Summary
Цель этого протокола заключается в доставке животных полученных и искусственных блюд крови комаров Aedes aegypti через искусственную мембрану подачи и точно количественно объем еды попадает.
Abstract
Самки некоторых видов комаров могут распространять болезни, кусая позвоночных хозяев, чтобы получить богатые белком блюда крови, необходимые для развития яйцеклеток. В лаборатории исследователи могут доставлять комаров с помощью мембранных фидей, которые позволяют манипулировать составом пищи животного происхождения и искусственной крови. Здесь мы представляем методы кормления крови и искусственной крови комаров Aedes aegypti и количественного объема, потребляемого отдельными женщинами.
Целенаправленное кормление и количественная оценка искусственных/кровяных блюд широко используются, включая тестирование влияния компонентов питания на поведение комаров и физиологию, доставку фармакологических соединений без инъекций и заражение комаров конкретными патогенами. Добавление флуоресцентного красителя в пищу перед кормлением позволяет последующей количественной оценки размера еды. Объем еды, потребляемой комарами, может быть измерен либо по весу, если самки должны быть использованы позже для поведенческих экспериментов, или путем гомогенизации отдельных женщин в 96-хорошо пластин и измерения уровня флуоресценции с помощью считывателя пластин в качестве конечной точки анализа. Количественная оценка размера еды может быть использована для определения того, изменяет ли изменение компонентов еды объем приема пищи или потребление еды отличается между штаммами комаров. Точная количестве еды количественно также имеет решающее значение для вниз по течению анализы, такие, как те, измерения воздействия на принимающей притяжения или плодовитости. Методы, представленные здесь, могут быть дополнительно адаптированы для отслеживания пищеварения еды в течение нескольких дней или для включения нескольких различимых маркеров, добавленных в различные блюда (например, нектар и кровь) для количественной оценки потребления каждого приема пищи одним комаром.
Эти методы позволяют исследователям в одиночку выполнять измерения высокой пропускной способности для сравнения объема еды, потребляемой сотнями отдельных комаров. Поэтому эти инструменты будут в целом полезны для сообщества исследователей комаров для ответа на различные биологические вопросы.
Introduction
Мы представляем протокол для кормления модифицированных блюд крови комаров Aedes aegypti с помощью искусственной мембранной подачи и точного измерения объема еды, потребляемой каждым отдельным комаром. Этот протокол может быть гибко адаптирован для изменения содержания еды или для сравнения объема еды, потребляемой различными экспериментальными группами комаров.
Комар Ae. aegypti угрожает глобальному здоровью, распространяя патогенные микроорганизмы, которые вызывают заболевания, включая желтую лихорадку, лихорадку денге, чикунгунья и вирус Зика1,2,3,4,5. Самки Ae. aegypti обязаны кровоскормы; они должны потреблять позвоночных крови, чтобы получить необходимый белок для развития яйцеклетки, и каждый сцепление яиц требует полной еды крови, по крайнеймере один хозяин 6,7,8. Самка комара сначала кусает хозяина, прокалывая кожу своим стилем и вводя слюну, которая содержит соединения, которые вызывают иммунный ответхозяина 9. Затем она питается, перекачивая кровь через ее stylet в ее midgut. Потребляя пищу крови от инфицированного хозяина, она может провести кровьпатогенов 6,8 , которые затеммигрируютиз комаров midgut к ее слюнных желез10. Самки комаров, инфицированных таким образом, могут распространять болезни путем инъекций патогенных микроорганизмов вместе со слюной приукусе последующих хозяев 11,12. Понимание и количественная оценка механизмов поведения при кормлении крови являются важнейшими шагами в борьбе с передачей болезней, передаваемых комарами.
Многие лабораторные протоколы для выращивания комаров и экспериментов использовать живых животных, включая мышей, морскихсвинок, или людейв качестве источника крови 13,14,15,16. Использование живых животных налагает этические проблемы, а также сложные требования к обучению персонала, жилью и уходу за животными, а также соблюдение политики Комитета по уходу и использованию животных (МАКУК). Он также ограничивает типы соединений, которые могут быть доставлены комаров, что ограничивает исследования, которые могут быть проведены17.
Искусственные аппараты для кормления крови, которые обычно используют мембранную систему для имитации кожи хозяина, являются полезными инструментами для изучения поведения при кормлении крови, которые обходят необходимость поддержания живых хозяев. Вся кровь может быть приобретена у ряда поставщиков и подается комарам с помощью подогревом, водяной курткой искусственных мембран фиделили аналогичных устройств 18,19. В этом протоколе мы демонстрируем использование небольших одноразовых мембранных фидерсов, которые называются «Глитрубы». Эта мембранная кормушка, ранее опубликованная Costa-da-Silva et al. (2013)20, может быть легко собрана из стандартного лабораторного оборудования, что делает ее идеальной для доставки крови к умеренному количеству комаров и простой для масштабирования для тестирования больших групп или нескольких формулировок еды. Glytube является недорогой и эффективной альтернативой другим коммерческим искусственных фидеров, которые могут потребовать больших объемов еды и более пригодны для партии кормления больших групп комаров на одинприем пищи формулировки 21.
Этот протокол включает в себя два раздела: подготовка/доставка искусственных блюд и количественная оценка потребления. В первом разделе, Glytubes используются в качестве эффективного средства для доставки манипулировать диеты. Вся кровь может быть заменена полностью искусственной едой, чтобы сравнить эффекты заменителей крови вместо еды крови. Рецепт адаптированы из Коган (1990)22 представлен здесь, хотя несколько искусственных формулировокеды были разработаны 23,24. Кроме того, кормление является менее инвазивным и менее трудоемким методом введения фармакологических соединений, чем инъекция. Из-за низкого общего объема, необходимого для каждого приема пищи (1-2 мл), этот протокол обеспечивает привлекательный метод доставки, чтобы уменьшить количество дорогих реагентов. Ae. aegypti женщины легко потребляют без белка питание солевого раствора с аденозином 5 "трифосфат(АТФ) 25,26, который обеспечивает базовый уровень для измерения воздействия отдельных компонентов еды. Например, Нейропептид Y-как рецептор 7 (NPYLR7) в Ae. aegypti, как известно, посредником принимающей ищет подавления после богатых белком крови еды, и когда NPYLR7 агонисты добавляются в безбелковый солевой еды, самки комаров экспонат принимающей поисках подавления похож на те, которыепотребляли всю кровь 7.
Во втором разделе представлены шаги по количественной оценке объема каждого приема пищи, потребляемого отдельными самками комаров. Этот анализ основан на флуоресценции и фиксирует состояние кормления в более высоком разрешении, чем методы, в которых женщины классифицируются как "кормили" или "unfed" на основе визуальной оценки брюшной дистензии в одиночку. Добавляя флуоресцентный к трапезе до кормления, объемы еды, проглатываемые отдельными лицами, могут быть количественно определены путем гомогенизации каждого комара в 96-хорошо пластины и измерения интенсивности флуоресценции в качестве считывания. Этот анализ может измерять различия в энергии кормления в ответ на такие переменные, как состав еды или генетический фон комаров. Точная количественная оценка имеет решающее значение для промежуточных размеров еды, например, когда женщинам предлагаются неоптимальные блюда, содержащие сдерживающие факторы для кормления, или когда они потребляют сахарозные блюдапеременных размеров 27. Если подкормленные комары необходимы для последующих поведенческих анализов после количественной оценки размера еды, размер еды может быть рассчитан путем взвешивания анестезированная самка в группах и оценки средней увеличенной массы на человека. Хотя менее точны, чем флуорессейн маркировки, взвешивание по-прежнему обеспечивает агрегированную оценку объема еды и позволяет изучать влияние еды на процессы вниз по течению, такие как плодовитость или последующего притяжения хозяина. В то время как размер еды крови является переменной и может зависетьот множества факторов 11,28,29 , попадаетразмеры едыизмеряется с методами, описанными здесь в соответствии спредыдущими количественными 7,30,31.
