Summary
Målet med detta protokoll är att leverera animaliska och konstgjorda blodmåltider till Aedes aegypti myggor genom en konstgjord membranmatare och exakt kvantifiera volymen av mjöl som intas.
Abstract
Kvinnor av vissa myggarter kan sprida sjukdomar medan biter ryggradsdjur värdar för att få proteinrika blodmåltider som krävs för äggutveckling. I laboratoriet kan forskare leverera animaliska och konstgjorda blodmåltider till myggor via membranmatare, vilket möjliggör manipulering av måltidssammansättning. Här presenterar vi metoder för att mata blod och konstgjorda blodmåltider till Aedes aegypti myggor och kvantifiera volymen som konsumeras av enskilda honor.
Riktad utfodring och kvantifiering av konstgjorda / blodmåltider har breda användningsområden, inklusive testning av måltidskomponenternas effekter på myggbeteende och fysiologi, leverera farmakologiska föreningar utan injektion och infektera myggor med specifika patogener. Att tillsätta fluoresceinfärgning till måltiden före utfodring möjliggör efterföljande kvantifiering av måltidsstorleken. Måltidsvolymen som konsumeras av myggor kan mätas antingen efter vikt, om honorna ska användas senare för beteendeexperiment, eller genom att homogenisera enskilda honor i 96-brunnsplattor och mäta fluorescensnivåer med hjälp av en plattläsare som en slutpunktsanalys. Kvantifiering av måltidsstorlek kan användas för att avgöra om ändring av måltidskomponenterna förändrar måltidsvolymen som intas eller om måltidskonsumtionen skiljer sig mellan myggstammar. Exakt kvantifiering av måltidsstorleken är också avgörande för nedströmsanalyser, såsom de som mäter effekter på värdattraktion eller fecundity. De metoder som presenteras här kan anpassas ytterligare för att spåra måltidssammanfattning under dagarna eller för att inkludera flera urskiljbara markörer som läggs till olika måltider (som nektar och blod) för att kvantifiera konsumtionen av varje måltid av en enda mygga.
Dessa metoder gör det möjligt för forskare att på egen hand utföra mätningar med hög genomströmning för att jämföra måltidsvolymen som konsumeras av hundratals enskilda myggor. Dessa verktyg kommer därför att vara i stort sett användbara för myggforskare för att svara på olika biologiska frågor.
Introduction
Vi presenterar ett protokoll för utfodring av modifierade blodmåltider till Aedes aegypti myggor med hjälp av en konstgjord membranmatare och exakt mäta måltidsvolymen som konsumeras av varje enskild mygga. Detta protokoll kan flexibelt anpassas för att ändra måltidens innehåll eller för att jämföra måltidsvolymen som konsumeras av olika experimentella grupper av myggor.
Ae. aegypti mygga hotar den globala hälsan genom att sprida patogener som orsakar sjukdomar inklusive gula febern, denguefeber, chikungunya och Zika1,2,3,4,5. Ae. aegypti honor är skyldiga blodmatare; De måste konsumera ryggradsdjur blod för att få det nödvändiga proteinet för äggutveckling, och varje koppling av ägg kräver en full blodmåltid från minst envärd 6,7,8. Den kvinnliga myggan biter först sin värd genom att genomborra huden med sin stylet och injicera saliv, som innehåller föreningar som utlöser värdens immunsvar9. Hon matar sedan genom att pumpa blod genom sin stil i sin midgut. Medan hon konsumerar en blodmåltid från en infekterad värd, kan hon inta blodburna patogener6,8, som sedan migrerar från myggans midgut till hennes salivkörtlar10. Kvinnliga myggor infekterade på detta sätt kan sprida sjukdom genom att injicera patogener tillsammans med saliv när man biter efterföljandevärdar 11,12. Att förstå och kvantifiera mekanismerna för blodmatningsbeteende är avgörande steg för att kontrollera överföringen av myggburna sjukdomar.
Många laboratorieprotokoll för mygguppfödning och experiment använder levande djur inklusive möss, marsvin eller människor som blodkälla13,14,15,16. Användningen av levande djur medför etiska problem samt komplexa krav på personalutbildning, djurhållning och djuromsorhållning samt efterlevnad av IACUC:s (Institutional Animal Care and Use Committee) politik. Det begränsar också de typer av föreningar som kan levereras till myggor, vilket begränsar de studier som kan utföras17.
Konstgjorda blodmatningsapparater, som vanligtvis använder ett membransystem för att simulera värdhud, är användbara verktyg för att studera blodmatningsbeteenden som kringgår behovet av underhåll av levande värdar. Helblod kan köpas från ett antal leverantörer och matas till myggor med uppvärmda, vattenmantlade konstgjorda membranmatare eller liknandeenheter 18,19. I detta protokoll demonstrerar vi användningen av små, engångsmembranmatare som kallas "Glytubes". Denna membranmatare, tidigare publicerad av Costa-da-Silva et al. (2013)20, kan enkelt monteras från standard laboratorieutrustning, vilket gör den idealisk för att leverera blodmåltider till måttligt antal myggor och enkelt att skala upp för att testa större grupper eller flera måltidsformuleringar. Glytube är ett billigt och effektivt alternativ till andra kommersiella konstgjorda matare, vilket kan kräva större måltidsvolymer och är mer lämpliga för batchmatning av stora grupper av myggor på en enda måltidsformulering21.
Detta protokoll innehåller två avsnitt: förbereda/leverera konstgjorda måltider och kvantifiera konsumtionen. I det första avsnittet används Glytubes som ett effektivt sätt att leverera manipulerade dieter. Helblod kan ersättas med en helt konstgjord måltid för att jämföra effekterna av blodsubstitut i stället för en blodmåltid. Ett recept anpassat från Kogan (1990)22 presenteras här, även om flera konstgjorda måltidsformuleringar har utvecklats23,24. Dessutom är utfodring en mindre invasiv och mindre mödosam metod för att införa farmakologiska föreningar än injektion. På grund av den låga totala volymen som krävs för varje måltid (1–2 ml) ger detta protokoll en attraktiv leveransmetod för att minska mängden dyra reagenser. Ae. aegypti honor konsumerar lätt proteinfria måltider av saltlösning med adenosin 5′-tripfosfat (ATP)25,26, vilket ger en baslinje för att mäta effekterna av single meal komponenter. Till exempel är Neuropeptid Y-liknande receptor 7 (NPYLR7) i Ae. aegypti känd för att medla värdsökande undertryckande efter en proteinrik blodmåltid, och när NPYLR7-agonister läggs till en proteinfri saltlösningsmåltid uppvisar kvinnliga myggor värdsökande undertryckande som liknar dem som har konsumerat helblod7.
