Summary
Målet med denne protokol er at levere animalske og kunstige blod måltider til Aedes aegypti myg gennem en kunstig membran feeder og præcist kvantificere mængden af måltid indtages.
Abstract
Kvinder af visse mygarter kan sprede sygdomme, mens bidende hvirveldyr værter for at opnå proteinrige blod måltider, der kræves for æg udvikling. I laboratoriet kan forskere levere animalske og kunstige blodmåltider til myg via membranfodere, som giver mulighed for manipulation af måltidssammensætningen. Her præsenterer vi metoder til fodring af blod og kunstige blod måltider til Aedes aegypti myg og kvantificere mængden forbruges af de enkelte kvinder.
Målrettet fodring og kvantificering af kunstige / blod måltider har bred anvendelse, herunder test af virkningerne af måltid komponenter på myg adfærd og fysiologi, levere farmakologiske forbindelser uden injektion, og inficere myg med specifikke patogener. Tilsætning af fluoresceinfarvestof til måltidet inden fodring giver mulighed for efterfølgende kvantificering af måltidsstørrelse. Måltidsvolumen, der forbruges af myg, kan måles enten efter vægt, hvis hunnerne senere skal bruges til adfærdseksperimenter eller ved at homogenisere individuelle kvinder i 96-brøndsplader og måle fluorescensniveauer ved hjælp af en pladelæser som et slutpunktsanalyse. Quantificering af måltidsstørrelse kan bruges til at afgøre, om ændring af måltidskomponenterne ændrer det forbrug af mel, der indtages, eller om måltidsforbruget varierer mellem myggestammer. Præcis måltid størrelse kvantificering er også afgørende for nedstrøms assays, såsom dem, der måler effekter på vært attraktion eller fecundity. De metoder, der præsenteres her, kan tilpasses yderligere til at spore måltidsfordøjelsen i løbet af dage eller til at omfatte flere skelnelige markører, der tilsættes forskellige måltider (som nektar og blod) for at kvantificere forbruget af hvert måltid med en enkelt myg.
Disse metoder giver forskere mulighed for egenhændigt at udføre målinger med høj gennemstrømning for at sammenligne måltidsvolumen, der forbruges af hundreder af individuelle myg. Disse værktøjer vil derfor være bredt nyttige for myggeforskere til at besvare forskellige biologiske spørgsmål.
Introduction
Vi præsenterer en protokol til fodring af modificerede blodmåltider til Aedes aegypti myg ved hjælp af en kunstig membran feeder og præcist måle måltidet volumen forbruges af hver enkelt myg. Denne protokol kan fleksibelt tilpasses for at ændre måltidets indhold eller for at sammenligne måltidsvolumen, der forbruges af forskellige eksperimentelle grupper af myg.
Ae. aegypti myggen truer den globale sundhed ved at sprede patogener, der forårsager sygdomme, herunder gul feber, denguefeber, chikungunya og Zika1,2,3,4,5. Ae. aegypti hunner er obligate blod-feeders; de skal forbruge hvirveldyr blod for at opnå det nødvendige protein til æg udvikling, og hver kobling af æg kræver en fuld blodmel fra mindst én vært6,7,8. Den kvindelige myg bider først sin vært ved at gennembore huden med sin stylet og injicere spyt, som indeholder forbindelser, der udløser værtens immunrespons9. Hun fodrer derefter ved at pumpe blod gennem hendes stylet ind i hendes midgut. Mens hun indtager et blodmåltid fra en inficeret vært, kan hun indtage blodbårne patogener6,8, som derefter migrerer fra myggens midgut til hendes spytkirtler10. Kvindelige myg smittet på denne måde kan sprede sygdom ved at injicere patogener sammen med spyt, når de bider efterfølgende værter11,12. Forståelse og kvantificering af mekanismerne for blodfodringsadfærd er afgørende skridt til at kontrollere overførslen af mygbårne sygdomme.
Mange laboratorieprotokoller til mygopdræt og -forsøg bruger levende dyr, herunder mus, marsvin eller mennesker som blodkilde13,14,15,16. Brugen af levende dyr pålægger etiske bekymringer samt komplekse krav til personaleuddannelse, dyreopstaldning og -pleje og overholdelse af institutionelle politikker for dyrepleje og -anvendelse (IACUC). Det begrænser også de typer forbindelser, der kan leveres til myg, hvilket begrænser de undersøgelser, der kan udføres17.
Kunstige blodfodringsapparater, som typisk bruger et membransystem til at simulere værtshud, er nyttige værktøjer til at studere blodfodringsadfærd, der omgår behovet for vedligeholdelse af levende værter. Fuldblod kan købes fra en række leverandører og fodres til myg ved hjælp af opvarmede, vandjakkede kunstige membranfødere eller lignende enheder18,19. I denne protokol demonstrerer vi brugen af små, engangsmembranfødere navnene "Glytubes". Denne membran feeder, tidligere udgivet af Costa-da-Silva et al. (2013)20, kan let samles fra standard laboratorieudstyr, hvilket gør det ideelt til at levere blod måltider til moderate antal myg og ligetil at skalere op til test af større grupper eller flere måltidsformuleringer. Glytube er et billigt og effektivt alternativ til andre kommercielle kunstige fødefodere, som kan kræve større måltidsmængder og er mere egnede til batchfodring af store grupper myg på en enkelt måltidsformulering21.
Denne protokol indeholder to afsnit: tilberedning/levering af kunstige måltider og kvantificering af forbruget. I det første afsnit bruges Glytubes som et effektivt middel til at levere manipulerede kostvaner. Fuldblod kan erstattes med et helt kunstigt måltid for at sammenligne virkningerne af bloderstatninger i stedet for et blodmåltid. En opskrift tilpasset fra Kogan (1990)22 præsenteres her, selv om flere kunstige måltid formuleringer er blevet udviklet23,24. Desuden er fodring en mindre invasiv og mindre besværlig metode til at indføre farmakologiske forbindelser end injektion. På grund af den lave samlede mængde, der kræves til hvert måltid (1-2 mL), giver denne protokol en attraktiv leveringsmetode til at reducere mængden af dyre reagenser. Ae. aegypti hunner let forbruge protein-fri måltider af saltvand løsning med adenosin 5′-triphosphat (ATP)25,26, som giver en baseline for måling af virkningerne af enkelt måltid komponenter. For eksempel er Neuropeptide Y-lignende receptor 7 (NPYLR7) i Ae. aegypti kendt for at mægle værtssøgende undertrykkelse efter et proteinrigt blodmåltid, og når NPYLR7-agonister tilsættes til et proteinfrit saltvandsmåltid, udviser kvindelige myg værtssøgende undertrykkelse svarende til dem, der har indtaget hele blod7.
I det andet afsnit præsenteres trin til kvantificering af mængden af hvert måltid, der forbruges af en individuel kvindelig myg. Denne analyse er fluorescens-baseret og fanger fodring status i højere opløsning end metoder, hvor kvinder er klassificeret som "fodret" eller "unfed" baseret på visuel vurdering af abdominal distension alene. Ved at tilsætte fluorescein til måltidet før fodring kan måltidsmængder, der indtages af enkeltpersoner, kvantificeres ved at homogenisere hver myg i en 96-brønds plade og måle fluorescensintensitet som en udlæsning. Denne analyse kan måle forskelle i fodring kraft som reaktion på variabler såsom måltid sammensætning eller myg 'genetiske baggrund. Præcis kvantificering er afgørende for mellemmåltidsstørrelser, f.eks. Hvis fodret myg er nødvendige for efterfølgende adfærdsmæssige assays efter måltid størrelse kvantificering, måltid størrelse kan i stedet beregnes ved at veje bedøvede hunner i grupper og anslå den gennemsnitlige øgede masse pr person. Selv om vejningen er mindre præcis end fluorescerende mærkning, giver den stadig et samlet skøn over måltidsvolumen og gør det muligt at undersøge måltidets virkning på downstream-processer, såsom fecundity eller efterfølgende værtsattraktion. Mens blodmel størrelse er variabel og kan påvirkes af et utal af faktorer11,28,29, indtages måltid størrelser målt med de metoder, der er beskrevet her , er i overensstemmelse med tidligere kvantificeringer7,30,31.
