe aan de resterende putten van de experimentele groepen die een maaltijd kregen aangeboden.
- Sluit de plaat zorgvuldig af en verstoort het weefsel door handmatig te slijpen. De buik moet grondig worden gehomogeniseerd om het meel vrij te geven. Methoden om weefsel te verstoren zijn onder meer het gebruik van een parelmolenhomogenisator met 3 mm borosilicaat massiefglasparels (30 Hz gedurende 30 seconden), vortexmixer met 3 mm borosilicaat massiefglas kralen of een stampermolen zonder kralen.
- Centrifugeer de plaat bij 2000 tpm gedurende 1-2 minuten om het lysaat te verzamelen.
- Bereid een zwarte plaat van 96 putten met 180 μL 1x PBS in elke put.
- Breng 20 μL lysaat over naar elke put met 180 μL 1x PBS en meng. Gebruik indien beschikbaar een meerkanaals pipet in deze stap voor een hogere snelheid en een betere consistentie.
- Meet de fluorescentie-intensiteit van elke put met behulp van een plaatlezer op het 485/520 excitatie/emissiekanaal. Genereer de referentiestandaardcurve door het bekende maaltijdvolume te plotten op basis van de overeenkomstige fluorescentie-intensiteitsmeting.
- Extrapoleer met behulp van de gegenereerde referentiestandaardcurve het maaltijdvolume dat door elk van de experimentele groepsmuggen wordt ingenomen. Trek de gemiddelde fluorescentie-intensiteitsmeting van de negatieve controlegroep van niet-gefeerde muggen af van de fluorescentie-intensiteitsmeting van elk experimenteel groep individu om te corrigeren voor autofluorescentie van het basisweefsel.
Representative Results
Figuur 1 bevat een schema voor het monteren van de Glytube, terwijl figuur 2 een overzicht geeft van het experimentele ontwerp om de grootte van de maaltijd te meten met behulp van de hier beschreven op fluorescentie gebaseerde test. Figuur 3 geeft representatieve fluoresceïnemeelgroottemetingen van een bloedvoedexperiment. Figuur 4, figuur 5en figuur 6 illustreren een bemonstering van biologische vragen die met dit protocol kunnen worden aangepakt. Toepassingen van het protocol zijn breed en omvatten het veranderen van de samenstelling van bloedmeel, het voeden van farmacologische verbindingen, het nauwkeurig kwantificeren van suboptimale bloedmaaltijden of kleinere nectarmaaltijden en het vergelijken van voedingsgedrag tussen muggengenotypen.
Om een standaardcurve voor maaltijdvolumeberekeningen te genereren, worden fluorescentiemetingen uitgezet uit de aangewezen referentieputten die elk een niet-gefeerde mug en een bekend volume van de maaltijd met 0,002% fluoresceïne bevatten (figuur 3A). Fluorescentiemetingen van de resterende putten, die muggen bevatten van de negatieve controlegroep van niet-gefeerde muggen of de experimentele groep muggen die een maaltijd worden aangeboden, worden vergeleken met deze standaardcurve om het maaltijdvolume (μL) dat door elke mug wordt geconsumeerd te kwantificeren (figuur 3B). Om de basismetingen in deze test te valideren, moet worden bevestigd dat muggen uit de niet-gefed negatieve controlegroep geen positieve waarde van verbruikte μL krijgen toegewezen (figuur 3B, links). Hoewel alle vrouwtjes in de experimentele groep de bloedmaaltijd kregen aangeboden, voedden sommige muggen (figuur 3B, midden) en sommige niet (figuur 3B, rechts). Dit resultaat toont aan dat uit dit protocol twee soorten gegevens kunnen worden verkregen: 1) het percentage totale vrouwtjes dat zich voedt met een bepaalde maaltijd, en 2) het volume dat wordt ingenomen door de vrouwtjes die zich voeden met een bepaalde maaltijd.