Protocol
Процедуры по кормлению крови не проводились с использованием живых животных или хозяев-человеков и соответствовали руководящим принципам, установленным Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Рокфеллеровского университета (IACUC) и Советом по институциональному обзору (IRB).
1. Приготовление пищи
- Приготовление фагостимулятора, аденозина 5"-трифосфата
- Приготовьте 25-метровый раствор aqueous NaHCO3 (молекулярный вес, МВт 84,006 г/мол). Для 100 мл 25 мМ NaHCO3добавьте 210 мг NaHCO3 в объемную колбу и заполните двойной дистиллированной водой (ddH2O) общим объемом 100 мл. Используя магнитное перемешивание бар, тщательно перемешать раствор, пока все NaHCO3 растворяется.
- Восстановленный гидрат соли АТФ (МВт 551,14 г/мол) в аквеевом 25 мМ NaHCO3 до конечной концентрации 200 мМ АТФ. При общем объеме 10 мл 200 мМ АТП в буфере 25 мМ NaHCO3 добавьте 1,1 г гидрата соли АТФ в объемную колбу и заполните буфером NaHCO3 25 мм при общем объеме 10 мл. Используя магнитный батончик, тщательно перемешайте раствор до тех пор, пока весь АТФ не растворится.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму гидролиз АТФ, он должен быть буферизирован соленым раствором, таким как NaHCO3. - Aliquot решение АТФ и хранить при -20 градусов по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это решение запасов АТФ, как правило, свежие каждые шесть месяцев и используется для всех блюд, описанных ниже. Чтобы предотвратить деградацию, АТП-алициты не должны проходить несколько циклов замораживания оттепели или нагреваться вместе с другими компонентами еды.
- Подготовка флуоресцентного раствора трассировщика, флуоресцентного
- Подготовьте 2% (w/v) стоковое решение aqueous флуоресцентного. Для общего объема раствора запаса 10 мл, смешайте 0,2 г флуоресцентной соли натрия с 10 мл ddH2O в 15 мл конической трубки, завернутой в алюминиевую фольгу при комнатной температуре. Этот стоковой раствор флуоресхейна может быть использован для разбавления во всех блюдах, описанных ниже.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку флуорессейн светочувствительный, избегайте воздействия света путем упаковки контейнеров в алюминиевую фольгу.
- Подготовьте 2% (w/v) стоковое решение aqueous флуоресцентного. Для общего объема раствора запаса 10 мл, смешайте 0,2 г флуоресцентной соли натрия с 10 мл ddH2O в 15 мл конической трубки, завернутой в алюминиевую фольгу при комнатной температуре. Этот стоковой раствор флуоресхейна может быть использован для разбавления во всех блюдах, описанных ниже.
- Приготовление пищи крови животного происхождения
- Рассчитать количество блюд, необходимых для кормления всех комаров; каждый Glytube содержит 2 мл еды и кормит около 25 комаров. Подготовьте один дополнительный прием пищи для калибровки стандартной кривой для показаний флуоресценции. Если не указано иное, все шаги в этом разделе описывают количество реагентов, необходимых для приготовления одного приема пищи с окончательным объемом 2 мл.
- Для еды крови животного происхождения перенесите 1,98-2 мл дефибрированной крови овец в коническую трубку 15 мл (см. шаг 3.3 для желаемого объема крови).
ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерчески дефибрированные источники позвоночной крови, в том числе от овец, морских свинок и людей, могут быть использованы13. Перед использованием убедитесь, что купленная кровь не прошла срок годности, и хорошо перемешайте ее, инвертировать бутылку, особенно если есть видимое разделение компонентов крови. - Для оптимального кормления добавьте АТФ в окончательную концентрацию 1-2 мМ после того, как кровь овец прогреется до 45 градусов по Цельсию на водяной бане. Для окончательной концентрации 1 мМ АТФ добавьте 10 МКЛ из 200 мТ АТФ в раствор запаса 1,99 мл предварительно разогретой крови и смешайте. Для окончательной концентрации 2 мМ АТФ добавьте 20 МКЛ из запаса 200 мТ АТФ в 1,98 мл предварительно разогретой крови и смешайте. Если АТФ не следует добавить, тепло 2 мл дефибрилированной крови овец.
- Если флуоресценция на основе количественной оценки размера еды должна быть впоследствии проведена, добавьте раствор флуоресцента к конечной концентрации 0,002% (2 мл 2% флуоресцентного запаса в 2 мл общего объема еды). Уменьшите объем крови на то же количество, что и добавленный флуоресцейн. Сохранить 1 мл окончательной формулировки еды, содержащей 0,002% флуорессейна для создания эталонной кривой. Относитесь к сохраненным объемам одинаково, чем к трапезе, которая доставляется комарам; подвергать же свет и температурные условия в течение всего эксперимента, а затем заморозить это вместе с доставленной еды.
- Подготовка искусственного питания крови
- Рассчитать количество блюд, необходимых для кормления всех комаров; каждый Glytube содержит 2 мл еды и кормит около 25 комаров. Подготовьте один дополнительный прием пищи для калибровки стандартной кривой для показаний флуоресценции. Если не указано иное, все шаги в этом разделе описывают количество реагентов, необходимых для приготовления одного приема пищи по 2 мл.
- Для подготовки искусственной крови (адаптированы из Когана (1990)22), как в таблице 1, сначала сделать фондовый раствор 400 мМ NaHCO3. При общем объеме 10 мл 400 мМ NaHCO3 (МВт 84,006 г/моль) добавьте 336 мг NaHCO3 в объемную колбу и заполните двойной дистиллированной водой (ddH2O) к общей объему 10 мл. Используя магнитное перемешивание бар, тщательно перемешать раствор, пока все NaHCO3 растворяется.
- Для белковых компонентов искусственной крови подготовьте стоковые растворы 50 мг/мл γ-глобулинов в 400 мМНаХКО 3,35 мг/мл гемоглобина в ddH2O и 300 мг/мл альбумин в растворах ddH2O. Protein stock можно хранить при 4 градусах Цельсия на срок до 2 месяцев. Окончательная концентрация белков человека в искусственной крови составляет 125 мг/мл. Это включает в себя окончательные концентрации 15 мг/мл γ-глобулинов, 8 мг/мл гемоглобина и 102 мг/мл альбумин.