Protocol
Blodfodringsprocedurer blev ikke udført ved hjælp af levende dyr eller menneskelige værter og overholdt retningslinjerne fra The Rockefeller University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) og Institutional Review Board (IRB).
1. Tilberedning af måltider
- Forberedelse af phagostimulerende, adenosin 5′-triphosphat
- Forbered en 25 mM opløsning af vandig NaHCO3 (molekylvægt, MW = 84,006 g/mol). For 100 mL på 25 mM NaHCO3tilsættes 210 mg NaHCO3 til en målekolbe og fyldes med dobbeltdestilleret vand (ddH2O) til et samlet volumen på 100 mL. Ved hjælp af en magnetisk rørestang blandes opløsningen grundigt, indtil alle NaHCO3 er opløst.
- Rekonstituer ATP-deodiumsalthydrat (MW = 551,14 g/mol) i den vandige 25 mM NaHCO3 til en endelig koncentration på 200 mM ATP. For et samlet volumen på 10 mL på 200 mM ATP i 25 mM NaHCO3 buffer tilsættes 1,1 g ATP-disodiumsalthydrat til en målekolbe og fyldes med 25 mM NaHCO3 buffer til et samlet volumen på 10 mL. Ved hjælp af en magnetisk rørestang blandes opløsningen grundigt, indtil al ATP er opløst.
BEMÆRK: For at minimere hydrolyse af ATP skal den bufferes af en saltopløsning som NaHCO3. - Atp-opløsningen til aliquot og opbevares ved -20 °C.
BEMÆRK: Denne lageropløsning af ATP laves typisk frisk hvert halve år og bruges til alle måltider, der er beskrevet nedenfor. For at forhindre nedbrydning bør ATP-aliquots ikke gennemgå flere fryse-optøningscyklusser eller opvarmes sammen med andre måltidskomponenter.
- Fremstilling af fluorescerende røbeopløsning, fluorescerende
- Forbered en 2% (w/ v) lageropløsning af vandig fluorescerende. For et samlet lageropløsningsvolumen på 10 ml blandes 0,2 g fluoresceindeodiumsalt med 10 ml ddH2O i et 15 ml konisk rør indpakket i aluminiumsfolie ved stuetemperatur. Denne stamopløsning af fluorescein kan bruges til fortynding i alle måltider, der er beskrevet nedenfor.
BEMÆRK: Da fluorescerende er lysfølsomt, skal du undgå at blive udsat for lys ved at pakke beholdere i aluminiumsfolie.
- Forbered en 2% (w/ v) lageropløsning af vandig fluorescerende. For et samlet lageropløsningsvolumen på 10 ml blandes 0,2 g fluoresceindeodiumsalt med 10 ml ddH2O i et 15 ml konisk rør indpakket i aluminiumsfolie ved stuetemperatur. Denne stamopløsning af fluorescein kan bruges til fortynding i alle måltider, der er beskrevet nedenfor.
- Tilberedning af blodmel af animalske produkter
- Beregn antallet af måltider, der er nødvendige for at fodre alle myg; hver Glytube holder et 2 mL måltid og fodrer ca. 25 myg. Forbered et ekstra måltid for at kalibrere standardkurven for fluorescensaflæsninger. Medmindre andet er angivet, beskriver alle trin i dette afsnit reagensmængder, der kræves for at tilberede et måltid med et endeligt volumen på 2 mL.
- For animalske blodmåltider overføres 1,98-2 mL defibrineret fåreblod til et 15 mL konisk rør (se trin 3.3 for den ønskede mængde blod).
BEMÆRK: Kommercielt defibrinerede kilder til hvirveldyrblod, herunder fra får, marsvin og mennesker, kan anvendes13. Før brug skal du sikre dig, at det købte blod ikke har overskredet udløbsdatoen og blande det godt ved at vende flasken, især hvis der er synlig adskillelse af blodkomponenter. - For optimal fodring tilsættes ATP til en endelig koncentration på 1-2 mM, efter at fåreblod er blevet opvarmet til 45 °C i et vandbad. For en endelig koncentration på 1 mM ATP tilsættes 10 μL af 200 mM ATP-stamopløsningen til 1,99 ml forvarmet blod og blandes. For en endelig koncentration på 2 mM ATP tilsættes 20 μL af 200 mM ATP-bestanden til 1,98 mL forvarmet blod og blandes. Hvis ATP ikke skal tilsættes, skal der tilsættes varm 2 mL defibrineret fåreblod.
- Hvis der efterfølgende skal foretages fluorescensbaseret kvantificering af måltidsstørrelsen, tilsættes fluorescenopløsning til en endelig koncentration på 0,002 % (2 μL 2 % fluoresceinbestand på 2 ml totalmelsvolumen). Reducer mængden af blod med samme mængde som fluorescein tilsat. 1 mL af den endelige måltidsformulering, der indeholder 0,002% fluorescein, beholder for at generere referencestandardkurven. Behandl det tilbageholdte volumen på samme måde som det måltid, der leveres til myg; udsættes for de samme lys- og temperaturforhold under hele forsøgets varighed og fastfryser derefter dette sammen med det leverede måltid.
- Tilberedning af måltider med kunstigt blod
- Beregn antallet af måltider, der er nødvendige for at fodre alle myg; hver Glytube holder et 2 mL måltid og fodrer ca. 25 myg. Forbered et ekstra måltid for at kalibrere standardkurven for fluorescensaflæsninger. Medmindre andet er angivet, beskriver alle trin i dette afsnit reagensmængder, der kræves for at tilberede et 2 mL måltid.
- For at forberede kunstigt blod (tilpasset fra Kogan (1990)22) som i tabel 1skal der først fremstilles en stamopløsning på 400 mM NaHCO3. For et samlet volumen på 10 mL på 400 mM NaHCO3 (MW = 84,006 g/mol) tilsættes 336 mg NaHCO3 til en målekolbe og fyldes med dobbeltdestilleret vand (ddH2O) til et samlet volumen på 10 mL. Ved hjælp af en magnetisk rørestang blandes opløsningen grundigt, indtil alle NaHCO3 er opløst.
- For proteinkomponenterne i kunstigt blod fremstilles stamopløsninger på 50 mg/mL γ-globuliner i 400 mM NaHCO3,35 mg/mL hæmoglobin i ddH2O og 300 mg/mL albumin i ddH2O. Proteinlagre kan opbevares ved 4 °C i op til 2 måneder. Den endelige koncentration af de samlede humane proteiner i kunstigt blod er 125 mg/mL. Dette omfatter endelige koncentrationer på 15 mg/mL γ-globuliner, 8 mg/mL hæmoglobin og 102 mg/mL albumin.
- For hvert 2 mL måltid kombineres 600 μL γ-globuliner, 460 μL hæmoglobin, 680 μL albumin og 250 μL ddH2O fra de stamopløsninger, der er anført i tabel 1. Vent med at tilsætte 10 μL 200 mM ATP-stamopløsning, indtil måltidet er varmet op til 45 °C, umiddelbart før måltidet præsenteres.