Dit protocol kan worden gebruikt om maaltijden met verschillende eiwitsamenstellingen te leveren en te kwantificeren. Figuur 4A,B toont gegevens verzameld met behulp van maaltijden met toegevoegde fluoresceïne. Het aandeel muggen dat voedde en het maaltijdvolume dat ze innamen, werden berekend op basis van de fluorescentiemetingen. Deze metingen zijn zeer gevoelig en maken een nauwkeurige kwantificering van μL mogelijk, maar hebben de beperking dat muggen niet kunnen worden gebruikt voor toekomstige live experimenten. Figuur 4C,D toont gegevens verzameld van een onafhankelijk experiment met muggen die werden gescoord als gevoed of niet gefed door het oog nadat ze maaltijden zonder fluoresceïne kregen aangeboden. De grootte van de maaltijd werd berekend als gemiddeld gewicht / vrouwtje uit groepen van 5 muggen. Hoewel deze gewichtsmetingen minder gevoelig zijn dan fluorescentiemetingen, maken ze het mogelijk om de vrouwtjes te herstellen en te gebruiken voor verdere live experimenten. Het aandeel muggen dat voedt, kan variëren over verschillende experimentele dagen, zoals weerspiegeld in figuur 4A en figuur 4C.
Figuur 5 toont het volume dat wordt geconsumeerd van maaltijden die medicijnen bevatten die het zoeken naar muggenhosts reguleren. In deze experimenten kregen vrouwtjes bloed, zoutoplossing + ATP of zoutoplossing + ATP-maaltijden aangeboden met 100 μM van de menselijke NPY Y2-receptoragonist, TM30338. Dit medicijn verandert gastheerzoekend gedrag door activering van Ae. aegypti NPY-achtige receptor 7. Het meten van meelgrootten is van cruciaal belang voor de interpretatie van experimenten om het effect van dit medicijn op post-bloedvoedingsgedrag te beoordelen, omdat het de onderzoeker in staat stelt om de dosis te berekenen die door elke vrouw wordt geconsumeerd.
In de vorige voorbeelden kregen vrouwen bloed of vervangende bloedmaaltijden, die allemaal resulteerden in 3-5 μL-maaltijden (figuur 3, figuur 4, figuur 5). Deze op fluorescentie gebaseerde test kan ook worden gebruikt om kleinere en/of meer variabele meelgroottes te meten die niet nauwkeurig kunnen worden onderscheiden van gemiddelde groepsgewichtmetingen. In figuur 6werd hetzelfde fluorescentiekwantificeringsprotocol gebruikt om nectarvoedingsgedrag te meten door de Glytube in te ruilen voor een katoenen bal verzadigd met 10% sacharose die 0,002% fluoresceïne bevat. Nectarsuikers kunnen niet worden gepresenteerd in de Glytube-test omdat vrouwtjes de aanwezigheid van nectarsuikers met de stylet niet kunnen detecteren en geen voeding initiëren27. Deze gegevens stellen de onderzoeker in staat om vast te stellen dat suikermaaltijden consistent kleiner zijn dan bloedmaaltijden, in overeenstemming met eerder werk34 (figuur 6).
Figuur 1: Opstelling van de Glytube-methode die wordt gebruikt om maaltijden aan muggen te voeren. (A) Schematisch van een gedeconstrueerde Glytube die wordt gebruikt om bloed en andere maaltijden aan muggen te voeren. (B) Schema van een Glytube gepresenteerd bovenop een container met muggen met een gaasdeksel. Vrouwelijke muggen kunnen door het gaasdeksel prikken om te voeden. (C) Foto's van de Glytube (boven) en vrouwelijke Aedes aegypti-muggen voor, tijdens en na het voeren (onder, van links naar rechts) op een door Glytube geleverde maaltijd. Muggen worden getoond piercing door het gaas dat hun container bedekt om toegang te krijgen tot de membraanvoeder. (D) Foto's die het uiterlijk laten zien van vrouwelijke Ae. aegypti-muggen die niet zijn gefed (links) en die zijn ingekapseld op een kunstmatige bloedmaaltijd (rechts, boven) of een zoutoplossing + ATP-maaltijd (rechts, onder). De Glytube-methode werd eerder gepubliceerd in Costa-da-Silva et al. (2013)20. Foto's in (C) en (D) zijn met dank aan Alex Wild. