Summary
Bu protokolün amacı, yapay bir membran besleyici aracılığıyla Aedes aegypti sivrisineklerine hayvansal türevli ve yapay kan yemekleri sunmak ve yutturılan yemek hacmini tam olarak ölçmektir.
Abstract
Bazı sivrisinek türlerinin dişileri, yumurta gelişimi için gerekli protein bakımından zengin kan yemekleri elde etmek için omurgalı konakları ısırırken hastalıkları yayabilir. Laboratuvarda araştırmacılar, yemek kompozisyonunun manipülasyonuna izin veren membran besleyiciler aracılığıyla sivrisineklere hayvansal türevli ve yapay kan yemekleri teslim edebilir. Burada, Aedes aegypti sivrisineklerine kan ve yapay kan yemeklerini beslemek ve bireysel dişiler tarafından tüketilen hacmi ölçmek için yöntemler sunuyoruz.
Yapay / kan yemeklerinin hedefli beslenmesi ve nicelleştirilmesi, yemek bileşenlerinin sivrisinek davranışı ve fizyolojisi üzerindeki etkilerini test etmek, enjeksiyon olmadan farmakolojik bileşikler sunmak ve sivrisinekleri belirli patojenlerle enfekte etmek de dahil olmak üzere geniş kullanım alanlarına sahiptir. Beslenmeden önce yemeğe floresan boyası eklemek, sonraki öğün boyutunun ölçülmesini sağlar. Sivrisinekler tarafından tüketilen yemek hacmi, dişiler daha sonra davranış deneyleri için kullanılacaksa, ağırlıkla veya 96 kuyulu tabaklarda tek tek kadınları homojenleştirerek ve bir plaka okuyucusu test olarak bir plaka okuyucu kullanarak floresan seviyelerini ölçerek ölçülebilir. Yemek boyutu nicelemesi, yemek bileşenlerinin değiştirilmesinin yutlanan yemek hacmini değiştirip değiştirmediğini veya yemek tüketiminin sivrisinek suşları arasında farklılık gösterip değiştirmediğini belirlemek için kullanılabilir. Hassas yemek boyutu nicelemesi, konak cazibesi veya doğurganlık üzerindeki etkileri ölçenler gibi aşağı akış tahlilleri için de kritik öneme sahiptir. Burada sunulan yöntemler, günler boyunca yemek sindirimini izlemek veya her yemeğin tek bir sivrisinek tarafından tüketimini ölçmek için farklı öğünlere (nektar ve kan gibi) eklenen birden fazla ayırt edilebilir belirteç içerecek şekilde daha da uyarlanabilir.
Bu yöntemler, araştırmacıların yüzlerce bireysel sivrisinek tarafından tüketilen yemek hacmini karşılaştırmak için tek başına yüksek verimli ölçümler yapmalarına izin verir. Bu nedenle bu araçlar, çeşitli biyolojik soruları yanıtlamak için sivrisinek araştırmacıları topluluğu için geniş ölçüde yararlı olacaktır.
Introduction
Değiştirilmiş kan yemeklerini yapay bir membran besleyici kullanarak Aedes aegypti sivrisineklerine beslemek ve her bir sivrisinek tarafından tüketilen yemek hacmini hassas bir şekilde ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, yemeğin içeriğini değiştirmek veya farklı deneysel sivrisinek grupları tarafından tüketilen yemek hacmini karşılaştırmak için esnek bir şekilde uyarlanabilir.
Ae. aegypti sivrisinek, sarıhumma, dang humması, chikungunya ve Zika 1, 2 ,3,4,5gibi hastalıklara nedenolanpatojenleri yayarak küresel sağlığı tehdit eder. Ae. aegypti dişileri zorunlu kan besleyicilerdir; yumurta gelişimi için gerekli proteini elde etmek için omurgalı kan tüketmelidirler ve her bir yumurta debriyajı en az bir konak6, 7,8'dentam bir kan unu gerektirir. Dişi sivrisinek ilk olarak cildi stylet ile delerek ve konağın bağışıklık tepkisini tetikleyen bileşikler içeren tükürük enjekte ederek konağını ısırır9. Daha sonra midgut'una stile kan pompalayarak beslenir. Enfekte bir konaktan bir kan unu tüketirken, kan kaynaklı patojenleriyutabilir 6,8, daha sonra sivrisinek midgutundan tükürük bezlerine göç edebilir10. Bu şekilde enfekte olan dişi sivrisinekler, sonraki konakları ısırırken tükürükle birlikte patojen enjekte ederek hastalık yayabilir11,12. Kan besleme davranışının mekanizmalarını anlamak ve ölçmek, sivrisinek kaynaklı hastalıkların bulaşmasını kontrol etmede çok önemli adımlardır.