- Hvis der efterfølgende skal foretages fluorescensbaseret kvantificering af måltidsstørrelsen, tilsættes fluorescenopløsning til en endelig koncentration på 0,002 % (2 μL 2 % fluoresceinbestand på 2 ml totalmelsvolumen). Volumenet af ddH2O reduceres i trin 4.4 med samme mængde som den tilsatte fluorescein. Der skal opbevares mindst 1 mL af den endelige melformulering, der indeholder 0,002 % fluorescein, for at generere referencestandardkurven. Behandl det tilbageholdte volumen på samme måde som det måltid, der leveres til myg; udsættes for de samme lys- og temperaturforhold under hele forsøgets varighed og fastfryser derefter dette sammen med det leverede måltid.
- Tilberedning af eksempel proteinfri saltvandsmåltider (tilpasset fra Duvall et al. (2019)7)
BEMÆRK: Proteinfri saltvandsmåltider kan tilberedes på flere måder7,27,32. Saltvandsmåltidet, der præsenteres her, er en proteinfri version af den kunstige blodopskrift, der er beskrevet ovenfor.- Beregn antallet af måltider, der er nødvendige for at fodre alle myg; hver Glytube holder et 2 mL måltid og fodrer ca. 25 myg Forbered et ekstra måltid for at kalibrere standardkurven for fluorescensmålinger. Medmindre andet er angivet, beskriver alle trin i dette afsnit reagensmængder, der kræves for at tilberede et 2 mL måltid.
- For at forberede saltvandsmåltidet skal du lave en lageropløsning på 400 mM NaHCO3. For et samlet volumen på 10 mL på 400 mM NaHCO3 (MW = 84,006 g/mol) tilsættes 336 mg NaHCO3 til en målekolbe og fyldes med ddH2O til et samlet volumen på 10 mL. Ved hjælp af en magnetisk rørestang blandes opløsningen grundigt, indtil alle NaHCO3 er opløst.
- For hvert 2 ml måltid kombineres i et 15 ml konisk rør 600 μL på 400 mM NaHCO3 med 1,39 ml ddH2O. Vent med at tilsætte 10 μL af 200 mM ATP-lageropløsningen, indtil måltidet er blevet opvarmet til 45 °C i et vandbad.
- Hvis der efterfølgende skal foretages fluorescensbaseret kvantificering af måltidsstørrelsen, tilsættes fluorescenopløsning til en endelig koncentration på 0,002 % (2 μL 2 % fluoresceinbestand på 2 ml af det samlede melvolumen). Volumenet af ddH2O reduceres i trin 5.3 med samme mængde som den tilsatte fluorescein. Der skal opbevares mindst 1 mL af den endelige melformulering, der indeholder 0,002 % fluorescein, for at generere referencestandardkurven. Behandl det tilbageholdte volumen på samme måde som det måltid, der leveres til myg; udsættes for de samme lys- og temperaturforhold under hele forsøgets varighed og fastfryser derefter dette sammen med det leverede måltid.
2. Levering af måltider til myg
- Opsætning af myggebeholdere til fodring
BEMÆRK: Myg kan fodres i en række beholdere, så længe følgende kriterier er opfyldt. Sørg for, at beholderen er stor nok til, at myg kan flyve rundt i, men ikke så stor, at det vil være svært for myggene at finde maskeoverfladen og begynde at fodre. Masken, der bruges til at dække beholderen, kan variere i materiale- og hulstørrelse. Hullerne skal være store nok til, at den kvindelige myg er stylet til at gennembore igennem, men ikke så stor, at myggen kan undslippe. Fastgør masken fast, så den er stram, og Glytube kan hvile stabilt på overfladen gennem hele fodringsperioden.- Et eksempel beholder (Figur 1) er en modificeret 946 ml (32 ounce) høj densitet polyethylen (HDPE) plast spand. For at kopiere denne opsætning skal du bruge et barberblad til at skære et centralt hul på ~ 10 cm diameter i spandlåget. At samle beholderen til besættelse af myg, sikre en ~ 400 cm2 firkantet stykke hvid 0,8 mm polyester myggenet på toppen af spanden, sikkert skubbe perforeret låg ned over det at snap stramt.
- Saml kvindelige myg, der er mindst 3 dage efter eclosion for at sikre, at de er modne nok til blodfoder. Optimale fodringsrater observeres efter 7 dage33.
- Placer kvindelige myg i beholderen og dæk med mesh. Hvis beholderen er tæt befolket med myg, skal du øge antallet af anvendte Glytubes. Optimal fodring opnås med ~ 25 myg / Glytube. Dette reducerer konkurrencen om adgang til fodringsmembranen.
- Afsæt en kontrolgruppe af ufed myg, der ikke vil blive tilbudt et måltid. I vægtmålingsprotokollen skal du veje den ufærede gruppe separat og bruge denne vægt til at estimere vægtforøgelse i den eksperimentelle gruppe, der fodres med et måltid. I den fluorescensbaserede kvantificeringsprotokol tilsættes den ufederede gruppe myg til brøndene til standardkurveberegningerne og til negative kontroller. For at matche baseline myggevæv autofluorescens i den eksperimentelle gruppe, sikre, at standardkurven og negative kontrol brønde indeholder en ufed myg.
- Konstruktion og opsætning af Glytube (tilpasset fra Costa-da-Silva et al. (2013)20)
- Som afbildet i figur 1, for at generere en varmekilde, fylde en 50 mL konisk rør med 40 mL på 100% glycerol. Forsegl det åbne koniske rør med et 5 cm × 5 cm stykke parafilm og gentag med et ekstra stykke 5 cm × 5 cm parafilm for at minimere risikoen for lækage. Parafilmen kan eventuelt holdes på plads ved hjælp af elastikker. Vend røret for at sikre, at der ikke er huller eller huller.
- For at skabe måltidsleveringsenheden skal du skære et centreret hul med en diameter på 2,5 cm i skruehætten på konisk rør ved hjælp af et skarpt barberblad eller, for bedre konsistens, en drejebænk. Stræk et 5 cm × 5 cm stykke parafilm jævnt, så det stort set fordobles i størrelse. Parafilmen skal være tynd nok til, at myg let kan gennembore det, men der bør ikke være lækager. Luk over skruehættens yderside for fuldt ud at dække hullet og sæt hætten til side.
BEMÆRK: For at øge tiltrækning til Glytube, før strække parafilm, parfume det med menneskelig lugt ved forsigtigt at gnide det på et plaster på den menneskelige hud uden kosmetik anvendes, idet man sørger for, at der ikke huller er skabt. Dette anbefales, hvis eksperimentet ikke har til formål at undersøge de sensoriske signaler, der kræves for myg at nærme sig måltidet. - Varm både det forseglede rør af glycerol og måltidet (med alle komponenter undtagen ATP) i et 42-45 °C vandbad i mindst 15 minutter. ATP må ikke forvarmes. tilføje det umiddelbart før du starter eksperimentet.
- Tilsæt ATP til det opvarmede måltid og vortex grundigt. Pipette 2 mL af det opvarmede måltid ind i skruehættens indre kammer og læg forsigtigt det omvendte, opvarmede, glycerolfyldte 50 mL koniske rør i det. Skru hætten delvist med måltidet på det glycerolfyldte rør – lige nok til at forhindre lækage af måltidet eller glycerolen.