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Schematisch van hoe de grootte van de maaltijd te kwantificeren na het Glytube-bloedvoedingsprotocol. (A) Muggen worden een maaltijd aangeboden met fluoresceïne (boven, experimentele groep) of geen maaltijd (bodem, niet-gefed negatieve controlegroep). (B) Individuele muggen worden toegevoegd aan een plaat van 96 putten na beëindiging van het voedingsexperiment. (C) Standaardcurve wordt gegenereerd met behulp van bekende hoeveelheden meel die 0,002% fluoresceïne bevatten. (D) Muggen worden gehomogeniseerd om verbruikt fluoresceïne vrij te geven, en fluorescentieniveaus in elke put worden gekwantificeerd met behulp van een plaatlezer. Deze fluorescentiekwantificeringsmethode is gewijzigd van Liesch et al. (2013)34. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Glytube-bloedvoedexperiment met op fluoresceïne gebaseerde kwantificering. (A) Standaardcurvemetingen verkregen uit de putten waar een mug uit de niet-gefeerde controlegroep werd toegevoegd aan een bekende hoeveelheid meel die 0,002% fluoresceïne bevat (y-asschaal = willekeurige eenheden). (B) Maaltijdvolume berekend aan de hand van fluorescentiemetingen voor vrouwtjes in de niet-gefeerde controlegroep (links, zwart, n = 40), de experimentele groep die zich voedde met bloed (midden, rood, n = 37) en de experimentele groep die zich niet voedde met bloed (rechts, rood, n = 23). Elk punt vertegenwoordigt een meting van een individuele vrouw. Gegevens worden weergegeven als mediaan met bereik. Letters geven statistisch verschillende groepen aan, Kruskal-Wallis test met Dunn's meervoudige vergelijking, p<0.01. Deze gegevens zijn gepubliceerd in Jové et al. (2020)27. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Kwantificering van maaltijden met verschillende eiwitsamenstelling. Vrouwtjes kregen maaltijden aangeboden van schapenbloed (rood), kunstmatig bloed met menselijke bloedeiwitten (Kogan (1990)22) (oranje), of eiwitvrije zoutoplossing + ATP-maaltijd (aqua)7. (A) Percentage gevoerde vrouwtjes scoorde met fluorescentiemetingen. Elk punt vertegenwoordigt een groep van 12-16 vrouwen. Gegevens worden weergegeven als medianen met bereiken, n = 12. (B) Maaltijdvolume berekend aan de hand van fluorescentiemetingen. Elk punt vertegenwoordigt een meting van een individuele vrouw in een enkele studie uit figuur 4A. Gegevens worden weergegeven als medianen met bereiken, n = 12. (C) Percentage vrouwtjes volledig engorged na kunstmatige membraanvoeding, gescoord door het oog. Elk punt vertegenwoordigt het percentage vrouwen dat is ingesnijd uit groepen van 20-30 vrouwen. Gegevens worden weergegeven als medianen met bereiken, n = 23. (D) Maaltijdmaten gescoord als gewicht/vrouw na voedingsstatus werd gescoord door het oog. Gewichten werden berekend als het gemiddelde van groepen van 5 muggen. Gegevens worden weergegeven als medianen met bereiken, n = 23. A–D: Letters geven statistisch verschillende groepen aan, Kruskal-Wallis test met Dunn's meervoudige vergelijking, p<0.05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Kwantificering van maaltijden met farmacologische verbindingen. Vrouwtjes consumeren maaltijden van dezelfde grootte schapenbloed (rood), zoutoplossing + ATP (aqua) en zoutoplossing + ATP + 100 μM dosis humaan NPY Y2-receptoragonist TM30338 (donkerblauw). Maaltijdvolume berekend aan de hand van fluorescentiemetingen. Elk punt vertegenwoordigt een meting van een individuele vrouw. Gegevens worden weergegeven als medianen met bereiken, n = 12. Letters geven statistisch verschillende groepen aan, Kruskal-Wallis test met Dunn's meervoudige vergelijking, p<0.05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Kwantificering van kleinere nectarmaaltijden. (A) Schematische nectarvoedingstest. (B) Het meelvolume berekend aan de hand van fluorescentiemetingen voor wilde vrouwtjes bood maaltijden aan van water (blauw, n = 36) of 10% sacharose (groen, n = 53), elk met 0,002% fluoresceïne, in de nectarvoedingstest. Elk punt vertegenwoordigt een meting van een individuele vrouw. Gegevens worden weergegeven als medianen met bereiken. Letters geven statistisch verschillende groepen aan, Mann-Whitney test, p<0.05. Deze gegevens zijn gepubliceerd in Jové et al. (2020)27. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Kunstmatige bloedmaaltijd | |||