I det andra avsnittet presenteras steg för kvantifiering av volymen av varje måltid som konsumeras av en enskild kvinnlig mygga. Denna analys är fluorescensbaserad och fångar utfodringsstatus i högre upplösning än metoder där kvinnor klassificeras som "matade" eller "unfed" baserat på visuell bedömning av enbart bukdistension. Genom att tillsätta fluorescein till måltiden före utfodring kan måltidsvolymer som intas av individer kvantifieras genom att homogenisera varje mygga i en 96-brunnsplatta och mäta fluorescensintensitet som en avläsning. Denna analys kan mäta skillnader i utfodringskraft som svar på variabler som måltidssammansättning eller myggornas genetiska bakgrund. Exakt kvantifiering är avgörande för mellanmålsstorlekar, till exempel när kvinnor erbjuds suboptimala måltider som innehåller foderavskräckningsmedel eller när de konsumerar sackarosmåltider av varierandestorlek 27. Om matade myggor krävs för efterföljande beteendemässiga analyser efter måltidsstorleks kvantifiering, kan måltidsstorleken istället beräknas genom att väga bedövade honor i grupper och uppskatta den genomsnittliga ökade massan per individ. Även om vägningen är mindre exakt än fluoresceinmärkningen ger vägningen fortfarande en aggregerad uppskattning av måltidsvolymen och gör det möjligt att undersöka måltidens inverkan på nedströmsprocesser, såsom fecundity eller efterföljande värdattraktion. Medan blodmjölsstorleken är variabel och kan påverkas av en myriad avfaktorer 11,28,29, intas måltidsstorlekar mätt med de metoder som beskrivs här överensstämmer med tidigare kvantifieringar7,30,31.
Protocol
Blodmatningsförfaranden utfördes inte med levande djur eller mänskliga värdar och följde riktlinjerna från Rockefeller University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) och Institutional Review Board (IRB).
1. Måltidsberedning
- Beredning av fogostimulantia, adenosin 5′-tripfosfat
- Förbered en 25 mM lösning av vattenhaltig NaHCO3 (molekylvikt, MW = 84,006 g/mol). För 100 ml 25 mM NaHCO3,tillsätt 210 mg NaHCO3 till en volymetrisk kolv och fyll med dubbeldestillerat vatten (ddH2O) till en total volym på 100 ml. Blanda lösningen noggrant med hjälp av en magnetisk omrörningsstång tills hela NaHCO3 är upplöst.
- Reconstitute ATP disodium salthydrat (MW = 551,14 g/mol) i vattenhaltiga 25 mM NaHCO3 till en slutlig koncentration på 200 mM ATP. För en total volym på 10 ml 200 mM ATP i 25 mM NaHCO3-buffert, tillsätt 1,1 g ATP disodiumsalthydrat till en volymetrisk kolv och fyll med 25 mM NaHCO3-buffert till en total volym på 10 ml. Blanda lösningen noggrant med hjälp av en magnetisk omrörningsstång tills all ATP är upplöst.
OBS: För att minimera hydrolys av ATP måste den buffras med en saltlösning som NaHCO3. - Aliquot ATP-lösningen och förvara vid -20 °C.
OBS: Denna lagerlösning av ATP görs vanligtvis färsk var sjätte månad och används för alla måltider som beskrivs nedan. För att förhindra nedbrytning bör ATP-alikvoter inte genomgå flera frys-tina-cykler eller värmas upp tillsammans med andra måltidskomponenter.
- Beredning av den fluorescerande spårlösningen, fluorescein
- Förbered en 2% (w/v) stamlösning av vattenhaltigt fluorescein. För en total stamlösningsvolym på 10 ml, blanda 0,2 g fluorescein disodiumsalt med 10 ml ddH2O i ett 15 ml koniskt rör insvept i aluminiumfolie vid rumstemperatur. Denna stamlösning av fluorescein kan användas för utspädning i alla måltider som beskrivs nedan.
OBS: Eftersom fluorescein är ljuskänsligt, undvik exponering för ljus genom att linda behållare i aluminiumfolie.
- Förbered en 2% (w/v) stamlösning av vattenhaltigt fluorescein. För en total stamlösningsvolym på 10 ml, blanda 0,2 g fluorescein disodiumsalt med 10 ml ddH2O i ett 15 ml koniskt rör insvept i aluminiumfolie vid rumstemperatur. Denna stamlösning av fluorescein kan användas för utspädning i alla måltider som beskrivs nedan.
- Beredning av animaliska blodmåltider
- Beräkna antalet måltider som behövs för att mata alla myggor; varje Glytube håller en 2 ml måltid och matar cirka 25 myggor. Förbered ytterligare en måltid för att kalibrera standardkurvan för fluorescensavläsningar. Om inget annat anges beskriver alla steg i detta avsnitt reagensbelopp som krävs för att förbereda en måltid med en slutlig volym på 2 ml.
- För animaliskt framställda blodmåltider, överför 1,98–2 ml defibrinerat fårblod till ett koniskt rör på 15 ml (se steg 3.3 för önskad blodvolym).
OBS: Kommersiellt trotsade källor till ryggradsdjursblod, även från får, marsvin och människor, får användas13. Före användning, se till att det köpta blodet inte har passerat utgångsdatumet och blanda det väl genom att invertera flaskan, särskilt om det finns synlig separation av blodkomponenter. - För optimal utfodring, tillsätt ATP till en slutlig koncentration på 1-2 mM efter att fårblodet har värmts upp till 45 °C i ett vattenbad. För en slutlig koncentration på 1 mM ATP, tillsätt 10 μL av 200 mM ATP-stamlösning till 1,99 ml förvärmt blod och blanda. För en slutlig koncentration på 2 mM ATP, tillsätt 20 μL av 200 mM ATP-beståndet till 1,98 ml förvärmt blod och blanda. Om ATP inte ska tillsättas, värm 2 ml defibrinerat fårblod.
- Om fluorescensbaserad kvantifiering av måltidsstorleken därefter ska utföras, tillsätt fluoresceinlösning till en slutlig koncentration på 0, 002% (2 μL 2% fluoresceinlager i 2 ml total måltidsvolym). Minska blodvolymen med samma mängd som fluorescein tillsatt. Behåll 1 ml av den slutliga måltidsformuleringen som innehåller 0,002% fluorescein för att generera referensstandardkurvan. Behandla den balanserade volymen identiskt med måltiden som levereras till myggor; utsätta för samma ljus- och temperaturförhållanden under hela experimentets varaktighet och därefter frysa detta tillsammans med den levererade måltiden.
- Beredning av konstgjorda blodmåltider
- Beräkna antalet måltider som behövs för att mata alla myggor; varje Glytube håller en 2 ml måltid och matar cirka 25 myggor. Förbered ytterligare en måltid för att kalibrera standardkurvan för fluorescensavläsningar. Om inget annat anges beskriver alla steg i detta avsnitt reagensbelopp som krävs för att förbereda en måltid på 2 ml.
- För att förbereda artificiellt blod (anpassat från Kogan (1990)22), som i tabell 1, gör först en stamlösning på 400 mM NaHCO3. För en total volym på 10 ml 400 mM NaHCO3 (MW = 84,006 g/mol), tillsätt 336 mg NaHCO3 till en volymetrisk kolv och fyll med dubbeldestillerat vatten (ddH2O) till en total volym på 10 ml. Blanda lösningen noggrant med hjälp av en magnetisk omrörningsstång tills hela NaHCO3 är upplöst.
- För proteinkomponenterna i artificiellt blod, bered stamlösningar på 50 mg/ml γ-globuliner i 400 mM NaHCO3,35 mg/ml hemoglobin i ddH2O och 300 mg/ml albumin i ddH2O. Proteinlagerlösningar kan lagras vid 4 °C i upp till 2 månader. Den slutliga koncentrationen av totala humana proteiner i artificiellt blod är 125 mg/ml. Detta inkluderar slutliga koncentrationer av 15 mg/ml γ-globuliner, 8 mg/ml hemoglobin och 102 mg/ml albumin.