BEMÆRK: Det anvendte måltidsvolumen kan variere mellem 1 mL og 2,5 mL. Lavere mængder kan især være nyttige, når måltider bruges til at levere forbindelser, der er knappe eller dyre. Det er vigtigt at arbejde hurtigt på dette trin, så måltidet ikke køler ned til omgivelsestemperatur og reducerer sandsynligheden for maksimal fodring. Kølehastigheden afhænger af omgivelsestemperaturen i det rum, hvor disse trin udføres, men de skal typisk være afsluttet inden for 5 minutter ved 25 °C. - Placer den samlede Glytube oven på mygbeholderen og lad myggene få adgang til foder i mindst 15 minutter for at opnå maksimale fodringshastigheder.
- For optimal fodring skal du placere myggebeholdere inde i et kammer udstyret med en CO2-pude og tillade mindst 15 minutters akklimatisering ved 25-28 °C og 70-80% fugtighed, før måltidet leveres. Analysen kammer, der anvendes her, er en enkel og billig ændring af en tidligere offentliggjort setup16. Det bruger en gennemskinnelig polypropylen opbevaringsboks af størrelse 36 cm L × 31 cm W × 32 cm H med et aftageligt låg. Et hul med en diameter på 1,5 cm lavet i kammervæggen giver mulighed for CO2-levering gennem silikonerør. CO 2-diffusionspuden anbringes i det indre centrum af låget til levering af renset luft og CO2 for at konditionere kammeratmosfæren under forsøget.
BEMÆRK: Sørg for, at værtssignaler (varme og CO2, med valgfri værtslugt16) er til stede, så myggene tiltrækkes af membranføderen. Hvis myggene ikke fortrænger under Glytuben, skal du kontrollere, at CO2 leveres korrekt, og at måltidet og Glytube er tilstrækkeligt varme. Hvis en ekstern CO2-kilde ikke er tilgængelig, kan CO2 leveres via pust af udåndet menneskelig ånde. - Efter fodring kan Glytube-hætten kasseres som biofarligt affald eller genbruges efter iblødsætning i en lav procentdel blegemiddelopløsning og grundigt skylning i vand.
3. Kvantificering af forbrugte måltider
- Vejning af myg, der skal anvendes til yderligere forsøg
BEMÆRK: Vejning af myg for at kvantificere måltidsstørrelsen gør det muligt at bruge dem til yderligere levende eksperimenter, men denne metode kræver at tage vægtmålinger fra en gruppe på 5 myg. Da vægte af individuelle myg er vanskelige at måle præcist ved hjælp af de fleste laboratorievægte, kan variation i individuel måltidsstørrelse ikke let kvantificeres ved at måle vægte. Vejning anbefales kun til situationer, hvor kvinder synligt engorge på måltidet.- Kolde bedøve myg ved at flytte deres beholder til et 4 °C koldt rum eller placere den på is.
- Vejer grupper på 5 kvinder fra den ufed kohorte (dvs. myg, der aldrig blev tilbudt et måltid) og beregner deres gennemsnitlige vægt som estimatet af "pre-feeding" vægt. Den gennemsnitlige vægt af en ufed myg afhænger af genotype, køn og opdrætsforhold. Unfed kvindelige Ae. aegypti myg opdrættet med ad libitum adgang til saccharose typisk vejer ca 2 mg hver.
- Fra den eksperimentelle kohorte (dvs. myg, der blev tilbudt et måltid), sortere kvinder i "fodret" og "ikke fodret" bunker baseret på abdominal distension observerbare med øje7. Del hver af de "fodrede" og "ikke fodrede" bunker henholdsvis i grupper på 5 myg til vejning. Myg inden for hver gruppe på 5 bør udledes af den samme eksperimentelle kohorte til at tage gruppevægtmålinger. Beregn den gennemsnitlige vægt pr. kvinde fra hver af de "fodrede" og "ikke fodrede" bunker i forsøgsgruppen.
- Fluorescensmåling til slutpunktsanalyse7,27,34
BEMÆRK: For at opnå præcise målinger af måltidsstørrelse fra individuelle myg, der ikke længere er nødvendige for yderligere levende forsøg, skal myggene og de resterende 1 mL mel, der indeholder 0,002% fluorescein, opbevares ved -20 °C umiddelbart efter fodring. Eksperimentet kan sættes på pause her. Denne metode er skitseret i Figur 2.- For at generere en referencestandardkurve skal du forberede en seriel fortynding af det samme måltid, der indeholder 0,002% fluorescein, der blev tilbudt den eksperimentelle gruppe af myg. Der vil være i alt 8 standard kurve løsninger. I hver af disse opløsninger vil det endelige måltidsvolumen, der indeholder 0,002 % fluorescein, være 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,3125, 0,15625, 0,078125 eller 0 μL, og hver vil være i 1x fosfat-buffered saltvand (PBS) for et samlet volumen på 100 μL (f.eks. 5 μL mel indeholdende 0,002% fluoresccein i 95 μL 1x PBS).
- For at gøre den første opløsning af standardkurven tilsættes 50 μL mel, der indeholder 0,002% fluorescein, til 950 μL 1x PBS og vortex grundigt (slutvolumen: 5 μL mel indeholdende 0,002% fluoresccein i 95 μL 1x PBS). For at gøre resten af standardkurveopløsningerne skal du udføre en 2-fold fortynding for hvert trin ved at tage 500 μL fra det forrige rør og tilføje det til et nyt rør, der indeholder 500 μL 1x PBS. Vortex længe før du forbereder den næste 2-fold fortynding.
- For at forberede brønde, der skal bruges til at generere en referencestandardkurve, skal du pipette 100 μL af hver af standardkurveopløsningerne ind i hver af de 8 brønde i den første kolonne på en 96-brønds PCR-plade. Tilsæt 1 ufed kontrol myg til hver af de samme 8 brønde i den første kolonne af pladen. Gentag i anden kolonne af pladen for en replikatmåling.
BEMÆRK: Hvis forsøgsgrupper tilbydes forskellige måltidstyper, skal der udarbejdes en separat referencestandardkurve for hver måltidstype. - Der tilsættes 100 μL 1x PBS i hver resterende brønd til de uindskredne kontrol- og forsøgsgrupper. Hvis vævet skal afbrydes i de efterfølgende trin ved hjælp af en perlemølle homogenisator eller vortex, tilsættes en 3 mm borosilikat massiv glasperle til hver brønd.
- Som en negativ kontrol tilsættes 1 ufed myg til hver brønd i de næste 2 kolonner af pladen. Den fluorescens, der måles i denne gruppe, sætter en baseline cutoff for at tage højde for vævs autofluorescens og vil blive brugt til at afgøre, om en myg i den eksperimentelle gruppe, der fodres med måltidet.
- Tilsæt 1 myg per brønd til de resterende brønde fra de eksperimentelle grupper, der blev tilbudt et måltid.
- Forsegl pladen forsigtigt og afbryd vævet ved manuel slibning. Underlivet skal homogeniseres grundigt for at frigive måltidet. Metoder til at forstyrre væv omfatter brug af en perlemølle homogenisator med 3 mm borosilikat massivt glas perler (30 Hz i 30 sekunder), vortex mixer med 3 mm borosilicate massivt glas perler, eller en pestle vinkelsliber uden perler.
- Centrifuge pladen ved 2000 omdrejninger i minuttet i 1-2 min for at indsamle lysatet.
- Forbered en sort 96-brønds plade med 180 μL 1x PBS i hver brønd.
- Der overføres 20 μL lysat til hver brønd med 180 μL 1x PBS og blandes. Hvis det er muligt, skal du bruge en multi-kanal pipette på dette trin for øget hastighed og bedre konsistens.