| Concentratie van de voorraadoplossing (mg/ml) | Volume van de voorraadoplossing in meel (μL/ml) | Uiteindelijke maaltijdconcentratie (mg/ml) | |
| Eiwitcomponenten* | |||
| γ-Globulinen | 50 | 300 | 15 |
| Hemoglobine | 35 | 230 | 8 |
| Albumine | 300 | 340 | 102 |
| Totaal eiwit | - | - | 125 |
| Niet-eiwitcomponenten | |||
| Concentratie van voorraadoplossing (mM) | Volume van de voorraadoplossing in meel (μL/ml) | Uiteindelijke maaltijdconcentratie (mM) | |
| Nacl | In γ-globuline voorraad | - | 5-10 |
| NaHCO | In γ-globuline voorraad | - | 120 |
| Atp | 200 | 5 | 1 |
| Water | - | 125 | - |
| *Eiwitcomponenten worden bereid in voorraadoplossing van dubbel gedestilleerd water, met uitzondering van γ-Globulinen, die zijn opgelost in 400 mM NaHCO3 en een variabele hoeveelheid NaCl bevatten (2-4%) in het product. | |||
Tabel 1: Recept voor het bereiden van kunstmatige bloedmaaltijden (aangepast aan Kogan (1990)22). Kunstmatig bloed bestaat uit eiwit- en niet-eiwitcomponenten die regelmatig in menselijk bloed worden aangetroffen en biedt de mogelijkheid om de verhoudingen van deze componenten te variëren. Muggen kunnen eieren produceren na het voeden met kunstmatig bloed7,22.
| Zoute maaltijd | |||
| Component | Concentratie van voorraadoplossing (mM) | Volume van de voorraadoplossing in meel (μL/ml) | Uiteindelijke maaltijdconcentratie (mM) |
| Nacl | - | - | - |
| NaHCO | 400 | 300 | 120 |
| Atp | 200 | 5 | 1 |
| Water | - | 695 | - |
Tabel 2: Recept voor zoute maaltijd met ATP (aangepast van Duvall et al. (2019)7). Eiwitvrije zoutoplossingsmaaltijden kunnen worden gebruikt om verbindingen te leveren die van belang zijn voor muggen, terwijl ze nog steeds de opgezette buik nabootsen die optreedt na bloedvoeding, maar zonder de eiontwikkeling te activeren die optreedt wanneer eiwitten worden ingenomen.
Discussion
Voor veel laboratoriumtoepassingen bieden kunstmatige membraanvoeders duidelijke voordelen in vergelijking met live hosts door onderzoekers de mogelijkheid te bieden om de inhoud van de maaltijd rechtstreeks te manipuleren. Hoewel er meerdere methoden beschikbaar zijn voor kunstmatige membraanvoeding, biedt de hier beschreven methode voordelen in flexibiliteit, kosten en doorvoer. In vergelijking met andere commerciële membraanvoeders vereist de Glytube-test een klein maaltijdvolume, waardoor het een efficiënt leveringsmechanisme is voor dure reagentia, waaronder geneesmiddelen of ziekteverwekkers, door het totale vereiste volume te minimaliseren7,35. Aangezien zowel de eiwitvrije zoutoplossing als kunstmatige bloedmaaltijden engorgement bevorderen, kunnen verbindingen of pathogenen aan beide maaltijden worden toegevoegd als een hoog doorvoereffect en niet-invasief alternatief voor injecties. Bovendien kan elk onderdeel van de Glytube gemakkelijk worden gewassen, vervangen of opgeschaald om meerdere meelsoorten te leveren en te kwantificeren zonder kruisbesmetting van het voedingsapparaat.
Om maaltijdvolumes die door muggen worden geconsumeerd te kwantificeren, maakt de op fluorescentie gebaseerde methode nauwkeurigere kwantificering van de meelgrootte mogelijk dan het wegen van de muggen voor en na het voeren. Opgemerkt moet worden dat deze methode een eindpunttest is. Met wegen kunnen de muggen daarentegen in leven worden gehouden voor verdere experimenten. Door een plaatlezer te gebruiken, kan de op fluorescentie gebaseerde methode eenvoudig worden opgeschaald voor kwantificering met hoge doorvoer van maaltijden die door honderden individuele vrouwen worden geconsumeerd.