- Для каждого приема пищи по 2 мл смешайте 600 МКЛ из γ-глобулинов, 460 мл гемоглобина, 680 МКЛ альбумин и 250 МКЛ ddH2O из фондовых растворов, перечисленных в таблице 1. Подождите, чтобы добавить 10 йл 200 мМ АТФ фондовый раствор до тех пор, пока после еды был разогрет до 45 градусов по Цельсию, непосредственно перед представлением еды.
- Если флуоресценция на основе количественной оценки размера еды должна быть впоследствии проведена, добавьте раствор флуоресцента к конечной концентрации 0,002% (2 мл 2% флуоресцентного запаса в 2 мл общего объема еды). Уменьшите объем ddH2O в шаге 4.4 на ту же сумму, что и добавленный флуоресцентный. Сохранить по крайней мере 1 мл окончательной формулировки еды, содержащей 0,002% флуорессейна для создания эталонной стандартной кривой. Относитесь к сохраненным объемам одинаково, чем к трапезе, которая доставляется комарам; подвергать же свет и температурные условия в течение всего эксперимента, а затем заморозить это вместе с доставленной еды.
- Подготовка примерных без белком солевые блюда (адаптированные из Duvall et al. (2019)7)
ПРИМЕЧАНИЕ: Без белка солевые блюда могут быть подготовлены несколькимиспособами 7,27,32. Соленая еда, представленная здесь, является без белком версией рецепта искусственной крови, описанного выше.- Рассчитать количество блюд, необходимых для кормления всех комаров; каждый Glytube содержит 2 мл еды и кормит около 25 комаров Подготовка одного дополнительного приема пищи для калибровки стандартной кривой для измерения флуоресценции. Если не указано иное, все шаги в этом разделе описывают количество реагентов, необходимых для приготовления одного приема пищи по 2 мл.
- Для приготовления солевой муки сделайте запас раствора 400 мМ НаГКО3. При общем объеме 10 мл 400 мМ NaHCO3 (МВт 84,006 г/моль) добавьте 336 мг NaHCO3 в объемную колбу и заполните ddH2O общим объемом 10 мл. Используя магнитное перемешивание бар, тщательно перемешать раствор, пока все NaHCO3 растворяется.
- Для каждого приема пищи 2 мл, объединить в 15 мл конической трубки 600 МКЛ 400 мМ NaHCO3 с 1,39 мл ddH2O. Подождите, чтобы добавить 10 йл 200 мМ ATP фондовый раствор до тех пор, пока после еды был разогрет до 45 градусов по Цельсию в водяной бане.
- Если флуоресценция на основе количественной оценки размера еды будет впоследствии проведена, добавьте раствор флуоресценции к конечной концентрации 0,002% (2 мл 2% флуоресцентного запаса в 2 мл от общего объема еды). Уменьшите объем ddH2O в шаге 5.3 на ту же сумму, что и добавленный флуоресцентный. Сохранить по крайней мере 1 мл окончательной формулировки еды, содержащей 0,002% флуорессейна для создания эталонной стандартной кривой. Относитесь к сохраненным объемам одинаково, чем к трапезе, которая доставляется комарам; подвергать же свет и температурные условия в течение всего эксперимента, а затем заморозить это вместе с доставленной еды.
2. Доставка еды комарам
- Настройка контейнеров для комаров для кормления
ПРИМЕЧАНИЕ: Комары могут быть поданы в различных контейнерах до тех пор, как следующие критерии будут выполнены. Убедитесь, что контейнер достаточно большой для комаров, чтобы летать вокруг, но не настолько велика, что это будет трудно для комаров, чтобы найти поверхность сетки и начать кормление. Сетка, используемая для покрытия контейнера, может различаться по размеру материала и отверстия. Отверстия должны быть достаточно большими для самки комара stylet пронзить, но не настолько велика, что комар может бежать. Защитите сетку крепко так, чтобы она была натянутой, и Glytube может надежно отдыхать на ее поверхности в течение всего периода кормления.- Примером контейнера(рисунок 1) является модифицированный 946 мл (32 унции) полиэтилен высокой плотности (HDPE) пластиковое ведро. Чтобы воспроизвести эту установку, используйте лезвие бритвы, чтобы вырезать центральное отверстие диаметром 10 см в крышке ведра. Чтобы собрать контейнер для занятия комарами, закрепте 400 см2 квадратный кусок белого 0,8 мм полиэфирной москитной сетки поверх ведра, надежно толкая перфорированную крышку вниз над ним, чтобы плотно щелкнуть.
- Соберите самок комаров, которые, по крайней мере 3 дней после выкупа, чтобы убедиться, что они достаточно зрелы, чтобы кровь корма. Оптимальные показатели кормления наблюдаются через 7 дней33.
- Поместите самок комаров в контейнер и накройте сеткой. Если контейнер густо заселен комарами, увеличьте количество используемых Glytubes. Оптимальное кормление достигается с помощью комаров No25/Glytube. Это снижает конкуренцию за доступ к кормовой мембране.
- Отложите в сторону контрольную группу неосуществимых комаров, которые не будут предложены питание. В протоколе измерения веса, взвесить unfed группы отдельно и использовать этот вес для оценки веса в экспериментальной группе, которая питалась едой. В протоколе количественной оценки на основе флуоресценции добавьте неосуществимую группу комаров в скважины для стандартных расчетов кривых и для отрицательного контроля. Чтобы соответствовать базовым аутофторесценции тканей комаров в экспериментальной группе, убедитесь, что стандартная кривая и отрицательные скважины управления содержат неосуществимых комаров.
- Строительство и создание Glytube (адаптировано от Коста-да-Сильва и др. (2013)20)
- Как по изображено на рисунке 1, для генерации источника тепла, заполнить 50 мл конической трубки с 40 мл 100% глицерол. Печать открытой конической трубки с 5 см × 5 см кусок парафильма и повторить с дополнительным куском 5 см × 5 см парафильма, чтобы свести к минимуму вероятность утечки. По желанию, парафильм может быть проведен на месте с использованием резинки. Инвертировать трубку, чтобы убедиться, что Есть нет отверстий или пробелов.
- Чтобы создать устройство доставки еды, вырежьте центрированное отверстие диаметром 2,5 см в винтовой крышке конической трубки с помощью острого лезвия бритвы или, для лучшей консистенции, планки. Растянуть 5 см × 5 см кусок парафильма равномерно, так что он примерно удваивается в размерах. Парафильм должен быть достаточно тонким, чтобы комары могли легко пронзить его, но не должно быть утечек. Печать над внешней поверхностью крышки винта, чтобы полностью покрыть отверстие и установить крышку в сторону.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы увеличить привлекательность для Glytube, до растяжения парафильма, духи его с человеческим запахом, мягко потирая его на участок человеческой кожи без косметики применяется, заботясь о том, чтобы не отверстия создаются. Это рекомендуется, если эксперимент не направлен на изучение сенсорных сигналов, необходимых для комаров, чтобы приблизиться к трапезе. - Нагрейте как запечатанную трубку глицерола, так и муку (со всеми компонентами, кроме АТФ) в водяной бане 42-45 градусов по Цельсию в течение по крайней мере 15 минут. Не нагревать АТФ; добавить его непосредственно перед началом эксперимента.