- Mål fluorescensintensiteten for hver brønd ved hjælp af en pladelæser på 485/520-excitations-/emissionskanalen. Generer referencestandardkurven ved at afbilde den kendte mængde mel i forhold til den tilsvarende måling af fluorescensintensiteten.
- Ved hjælp af den genererede referencestandardkurve ekstrapoleres det måltidsvolumen, der indtages af hver af forsøgsgruppemygene. Træk den gennemsnitlige fluorescensintensitetsaflæsning af den negative kontrolgruppe af ufed myg fra fluorescensintensitetsaflæsningen for hver eksperimentel gruppeperson for at korrigere for baseline væv autofluorescens.
Representative Results
Figur 1 viser et skema til samling af Glytube, mens figur 2 viser en oversigt over det eksperimentelle design til måling af måltidsstørrelse ved hjælp af den fluorescensbaserede analyse, der er beskrevet her. Figur 3 giver repræsentative målinger af fluoresceinmelstørrelse fra et blodfodringseksperiment. Figur 4, figur 5og figur 6 illustrerer et udsnit af biologiske spørgsmål, der kan behandles ved hjælp af denne protokol. Anvendelse af protokollen er vidtrækkende og omfatter ændring af blodmel sammensætning, fodring farmakologiske forbindelser, præcist kvantificere sub-optimale blod måltider eller mindre nektar måltider, og sammenligne fodring adfærd på tværs af myg genotyper.
For at generere en standardkurve for beregninger af melvolumen afbildes fluorescensaflæsninger fra de udpegede referencebrønde, der hver indeholder en ufed myg og et kendt volumen af måltidet med 0,002% fluorescein (Figur 3A). Fluorescensaflæsninger fra de resterende brønde, som indeholder myg fra enten den negative kontrolgruppe af ufærede myg eller den eksperimentelle gruppe af myg, der tilbydes et måltid, sammenlignes med denne standardkurve for at kvantificere måltidsvolumen (μL), der forbruges af hver myg (Figur 3B). For at validere basisaflæsningerne i denne analyse skal det bekræftes, at myg fra den ufærede negative kontrolgruppe ikke tildeles en positiv værdi på μL forbrugt (Figur 3B, venstre). Selv om alle kvinder i forsøgsgruppen blev tilbudt blodmelet, fodrede nogle myg(figur 3B, midten),og nogle gjorde det ikke(figur 3B, til højre). Dette resultat viser, at der kan opnås to typer data fra denne protokol: 1) procentdelen af det samlede antal hunner, der fodrer med et givet måltid, og 2) den mængde, der indtages af de hunner, der fodrer med et givet måltid.
Denne protokol kan bruges til at levere og kvantificere måltider med forskellige proteinsammensætninger. Figur 4A,B viser data indsamlet ved hjælp af måltider tilsat fluorescerende. Andelen af myg, der fodrede, og det måltidsvolumen, de indtagede, blev beregnet ud fra fluorescensaflæsningerne. Disse aflæsninger er meget følsomme og giver mulighed for præcis kvantificering af μL, men har den begrænsning, at myg ikke kan bruges til fremtidige levende eksperimenter. Figur 4C,D viser data indsamlet fra et uafhængigt eksperiment med myg, der blev scoret som fodret eller unfed af øjet, efter at de blev tilbudt måltider uden fluorescein. Måltidsstørrelse blev beregnet som gennemsnitlig vægt / kvinde fra grupper på 5 myg. Selv om disse vægtmålinger er mindre følsomme end fluorescensmålinger, gør de det muligt at genvinde hunnerne og bruge dem til yderligere levende forsøg. Andelen af myg, der fodrer, kan variere på tværs af forskellige eksperimentelle dage, som afspejlet i figur 4A og figur 4C.
Figur 5 viser mængden forbruges af måltider, der indeholder lægemidler, der regulerer myg vært-søger adfærd. I disse eksperimenter blev kvinder tilbudt blod, saltvand + ATP eller saltvand + ATP-måltider med 100 μM af den menneskelige NPY Y2-receptor agonist, TM30338. Dette stof ændrer værtssøgende adfærd gennem aktivering af Ae. aegypti NPY-lignende receptor 7. Måling af måltidsstørrelser er afgørende for fortolkningen af eksperimenter for at vurdere virkningen af dette lægemiddel på post-blod-fodring adfærd, fordi det giver forskeren mulighed for at beregne den dosis, der forbruges af hver kvinde.
I de foregående eksempler blev hunnerne fodret med enten blod eller erstatningsblodmåltider, som alle resulterede i 3-5 μL måltider(figur 3, figur 4, figur 5). Denne fluorescensbaserede analyse kan også bruges til at måle mindre og/eller mere variable måltidsstørrelser, der ikke kan skelnes nøjagtigt fra gennemsnitlige gruppevægtmålinger. I figur 6blev den samme fluorescenskvantificeringsprotokol brugt til at måle nektarfodringsadfærd ved at udskifte Glytube for en bomuldskugle mættet med 10% saccharose indeholdende 0,002% fluorescein. Nektarsukker kan ikke præsenteres i Glytube-analysen, fordi hunnerne ikke kan påvise tilstedeværelsen af nektarsukker med stylet og ikke indleder fodring27. Disse data gør det muligt for forskeren at fastslå, at sukkermåltider konsekvent er mindre end blodmåltider efter aftale med tidligere arbejde34 (Figur 6).