Om hoge voedingssnelheden te bereiken, moet een combinatie van voldoende gastheersignalen aanwezig zijn om vrouwelijk gastheerzoekend gedrag te activeren en vrouwtjes naar de feeder te trekken. Als muggen zich niet onder de Glytube verdringen, kan de maaltijd niet goed worden opgewarmd of is de CO2-levering mogelijk niet voldoende. Toevoeging van menselijke geur aan het membraanoppervlak verhoogt op betrouwbare wijze de aantrekkelijkheid van het kunstmatige membraan. Als muggen onder de Glytube worden waargenomen, maar zich niet voeden, kan de samenstelling van de maaltijd fout zijn. Vrouwtjes mogen zich niet voeden als de maaltijd zelf niet warm is, het bloed te oud is of als de additieven aan de maaltijd intrinsiek aversief zijn of een ongewenste chemische reactie veroorzaken36. Extra ATP verhoogt ook op betrouwbare wijze de voedingssnelheden en kan worden opgeschaald naar een uiteindelijke concentratie van 2 mM in elk van de verstrekte recepten. Vrouwtjes mogen zich niet voeden als de parafilm niet strak over de Glytube-dop wordt getrokken; de parafilm moet uniform transparant zijn en mag geen gesp maken, omdat dit voorkomt dat het vrouwtje de parafilm effectief kan doorboren met haar stylet. Als de maaltijd door de Glytube op het gaas lekt, kan de parafilm tijdens het uitrekken gescheurd zijn en vervangen worden.
Het veranderen van de maaltijdsamenstelling kan onderzoekers ook in staat stellen om de tijd te manipuleren die nodig is om de maaltijd uit de mug te wissen, evenals het daaropvolgende gastheerzoekende gedrag. De hier gepresenteerde maaltijden vereisen 24-36 uur voor de spijsvertering7 vergelijkbaar met dierlijk bloed. Na het voeden met een van deze maaltijden, zullen vrouwtjes het zoeken naar gastheer onderdrukken tijdens het verteringstijdvenster. Omdat de zoutoplossing geen eiwit heeft, keren vrouwtjes terug naar gastheerzoekend nadat de maaltijd is geklaard. Als een snellere terugkeer wenselijk is, kunnen onderzoekers alternatieve "quick clearing" zoutoplossingmaaltijden kiezen die in ongeveer 6 uur27worden uitgescheiden. Hoewel de samenstelling van het hier gepresenteerde zoutmeel is afgestemd om de resultaten rechtstreeks te vergelijken met het kunstmatige bloedmeel, komt de "quick clearing"-maaltijd beter overeen met fysiologische zoutniveaus in gewerveld bloed.
De hier beschreven methoden hebben beperkingen die moeten worden overwogen voordat de test wordt geselecteerd die het meest geschikt is voor de experimentele doelen van de onderzoeker. De beschreven fluoresceïnemetingen laten niet toe dat muggen opnieuw worden gebruikt voor extra experimenten. Gewichtsmetingen kunnen echter worden uitgevoerd voorafgaand aan de kwantificering van de meelgrootte met behulp van de fluoresceïnetest. Als gewicht en maaltijdgrootte consistent zijn in meerdere proeven voor een bepaalde maaltijd, kan gewicht worden gebruikt als proxy in toekomstige experimenten. Bovendien maakt dit protocol geen onderscheid tussen tekorten in gastheerzoekend versus bloedvoedgedrag; muggen die beperkingen vertonen bij het vinden van de membraanvoeder zullen een vermindering van de voedersnelheden en / of maaltijdgrootte hebben. Door een camera toe te voegen om gedrag tijdens de test vast te leggen, kunnen onderzoekers bepalen of de vrouwtjes de Glytube niet kunnen vinden, of dat ze de Glytube vinden, maar niet voeden.