- För varje 2 ml måltid, kombinera 600 μL γ-globuliner, 460 μL hemoglobin, 680 μL albumin och 250 μL ddH2O från lagerlösningar noterade i tabell 1. Vänta med att lägga till 10 μL 200 mM ATP-stamlösning tills måltiden har värmts upp till 45 °C, omedelbart innan du presenterar måltiden.
- Om fluorescensbaserad kvantifiering av måltidsstorleken därefter ska utföras, tillsätt fluoresceinlösning till en slutlig koncentration på 0, 002% (2 μL 2% fluoresceinlager i 2 ml total måltidsvolym). Minska volymen av ddH2O i steg 4.4 med samma mängd som fluorescein tillsatt. Behåll minst 1 ml av den slutliga måltidsformuleringen som innehåller 0,002% fluorescein för att generera referensstandardkurvan. Behandla den balanserade volymen identiskt med måltiden som levereras till myggor; utsätta för samma ljus- och temperaturförhållanden under hela experimentets varaktighet och därefter frysa detta tillsammans med den levererade måltiden.
- Beredning av exempel proteinfria saltlösningsmåltider (anpassad från Duvall et al. (2019)7)
OBS: Proteinfria saltlösningsmåltider kan tillagas på flerasätt 7,27,32. Saltlösningsmjölet som presenteras här är en proteinfri version av det konstgjorda blodreceptet som beskrivs ovan.- Beräkna antalet måltider som behövs för att mata alla myggor; varje Glytube håller en 2 ml måltid och matar cirka 25 myggor Förbered ytterligare en måltid för att kalibrera standardkurvan för fluorescensmätningar. Om inget annat anges beskriver alla steg i detta avsnitt reagensbelopp som krävs för att förbereda en måltid på 2 ml.
- För att förbereda saltlösningen, gör en lagerlösning på 400 mM NaHCO3. För en total volym på 10 ml 400 mM NaHCO3 (MW = 84,006 g/mol), tillsätt 336 mg NaHCO3 till en volymetrisk kolv och fyll med ddH2O till en total volym på 10 ml. Blanda lösningen noggrant med hjälp av en magnetisk omrörningsstång tills hela NaHCO3 är upplöst.
- För varje 2 ml måltid, kombinera i ett 15 ml koniskt rör 600 μL på 400 mM NaHCO3 med 1,39 ml ddH2O. Vänta med att lägga till 10 μL av 200 mM ATP-stamlösningen tills efter måltiden har värmts upp till 45 °C i ett vattenbad.
- Om fluorescensbaserad kvantifiering av måltidsstorleken därefter ska utföras, tillsätt fluoresceinlösning till en slutlig koncentration på 0,002% (2 μL 2% fluoresceinlager i 2 ml total måltidsvolym). Minska volymen av ddH2O i steg 5.3 med samma mängd som fluorescein tillsatt. Behåll minst 1 ml av den slutliga måltidsformuleringen som innehåller 0,002% fluorescein för att generera referensstandardkurvan. Behandla den balanserade volymen identiskt med måltiden som levereras till myggor; utsätta för samma ljus- och temperaturförhållanden under hela experimentets varaktighet och därefter frysa detta tillsammans med den levererade måltiden.
2. Måltidsleverans till myggor
- Ställa in myggbehållare för utfodring
OBS: Myggor kan matas i en mängd olika behållare så länge följande kriterier är uppfyllda. Se till att behållaren är tillräckligt stor för myggor att flyga runt i, men inte så stor att det blir svårt för myggorna att hitta nätytan och börja mata. Nätet som används för att täcka behållaren kan variera i material- och hålstorlek. Hålen måste vara tillräckligt stora för att den kvinnliga myggans stil ska genomborras, men inte så stor att myggan kan fly. Säkra nätet ordentligt så att det är spänd, och Glytube kan vila stabilt på sin yta under hela utfodringsperioden.- En exempelbehållare (figur 1) är en modifierad 946 ml (32 oz) högdensitetspolyeten (HDPE) plasthink. För att replikera denna inställning, använd ett rakblad för att skära ett centralt hål med ~ 10 cm diameter i hinklocket. För att montera behållaren för ockupation av myggor, säkra en ~ 400 cm2 kvadratisk bit vit 0,8 mm polyester myggnät ovanpå hinken, säkert trycka det perforerade locket ner över det för att knäppa tätt.
- Samla kvinnliga myggor som är minst 3 dagar efter eclosion för att säkerställa att de är mogna nog att blodfoder. Optimal matningshastighet observeras efter 7 dagar33.
- Placera kvinnliga myggor i behållaren och täck med nät. Om behållaren är tätt befolkad med myggor, öka antalet Glytubes som används. Optimal utfodring uppnås med ~ 25 myggor / Glytube. Detta minskar konkurrensen om tillgången till matningsmembranet.
- Avsätt en kontrollgrupp av oskyddade myggor som inte kommer att erbjudas en måltid. I viktmätningsprotokollet, väg den oavsedda gruppen separat och använd denna vikt för att uppskatta viktökningen i den experimentella gruppen som matade på en måltid. I det fluorescensbaserade kvantifieringsprotokollet lägger du till den oavsedda mygggruppen till brunnarna för standardkurvans beräkningar och för negativa kontroller. För att matcha baslinjen myggvävnad autofluorescens i den experimentella gruppen, se till att standardkurvan och negativa kontrollbrunnar innehåller en oskyddad mygga.
- Byggande och inrättandet av Glytube (anpassad från Costa-da-Silva et al. (2013)20)
- Som avbildas i figur 1, för att generera en värmekälla, fyll ett 50 ml koniskt rör med 40 ml 100% glycerol. Försegla det öppna koniska röret med en 5 cm × 5 cm parafilm och upprepa med ytterligare en bit på 5 cm × 5 cm parafilm för att minimera risken för läckage. Som tillval kan parafilmen hållas på plats med hjälp av gummiband. Vänd röret för att säkerställa att det inte finns några hål eller luckor.
- För att skapa måltidsleveransanordningen, skär ett centrerat hål med 2,5 cm diameter i skruvlocket på det koniska röret med ett vasst rakblad eller, för bättre konsistens, en svarv. Sträck en 5 cm × 5 cm bit parafilm jämnt så att den ungefär fördubblas i storlek. Parafilmen ska vara tunn nog att myggor lätt kan tränga igenom den, men det bör inte finnas några läckor. Täta över skruvlockets yttre yta för att helt täcka hålet och ställ locket åt sidan.
OBS: För att öka attraktionen till Glytube, innan du sträcker parafilmen, parfymera den med mänsklig lukt genom att försiktigt gnugga den på en fläck av mänsklig hud utan kosmetika applicerad, var försiktig så att inga hål skapas. Detta rekommenderas om experimentet inte syftar till att undersöka de sensoriska signaler som krävs för att myggor ska närma sig måltiden. - Värm både det förseglade röret av glycerol och måltiden (med alla komponenter utom ATP) i ett vattenbad på 42–45 °C i minst 15 minuter. Förvärm inte ATP; lägg till den omedelbart innan experimentet påbörjas.
- Tillsätt ATP till den uppvärmda måltiden och virveln noggrant. Pipett 2 ml av den uppvärmda måltiden i skruvlockets inre kammare och placera försiktigt det inverterade, uppvärmda, glycerolfyllda 50 ml koniska röret i det. Skruva delvis locket med måltiden på det glykolfyllda röret - precis tillräckligt för att förhindra läckage av måltiden eller glycerolen.