Figur 1: Opsætning af Glytube-metode, der bruges til at fodre måltider til myg. (A) Skematisk over en dekonstrueret Glytube bruges til at fodre blod og andre måltider til myg. (B) Skematisk over en Glytube præsenteret oven på en beholder med myg med et netlåg. Kvindelige myg kan gennembore gennem netlåget for at fodre. (C) Fotografier af Glytube (øverst) og kvindelige Aedes aegypti myg før, under og efter fodring (nederst, fra venstre mod højre) på et Glytube-leveret måltid. Myg er vist piercing gennem masken, der dækker deres beholder for at få adgang til membran feeder. (D) Fotografier, der viser udseendet af kvindelige Ae. aegypti myg, der er unfed (venstre), og som har engorged på enten en kunstig blodmel (højre, top) eller en saltvand + ATP måltid (højre, bund). Glytube-metoden blev tidligere offentliggjort i Costa-da-Silva et al. (2013)20. Fotografier i (C) og (D) er høflighed af Alex Wild. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Skematisk over, hvordan måltidsstørrelsen kvantificeres efter Glytubes blodfodringsprotokol. (A) Myg tilbydes et måltid med fluorescein (top, eksperimentel gruppe) eller intet måltid (bund, ufed negativ kontrolgruppe). (B) Enkelte myg tilsættes til en 96-brønds plade efter afslutning af fodringsforsøget. (C) Standardkurven genereres ved hjælp af kendte mængder mel, der indeholder 0,002 % fluorescein. (D) Myg homogeniseres for at frigive forbrugt fluorescerende, og fluorescensniveauer i hver brønd kvantificeres ved hjælp af en pladelæser. Denne fluorescenskvantificeringsmetode ændres fra Liesch et al. (2013)34. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Glytube-blodfodringseksperiment med fluoresceinbaseret kvantificering. (A) Standardkurvemålinger fra brøndene, hvor en myg fra den ufederede kontrolgruppe blev føjet til en kendt mængde mel indeholdende 0,002% fluorescein (y-akseskala = vilkårlige enheder). (B) Måltidsvolumen beregnet ved hjælp af fluorescensaflæsninger for hunner i den ufærede kontrolgruppe (venstre, sort, n = 40), den eksperimentelle gruppe, der fodrede med blod (mellem, rød, n = 37), og den eksperimentelle gruppe, der ikke levede af blod (højre, rød, n = 23). Hvert punkt repræsenterer en måling fra en individuel kvinde. Data vises som median med rækkevidde. Bogstaver angiver statistisk forskellige grupper, Kruskal-Wallis test med Dunn's flere sammenligning, p<0.01. Disse data blev offentliggjort i Jové et al. (2020)27. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Kvantificering af måltider med forskellig proteinsammensætning. Hunnerne blev tilbudt måltider af enten fåreblod (rødt), kunstigt blod med humane blodproteiner (Kogan (1990)22) (orange) eller proteinfri saltvand + ATP-måltid (aqua)7. (a)Procentdel af kvinder, der fodres, scorede ved hjælp af fluorescensaflæsninger. Hvert punkt repræsenterer en gruppe på 12-16 kvinder. Data vises som medianer med intervaller, n = 12. (B) Måltidsvolumen beregnet ved hjælp af fluorescensaflæsninger. Hvert punkt repræsenterer en måling fra en enkelt kvinde i et enkelt forsøg fra figur 4A. Data vises som medianer med intervaller, n = 12. (C) Procentdel af hunner, der er fuldt engorged efter kunstig membranfodring, scoret med øjet. Hvert punkt repræsenterer procentdelen af kvinder, der er engorged fra grupper på 20-30 kvinder. Data vises som medianer med intervaller, n = 23. (D) Måltidsstørrelser scoret som vægt/kvinde efter fodringsstatus blev scoret med øjet. Vægte blev beregnet som gennemsnittet af grupper på 5 myg. Data vises som medianer med intervaller, n = 23. A–D: Bogstaver angiver statistisk forskellige grupper, Kruskal-Wallis test med Dunn's multiple sammenligning, p<0.05. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Kvantificering af måltider med farmakologiske forbindelser. Hunnerne indtager måltider af samme størrelse fåreblod (rød), saltvand + ATP (aqua) og saltvand + ATP + 100 μM dosis af human NPY Y2 receptor agonist TM30338 (mørkeblå). Måltidsvolumen beregnet ved hjælp af fluorescensmålinger. Hvert punkt repræsenterer en måling fra en individuel kvinde. Data vises som medianer med intervaller, n = 12. Bogstaver angiver statistisk forskellige grupper, Kruskal-Wallis test med Dunn's multiple sammenligning, p<0.05. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Kvantificering af mindre nektarmåltider. (A)Skematisk over nektarfodringsanalyse. (B) Måltidsvolumen beregnet ved hjælp af fluorescensmålinger for hundyr af vild type, der tilbydes måltider af enten vand (blå, n = 36) eller 10% saccharose (grøn, n = 53), hver med 0,002% fluorescein, i nektarfodringsanalysen. Hvert punkt repræsenterer en måling fra en individuel kvinde. Data vises som medianer med områder. Bogstaver angiver statistisk forskellige grupper, Mann-Whitney test, p<0.05. Disse data blev offentliggjort i Jové et al. (2020)27. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Kunstigt blodmåltid | |||
| Koncentration af stamopløsning (mg/mL) | Volumen af stamopløsning i mel (μL/mL) | Koncentration af slutmel (mg/mL) | |
| Proteinkomponenter* | |||
| γ-Globuliner | 50 | 300 | 15 |
| Hæmoglobin | 35 | 230 | 8 |
| Albumin | 300 | 340 | 102 |
| Protein i alt | - | - | 125 |
| Komponenter, der ikke er proteinholdige | |||
| Koncentration af stamopløsning (mM) | Volumen af stamopløsning i mel (μL/mL) | Endelig måltidskoncentration (mM) | |
| Nacl | I γ-globulin lager | - | 5-10 |
| NaHCO3 | I γ-globulin lager | - | 120 |
| Atp | 200 | 5 | 1 |
| Vand | - | 125 | - |
| *Proteinkomponenter fremstilles i stamopløsning af dobbeltdestilleret vand, bortset fra γ-Globuliner, som opløses i 400 mM NaHCO3 og omfatter en variabel mængde NaCl (2-4%) i produktet. | |||
Tabel 1: Opskrift på tilberedning af måltider af kunstigt blod (tilpasset fra Kogan (1990)22). Kunstigt blod består af protein- og ikke-proteinkomponenter, der regelmæssigt findes i humant blod, og giver mulighed for at variere forholdet mellem disse komponenter. Myg kan producere æg efter fodring på kunstigt blod7,22.
| Saltvand Måltid | |||
| Komponent | Koncentration af stamopløsning (mM) | Volumen af stamopløsning i mel (μL/mL) | Endelig måltidskoncentration (mM) |
| Nacl | - | - | - |
| NaHCO3 | 400 | 300 | 120 |
| Atp | 200 | 5 | 1 |
| Vand | - | 695 | - |
Tabel 2: Opskrift på saltvandsmåltid med ATP (tilpasset fra Duvall et al. (2019)7). Proteinfri saltvand måltider kan bruges til at levere forbindelser af interesse for myg, mens du stadig efterligner abdominal udspiling, der opstår efter blod-fodring, men uden at udløse æg udvikling, der opstår, når proteiner indtages.
Discussion
Til mange laboratorieapplikationer tilbyder kunstige membranfødere forskellige fordele sammenlignet med levende værter ved at give forskere mulighed for direkte at manipulere indholdet af måltidet. Selvom flere metoder er tilgængelige til kunstig membranfodring, giver den metode, der er beskrevet her, fordele i fleksibilitet, omkostninger og gennemløb. Sammenlignet med andre kommercielle membranfødere kræver Glytube-analysen et lille måltidsvolumen, hvilket gør det til en effektiv leveringsmekanisme for dyre reagenser, herunder lægemidler eller patogener, ved at minimere det samlede volumen, der kræves7,35. Da både de proteinfri saltvands- og kunstige blodmåltider fremmer engorgement, kan forbindelser eller patogener tilsættes til enten måltidet som et højoverførselshastigheds- og ikke-invasivt alternativ til injektioner. Derudover kan hver komponent i Glytube nemt vaskes, udskiftes eller skaleres op for at levere og kvantificere flere måltidstyper uden krydskontaminering af fodringsapparatet.
For at kvantificere måltidsmængder, der forbruges af myg, muliggør den fluorescensbaserede metode mere præcis måltidsstørrelse kvantificering end vejning af myg før og efter fodring. Det skal bemærkes, at denne metode er en endepunktsanalyse. I modsætning hertil gør vejningen det muligt at holde myggene i live for yderligere eksperimenter. Ved at bruge en pladelæser kan den fluorescensbaserede metode let skaleres op til høj gennemstrømningsquantificering af måltider, der forbruges af hundreder af individuelle kvinder.
For at opnå høje fodringsrater skal der være en kombination af tilstrækkelige værtssignaler til stede for at aktivere kvindelig værtssøgende adfærd og tiltrække kvinder til føderen. Hvis myggene ikke fortrænger under Glytuben, opvarmes måltidet muligvis ikke korrekt, eller CO2-levering er muligvis ikke tilstrækkelig. Tilsætning af menneskelig lugt til membranoverfladen øger pålideligt tiltrækningskraften af den kunstige membran. Hvis myg observeres under Glytube, men undlader at fodre, kan måltidets sammensætning være skyld. Kvinder må ikke fodre, hvis selve måltidet ikke er varmt, blodet er for gammelt, eller hvis tilsætningsstofferne til måltidet i sig selv er aversive eller forårsager en uønsket kemisk reaktion36. Yderligere ATP øger også fodringshastigheden pålideligt og kan skaleres op til en endelig koncentration på 2 mM i hver af de medfølgende opskrifter. Hunnerne må ikke fodre, hvis parafilmen ikke trækkes stramt hen over Glytube-hætten. parafilmen skal være ensartet gennemsigtig og bør ikke spænde, da dette forhindrer kvinden i effektivt at gennembore parafilmen med sin stylet. Hvis måltidet lækker gennem Glytuben på masken, kan parafilmen være revet i stykker under strækningsprocessen og bør udskiftes.