De hier beschreven test kan worden aangepast om veel openstaande vragen met betrekking tot voedingsgedrag bij muggen te verkennen. De bijdrage van specifieke bloedeiwitten kan bijvoorbeeld worden onderzocht door de verhouding van samenstellende eiwitten of de totale eiwitconcentratie in het kunstmatige bloedmeel te wijzigen. Om maaltijdgroottes te evalueren van meerdere voedingsgebeurtenissen, kunnen kleurstoffen met verschillende fluorescentiespectra worden toegevoegd om maaltijden te onderscheiden van unieke bronnen37. Dit protocol kan ook worden aangepast om de interne monddelen die bloed detecteren afzonderlijk te stimuleren en die worden gebruikt voor inname (d.w.z. stylet), en de chemosensorische aanhangsels die contact maken met de huid (d.w.z. labium, benen) als de mug landt om te beginnen met bloedvoeding36. Als liganden bijvoorbeeld rechtstreeks aan de maaltijd worden toegevoegd, komen ze niet in contact met het labium en de benen, omdat het membraan alleen doorboord wordt door de stylet. Als in plaats daarvan liganden aan het buitenoppervlak van de parafilm worden toegevoegd, blijven ze gescheiden van de maaltijd en kunnen ze worden gecontacteerd door het labium en de benen36. Ten slotte worden de gedetailleerde kinetiek van bloedvoedgedrag niet goed begrepen en kan de hier gepresenteerde methode worden gewijzigd om tracking met hoge resolutie te combineren met machine learning-tools om gedragsuitlezingen van voortbeweging, houding en voedingsdynamiek te extraheren38.
Dit protocol is gericht op gebruiksvriendelijk en kosteneffectief zijn, met de mogelijkheid om onderzoekers te dienen die farmacologische en genetische manipulaties gebruiken om muggenbloedvoeding en post-bloedvoedingsgedrag te bestuderen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We danken Nipun Basrur, Adriana K. Rosas Villegas, Nadav Shai en Trevor Sorrells voor opmerkingen over de manuscripten, en Zhongyan Gong en Kyrollos Barsoum voor technische hulp. We danken Alex Wild voor de foto's die in figuur 1 zijngebruikt. K.V. werd ondersteund door het Boehringer Ingelheim Fonds PhD fellowship. V.J. werd mede ondersteund door NIH T32-MH095246. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een subsidie aan de Rockefeller University van het Howard Hughes Medical Institute via het James H. Gilliam Fellowships for Advanced Study-programma aan V.J. Dit materiaal is gebaseerd op werk dat wordt ondersteund door het National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program onder Grant No. NSF DGE-1325261 naar V.J. Alle meningen, bevindingen en conclusies of aanbevelingen in dit materiaal zijn die van de auteur(s) en weerspiegelen niet noodzakelijkerwijs de standpunten van de National Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 3 mm diameter borosilicate solid-glass bead | MilliporeSigma | Z143928 | For use for bead mill homogenizer; not required if using pellet pestle grinder |
| 32 oz. high-density polyethylene (HDPE) plastic cup | VWR | 89009-668 | Example mosquito container used for feeding assays shown; alternate options can be used |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 96-well black polystyrene plate | ThermoFisher | 12-566-09 | |
| 96-well PCR plate sealing film | Bio-Rad | MSB1001 | Alternate options can be used |
| 96-well PCR plates | Bio-Rad | HSP9621 | Alternate options can be used |
| Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | MilliporeSigma | A6419 | |
| Albumin (human serum) | MilliporeSigma | A9511 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213 | Alternate options can be used to block light entering fluorescein container |
| Balance | Fisher Scientific | 01-911 | Alternate options can be used |
| Bead mill homogenizer | Qiagen | 85300 | Not required if using pellet pestle grinder |
| Cotton ball | Fisher Scientific | 22456880 | For nectar-feeding; alternate options can be used |
| Defibrinated sheep blood | Hemostat Laboratories | DSB100 | Alternate options can be used |
| Drosophila CO2 fly pad | Tritech Research | MINJ-DROS-FP | Alternate options can be used |
| Fluorescein | MilliporeSigma | F6377 | |