Sivrisinek yetiştirme ve deneyler için birçok laboratuvar protokolü, fareler, kobaylar veya insanlar dahil olmak üzere canlı hayvanları kan kaynağı olarak kullanır13,14,15,16. Canlı hayvanların kullanımı, etik kaygıların yanı sıra personel eğitimi, hayvan barınması ve bakımı ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) politikalarına uyum için karmaşık gereksinimler getirmektedir. Ayrıca sivrisineklere teslim edilebilecek bileşik türlerini sınırlar, bu da gerçekleştirilebilecek çalışmaları kısıtlar17.
Tipik olarak konakçı cildi simüle etmek için bir membran sistemi kullanan yapay kan besleme aparatları, canlı konakçıların bakımı ihtiyacını atlatan kan besleme davranışlarını incelemek için yararlı araçlardır. Tam kan bir dizi satıcıdan satın alınabilir ve ısıtılmış, su ceketli yapay membran besleyiciler veya benzeri cihazlar kullanılarak sivrisineklere beslenebilir18,19. Bu protokolde, "Glytubes" olarak adlandırdığımız küçük, tek kullanımlık membran besleyicilerin kullanımını gösteriyoruz. Daha önce Costa-da-Silva ve ark. (2013)20tarafından yayınlanan bu membran besleyici, standart laboratuvar ekipmanlarından kolayca monte edilebilir, bu da kan yemeklerini ılımlı sayıda sivrisineklere ulaştırmak için idealdir ve daha büyük grupları veya birden fazla yemek formülasyonunu test etmek için ölçeklendirmek için basittir. Glytube, daha büyük yemek hacimleri gerektirebilecek ve tek bir öğün formülasyonunda büyük sivrisinek gruplarını toplu olarak beslemek için daha uygun olan diğer ticari yapay besleyicilere ucuz ve verimli bir alternatiftir21.
Bu protokol iki bölüm içerir: yapay yemeklerin hazırlanması/sunulması ve tüketimin ölçülmesi. İlk bölümde, Glytube'lar manipüle edilmiş diyetler sunmak için etkili bir araç olarak kullanılır. Bütün kan, bir kan unu yerine kan ikamelerinin etkilerini karşılaştırmak için tamamen yapay bir yemekle ikame edilebilir. Kogan (1990)22'den uyarlanan bir tarif burada sunulmaktadır, ancak birden fazla yapay yemek formülasyonu geliştirilmiştir23,24. Ayrıca, beslenme, farmakolojik bileşikleri enjeksiyondan daha az invaziv ve daha az zahmetli bir yöntemdir. Her öğün için gereken düşük toplam hacim (1-2 mL) nedeniyle, bu protokol pahalı reaktiflerin miktarlarını azaltmak için cazip bir teslimat yöntemi sağlar. Ae. aegypti dişiler kolayca adenozin ile tuzlu çözelti proteinsiz yemekler tüketin 5′-trifosfat (ATP)25,26, hangi tek öğün bileşenlerinin etkilerini ölçmek için bir taban çizgisi sağlar. Örneğin, Ae. aegypti'deki Neuropeptide Y benzeri reseptör 7 'nin (NPYLR7), protein bakımından zengin bir kan yemeğinden sonra konak arayan baskılamaya aracılık ettiği bilinmektedir ve NPYLR7 agonistleri proteinsiz bir tuzlu yemeğe eklendiğinde, dişi sivrisinekler tam kan tüketenlere benzer konak arayan baskılama sergilerler7.
İkinci bölümde, bireysel bir dişi sivrisinek tarafından tüketilen her yemeğin hacmini ölçmek için adımlar sunulmaktadır. Bu test floresan bazlıdır ve sadece karın distansiyonunun görsel değerlendirmesine dayanarak kadınların "beslenen" veya "beslenmemiş" olarak sınıflandırıldığı yöntemlerden daha yüksek çözünürlükte beslenme durumunu yakalar. Beslenmeden önce yemeğe floresan eklenerek, bireyler tarafından yutulan yemek hacimleri, her sivrisinek 96 kuyulu bir tabakta homojenleştirilerek ve floresan yoğunluğu okuma olarak ölçülerek ölçülebilir. Bu tahlil, yemek bileşimi veya sivrisineklerin genetik arka planı gibi değişkenlere yanıt olarak beslenme dinçliğindeki farklılıkları ölçebilir. Kesin niceleme ara öğün boyutları için kritik öneme sahiptir, örneğin kadınlara beslenme caydırıcıları içeren yetersiz yemekler sunulduğunda veya değişken boyutlarda sakkaroz yemekleri tükettiğinde27. Beslenen sivrisinekler, yemek büyüklüğü ölçülmesi sonrasında sonraki davranışsal tahliller için gerekliyse, bunun yerine anestezi edilmiş dişilerin gruplar halinde tartılması ve birey başına ortalama artan kütlenin tahmin edilmesiyle yemek büyüklüğü hesaplanabilir. Floresan işaretinden daha az kesin olmasına rağmen, tartım hala öğün hacminin toplu bir tahminini sağlar ve yemeğin doğurganlık veya sonraki konak cazibesi gibi aşağı akış süreçleri üzerindeki etkisinin incelenmesine izin verir. Kan unu boyutu değişkendir ve burada açıklanan yöntemlerle ölçülen11,28,29,yutmuş yemek boyutlarının sayısız faktöründen etkilenebilirken, önceki nicelemeler 7 ,30,31ile tutarlıdır.