Ændring af måltidet sammensætning kan også give forskerne mulighed for at manipulere den tid, der er nødvendig for at rydde måltidet fra midgut samt den efterfølgende vært-søger adfærd. De måltider, der præsenteres her, kræver 24-36 timer til fordøjelse7 svarende til animalsk blod. Efter fodring på nogen af disse måltider vil kvinder undertrykke værtssøgende i fordøjelsestidsvinduet. Da saltvand måltid mangler protein, hunner vende tilbage til vært-søger efter måltidet er ryddet. Hvis et hurtigere afkast er ønskeligt, kan forskere vælge alternative "hurtig clearing" saltvand måltider, der udskilles i ca 6 timer27. Mens sammensætningen af saltvandsmelet præsenteret her matches for direkte at sammenligne resultater med det kunstige blodmåltid, matcher det "hurtige clearing" måltid bedre fysiologiske saltniveauer, der findes i hvirveldyrblod.
De metoder, der er beskrevet her, har begrænsninger, der bør overvejes, før du vælger den analyse, der passer bedst til forskerens eksperimentelle mål. De beskrevne fluoresceinmålinger tillader ikke, at myg igen anvendes til yderligere forsøg. Vægtmålinger kan dog foretages inden kvantificering af måltidsstørrelse ved hjælp af fluoresceinanalysen. Hvis vægt og måltid størrelse er konsekvente på tværs af flere forsøg for et givet måltid, vægt kan bruges som en proxy i fremtidige eksperimenter. Desuden skelner denne protokol ikke mellem underskud i værtssøgende versus blodfodringsadfærd; myg, der viser funktionsnedsættelser i at finde membranen feeder vil have en reduktion i fodring satser og / eller måltid størrelse. Ved at tilføje et kamera til at optage adfærd i hele analysen, kan forskerne afgøre, om hunnerne ikke kan finde Glytube, eller om de finder Glytube, men ikke foder.
Analysen, der er beskrevet her, kan tilpasses til at udforske mange udestående spørgsmål relateret til fodringsadfærd hos myg. For eksempel kan bidraget fra specifikke blodproteiner undersøges ved at ændre forholdet mellem bestanddele proteiner eller den samlede proteinkoncentration i det kunstige blodmel. For at evaluere måltidsstørrelser fra flere fodringshændelser kan farvestoffer med forskellige fluorescensspektre tilføjes for at skelne måltider fra unikke kilder37. Denne protokol kan også ændres for separat at stimulere de interne mundstykker, der registrerer blod, og som bruges til indtagelse (dvs. stylet), og de kemosensoriske vedhæng, der kontakter huden (dvs. labium, ben), da myggen lander for at begynde blodfodring36. For eksempel, hvis ligands tilsættes direkte til måltidet, kontakter de ikke labium og ben, da membranen kun gennembores af stylet. Hvis der i stedet tilsættes ligands til parafilmens yderside, forbliver de adskilt fra måltidet og kan kontaktes af labium og ben36. Endelig er de detaljerede kinetik af blodfodringsadfærd ikke godt forstået, og den metode, der præsenteres her, kan ændres for at kombinere sporing i høj opløsning med maskinlæringsværktøjer til at udtrække adfærdsmæssige udlæsninger af bevægelse, kropsholdning og fodringsdynamik38.
Denne protokol er rettet mod at være brugervenlig og omkostningseffektiv, med evnen til at tjene forskere, der beskæftiger farmakologiske og genetiske manipulationer til at studere myg blod-fodring og post-blod-fodring adfærd.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Nipun Basrur, Adriana K. Rosas Villegas, Nadav Shai og Trevor Sorrells for kommentarer til manuskripterne og Zhongyan Gong og Kyrollos Barsoum for teknisk bistand. Vi takker Alex Wild for fotografier, der anvendes i figur 1. K.V. blev støttet af Boehringer Ingelheim Fonds ph.d.-stipendium. V.J. blev delvist støttet af NIH T32-MH095246. Dette arbejde blev delvist støttet af et tilskud til The Rockefeller University fra Howard Hughes Medical Institute gennem James H. Gilliam Fellowships for Advanced Study-programmet til V.J. Dette materiale er baseret på arbejde, der støttes af National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program under Grant No. NSF DGE-1325261 til V.J. Eventuelle udtalelser, resultater og konklusioner eller anbefalinger, der kommer til udtryk i dette materiale, er forfatterens(e) udtalelser, resultater og anbefalinger, der kommer til udtryk i dette materiale, og afspejler ikke nødvendigvis National Science Foundations synspunkter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 3 mm diameter borosilicate solid-glass bead | MilliporeSigma | Z143928 | For use for bead mill homogenizer; not required if using pellet pestle grinder |
| 32 oz. high-density polyethylene (HDPE) plastic cup | VWR | 89009-668 | Example mosquito container used for feeding assays shown; alternate options can be used |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 96-well black polystyrene plate | ThermoFisher | 12-566-09 | |
| 96-well PCR plate sealing film | Bio-Rad | MSB1001 | Alternate options can be used |
| 96-well PCR plates | Bio-Rad | HSP9621 | Alternate options can be used |
| Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | MilliporeSigma | A6419 | |
| Albumin (human serum) | MilliporeSigma | A9511 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213 | Alternate options can be used to block light entering fluorescein container |
| Balance | Fisher Scientific | 01-911 | Alternate options can be used |
| Bead mill homogenizer | Qiagen | 85300 | Not required if using pellet pestle grinder |
| Cotton ball | Fisher Scientific | 22456880 | For nectar-feeding; alternate options can be used |
| Defibrinated sheep blood | Hemostat Laboratories | DSB100 | Alternate options can be used |
| Drosophila CO2 fly pad | Tritech Research | MINJ-DROS-FP | Alternate options can be used |
| Fluorescein | MilliporeSigma | F6377 | |
| Fluorescence plate-reader | ThermoFisher | VL0000D0 | Alternate options can be used |
| Gamma-globulin (human blood) | MilliporeSigma | H7379 | |
| Glycerol | MilliporeSigma | G7893 | |
| Hemoglobin (human) | MilliporeSigma | G4386 | |
| Laboratory wrapping film - parafilm | Fisher Scientific | 13-374 | |
| Magnetic stirrer | Fisher Scientific | 90-691 | Alternate magnetic stirrers can be used |
| Microcentrifuge for 96-well plate | VWR | 80094-180 | Alternate options can be used |
| Microcentrifuge Tubes | MilliporeSigma | 2236412 | Alternate options can be used |
| Pellet pestle grinder | VWR | KT749521-1500 | Not required if using bead mill homogenizer |
| Phosphate buffered solution (PBS) | Fisher Scientific | BW17-516F | Optional |
| Razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | Alternate options can be used, such as a lathe for better consistency of cutting |
| Rubber bands | |||
| Silicone tubing | McMaster Carr | Needed if using a fly pad for CO2 delivery | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | S233 | |
| Sodium chloride (NaCl) | MilliporeSigma | S9888 | |
| Stir bars | Fisher Scientific | 14-512 | Alternate magnetic stir bars can be used |
| Translucent polypropylene storage box with removable lid | Example box used for feeding assays shown | ||
| Vortex mixer | |||
| Water bath | Alternate heating device may be used | ||
| White 0.8 mm polyester mosquito netting | American Home & Habit Inc. | F03A-PONO-MOSQ-M008-WT | Alternate options can be used |
References
- Bhatt, S., et al. The global distribution and burden of dengue. Nature. 496 (7446), 504-507 (2014).