OBS: Måltidsvolymen som används kan variera mellan 1 ml och 2,5 ml. Lägre volymer kan vara särskilt användbara när måltider används för att leverera föreningar som är knappa eller dyra. Det är viktigt att arbeta snabbt i detta steg så att måltiden inte svalnar till omgivningstemperatur och minskar sannolikheten för maximal utfodring. Kylhastigheten beror på omgivningstemperaturen i rummet där dessa steg utförs, men de bör vanligtvis slutföras inom 5 minuter vid 25 °C. - Placera den monterade Glytube ovanpå myggbehållaren och ge myggorna tillgång till foder i minst 15 minuter för att uppnå maximal utfodringshastighet.
- För optimal utfodring, placera myggbehållare i en kammare utrustad med en CO2-dyna och låt minst 15 minuters acklimatisering vid 25–28 °C och 70–80 % luftfuktighet innan måltiden levereras. Analyskammaren som används här är en enkel och billig ändring av en tidigare publicerad inställning16. Den använder en genomskinlig polypropylen förvaringslåda i storlek 36 cm L × 31 cm W × 32 cm H med ett avtagbart lock. Ett hål med en diameter på 1,5 cm i kammarväggen möjliggör CO2-leverans genom silikonrör. CO2 diffusionsdynan är fäst på lockets inre mitt för leverans av renad luft och CO2 för att konditionera kammarens atmosfär under försöket.
OBS: Se till att värdsignaler (värme och CO2, med valfri värdlukt16) finns så att myggorna lockas till membranmataren. Om myggor inte trängs under Glytube, kontrollera att CO2 levereras korrekt och att måltiden och Glytube är tillräckligt varma. Om en extern CO2-källa inte är tillgänglig kan CO2 levereras via puffar av utandad mänsklig andedräkt. - Efter utfodring kan Glytube-locket kasseras som biologiskt avfall eller återanvändas efter blötläggning i en låg procent blekmedelslösning och sköljs noggrant i vatten.
3. Kvantifiering av konsumerade måltider
- Vägning av myggor som ska användas för ytterligare experiment
OBS: Att väga myggor för att kvantifiera måltidsstorlek gör att de kan användas för ytterligare levande experiment, men den här metoden kräver att man tar viktmätningar från en grupp på 5 myggor. Eftersom vikter av enskilda myggor är svåra att exakt mäta med de flesta laboratoriebalanser, kan variation i individuell måltidsstorlek inte lätt kvantifieras genom att mäta vikter. Vägning rekommenderas endast för situationer där kvinnor synligt engorge på måltiden.- Kallbedövning myggor genom att flytta sin behållare till ett 4 °C kallt rum eller placera den på is.
- Väg grupper på 5 honor från den oskyddade kohorten (dvs myggor som aldrig erbjöds en måltid) och beräkna deras genomsnittliga vikt som uppskattning av "förmatningsvikten". Den genomsnittliga vikten av en unfed mygga beror på genotyp, kön och uppfödningsförhållanden. Unfed kvinnliga Ae. aegypti myggor uppfödda med ad libitum tillgång till sackaros väger vanligtvis cirka 2 mg vardera.
- Från den experimentella kohorten (dvs myggor som erbjöds en måltid), sortera kvinnor i "matade" och "inte matade" högar baserat på bukdistensionen som kan observeras av öga7. Dela var och en av de "matade" och "inte matade" högarna i grupper om 5 myggor för vägning. Myggor inom varje grupp av 5 bör härledas från samma experimentella kohort för att ta gruppviktsmätningar. Beräkna den genomsnittliga vikten per kvinna från var och en av de "matade" och "inte matade" högarna i den experimentella gruppen.
- Fluorescensmätning för slutpunktsanalys7,27,34
OBS: För att få exakta måltidsstorleksmätningar från enskilda myggor som inte längre krävs för ytterligare levande experiment, lagra myggorna och resterande 1 ml måltid som innehåller 0,002% fluorescein vid -20 °C omedelbart efter utfodring. Experimentet kan pausas här. Den här metoden beskrivs i Figur 2.- För att generera en referensstandardkurva, förbered en seriell utspädning av samma måltid som innehåller 0,002% fluorescein som erbjöds den experimentella gruppen myggor. Det kommer att finnas totalt 8 standardkurvlösningar. I var och en av dessa lösningar kommer den slutliga måltidsvolymen som innehåller 0,002% fluorescein att vara 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,3125, 0,15625, 0,078125 eller 0 μL, och var och en kommer att vara i 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för en total volym på 100 μL (t.ex. 5 μL mjöl som innehåller 0,002% fluorescein i 95 μL 1xS).
- För att göra den första lösningen av standardkurvan, tillsätt 50 μL mjöl som innehåller 0,002% fluorescein till 950 μL 1x PBS och virvel noggrant (slutlig volym: 5 μL måltid som innehåller 0,002% fluorescein i 95 μL 1x PBS). För att göra resten av standardkurvlösningarna, utför en 2-faldig utspädning för varje steg genom att ta 500 μL från föregående rör och lägga till det i ett nytt rör som innehåller 500 μL 1x PBS. Virvelbrunn innan du förbereder nästa 2-faldiga utspädning.
- För att förbereda brunnar som ska användas för att generera en referensstandardkurva, pipett 100 μL av var och en av standardkurvlösningarna till var och en av de 8 brunnarna i den första kolumnen på en 96-brunn PCR-platta. Tillsätt 1 unfed kontrollmygga till var och en av samma 8 brunnar i den första kolumnen på plattan. Upprepa i den andra kolumnen på plattan för en replikerad mätning.
OBS: Om experimentella grupper erbjuds olika måltidstyper måste en separat referensstandardkurva beredas för varje måltidstyp. - Tillsätt 100 μL 1x PBS i varje återstående brunn för de oskyddade kontroll- och experimentgrupperna. Om vävnaden ska störas i efterföljande steg med hjälp av en pärlkvarn homogenisator eller virvel, tillsätt en 3 mm borosilikat massivglaspläd till varje brunn.
- Som en negativ kontroll, lägg till 1 unfed mygga till varje brunn i de kommande 2 kolumnerna på plattan. Fluorescensen som mäts i denna grupp sätter en baslinjeavskärning för att ta hänsyn till vävnads autofluorescens och kommer att användas för att avgöra om en mygga i den experimentella gruppen som matas på måltiden.
- Tillsätt 1 mygga per brunn till de återstående brunnarna från de experimentella grupperna som erbjöds en måltid.
- Försegla plattan försiktigt och stör vävnaden genom manuell slipning. Buken bör homogeniseras noggrant för att frigöra måltiden. Metoder för att störa vävnad inkluderar användning av en pärlkvarn homogenisator med 3 mm borosilikat fasta glaspärlor (30 Hz i 30 sekunder), virvelblandare med 3 mm borosilikat fasta glaspärlor eller en mortelkvarn utan pärlor.
- Centrifugera plattan vid 2000 varv/min i 1–2 minuter för att samla lysatet.
- Förbered en svart 96-brunnsplatta med 180 μL 1x PBS i varje brunn.
- Överför 20 μL lysat till varje brunn med 180 μL 1x PBS och blanda. Om tillgängligt, använd en flerkanalspipett i det här steget för ökad hastighet och bättre konsistens.