Protocol
Kan besleme işlemleri canlı hayvanlar veya insan konakçıları kullanılarak yapılmamış ve Rockefeller Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) ve Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) tarafından belirlenen yönergelere uygun hale getirilmiştir.
1. Yemek hazırlama
- Fagostimülan hazırlanması, adenozin 5′-trifosfat
- Sulu NaHCO3'ün 25 mM'lik bir çözeltisi hazırlayın (moleküler ağırlık, MW = 84.006 g/mol). 25 mM NaHCO3'ün100 mL'si için, hacimsel bir şişeye 210 mg NaHCO3 ekleyin ve toplam 100 mL hacme çift damıtılmış su (ddH2O) ile doldurun. Manyetik bir karıştırma çubuğu kullanarak, tüm NaHCO3 çözülene kadar çözeltiyi iyice karıştırın.
- Sulu 25 mM NaHCO3'teki ATP disodium tuz hidratını (MW = 551.14 g/mol) 200 mM ATP'lik son konsantrasyona yeniden inşa edin. 25 mM NaHCO3 tamponda toplam 10 mL 200 mM ATP hacmi için, hacimsel bir şişeye 1,1 g ATP disodium tuz hidrat ekleyin ve toplam 10 mL hacme 25 mM NaHCO3 tampon ile doldurun. Manyetik bir karıştırma çubuğu kullanarak, tüm ATP çözülene kadar çözeltiyi iyice karıştırın.
NOT: ATP'nin hidrolizini en aza indirmek için NaHCO3gibi bir tuz çözeltisi ile tamponlanmalıdır. - ATP çözümünü aliquot ve -20 °C'de saklayın.
NOT: ATP'nin bu stok çözümü genellikle her altı ayda bir taze olarak yapılır ve aşağıda açıklanan tüm öğünler için kullanılır. Bozulmayı önlemek için, ATP aliquots birden fazla donma-çözülme döngüsüne tabi tutulmamalı veya diğer yemek bileşenleriyle birlikte ısıtılmamalıdır.
- Floresan izleyici çözeltisinin hazırlanması, floresan
- Sulu floresan%2 (w/v) stok çözeltisi hazırlayın. Toplam 10 mL stok çözelti hacmi için, oda sıcaklığında alüminyum folyoya sarılmış 15 mL konik bir tüpte 10 mL ddH2O ile 0,2 g floresan disodium tuzu karıştırın. Bu floresan stok çözeltisi, aşağıda açıklanan tüm öğünlerde seyreltme için kullanılabilir.
NOT: Floresan ışığa duyarlı olduğundan, kapları alüminyum folyoya sararak ışığa maruz kalmaktan kaçının.
- Sulu floresan%2 (w/v) stok çözeltisi hazırlayın. Toplam 10 mL stok çözelti hacmi için, oda sıcaklığında alüminyum folyoya sarılmış 15 mL konik bir tüpte 10 mL ddH2O ile 0,2 g floresan disodium tuzu karıştırın. Bu floresan stok çözeltisi, aşağıda açıklanan tüm öğünlerde seyreltme için kullanılabilir.
- Hayvansal türevli kan yemeklerinin hazırlanması
- Tüm sivrisinekleri beslemek için gereken öğün sayısını hesaplayın; her Glytube 2 mL'lik bir yemek tutar ve yaklaşık 25 sivrisinek besler. Floresan okumaları için standart eğriyi kalibre etmek için bir öğün daha hazırlayın. Aksi belirtilmedikçe, bu bölümdeki tüm adımlar son hacmi 2 mL olan bir yemek hazırlamak için gereken reaktif miktarlarını açıklar.
- Hayvan kaynaklı kan yemekleri için, 1.98–2 mL defibrinated koyun kanını 15 mL konik bir tüpe aktarın (istenen kan hacmi için 3.3 adımına bakın).