| Fluorescence plate-reader | ThermoFisher | VL0000D0 | Alternate options can be used |
| Gamma-globulin (human blood) | MilliporeSigma | H7379 | |
| Glycerol | MilliporeSigma | G7893 | |
| Hemoglobin (human) | MilliporeSigma | G4386 | |
| Laboratory wrapping film - parafilm | Fisher Scientific | 13-374 | |
| Magnetic stirrer | Fisher Scientific | 90-691 | Alternate magnetic stirrers can be used |
| Microcentrifuge for 96-well plate | VWR | 80094-180 | Alternate options can be used |
| Microcentrifuge Tubes | MilliporeSigma | 2236412 | Alternate options can be used |
| Pellet pestle grinder | VWR | KT749521-1500 | Not required if using bead mill homogenizer |
| Phosphate buffered solution (PBS) | Fisher Scientific | BW17-516F | Optional |
| Razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | Alternate options can be used, such as a lathe for better consistency of cutting |
| Rubber bands | |||
| Silicone tubing | McMaster Carr | Needed if using a fly pad for CO2 delivery | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | S233 | |
| Sodium chloride (NaCl) | MilliporeSigma | S9888 | |
| Stir bars | Fisher Scientific | 14-512 | Alternate magnetic stir bars can be used |
| Translucent polypropylene storage box with removable lid | Example box used for feeding assays shown | ||
| Vortex mixer | |||
| Water bath | Alternate heating device may be used | ||
| White 0.8 mm polyester mosquito netting | American Home & Habit Inc. | F03A-PONO-MOSQ-M008-WT | Alternate options can be used |
References
- Bhatt, S., et al. The global distribution and burden of dengue. Nature. 496 (7446), 504-507 (2014).
- Rogers, D. J., Wilson, A. J., Hay, S. I., Graham, A. J. The global distribution of yellow fever and dengue. Advances in Parasitology. 62 (05), 181-220 (2006).
- Chouin-Carneiro, T., et al. Differential susceptibilities of Aedes aegypti and Aedes albopictus from the Americas to Zika virus. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (3), (2016).
- Guerbois, M., et al. Outbreak of Zika virus infection, Chiapas State, Mexico, 2015, and first confirmed transmission by Aedes aegypti mosquitoes in the Amercias. Journal of Infectious Diseases. 214 (9), 1349-1356 (2016).
- Weaver, S. C., et al. Zika virus: history, emergence, biology, and prospects for control. Antiviral Research. 130, 69-80 (2016).
- Attardo, G. M., Hansen, I. A., Raikhel, A. S. Nutritional regulation of vitellogenesis in mosquitoes: implications for anautogeny. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 35 (7), 661-675 (2005).
- Duvall, L. B., Ramos-Espiritu, L., Barsoum, K. E., Glickman, J. F., Vosshall, L. B. Small-molecule agonists of Ae. aegypti neuropeptide Y receptor block mosquito biting. Cell. 176 (4), 687-701 (2019).
- Dimond, J. B., Lea, A. O., Hahnert, W. F., DeLong, D. M. The amino acids required for egg production in Aedes aegypti. The Canadian Entomologist. 88 (2), 57-62 (1956).
- Guerrero, D., Cantaert, T., Missé, D. Aedes mosquito salivary components and their effect on the immune response to arboviruses. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 1-11 (2020).
- Raquin, V., Lambrechts, L. Dengue virus replicates and accumulates in Aedes aegypti salivary glands. Virology. 507, 75-81 (2017).
- Farjana, T., Tuno, N. Multiple blood feeding and host-seeking behavior in Aedes aegypti and Aedes albopictus (diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 50 (4), 838-846 (2013).
- Scott, T. W., Takken, W. Feeding strategies of anthropophilic mosquitoes result in increased risk of pathogen transmission. Trends in Parasitology. 28 (3), 114-121 (2012).
- Ross, P. A., Lau, M. J., Hoffmann, A. A. Does membrane feeding compromise the quality of Aedes aegypti mosquitoes. PLoS ONE. 14 (11), 1-19 (2019).
- Ross, P. A., Axford, J. K., Richardson, K. M., Endersby-Harshman, N. M., Hoffmann, A. A. Maintaining Aedes aegypti mosquitoes infected with wolbachia. Journal of Visualized Experiments. 2017 (126), 1-8 (2017).
- Briegel, H., Hefti, M., DiMarco, E. Lipid metabolism during sequential gonotrophic cycles in large and small female Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 48 (5), 547-554 (2002).