- Mät fluorescensintensiteten för varje brunn med hjälp av en plåtläsare på excitations-/utsläppskanalen 485/520. Generera referensstandardkurvan genom att rita den kända måltidsvolymen mot motsvarande fluorescensintensitetsmätning.
- Använd referensstandardkurvan som genereras, extrapolera måltidsvolymen som intas av var och en av de experimentella gruppmyggorna. Subtrahera den genomsnittliga fluorescensintensitetsavläsningen av den negativa kontrollgruppen av oskyddade myggor från fluorescensintensitetsavläsningen av varje experimentell gruppperson för att korrigera för autofluorescens av baslinjevävnad.
Representative Results
Figur 1 presenterar ett schema för montering av Glytube, medan figur 2 visar en översikt över den experimentella designen för att mäta måltidsstorleken med hjälp av den fluorescensbaserade analysen som beskrivs här. Figur 3 ger representativa mätningar av fluoresceinmjölsstorlek från ett blodmatningsexperiment. Figur 4, figur 5och figur 6 illustrerar ett urval av biologiska frågor som kan tas upp med hjälp av detta protokoll. Tillämpningarna av protokollet är omfattande och inkluderar att ändra blodmjölssammansättningen, mata farmakologiska föreningar, exakt kvantifiera suboptimala blodmåltider eller mindre nektarmåltider och jämföra utfodringsbeteendet mellan mygggenotyper.
För att generera en standardkurva för måltidsvolymberäkningar plottas fluorescensavläsningar från de angivna referensbrunnarna som var och en innehåller en ofed mygga och en känd volym av måltiden med 0,002% fluorescein (Figur 3A). Fluorescensavläsningar från de återstående brunnarna, som innehåller myggor från antingen den negativa kontrollgruppen av unfed myggor eller den experimentella gruppen myggor som erbjuds en måltid, jämförs med denna standardkurva för att kvantifiera måltidsvolymen (μL) som konsumeras av varje mygga (Figur 3B). För att validera baslinjeavläsningarna i denna analys bör det bekräftas att myggor från den oskyddade negativa kontrollgruppen inte tilldelas ett positivt värde på μL som konsumeras (figur 3B, vänster). Även om alla honor i den experimentella gruppen erbjöds blodmåltiden, matades vissa myggor (Figur 3B, mitten) och vissa gjorde det inte (Figur 3B, höger). Detta resultat visar att två typer av data kan erhållas från detta protokoll: 1) andelen totala honor som matar på en viss måltid och 2) volymen som intas av honorna som matar på en viss måltid.
Detta protokoll kan användas för att leverera och kvantifiera måltider med olika proteinsammansättningar. Figur 4A,B visar data som samlats in med hjälp av måltider med tillsatt fluorescein. Andelen myggor som matade och måltidsvolymen de intog beräknades från fluorescensavläsningarna. Dessa avläsningar är mycket känsliga och möjliggör exakt kvantifiering av μL, men har begränsningen att myggor inte kan användas för framtida levande experiment. Figur 4C, D visar data som samlats in från ett oberoende experiment med myggor som fick poäng som matade eller ofed av ögat efter att de erbjöds måltider utan fluorescein. Måltidsstorlek beräknades som genomsnittlig vikt / kvinna från grupper om 5 myggor. Även om dessa viktmätningar är mindre känsliga än fluorescensmätningar, tillåter de att honorna återvinns och används för ytterligare levande experiment. Andelen myggor som matar kan variera mellan olika experimentella dagar, vilket återspeglas i figur 4A och figur 4C.
Figur 5 visar volymen som konsumeras av måltider som innehåller droger som reglerar myggvärdssökande beteende. I dessa experiment erbjöds kvinnor blod, saltlösning + ATP eller saltlösning + ATP-måltider med 100 μM av den mänskliga NPY Y2-receptoragonisten TM30338. Detta läkemedel förändrar värdsökande beteende genom aktivering av Ae. aegypti NPY-liknande receptor 7. Mätning av måltidsstorlekar är avgörande för tolkningen av experiment för att bedöma effekten av detta läkemedel på beteende efter blodmatning eftersom det gör det möjligt för forskaren att beräkna den dos som konsumeras av varje kvinna.
I de tidigare exemplen utfodrades honorna med antingen blod eller substitut för blodmåltider, som alla resulterade i 3–5 μL-måltider (figur 3, figur 4, figur 5). Denna fluorescensbaserade analys kan också användas för att mäta mindre och/eller mer variabla måltidsstorlekar som inte kan urskiljas exakt från genomsnittliga gruppviktsmätningar. I figur 6användes samma fluorescensk kvantifieringsprotokoll för att mäta nektarmatningsbeteende genom att byta Glytube mot en bomullstuss mättad med 10% sackaros som innehåller 0,002% fluorescein. Nektarsocker kan inte presenteras i Glytube-analysen eftersom kvinnor inte kan upptäcka närvaron av nektarsocker med styleten och inte initierar utfodring27. Dessa uppgifter gör det möjligt för forskaren att fastställa att sockermåltider är genomgående mindre än blodmåltider, i enlighet med tidigarearbete 34 (figur 6).
Figur 1: Inställning av Glytube-metoden som används för att mata måltider till myggor. A)Schematisk av en dekonstruerad Glytube som används för att mata blod och andra måltider till myggor. (B) Schematisk av en Glytube presenteras ovanpå en behållare med myggor med ett nätlock. Kvinnliga myggor kan genomborra genom nätlocket för att mata. (C) Fotografier av Glytube (överst) och Aedes aegypti myggor före, under och efter utfodring (botten, från vänster till höger) på en Glytube-levererad måltid. Myggor visas piercing genom nätet som täcker deras behållare för att komma åt membranmataren. (D) Fotografier som visar utseendet på kvinnliga Ae. aegypti myggor som är unfed (vänster) och som har engorged på antingen en konstgjord blodmåltid (höger, överst) eller en saltlösning + ATP måltid (höger, botten). Glytube-metoden publicerades tidigare i Costa-da-Silva et al. (2013)20. Fotografier i (C) och (D) är med tillstånd av Alex Wild. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Schematiskt om hur man kvantifierar måltidsstorleken efter Glytubes blodmatningsprotokoll. (A) Myggor erbjuds en måltid med fluorescein (topp, experimentell grupp) eller ingen måltid (botten, oskyddad negativ kontrollgrupp). (B) Enskilda myggor tillsätts till en 96-brunnsplatta efter att utfodringsexperimentet har upphört. (C) Standardkurvan genereras med hjälp av kända mängder mjöl som innehåller 0,002 % fluorescein. (D) Myggor homogeniseras för att frigöra förbrukat fluorescein, och fluorescensnivåerna i varje brunn kvantifieras med hjälp av en plåtläsare. Denna fluorescens kvantifieringsmetod modifieras från Liesch et al. (2013)34. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Glytube blodmatningsförsök med fluoresceinbaserad kvantifiering. (A) Standardkurvmätningar som erhållits från brunnarna där en mygga från den oskyddade kontrollgruppen tillsattes till en känd mängd mjöl som innehöll 0,002% fluorescein (y-axelskala = godtyckliga enheter). (B) Måltidsvolym beräknad med fluorescensavläsningar för kvinnor i den oskyddade kontrollgruppen (vänster, svart, n = 40), den experimentella gruppen som matade på blod (mitten, rött, n = 37) och den experimentella gruppen som inte matade på blod (höger, röd, n = 23). Varje punkt representerar en mätning från en enskild kvinna. Data visas som median med intervall. Bokstäver indikerar statistiskt distinkta grupper, Kruskal-Wallis test med Dunns multipeljämförelse, p<0.01. Dessa uppgifter publicerades i Jové et al. (2020)27. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Kvantifiering av måltider med olika proteinsammansättning. Kvinnor erbjöds måltider av antingen fårblod (rött), artificiellt blod med humant blodproteiner (Kogan (1990)22) (orange) eller proteinfri saltlösning + ATP-måltid (aqua)7. (A) Procentandel kvinnor som matas poäng med fluorescensavläsningar. Varje poäng representerar en grupp på 12–16 honor. Data visas som medianer med intervall, n = 12. B)Måltidsvolym beräknad med hjälp av fluorescensavläsningar. Varje punkt representerar en mätning från en enskild kvinna i en enda studie från figur 4A. Data visas som medianer med intervall, n = 12. C)Procentandel kvinnor som är helt engorgerade efter konstgjord membranmatning, poängsätts med ögat. Varje punkt representerar den procent av kvinnorna som är insydd i grupper om 20–30 honor. Data visas som medianer med intervall, n = 23. (D) Måltidsstorlekar poängst. vikt/kvinna efter utfodringsstatus poäng gjordes med ögat. Vikter beräknades som genomsnittet av grupper på 5 myggor. Data visas som medianer med intervall, n = 23. A–D: Bokstäver indikerar statistiskt distinkta grupper, Kruskal-Wallis test med Dunns multipla jämförelse, p<0.05. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Kvantifiering av måltider med farmakologiska föreningar. Kvinnor konsumerar måltider av samma storlek av fårblod (rött), saltlösning + ATP (aqua) och saltlösning + ATP + 100 μM dos av human NPY Y2 receptor agonist TM30338 (mörkblå). Måltidsvolym beräknad med fluorescensavläsningar. Varje punkt representerar en mätning från en enskild kvinna. Data visas som medianer med intervall, n = 12. Bokstäver indikerar statistiskt distinkta grupper, Kruskal-Wallis test med Dunns multipeljämförelse, p<0,05. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 6: Kvantifiering av mindre nektarmåltider. A)Schematisk analys av nektarmatning. (B) Måltidsvolym beräknad med fluorescensavläsningar för vilda honor erbjöd måltider av antingen vatten (blå, n = 36) eller 10% sackaros (grön, n = 53), var och en med 0,002% fluorescein, i nektarmatningsanalysen. Varje punkt representerar en mätning från en enskild kvinna. Data visas som medianvärden med intervall. Bokstäver anger statistiskt distinkta grupper, Mann-Whitney test, p<0.05. Dessa uppgifter publicerades i Jové et al. (2020)27. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Konstgjord blodmåltid | |||
| Koncentration av stamlösning (mg/ml) | Volym lagerlösning i måltid (μL/ml) | Slutlig måltidskoncentration (mg/ml) | |
| Proteinkomponenter* | |||
| γ-Globuliner | 50 | 300 | 15 |
| Hemoglobin | 35 | 230 | 8 |
| Albumin | 300 | 340 | 102 |
| Totalt protein | - | - | 125 |
| Icke-proteinkomponenter | |||
| Koncentration av stamlösning (mM) | Volym lagerlösning i måltid (μL/ml) | Slutlig måltidskoncentration (mM) | |
| Nacl | I γ-globulinbuljong | - | 5-10 |
| NaHCO3 (på NaHCO) | I γ-globulinbuljong | - | 120 |
| Atp | 200 | 5 | 1 |
| Vatten | - | 125 | - |
| *Proteinkomponenter bereds i stamlösning av dubbeldestillerat vatten, med undantag för γ-Globulins, som löses upp i 400 mM NaHCO3 och inkluderar en variabel mängd NaCl (2-4%) i produkten. | |||
Tabell 1: Recept för att förbereda konstgjorda blodmåltider (anpassad från Kogan (1990)22). Artificiellt blod består av protein och icke-proteinkomponenter som regelbundet finns i humant blod och ger möjlighet att variera förhållandet mellan dessa komponenter. Myggor kan producera ägg efter utfodring på artificielltblod 7,22.
| Saltlösning måltid | |||
| Komponent | Koncentration av stamlösning (mM) | Volym lagerlösning i måltid (μL/ml) | Slutlig måltidskoncentration (mM) |
| Nacl | - | - | - |
| NaHCO3 (på NaHCO) | 400 | 300 | 120 |
| Atp | 200 | 5 | 1 |
| Vatten | - | 695 | - |
Tabell 2: Recept på saltlösningsmjöl med ATP (anpassad från Duvall et al. (2019)7). Proteinfria saltlösningsmåltider kan användas för att leverera föreningar av intresse för myggor samtidigt som de efterliknar bukdistensionen som uppstår efter blodmatning, men utan att utlösa äggutvecklingen som uppstår när proteiner intas.
Discussion
För många laboratorieapplikationer erbjuder konstgjorda membranmatare distinkta fördelar jämfört med levande värdar genom att ge forskare möjlighet att direkt manipulera måltidens innehåll. Även om flera metoder finns tillgängliga för artificiell membranmatning, erbjuder den metod som beskrivs här fördelar i flexibilitet, kostnad och genomströmning. I jämförelse med andra kommersiella membranmatare kräver Glytube-analysen en liten måltidsvolym, vilket gör det till en effektiv leveransmekanism för kostsamma reagenser, inklusive läkemedel eller patogener, genom att minimera den totala volymensom krävs 7,35. Eftersom både den proteinfria saltlösningen och konstgjorda blodmåltider främjar engorgement, föreningar eller patogener kan läggas till antingen måltid som en hög genomströmning och icke-invasiva alternativ till injektioner. Dessutom kan varje komponent i Glytube enkelt tvättas, bytas ut eller skalas upp för att leverera och kvantifiera flera måltidstyper utan korskontaminering av matningsapparaten.
För att kvantifiera måltidsvolymer som konsumeras av myggor möjliggör den fluorescensbaserade metoden mer exakt måltidsstorleks kvantifiering än att väga myggorna före och efter utfodring. Det bör noteras att denna metod är en slutpunktsanalys. Däremot tillåter vägning myggorna att hållas vid liv för ytterligare experiment. Genom att använda en tallriksläsare kan den fluorescensbaserade metoden enkelt skalas upp för kvantifiering av måltider som konsumeras av hundratals enskilda kvinnor.
För att uppnå höga utfodringshastigheter måste en kombination av tillräckliga värdsignaler vara närvarande för att aktivera kvinnligt värdsökande beteende och locka kvinnor till mataren. Om myggor inte trängs under Glytube kanske måltiden inte värms ordentligt, eller CO2-leveransen kanske inte är tillräcklig. Tillsats av mänsklig lukt till membranytan ökar på ett tillförlitligt sätt attraktiviteten hos det konstgjorda membranet. Om myggor observeras under Glytube men misslyckas med att mata, kan måltidssammansättningen vara fel. Kvinnor får inte mata om måltiden i sig inte är varm, blodet är för gammalt eller om tillsatserna till måltiden är i sig aversiva eller orsakar en oönskad kemisk reaktion36. Ytterligare ATP ökar också utfodringshastigheterna på ett tillförlitligt sätt och kan skalas upp till en slutlig koncentration på 2 mM i vart och ett av recepten. Kvinnor får inte mata om parafilmen inte dras spänd över Glytube-locket; parafilmen ska vara enhetligt transparent och bör inte spännas, eftersom detta förhindrar att honan effektivt kan genomborra parafilmen med sin stil. Om måltiden läcker genom Glytuben på nätet kan parafilmen ha slitits sönder under sträckningsprocessen och bör bytas ut.