- Rogers, D. J., Wilson, A. J., Hay, S. I., Graham, A. J. The global distribution of yellow fever and dengue. Advances in Parasitology. 62 (05), 181-220 (2006).
- Chouin-Carneiro, T., et al. Differential susceptibilities of Aedes aegypti and Aedes albopictus from the Americas to Zika virus. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (3), (2016).
- Guerbois, M., et al. Outbreak of Zika virus infection, Chiapas State, Mexico, 2015, and first confirmed transmission by Aedes aegypti mosquitoes in the Amercias. Journal of Infectious Diseases. 214 (9), 1349-1356 (2016).
- Weaver, S. C., et al. Zika virus: history, emergence, biology, and prospects for control. Antiviral Research. 130, 69-80 (2016).
- Attardo, G. M., Hansen, I. A., Raikhel, A. S. Nutritional regulation of vitellogenesis in mosquitoes: implications for anautogeny. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 35 (7), 661-675 (2005).
- Duvall, L. B., Ramos-Espiritu, L., Barsoum, K. E., Glickman, J. F., Vosshall, L. B. Small-molecule agonists of Ae. aegypti neuropeptide Y receptor block mosquito biting. Cell. 176 (4), 687-701 (2019).
- Dimond, J. B., Lea, A. O., Hahnert, W. F., DeLong, D. M. The amino acids required for egg production in Aedes aegypti. The Canadian Entomologist. 88 (2), 57-62 (1956).
- Guerrero, D., Cantaert, T., Missé, D. Aedes mosquito salivary components and their effect on the immune response to arboviruses. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 1-11 (2020).
- Raquin, V., Lambrechts, L. Dengue virus replicates and accumulates in Aedes aegypti salivary glands. Virology. 507, 75-81 (2017).
- Farjana, T., Tuno, N. Multiple blood feeding and host-seeking behavior in Aedes aegypti and Aedes albopictus (diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 50 (4), 838-846 (2013).
- Scott, T. W., Takken, W. Feeding strategies of anthropophilic mosquitoes result in increased risk of pathogen transmission. Trends in Parasitology. 28 (3), 114-121 (2012).
- Ross, P. A., Lau, M. J., Hoffmann, A. A. Does membrane feeding compromise the quality of Aedes aegypti mosquitoes. PLoS ONE. 14 (11), 1-19 (2019).
- Ross, P. A., Axford, J. K., Richardson, K. M., Endersby-Harshman, N. M., Hoffmann, A. A. Maintaining Aedes aegypti mosquitoes infected with wolbachia. Journal of Visualized Experiments. 2017 (126), 1-8 (2017).
- Briegel, H., Hefti, M., DiMarco, E. Lipid metabolism during sequential gonotrophic cycles in large and small female Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 48 (5), 547-554 (2002).
- McMeniman, C. J., Corfas, R. A., Matthews, B. J., Ritchie, S. A. S., Vosshall, L. B. Multimodal integration of carbon dioxide and other sensory cues drives mosquito attraction to humans. Cell. 156 (5), 1060-1071 (2014).
- Pakes, S. P., et al. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , National Academic Press. Washington, DC, USA. (2011).
- Deng, L., Koou, S. Y., Png, A. B., Ng, L. C., Lam-Phua, S. G. A novel mosquito feeding system for routine blood-feeding of Aedes aegypti and Aedes albopictus. Tropical Biomedicine. 29 (1), 169-174 (2012).
- Gunathilaka, N., Ranathunge, T., Udayanga, L., Abeyewickreme, W. Efficacy of blood sources and artificial blood feeding methods in rearing of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) for sterile insect technique and incompatible insect technique approaches in Sri Lanka. BioMed Research International. 2017, 3196924 (2017).
- Costa-da-Silva, A. L., et al. Glytube: a conical tube and parafilm M-based method as a simplified device to artificially blood-feed the Dengue vector mosquito, Aedes aegypti. PLoS ONE. 8 (1), 53816 (2013).
- Carvalho, D. O., et al. Mass production of genetically modified Aedes aegypti for field releases in Brazil. Journal of Visualized Experiments. 83 (83), 1-10 (2014).
- Kogan, P. H. H. Substitute blood meal for investigating and maintaining Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 27 (4), 1-4 (1990).
- Gonzales, K. K., Hansen, I. A.
- Baughman, T., et al. A highly stable blood meal alternative for rearing Aedes and Anopheles mosquitoes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (12), 0006142 (2017).
- Galun, R. Feeding stimuli and artificial feeding. Bulletin of the World Health Organization. 36, 590-593 (1967).
- Galun, R. Feeding response in Aedes aegypti: stimulation by adenosine triphosphate. Science. 142, 1674-1675 (1963).
- Jové, V., et al. Sensory Discrimination of Blood and Floral Nectar by Aedes aegypti Mosquitoes. Neuron. 108, 1-18 (2020).
- Petersen, M. T., et al. The impact of the age of first blood meal and Zika virus infection on Aedes aegypti egg production and longevity. PLoS ONE. 13 (7), 1-15 (2018).
- Sissoko, F., et al. Frequent sugar feeding behavior by Aedes aegypti in Bamako, Mali makes them ideal candidates for control with Attractive Toxic Sugar Baits (ATSB). PLoS ONE. 14 (6), 0214170 (2019).
- Houseman, J. G., Downe, A. E. R. Methods of measuring blood meal size and proteinase activity for determining the effects of mated state of digestive processes of female Aedes aegypti (L.) (Diperta: Culicidae). The Canadian Entomologist. 18, 241-248 (1986).
- Redington, B. C., Hockmeyer, W. T. A method for estimating blood meal volume in Aedes aegypti using a radioisotope. Journal of Insect Physiology. 22 (7), 961-966 (1976).
- Gonzales, K. K., et al. The effect of SkitoSnack, an artificial blood meal replacement, on Aedes aegypti life history traits and gut microbiota. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
- Klowden, M. J. The endogenous regulation of mosquito reproductive behavior. Experientia. 46 (7), 660-670 (1990).
- Liesch, J., Bellani, L. L., Vosshall, L. B. Functional and genetic characterization of neuropeptide Y-like receptors in Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (10), 22486 (2013).
- Frances, S. P., Sithiprasasna, R., Linthicum, K. J. Laboratory evaluation of the response of Aedes aegypti and Aedes albopictus uninfected and infected with Dengue virus to Deet. Journal of Medical Entomology. 48 (2), (2011).
- Dennis, E. J., Goldman, O. V., Vosshall, L. B. Aedes aegypti mosquitoes use their legs to sense DEET on contact. Current Biology. 29 (9), 1551-1556 (2019).
- Harrington, L. C., et al. Heterogeneous feeding patterns of the Dengue vector, Aedes aegypti, on individual human hosts in rural Thailand. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (8), 3048 (2014).
- Hol, F. J., Lambrechts, L., Prakash, M. BiteOscope, an open platform to study mosquito biting behavior. eLife. 9, 1-24 (2020).