- McMeniman, C. J., Corfas, R. A., Matthews, B. J., Ritchie, S. A. S., Vosshall, L. B. Multimodal integration of carbon dioxide and other sensory cues drives mosquito attraction to humans. Cell. 156 (5), 1060-1071 (2014).
- Pakes, S. P., et al. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , National Academic Press. Washington, DC, USA. (2011).
- Deng, L., Koou, S. Y., Png, A. B., Ng, L. C., Lam-Phua, S. G. A novel mosquito feeding system for routine blood-feeding of Aedes aegypti and Aedes albopictus. Tropical Biomedicine. 29 (1), 169-174 (2012).
- Gunathilaka, N., Ranathunge, T., Udayanga, L., Abeyewickreme, W. Efficacy of blood sources and artificial blood feeding methods in rearing of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) for sterile insect technique and incompatible insect technique approaches in Sri Lanka. BioMed Research International. 2017, 3196924 (2017).
- Costa-da-Silva, A. L., et al. Glytube: a conical tube and parafilm M-based method as a simplified device to artificially blood-feed the Dengue vector mosquito, Aedes aegypti. PLoS ONE. 8 (1), 53816 (2013).
- Carvalho, D. O., et al. Mass production of genetically modified Aedes aegypti for field releases in Brazil. Journal of Visualized Experiments. 83 (83), 1-10 (2014).
- Kogan, P. H. H. Substitute blood meal for investigating and maintaining Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 27 (4), 1-4 (1990).
- Gonzales, K. K., Hansen, I. A.
- Baughman, T., et al. A highly stable blood meal alternative for rearing Aedes and Anopheles mosquitoes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (12), 0006142 (2017).
- Galun, R. Feeding stimuli and artificial feeding. Bulletin of the World Health Organization. 36, 590-593 (1967).
- Galun, R. Feeding response in Aedes aegypti: stimulation by adenosine triphosphate. Science. 142, 1674-1675 (1963).
- Jové, V., et al. Sensory Discrimination of Blood and Floral Nectar by Aedes aegypti Mosquitoes. Neuron. 108, 1-18 (2020).
- Petersen, M. T., et al. The impact of the age of first blood meal and Zika virus infection on Aedes aegypti egg production and longevity. PLoS ONE. 13 (7), 1-15 (2018).
- Sissoko, F., et al. Frequent sugar feeding behavior by Aedes aegypti in Bamako, Mali makes them ideal candidates for control with Attractive Toxic Sugar Baits (ATSB). PLoS ONE. 14 (6), 0214170 (2019).
- Houseman, J. G., Downe, A. E. R. Methods of measuring blood meal size and proteinase activity for determining the effects of mated state of digestive processes of female Aedes aegypti (L.) (Diperta: Culicidae). The Canadian Entomologist. 18, 241-248 (1986).
- Redington, B. C., Hockmeyer, W. T. A method for estimating blood meal volume in Aedes aegypti using a radioisotope. Journal of Insect Physiology. 22 (7), 961-966 (1976).
- Gonzales, K. K., et al. The effect of SkitoSnack, an artificial blood meal replacement, on Aedes aegypti life history traits and gut microbiota. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
- Klowden, M. J. The endogenous regulation of mosquito reproductive behavior. Experientia. 46 (7), 660-670 (1990).
- Liesch, J., Bellani, L. L., Vosshall, L. B. Functional and genetic characterization of neuropeptide Y-like receptors in Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (10), 22486 (2013).
- Frances, S. P., Sithiprasasna, R., Linthicum, K. J. Laboratory evaluation of the response of Aedes aegypti and Aedes albopictus uninfected and infected with Dengue virus to Deet. Journal of Medical Entomology. 48 (2), (2011).
- Dennis, E. J., Goldman, O. V., Vosshall, L. B. Aedes aegypti mosquitoes use their legs to sense DEET on contact. Current Biology. 29 (9), 1551-1556 (2019).
- Harrington, L. C., et al. Heterogeneous feeding patterns of the Dengue vector, Aedes aegypti, on individual human hosts in rural Thailand. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (8), 3048 (2014).
- Hol, F. J., Lambrechts, L., Prakash, M. BiteOscope, an open platform to study mosquito biting behavior. eLife. 9, 1-24 (2020).