Att ändra måltidssammansättningen kan också göra det möjligt för forskare att manipulera den tid som behövs för att rensa måltiden från midgut samt det efterföljande värdsökande beteendet. Måltiderna som presenteras här kräver 24-36 h för matsmältning7 som liknar animaliskt härlett blod. Efter utfodring på någon av dessa måltider kommer kvinnor att undertrycka värdsökande under matsmältningstidens fönster. Eftersom saltlösningsmjölet saknar protein återvänder kvinnor till värdsökande efter att måltiden har rensats. Om en snabbare avkastning är önskvärd kan forskare välja alternativa "snabb clearing" saltlösning måltider som utsöndras i cirka 6 h27. Medan sammansättningen av saltlösningsmjölet som presenteras här matchas för att direkt jämföra resultat med den konstgjorda blodmåltiden, matchar den "snabba clearing" måltiden närmare fysiologiska saltnivåer som finns i ryggradsdjursblod.
De metoder som beskrivs här har begränsningar som bör övervägas innan du väljer den analys som är mest lämpad för forskarens experimentella mål. De fluoresceinmätningar som beskrivs tillåter inte myggor att användas igen för ytterligare experiment. Viktmätningar kan dock göras före kvantifiering av måltidsstorleken med fluoresceinanalysen. Om vikt och måltidsstorlek är konsekventa i flera försök för en viss måltid kan vikt användas som proxy i framtida experiment. Dessutom skiljer detta protokoll inte mellan underskott i värdsökande kontra blodmatningsbeteende; myggor som visar försämringar i att hitta membranmataren kommer att ha en minskning av utfodringshastigheter och / eller måltidsstorlek. Genom att lägga till en kamera för att spela in beteende under hela analysen kan forskare avgöra om honorna inte kan hitta Glytube, eller om de hittar Glytube, men inte matar.
Analysen som beskrivs här kan anpassas för att utforska många enastående frågor relaterade till utfodringsbeteende hos myggor. Till exempel kan bidraget från specifika blodproteiner utforskas genom att ändra förhållandet mellan ingående proteiner eller total proteinkoncentration i den konstgjorda blodmjölet. För att utvärdera måltidsstorlekar från flera utfodringshändelser kan färgämnen med distinkt fluorescensspektra läggas till för att skilja måltider från unika källor37. Detta protokoll kan också ändras för att separat stimulera de inre munstyckena som detekterar blod och som används för intag (dvs. stylet) och de kemosensoriska bihang som kommer i kontakt med huden (dvs. labium, ben) när myggan landar för att börjablodmatning 36. Till exempel, om ligands läggs direkt till måltiden, kontaktar de inte labiet och benen, eftersom membranet endast genomborras av styleten. Om ligands läggs till den yttre ytan av parafilmen istället, förblir de separerade från måltiden och kan kontaktas av labium och ben36. Slutligen är de detaljerade kinetikerna av blodmatningsbeteende inte väl förstådda och metoden som presenteras här kan ändras för att kombinera högupplöst spårning med maskininlärningsverktyg för att extrahera beteendemässiga avläsningar av rörelse, hållning ochutfodringsdynamik 38.
Detta protokoll syftar till att vara användarvänligt och kostnadseffektivt, med förmågan att betjäna forskare som använder farmakologiska och genetiska manipuleringar för att studera myggblodmatning och post-blodmatningsbeteende.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Nipun Basrur, Adriana K. Rosas Villegas, Nadav Shai och Trevor Sorrells för kommentarer om manuskripten och Zhongyan Gong och Kyrollos Barsoum för teknisk hjälp. Vi tackar Alex Wild för fotografier som används i figur 1. K.V. fick stöd av Boehringer Ingelheim Fonds doktorandstipendium. V.J. stöddes delvis av NIH T32-MH095246. Detta arbete stöddes delvis av ett anslag till The Rockefeller University från Howard Hughes Medical Institute genom James H. Gilliam Fellowships for Advanced Study program till V.J. Detta material är baserat på arbete som stöds av National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program under Grant No. NSF DGE-1325261 till V.J. Alla yttranden, slutsatser och slutsatser eller rekommendationer som uttrycks i detta material är upphovsmannens och återspeglar inte nödvändigtvis den nationella vetenskapsstiftelsens åsikter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 3 mm diameter borosilicate solid-glass bead | MilliporeSigma | Z143928 | For use for bead mill homogenizer; not required if using pellet pestle grinder |
| 32 oz. high-density polyethylene (HDPE) plastic cup | VWR | 89009-668 | Example mosquito container used for feeding assays shown; alternate options can be used |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 96-well black polystyrene plate | ThermoFisher | 12-566-09 | |
| 96-well PCR plate sealing film | Bio-Rad | MSB1001 | Alternate options can be used |
| 96-well PCR plates | Bio-Rad | HSP9621 | Alternate options can be used |
| Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | MilliporeSigma | A6419 | |
| Albumin (human serum) | MilliporeSigma | A9511 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213 | Alternate options can be used to block light entering fluorescein container |
| Balance | Fisher Scientific | 01-911 | Alternate options can be used |
| Bead mill homogenizer | Qiagen | 85300 | Not required if using pellet pestle grinder |
| Cotton ball | Fisher Scientific | 22456880 | For nectar-feeding; alternate options can be used |
| Defibrinated sheep blood | Hemostat Laboratories | DSB100 | Alternate options can be used |
| Drosophila CO2 fly pad | Tritech Research | MINJ-DROS-FP | Alternate options can be used |
| Fluorescein | MilliporeSigma | F6377 | |
| Fluorescence plate-reader | ThermoFisher | VL0000D0 | Alternate options can be used |
| Gamma-globulin (human blood) | MilliporeSigma | H7379 | |
| Glycerol | MilliporeSigma | G7893 | |
| Hemoglobin (human) | MilliporeSigma | G4386 | |
| Laboratory wrapping film - parafilm | Fisher Scientific | 13-374 | |
| Magnetic stirrer | Fisher Scientific | 90-691 | Alternate magnetic stirrers can be used |
| Microcentrifuge for 96-well plate | VWR | 80094-180 | Alternate options can be used |
| Microcentrifuge Tubes | MilliporeSigma | 2236412 | Alternate options can be used |
| Pellet pestle grinder | VWR | KT749521-1500 | Not required if using bead mill homogenizer |
| Phosphate buffered solution (PBS) | Fisher Scientific | BW17-516F | Optional |
| Razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | Alternate options can be used, such as a lathe for better consistency of cutting |
| Rubber bands | |||
| Silicone tubing | McMaster Carr | Needed if using a fly pad for CO2 delivery | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | S233 | |
| Sodium chloride (NaCl) | MilliporeSigma | S9888 | |
| Stir bars | Fisher Scientific | 14-512 | Alternate magnetic stir bars can be used |
| Translucent polypropylene storage box with removable lid | Example box used for feeding assays shown | ||
| Vortex mixer | |||
| Water bath | Alternate heating device may be used | ||
| White 0.8 mm polyester mosquito netting | American Home & Habit Inc. | F03A-PONO-MOSQ-M008-WT | Alternate options can be used |
References
- Bhatt, S., et al. The global distribution and burden of dengue. Nature. 496 (7446), 504-507 (2014).