- Добавьте АТФ в разогретую еду и вихрь тщательно. Pipette 2 мл разогретой еды во внутреннюю камеру винтовой крышки и аккуратно поместите в нее перевернутую, подогретую, заполненную глицеролом 50 мл коническую трубку. Частично винт крышку с едой на глицерол заполненные трубки-как раз достаточно, чтобы предотвратить утечку еды или глицерол.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем используемой еды может варьироваться от 1 мл до 2,5 мл. Более низкие объемы могут быть особенно полезны, когда блюда используются для доставки соединений, которые являются дефицитными или дорогими. Важно быстро работать на этом этапе, чтобы еда не остыла до температуры окружающей среды и не уменьшала вероятность максимального кормления. Скорость охлаждения будет зависеть от температуры окружающей среды в помещении, где проводятся эти шаги, но они, как правило, должны быть завершены в течение 5 минут при температуре 25 градусов по Цельсию. - Поместите собранный Glytube поверх контейнера с комарами и позвольте комарам получить доступ к кормам в течение по крайней мере 15 минут для достижения максимальной ставки кормления.
- Для оптимального кормления поместите контейнеры с комарами в камеру,оборудованную прокладкой CO 2, и до доставки еды допускают не менее 15 минут акклиматизации при 25–28 градусах Цельсия и 70–80% влажности. Камера анализа, используемая здесь, является простой и недорогой модификацией ранее опубликованной установки16. Он использует полупрозрачную полипропиленовую коробку для хранения размером 36 см × 31 см × 32 см H со съемной крышкой. Отверстие диаметром 1,5 см, сделанное в стене камеры, позволяетдоставка CO 2 через силиконовые трубки. Диффузионная прокладка CO 2 прикреплена к внутреннему центру крышки для доставки очищенного воздуха и CO2 для состояния камерной атмосферы во время испытания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что хост сигналы(тепло иCO 2 , с дополнительнымзапахом хозяина 16) присутствуют так, что комары привлекают мембраны подачи. Если комары не скучены под Glytube, убедитесь, что CO2 правильно доставлены и что еда и Glytube достаточно тепло. Если внешний источник CO2 недоступен, CO2 может быть доставлен через клубы выдыхаемого человеческого дыхания. - После кормления, крышка Glytube может быть отброшена в качестве биоопасных отходов или повторно использоваться после замачивания в низком процентном растворе отбеливателя и тщательно полоскания в воде.
3. Количественная оценка потребляемых блюд
- Взвешивание комаров, которые будут использоваться для дальнейших экспериментов
ПРИМЕЧАНИЕ: Взвешивание комаров для количественной оценки размера еды позволяет использовать их для дальнейших живых экспериментов, но этот метод требует измерения веса от группы из 5 комаров. Поскольку вес отдельных комаров трудно точно измерить с помощью большинства лабораторных балансов, изменчивость в индивидуальном размере еды не может быть легко количественно путем измерения веса. Взвешивание рекомендуется только для ситуаций, в которых самки заметно engorge на еду.- Холодные комары обезболивать, перемещая их контейнер в 4 градуса по Цельсию холодной комнате или поместив его на лед.
- Взвешивайте группы из 5 самок из некормленной когорты (т.е. комаров, которые никогда не предлагали еду) и вычисляйте их средний вес в качестве оценки веса «предкормления». Средний вес неосуществимого комара зависит от генотипа, пола и условий воспитания. Unfed самка комаров Ae. aegypti, вырастившими доступ к сахарозе ad libitum, обычно весит около 2 мг каждый.
- Из экспериментальной когорты (т.е. комаров, которые были предложены еды), сортировать самок в "кормили" и "не кормили" сваи на основе брюшной дистензии наблюдаетсяглаз 7. Разделите каждую из «кормили» и «не кормили» сваи, соответственно, на группы по 5 комаров для взвешивания. Комары в каждой группе по 5 должны быть получены из одной и той же экспериментальной когорты для групповых измерений веса. Рассчитайте средний вес на одну самку с каждой из «кормили» и «не кормили» груды экспериментальной группы.
- Измерение флуоресценции для анализа конечных то пойнтов7,27,34
ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения точных измерений размера еды от отдельных комаров, которые больше не требуются для дальнейших живых экспериментов, храните комаров и оставшиеся 1 мл еды, содержащей 0,002% флуоресцентаина при -20 градусов по Цельсию сразу после кормления. Эксперимент можно приостановить здесь. Этот метод изложен в Рисунок 2.- Для создания эталонной стандартной кривой подготовьйте серийное разбавление той же еды, содержащей флуорессейн 0,002%, который был предложен экспериментальной группе комаров. Там будет в общей сложности 8 стандартных решений кривой. В каждом из этих решений, окончательный объем еды, содержащей 0,002% флуорессейна будет 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,3125, 0.15625, 0.078125, или 0 хл, и каждый будет в 1x фосфат-буферный солевой раствор (PBS) для общего объема 100 йл (например, 5 мл еды, содержащей 0,002% фторсейна в 95 МЛ 1x PBS).
- Чтобы сделать первое решение стандартной кривой, добавьте 50 йл еды, содержащей 0,002% фторсейна, до 950 МКЛ 1x PBS и вихря тщательно (окончательный объем: 5 йл еды, содержащей 0,002% флуорескейна в 95 МКЛ 1x PBS). Чтобы сделать остальные стандартные решения кривой, выполните 2-кратное разбавление для каждого шага, взяв 500 МКЛ из предыдущей трубки и добавив его в новую трубку, содержащую 500 МКЛ 1x PBS. Vortex задолго до подготовки следующего 2-кратного разбавления.
- Для подготовки скважин, которые будут использоваться для генерации эталонной стандартной кривой, пипетка 100 МКЛ каждого из стандартных решений кривой в каждой из 8 скважин в первой колонке 96-хорошо ПЦР пластины. Добавьте 1 неосуществимый контрольный комар к каждой из тех же 8 скважин в первом столбце пластины. Повторите во втором столбце пластины для измерения репликации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если экспериментальным группам предлагаются различные типы блюд, для каждого типа приема пищи должна быть подготовлена отдельная стандартная кривая. - Добавьте 100 МКЛ 1x PBS в каждом оставшемся хорошо для unfed контроля и экспериментальных групп. Если ткань должна быть нарушена в последующих шагах с помощью гомогенизатора бисерной мельницы или вихря, добавьте один 3 мм борозиликат твердого стекла шарик для каждой хорошо.
- В качестве отрицательного контроля добавьте по 1 неосуществимому комару в каждую колодец в следующих 2 столбцах пластины. Флуоресценция, измеренная в этой группе, устанавливает базовое отрезание для учета аутофторесценции тканей и будет использоваться для определения того, питался ли комар в экспериментальной группе приемом пищи.
- Добавьте 1 комара на колодец в оставшиеся колодцы из экспериментальных групп, которые были предложены питание.
- Печать пластины тщательно и нарушить ткани ручной шлифовки. Брюшко должно быть тщательно однородно, чтобы освободить еду. Методы для того чтобы нарушить ткань вклюают использование гомогенизатора мельницы шарика шарика с 3 mm borosilicate твердо-стеклянными бусинами (30 Гц на 30 секунд), смеситель вихря с 3 мм borosilicate твердо-стеклянные шарики, или молотька пестика без шарика.
- Центрифуга пластины при 2000 об/мин в течение 1-2 минут, чтобы собрать лизат.
- Подготовка черный 96-хорошо пластины с 180 йл 1x PBS в каждой хорошо.
- Передача 20 йл лисата в каждый колодец с 180 МКЛ 1x PBS и перемешать. При наличии, используйте многоканайный пипетки на этом этапе для увеличения скорости и лучшей согласованности.
- Измерьте интенсивность флуоресценции каждой системы с помощью считывателя пластин на канале возбуждения/выброса 485/520. Создайте стандартную кривую, напланив известный объем еды на основе соответствующего измерения интенсивности флуоресценции.
- Используя стандартную кривую, экстраполировать объем еды, поглатываемый каждым из экспериментальных групповых комаров. Вычесть средний показатель интенсивности флуоресценции отрицательной контрольной группы нефed комаров из флуоресценции интенсивности чтения каждой экспериментальной группы отдельных исправить для базовой ткани аутофторесценции.
Representative Results
На рисунке 1 представлена схема сборки Glytube, в то время как на рисунке 2 показан обзор экспериментального дизайна для измерения размера еды с использованием анализа на основе флуоресценции, описанного здесь. Рисунок 3 обеспечивает репрезентативные измерения размера флуорессейна в ходе эксперимента по кормлению крови. Рисунок 4, рисунок 5, и рисунок 6 иллюстрируют выборку биологических вопросов, которые могут быть решены с помощью этого протокола. Применение протокола является широким и включает в себя изменение состава еды крови, кормление фармакологическими соединениями, точную количественную оценку неоптимальных блюд крови или меньших нектарных блюд, а также сравнение поведения кормления по генотипам комаров.
Для создания стандартной кривой для расчетов объема еды, флуоресценции показания построены из назначенных эталонных скважин каждый, содержащий unfed комаров и известный объем еды с 0,002% флуорессейна (Рисунок 3A). Показания флуоресценции из оставшихся колодцев, которые содержат комаров либо из отрицательной контрольной группы неплодобряющих комаров, либо из экспериментальной группы комаров, которым предлагается еда, сравниваются с этой стандартной кривой для количественной оценки объема еды (ОЛ), потребляемой каждым комаром(рисунок 3B). Для проверки базовых показаний в этом анализе, следует подтвердить, что комары из unfed отрицательной контрольной группы не назначаются положительное значение потребленияйЛ (рисунок 3B, слева). Хотя все женщины в экспериментальной группе были предложены крови еды, некоторые комарыкормили (рисунок 3B, средний), а некоторые нет (Рисунок 3B, право). Этот результат показывает, что из этого протокола можно получить два типа данных: 1) процент от общего числа женщин, питаемых тем или иным приемом пищи, и 2) объем, поглатываемый самками, которые питаются тем или иным приемом пищи.
Этот протокол может быть использован для доставки и количественной оценки блюд с различными составами белков. Рисунок 4A,B показывает данные, собранные с использованием блюд с добавлен флуоресхейном. Доля комаров, которые кормили и объем еды они попадает, соответственно, были рассчитаны из показаний флуоресценции. Эти показания являются весьма чувствительными и позволяют точной количественной оценки йЛ, но имеют ограничение, что комары не могут быть использованы для будущих живых экспериментов. Рисунок 4C,D показывают данные, собранные в ходе независимого эксперимента с комарами, которые были забиты как кормили или unfed на глаз после того, как они были предложены блюда без флуоресхейна. Размер еды был рассчитан как средний вес/женщина из групп по 5 комаров. Хотя эти измерения веса менее чувствительны, чем измерения флуоресценции, они позволяют женщинам быть восстановлены и использованы для дальнейших живых экспериментов. Доля комаров, которые питаются может варьироваться в различные экспериментальные дни, как это отражено на рисунке 4A и рисунок 4C.
На рисунке 5 показан объем потребляемых блюд, содержащих препараты, которые регулируют поведение комаров, ищущих хозяина. В этих экспериментах, женщины были предложены крови, солевой АТФ, или солевой АТФ питание с 100 МКМ человека NPY Y2 рецептор агонист, TM30338. Этот препарат изменяет поведение хозяина ищет путем активации Ae. aegypti NPY-как рецептор 7. Измерение размеров еды имеет решающее значение для интерпретации экспериментов для оценки влияния этого препарата на поведение после кормления крови, поскольку оно позволяет исследователю рассчитать дозу, потребляемую каждой женщиной.
В предыдущих примерах женщин кормили либо кровью, либо заменой крови, что приводило к приему пищи в 3–5 йл(рисунок 3, рисунок 4, рисунок 5). Этот анализ на основе флуоресценции также может быть использован для измерения меньших и/или более переменных размеров еды, которые не могут быть точно различимы из средних групповых измерений веса. На рисунке 6,тот же протокол количественной оценки флуоресценции был использован для измерения нектара кормления поведение путем обмена Glytube на ватный шарик насыщенный 10% сахарозы, содержащей 0,002% флуоресцентного. Нектар сахара не могут быть представлены в анализе Glytube, потому что женщины не могут обнаружить наличие сахара нектара с stylet и не инициироватькормление 27. Эти данные позволяют исследователю определить, что сахар питание последовательно меньше, чем кровь питание, в согласии спредыдущей работой 34 (рисунок 6).