- Rogers, D. J., Wilson, A. J., Hay, S. I., Graham, A. J. The global distribution of yellow fever and dengue. Advances in Parasitology. 62 (05), 181-220 (2006).
- Chouin-Carneiro, T., et al. Differential susceptibilities of Aedes aegypti and Aedes albopictus from the Americas to Zika virus. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (3), (2016).
- Guerbois, M., et al. Outbreak of Zika virus infection, Chiapas State, Mexico, 2015, and first confirmed transmission by Aedes aegypti mosquitoes in the Amercias. Journal of Infectious Diseases. 214 (9), 1349-1356 (2016).
- Weaver, S. C., et al. Zika virus: history, emergence, biology, and prospects for control. Antiviral Research. 130, 69-80 (2016).
- Attardo, G. M., Hansen, I. A., Raikhel, A. S. Nutritional regulation of vitellogenesis in mosquitoes: implications for anautogeny. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 35 (7), 661-675 (2005).
- Duvall, L. B., Ramos-Espiritu, L., Barsoum, K. E., Glickman, J. F., Vosshall, L. B. Small-molecule agonists of Ae. aegypti neuropeptide Y receptor block mosquito biting. Cell. 176 (4), 687-701 (2019).
- Dimond, J. B., Lea, A. O., Hahnert, W. F., DeLong, D. M. The amino acids required for egg production in Aedes aegypti. The Canadian Entomologist. 88 (2), 57-62 (1956).
- Guerrero, D., Cantaert, T., Missé, D. Aedes mosquito salivary components and their effect on the immune response to arboviruses. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 1-11 (2020).
- Raquin, V., Lambrechts, L. Dengue virus replicates and accumulates in Aedes aegypti salivary glands. Virology. 507, 75-81 (2017).
- Farjana, T., Tuno, N. Multiple blood feeding and host-seeking behavior in Aedes aegypti and Aedes albopictus (diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 50 (4), 838-846 (2013).
- Scott, T. W., Takken, W. Feeding strategies of anthropophilic mosquitoes result in increased risk of pathogen transmission. Trends in Parasitology. 28 (3), 114-121 (2012).
- Ross, P. A., Lau, M. J., Hoffmann, A. A. Does membrane feeding compromise the quality of Aedes aegypti mosquitoes. PLoS ONE. 14 (11), 1-19 (2019).
- Ross, P. A., Axford, J. K., Richardson, K. M., Endersby-Harshman, N. M., Hoffmann, A. A. Maintaining Aedes aegypti mosquitoes infected with wolbachia. Journal of Visualized Experiments. 2017 (126), 1-8 (2017).
- Briegel, H., Hefti, M., DiMarco, E. Lipid metabolism during sequential gonotrophic cycles in large and small female Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 48 (5), 547-554 (2002).
- McMeniman, C. J., Corfas, R. A., Matthews, B. J., Ritchie, S. A. S., Vosshall, L. B. Multimodal integration of carbon dioxide and other sensory cues drives mosquito attraction to humans. Cell. 156 (5), 1060-1071 (2014).
- Pakes, S. P., et al. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , National Academic Press. Washington, DC, USA. (2011).
- Deng, L., Koou, S. Y., Png, A. B., Ng, L. C., Lam-Phua, S. G. A novel mosquito feeding system for routine blood-feeding of Aedes aegypti and Aedes albopictus. Tropical Biomedicine. 29 (1), 169-174 (2012).
- Gunathilaka, N., Ranathunge, T., Udayanga, L., Abeyewickreme, W. Efficacy of blood sources and artificial blood feeding methods in rearing of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) for sterile insect technique and incompatible insect technique approaches in Sri Lanka. BioMed Research International. 2017, 3196924 (2017).
- Costa-da-Silva, A. L., et al. Glytube: a conical tube and parafilm M-based method as a simplified device to artificially blood-feed the Dengue vector mosquito, Aedes aegypti. PLoS ONE. 8 (1), 53816 (2013).
- Carvalho, D. O., et al. Mass production of genetically modified Aedes aegypti for field releases in Brazil. Journal of Visualized Experiments. 83 (83), 1-10 (2014).
- Kogan, P. H. H. Substitute blood meal for investigating and maintaining Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 27 (4), 1-4 (1990).
- Gonzales, K. K., Hansen, I. A.
- Baughman, T., et al. A highly stable blood meal alternative for rearing Aedes and Anopheles mosquitoes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (12), 0006142 (2017).
- Galun, R. Feeding stimuli and artificial feeding. Bulletin of the World Health Organization. 36, 590-593 (1967).
- Galun, R. Feeding response in Aedes aegypti: stimulation by adenosine triphosphate. Science. 142, 1674-1675 (1963).
- Jové, V., et al. Sensory Discrimination of Blood and Floral Nectar by Aedes aegypti Mosquitoes. Neuron. 108, 1-18 (2020).
- Petersen, M. T., et al. The impact of the age of first blood meal and Zika virus infection on Aedes aegypti egg production and longevity. PLoS ONE. 13 (7), 1-15 (2018).
- Sissoko, F., et al. Frequent sugar feeding behavior by Aedes aegypti in Bamako, Mali makes them ideal candidates for control with Attractive Toxic Sugar Baits (ATSB). PLoS ONE. 14 (6), 0214170 (2019).
- Houseman, J. G., Downe, A. E. R. Methods of measuring blood meal size and proteinase activity for determining the effects of mated state of digestive processes of female Aedes aegypti (L.) (Diperta: Culicidae). The Canadian Entomologist. 18, 241-248 (1986).
- Redington, B. C., Hockmeyer, W. T. A method for estimating blood meal volume in Aedes aegypti using a radioisotope. Journal of Insect Physiology. 22 (7), 961-966 (1976).
- Gonzales, K. K., et al. The effect of SkitoSnack, an artificial blood meal replacement, on Aedes aegypti life history traits and gut microbiota. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
- Klowden, M. J. The endogenous regulation of mosquito reproductive behavior. Experientia. 46 (7), 660-670 (1990).
- Liesch, J., Bellani, L. L., Vosshall, L. B. Functional and genetic characterization of neuropeptide Y-like receptors in Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (10), 22486 (2013).
- Frances, S. P., Sithiprasasna, R., Linthicum, K. J. Laboratory evaluation of the response of Aedes aegypti and Aedes albopictus uninfected and infected with Dengue virus to Deet. Journal of Medical Entomology. 48 (2), (2011).
- Dennis, E. J., Goldman, O. V., Vosshall, L. B. Aedes aegypti mosquitoes use their legs to sense DEET on contact. Current Biology. 29 (9), 1551-1556 (2019).
- Harrington, L. C., et al. Heterogeneous feeding patterns of the Dengue vector, Aedes aegypti, on individual human hosts in rural Thailand. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (8), 3048 (2014).
- Hol, F. J., Lambrechts, L., Prakash, M. BiteOscope, an open platform to study mosquito biting behavior. eLife. 9, 1-24 (2020).