Рисунок 1: Настройка метода Glytube, используемого для кормления комаров. (A)Схема деконструкции Glytube используется для подачи крови и других блюд для комаров. (B)Схема Glytube представлена на вершине контейнера комаров с крышкой сетки. Самки комаров могут прокалывать крышку сетки, чтобы покормить. (C) Фотографии Glytube (вверху), и самки комаров Aedes aegypti до, во время и после кормления (внизу, слева направо) на Glytube доставлены еды. Комары показаны пирсинг через сетку, покрывающую их контейнер для доступа к мембранной подачи. (D) Фотографии, показывающие появление самок комаров Ae. aegypti, которые не имеют (слева) и которые имеют engorged либо искусственной еды крови (справа, сверху) или солевой й АТФ еды (справа, снизу). Метод Glytube был ранее опубликован в Costa-da-Silva et al. (2013)20. Фотографии в( C) и (D) любезно Алекс Уайлд. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Схема того, как количественно размер еды после Glytube протокол кормления крови. (A) Комары предлагаются питание с флуорессейном (вверху, экспериментальная группа) или нет еды (внизу, unfed отрицательной контрольной группы). (B)Индивидуальные комары добавляются в 96-хорошо пластины после прекращения кормления эксперимента. (C)Стандартная кривая генерируется с использованием известных количеств еды, содержащей 0,002% флуоресцентного. (D) Комары гомогенизированы, чтобы освободить любой потребляемый флуоресцентный, и уровни флуоресценции в каждой хорошо количественно с помощью считывателя пластин. Этот метод количественной оценки флуоресценции модифицировался из Liesch et al. (2013)34. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Эксперимент по кормлению крови Glytube с количественной оценкой на основе фторсейна. (A) Стандартные измерения кривой, полученные из скважин, где комар из unfed контрольной группы был добавлен к известному количеству еды, содержащей 0,002% флуорессейна (шкала оси - произвольные единицы). (B) Объем еды, рассчитанный с использованием показаний флуоресценции для женщин в некормленной контрольной группе (слева, черный, n No 40), экспериментальная группа, которая питалась кровью (средняя, красная, n No 37), и экспериментальная группа, которая не питалась кровью (справа, красный, n No 23). Каждая точка представляет собой измерение от отдельной женщины. Данные отображаются как медианные с диапазоном. Буквы указывают статистически различные группы, тест Крускаль-Уоллис с множественным сравнением Данна, p'lt;0.01. Эти данные были опубликованы в Jovе et al. (2020)27. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Количественная оценка блюд с различным составом белка. Самкам предлагались блюда либо из овечьей крови (красная), искусственной крови с белками крови человека (Коган (1990)22) (оранжевый), либо без белка солевого раствора и еды АТФ (аква)7. (A) Процент женщин кормили забил с помощью флуоресценции чтения. Каждая точка представляет собой группу из 12-16 женщин. Данные отображаются как медианы с диапазонами, n No 12. (B)Объем питания, рассчитанный с использованием показаний флуоресценции. Каждая точка представляет собой измерение от отдельной женщины в одном испытании с рисунка 4A. Данные отображаются как медианы с диапазонами, n No 12. (C)Процент самок полностью engorged после искусственного кормления мембраны, забил глаз. Каждая точка представляет процент женщин, engorged из групп 20-30 женщин. Данные отображаются как медианы с диапазонами, n No 23. (D) Размеры еды забил, как вес / женщина после кормления статус был забит глазом. Вес рассчитывался как среднее число групп из 5 комаров. Данные отображаются как медианы с диапазонами, n No 23. A-D: Письма указывают статистически различные группы, тест Kruskal-Wallis с множественным сравнением Данна, p'lt;0.05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Количественная оценка блюд с фармакологическими соединениями. Самки потребляют блюда такого же размера овечьей крови (красный), солевой атФ (аква), а солевой АТФ - 100 МКМ дозы агониста рецепторов NPY Y2 человека TM30338 (темно-синий). Объем питания рассчитывается с использованием показаний флуоресценции. Каждая точка представляет собой измерение от отдельной женщины. Данные отображаются как медианы с диапазонами, n No 12. Буквы указывают статистически различные группы, тест Крускаль-Уоллис с множественным сравнением Данна, p'lt;0.05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Количественная оценка небольших нектарных блюд. (A)Схема анализа нектарного кормления. (B) Объем еды, рассчитанный с использованием показаний флуоресценции для диких самок, предлагал питание либо воды (синий, n No 36) или 10% сахарозы (зеленый, n No 53), каждый с 0,002% флуоресценции, в нектар кормления анализа. Каждая точка представляет собой измерение от отдельной женщины. Данные отображаются как медианы с диапазонами. Письма указывают статистически различные группы, тест Манн-Уитни, p'lt;0.05. Эти данные были опубликованы в Jovе et al. (2020)27. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Искусственное питание крови | |||
| Концентрация стокового раствора (мг/мЛ) | Объем стокового раствора в еде (L/mL) | Окончательная концентрация еды (мг/мЛ) | |
| Белковые компоненты | |||
| γ-Глобулины | 50 | 300 | 15 |
| Гемоглобина | 35 | 230 | 8 |
| Альбумина | 300 | 340 | 102 |
| Всего белка | - | - | 125 |
| Небелковые компоненты | |||
| Концентрация стокового решения (mM) | Объем стокового раствора в еде (L/mL) | Окончательная концентрация еды (mM) | |
| Nacl | В γ-глобулин | - | 5-10 |
| НаХКО3 | В γ-глобулин | - | 120 |
| Atp | 200 | 5 | 1 |
| Вода | - | 125 | - |
| «Белковые компоненты готовятся в складном растворе двойной дистиллированной воды, за исключением γ-глобулинов, которые растворяются в 400 мМ NaHCO3 и включают в себя переменное количество NaCl (2-4%) в продукте. | |||
Таблица 1: Рецепт приготовления искусственных блюд крови (адаптирован из Когана (1990)22). Искусственная кровь состоит из белковых и небелковых компонентов, регулярно встречаясь в крови человека, и дает возможность изменять соотношения этих компонентов. Комары могут производить яйца после кормления искусственнойкровью 7,22.
| Соленая еда | |||
| Компонент | Концентрация стокового решения (mM) | Объем стокового раствора в еде (L/mL) | Окончательная концентрация еды (mM) |
| Nacl | - | - | - |
| НаХКО3 | 400 | 300 | 120 |
| Atp | 200 | 5 | 1 |
| Вода | - | 695 | - |
Таблица 2: Рецепт солевой муки с АТФ (адаптирован из Дюваль и др. (2019)7). Белковые солевые блюда могут быть использованы для доставки соединений, представляющих интерес для комаров в то же время имитируя брюшной дистензии, что происходит после кровопосадки, но без запуска развития яйцеклетки, что происходит, когда белки попадает.
Discussion
Для многих лабораторных применений, искусственные мембранные фидееры предлагают различные преимущества по сравнению с живыми хозяевами, позволяя исследователям возможность непосредственно манипулировать содержанием еды. Хотя несколько методов доступны для искусственного мембранного кормления, метод, описанный здесь предлагает преимущества в гибкости, стоимости и пропускной способности. По сравнению с другими коммерческими мембранными кормушками, анализ Glytube требует небольшого объема еды, что делает его эффективным механизмом доставки дорогостоящих реагентов, включая лекарства или патогенные микроорганизмы, путем минимизации общего объема,необходимого 7,35. По мере того как и протеин-свободно солевой и искусственная еда крови способствуют engorgement, соединения или патогены можно добавить к любой еде как high-throughput и неинвазивная алтернатива к инъекциям. Кроме того, каждый компонент Glytube можно легко мыть, заменять или масштабировать для доставки и количественной оценки нескольких типов еды без перекрестного загрязнения аппарата питания.
Для количественной оценки объемов еды, потребляемой комарами, метод на основе флуоресценции позволяет более точно определить размер еды, чем взвешивание комаров до и после кормления. Следует отметить, что данный метод является анализом конечных токов. В отличие от этого, взвешивание позволяет комаров, чтобы сохранить в живых для дальнейших экспериментов. С помощью считывателя пластин метод на основе флуоресценции может быть легко расширен для высокой пропускной способности количественной оценки блюд, потребляемых сотнями отдельных женщин.
Для достижения высоких показателей кормления, сочетание достаточного принимающей сигналы должны присутствовать, чтобы активировать женский принимающей поведение и привлечь женщин к кормушки. Если комары не скучены под Glytube, еда не может быть должным образом нагревается, или CO2 доставка не может быть достаточно. Добавление человеческого запаха к поверхности мембраны надежно повышает привлекательность искусственной мембраны. Если комары наблюдаются под Glytube, но не в состоянии кормить, состав еды может быть виноват. Самки не могут кормить, если сама еда не теплая, кровь слишком старая, или если добавки к трапезе по своей сути аверсивны или вызывают нежелательнуюхимическую реакцию 36. Дополнительный АТФ также надежно увеличивает показатели кормления и может быть увеличен до конечной концентрации 2 мМ в каждом из предусмотренных рецептов. Самки не могут кормить, если парафильм не вытащил тугой через крышку Glytube; парафильм должен быть равномерно прозрачным и не должен пряжки, так как это предотвращает женщину от возможности эффективно проколоть parafilm с ее stylet. Если еда протекает через Glytube на сетку, парафильм может быть разорван во время процесса растяжения и должен быть заменен.
Изменение состава еды также может позволить исследователям манипулировать продолжительностью времени, необходимого для очищения еды от midgut, а также последующим поведением, ищущим хозяина. Блюда, представленные здесь требуют 24-36 ч дляпищеварения 7 похож на животных полученных крови. После кормления на любой из этих приемов пищи, женщины будут подавлять хост-поиск во время пищеварения время окна. Так как солевой еды не хватает белка, женщины возвращаются к хозяину ищет после еды очищается. Если более быстрое возвращение желательно, исследователи могут выбрать альтернативные "быстрой очистки" солевые блюда, которые выделяются примерно в 6 ч27. В то время как состав солевой муки, представленной здесь, сравнивается с результатами искусственной крови, «быстрая очистка» еды более тесно соответствует физиологическим уровням соли, обнаруженным в крови позвоночных.
Методы, описанные здесь, имеют ограничения, которые следует рассмотреть, прежде чем выбрать анализ, который наиболее подходит для экспериментальных целей исследователя. Описанные измерения флуоресцента не позволяют снова использовать комаров для дополнительных экспериментов. Тем не менее, измерения веса могут быть приняты до количественной оценки размера еды с использованием флуоресксейна анализа. Если вес и размер еды являются последовательными в нескольких испытаниях для данного приема пищи, вес может быть использован в качестве прокси в будущих экспериментах. Кроме того, в этом протоколе не проводится различия между дефицитом в поиске хозяина и поведением, питающиеся кровью; комары, которые показывают нарушения в поиске мембраны подачи будет иметь снижение уровня кормления и / или размер еды. Добавив камеру для записи поведения на протяжении всего анализа, исследователи могут определить, не могут ли самки найти Glytube, или же они находят Glytube, но не питаются.
Анализ, описанный здесь, может быть адаптирован для изучения многих нерешенных вопросов, связанных с поведением кормления у комаров. Например, вклад конкретных белков крови можно исследовать путем изменения соотношения составных белков или общей концентрации белка в искусственной крови. Для оценки размеров еды из нескольких событий кормления, красители с различными спектрами флуоресценции могут быть добавлены, чтобы отличить питание от уникальныхисточников 37. Этот протокол также может быть изменен, чтобы отдельно стимулировать внутренние ротовые части, которые обнаруживают кровь и которые используются для приема внутрь (т.е. stylet), и хемосенсорные придатки, которые контактируют с кожей (т.е. лабий, ноги), как комар земли, чтобы начатькормление крови 36. Например, если лиганды добавляются непосредственно в трапезу, они не контактировать с лабием и ногами, так как мембрана пронзается только stylet. Если лиганды добавляются на внешнюю поверхность парафильма вместо этого, они остаются отделенными от еды и могут связаться с лабием иногами 36. Наконец, подробные кинетики крови кормления поведение не очень хорошо изучены и метод, представленный здесь может быть изменен, чтобы объединить высокое разрешение отслеживания с машинным обучением инструменты для извлечения поведенческих считывания передвижения, осанки и кормлениядинамики 38.
Этот протокол направлен на то, чтобы быть удобным и экономически эффективным, с возможностью служить исследователям, использующим фармакологические и генетические манипуляции для изучения комаров, кормящих кровью и после кормления крови поведения.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим Нипуна Басрера, Адриану К. Росас Вильегас, Надава Шай и Тревора Сорреллса за комментарии к рукописям, а Чжуньяна Гонга и Киролоса Барсума — за техническую помощь. Мы благодарим Алекса Уайлда за фотографии, использованные на рисунке 1. К.В. был поддержан стипендией Boehringer Ingelheim Fonds PhD. В.Я. частично поддержал NIH T32-MH095246. Эта работа была частично поддержана грантом Рокфеллеровского университета от Медицинского института Говарда Хьюза через стипендию Джеймса Х. Гиллиама для программы Advanced Study для V.J. Данный материал основан на работе, поддерживаемой Программой стипендий Национального научного фонда в рамках гранта No. NSF DGE-1325261 до В.Я. Любые мнения, выводы и выводы или рекомендации, выраженные в этом материале, являются мнениями автора (ы) и не обязательно отражают точку зрения Национального научного фонда.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 3 mm diameter borosilicate solid-glass bead | MilliporeSigma | Z143928 | For use for bead mill homogenizer; not required if using pellet pestle grinder |
| 32 oz. high-density polyethylene (HDPE) plastic cup | VWR | 89009-668 | Example mosquito container used for feeding assays shown; alternate options can be used |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 96-well black polystyrene plate | ThermoFisher | 12-566-09 | |
| 96-well PCR plate sealing film | Bio-Rad | MSB1001 | Alternate options can be used |
| 96-well PCR plates | Bio-Rad | HSP9621 | Alternate options can be used |
| Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | MilliporeSigma | A6419 | |
| Albumin (human serum) | MilliporeSigma | A9511 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213 | Alternate options can be used to block light entering fluorescein container |
| Balance | Fisher Scientific | 01-911 | Alternate options can be used |
| Bead mill homogenizer | Qiagen | 85300 | Not required if using pellet pestle grinder |
| Cotton ball | Fisher Scientific | 22456880 | For nectar-feeding; alternate options can be used |
| Defibrinated sheep blood | Hemostat Laboratories | DSB100 | Alternate options can be used |
| Drosophila CO2 fly pad | Tritech Research | MINJ-DROS-FP | Alternate options can be used |
| Fluorescein | MilliporeSigma | F6377 | |
| Fluorescence plate-reader | ThermoFisher | VL0000D0 | Alternate options can be used |
| Gamma-globulin (human blood) | MilliporeSigma | H7379 | |
| Glycerol | MilliporeSigma | G7893 | |
| Hemoglobin (human) | MilliporeSigma | G4386 | |
| Laboratory wrapping film - parafilm | Fisher Scientific | 13-374 | |
| Magnetic stirrer | Fisher Scientific | 90-691 | Alternate magnetic stirrers can be used |
| Microcentrifuge for 96-well plate | VWR | 80094-180 | Alternate options can be used |
| Microcentrifuge Tubes | MilliporeSigma | 2236412 | Alternate options can be used |
| Pellet pestle grinder | VWR | KT749521-1500 | Not required if using bead mill homogenizer |
| Phosphate buffered solution (PBS) | Fisher Scientific | BW17-516F | Optional |
| Razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | Alternate options can be used, such as a lathe for better consistency of cutting |
| Rubber bands | |||
| Silicone tubing | McMaster Carr | Needed if using a fly pad for CO2 delivery | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | S233 | |
| Sodium chloride (NaCl) | MilliporeSigma | S9888 | |
| Stir bars | Fisher Scientific | 14-512 | Alternate magnetic stir bars can be used |
| Translucent polypropylene storage box with removable lid | Example box used for feeding assays shown | ||
| Vortex mixer | |||
| Water bath | Alternate heating device may be used | ||
| White 0.8 mm polyester mosquito netting | American Home & Habit Inc. | F03A-PONO-MOSQ-M008-WT | Alternate options can be used |
References
- Bhatt, S., et al. The global distribution and burden of dengue. Nature. 496 (7446), 504-507 (2014).
- Rogers, D. J., Wilson, A. J., Hay, S. I., Graham, A. J. The global distribution of yellow fever and dengue. Advances in Parasitology. 62 (05), 181-220 (2006).
- Chouin-Carneiro, T., et al. Differential susceptibilities of Aedes aegypti and Aedes albopictus from the Americas to Zika virus. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (3), (2016).
- Guerbois, M., et al. Outbreak of Zika virus infection, Chiapas State, Mexico, 2015, and first confirmed transmission by Aedes aegypti mosquitoes in the Amercias. Journal of Infectious Diseases. 214 (9), 1349-1356 (2016).
- Weaver, S. C., et al. Zika virus: history, emergence, biology, and prospects for control. Antiviral Research. 130, 69-80 (2016).
- Attardo, G. M., Hansen, I. A., Raikhel, A. S. Nutritional regulation of vitellogenesis in mosquitoes: implications for anautogeny. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 35 (7), 661-675 (2005).
- Duvall, L. B., Ramos-Espiritu, L., Barsoum, K. E., Glickman, J. F., Vosshall, L. B. Small-molecule agonists of Ae. aegypti neuropeptide Y receptor block mosquito biting. Cell. 176 (4), 687-701 (2019).
- Dimond, J. B., Lea, A. O., Hahnert, W. F., DeLong, D. M. The amino acids required for egg production in Aedes aegypti. The Canadian Entomologist. 88 (2), 57-62 (1956).
- Guerrero, D., Cantaert, T., Missé, D. Aedes mosquito salivary components and their effect on the immune response to arboviruses. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 1-11 (2020).
- Raquin, V., Lambrechts, L. Dengue virus replicates and accumulates in Aedes aegypti salivary glands. Virology. 507, 75-81 (2017).
- Farjana, T., Tuno, N. Multiple blood feeding and host-seeking behavior in Aedes aegypti and Aedes albopictus (diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 50 (4), 838-846 (2013).
- Scott, T. W., Takken, W. Feeding strategies of anthropophilic mosquitoes result in increased risk of pathogen transmission. Trends in Parasitology. 28 (3), 114-121 (2012).
- Ross, P. A., Lau, M. J., Hoffmann, A. A. Does membrane feeding compromise the quality of Aedes aegypti mosquitoes. PLoS ONE. 14 (11), 1-19 (2019).
- Ross, P. A., Axford, J. K., Richardson, K. M., Endersby-Harshman, N. M., Hoffmann, A. A. Maintaining Aedes aegypti mosquitoes infected with wolbachia. Journal of Visualized Experiments. 2017 (126), 1-8 (2017).
- Briegel, H., Hefti, M., DiMarco, E. Lipid metabolism during sequential gonotrophic cycles in large and small female Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 48 (5), 547-554 (2002).
- McMeniman, C. J., Corfas, R. A., Matthews, B. J., Ritchie, S. A. S., Vosshall, L. B. Multimodal integration of carbon dioxide and other sensory cues drives mosquito attraction to humans. Cell. 156 (5), 1060-1071 (2014).
- Pakes, S. P., et al. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , National Academic Press. Washington, DC, USA. (2011).
- Deng, L., Koou, S. Y., Png, A. B., Ng, L. C., Lam-Phua, S. G. A novel mosquito feeding system for routine blood-feeding of Aedes aegypti and Aedes albopictus. Tropical Biomedicine. 29 (1), 169-174 (2012).
- Gunathilaka, N., Ranathunge, T., Udayanga, L., Abeyewickreme, W. Efficacy of blood sources and artificial blood feeding methods in rearing of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) for sterile insect technique and incompatible insect technique approaches in Sri Lanka. BioMed Research International. 2017, 3196924 (2017).
- Costa-da-Silva, A. L., et al. Glytube: a conical tube and parafilm M-based method as a simplified device to artificially blood-feed the Dengue vector mosquito, Aedes aegypti. PLoS ONE. 8 (1), 53816 (2013).
- Carvalho, D. O., et al. Mass production of genetically modified Aedes aegypti for field releases in Brazil. Journal of Visualized Experiments. 83 (83), 1-10 (2014).
- Kogan, P. H. H. Substitute blood meal for investigating and maintaining Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 27 (4), 1-4 (1990).
- Gonzales, K. K., Hansen, I. A.
- Baughman, T., et al. A highly stable blood meal alternative for rearing Aedes and Anopheles mosquitoes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (12), 0006142 (2017).
- Galun, R. Feeding stimuli and artificial feeding. Bulletin of the World Health Organization. 36, 590-593 (1967).
- Galun, R. Feeding response in Aedes aegypti: stimulation by adenosine triphosphate. Science. 142, 1674-1675 (1963).
- Jové, V., et al. Sensory Discrimination of Blood and Floral Nectar by Aedes aegypti Mosquitoes. Neuron. 108, 1-18 (2020).
- Petersen, M. T., et al. The impact of the age of first blood meal and Zika virus infection on Aedes aegypti egg production and longevity. PLoS ONE. 13 (7), 1-15 (2018).
- Sissoko, F., et al. Frequent sugar feeding behavior by Aedes aegypti in Bamako, Mali makes them ideal candidates for control with Attractive Toxic Sugar Baits (ATSB). PLoS ONE. 14 (6), 0214170 (2019).
- Houseman, J. G., Downe, A. E. R. Methods of measuring blood meal size and proteinase activity for determining the effects of mated state of digestive processes of female Aedes aegypti (L.) (Diperta: Culicidae). The Canadian Entomologist. 18, 241-248 (1986).
- Redington, B. C., Hockmeyer, W. T. A method for estimating blood meal volume in Aedes aegypti using a radioisotope. Journal of Insect Physiology. 22 (7), 961-966 (1976).
- Gonzales, K. K., et al. The effect of SkitoSnack, an artificial blood meal replacement, on Aedes aegypti life history traits and gut microbiota. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
- Klowden, M. J. The endogenous regulation of mosquito reproductive behavior. Experientia. 46 (7), 660-670 (1990).
- Liesch, J., Bellani, L. L., Vosshall, L. B. Functional and genetic characterization of neuropeptide Y-like receptors in Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (10), 22486 (2013).
- Frances, S. P., Sithiprasasna, R., Linthicum, K. J. Laboratory evaluation of the response of Aedes aegypti and Aedes albopictus uninfected and infected with Dengue virus to Deet. Journal of Medical Entomology. 48 (2), (2011).
- Dennis, E. J., Goldman, O. V., Vosshall, L. B. Aedes aegypti mosquitoes use their legs to sense DEET on contact. Current Biology. 29 (9), 1551-1556 (2019).
- Harrington, L. C., et al. Heterogeneous feeding patterns of the Dengue vector, Aedes aegypti, on individual human hosts in rural Thailand. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (8), 3048 (2014).
- Hol, F. J., Lambrechts, L., Prakash, M. BiteOscope, an open platform to study mosquito biting behavior. eLife. 9, 1-24 (2020).