NOT: Koyunlar, kobaylar ve insanlar da dahil olmak üzere ticari olarak bozulmamış omurgalı kan kaynaklarıkullanılabilir 13. Kullanmadan önce, satın alınan kanın son kullanma tarihini geçmemiş olduğundan emin olun ve özellikle kan bileşenlerinin gözle görülür bir şekilde ayrılması varsa şişeyi ters çevirerek iyice karıştırın. - Optimum beslenme için, koyun kanı bir su banyosunda 45 ° C'ye ısıtıldıktan sonra ATP'yi 1-2 mM'lik son konsantrasyona ekleyin. 1 mM ATP'lik son konsantrasyon için, önceden ısıtılmış 1,99 mL kana 200 mM ATP stok çözeltisinin 10 μL'sini ekleyin ve karıştırın. 2 mM ATP'lik son konsantrasyon için, 1,98 mL önceden ısıtılmış kana 20 μL 20 mM ATP stoğu ekleyin ve karıştırın. ATP eklenmeyecekse, 2 mL'lik sıcak defibrinated koyun kanı.
- Daha sonra yemek boyutunun floresan bazlı nicelemesi yapılacaksa, %0,002'lik son konsantrasyona floresan çözeltisi ekleyin (2 mL toplam yemek hacminde %2 floresan stoğunun 2 μL'si). Kan hacmini floresan eklenerek aynı miktarda azaltın. Referans standart eğriyi oluşturmak için %0,002 floresan içeren son yemek formülasyonunun 1 mL'sini saklayın. Tutulan hacmi sivrisineklere teslim edilen yemekle aynı şekilde tedavi edin; deney süresi boyunca aynı ışık ve sıcaklık koşullarına maruz kalmak ve daha sonra teslim edilen yemekle birlikte bunu dondurmak.
- Yapay kan yemeklerinin hazırlanması
- Tüm sivrisinekleri beslemek için gereken öğün sayısını hesaplayın; her Glytube 2 mL'lik bir yemek tutar ve yaklaşık 25 sivrisinek besler. Floresan okumaları için standart eğriyi kalibre etmek için bir öğün daha hazırlayın. Aksi belirtilmedikçe, bu bölümdeki tüm adımlar bir 2 mL yemek hazırlamak için gereken reaktif miktarlarını açıklar.
- Yapay kan hazırlamak için (Kogan'dan uyarlanmış (1990)22), Tablo 1'deolduğu gibi, önce 400 mM NaHCO 3 stok çözeltisiyapın. Toplam 10 mL 400 mM NaHCO3 (MW = 84.006 g/mol) hacmi için, hacimsel bir şişeye336 mg NaHCO 3 ekleyin ve toplam 10 mL hacme çift damıtılmış su (ddH2O) ile doldurun. Manyetik bir karıştırma çubuğu kullanarak, tüm NaHCO3 çözülene kadar çözeltiyi iyice karıştırın.
- Yapay kanın protein bileşenleri için, 400 mM NaHCO3'te50 mg/mL γ-globulin, ddH 2 O'da 35 mg/mL hemoglobin ve ddH2O'da 300 mg/mL albümin stok çözeltileri hazırlayın Protein stok çözeltileri2aya kadar 4 °C'de saklanabilir. Yapay kandaki toplam insan proteinlerinin son konsantrasyonu 125 mg/mL'dir. Buna 15 mg/mL γ-globulin, 8 mg/mL hemoglobin ve 102 mg/mL albümin son konsantrasyonları dahildir.
- Her 2 mL yemek için, Tablo 1'delistelenen stok çözeltilerinden 600 μL γ-globulin, 460 μL hemoglobin, 680 μL albümin ve250 μLddH 2 O'yu birleştirin. Yemeği sunmadan hemen önce, yemek 45 °C'ye ısıtılana kadar 10 μL 200 mM ATP stok çözeltisi eklemeyi bekleyin.
- Daha sonra yemek boyutunun floresan bazlı nicelemesi yapılacaksa, %0,002'lik son konsantrasyona floresan çözeltisi ekleyin (2 mL toplam yemek hacminde %2 floresan stoğunun 2 μL'si). Adım4.4'tekiddH 2 O'nun hacmini floresan eklenerek aynı miktarda azaltın. Referans standart eğriyi oluşturmak için %0,002 floresan içeren son öğün formülasyonunun en az 1 mL'sini koruyun. Tutulan hacmi sivrisineklere teslim edilen yemekle aynı şekilde tedavi edin; deney süresi boyunca aynı ışık ve sıcaklık koşullarına maruz kalmak ve daha sonra teslim edilen yemekle birlikte bunu dondurmak.
- Örnek proteinsiz tuzlu su yemeklerinin hazırlanması (Duvall ve ark. (2019)7'denuyarlanmıştır)
NOT: Proteinsiz tuzlu su yemekleri birden fazla şekilde hazırlanabilir7,27,32. Burada sunulan tuzlu su unu, yukarıda açıklanan yapay kan tarifinin proteinsiz bir versiyonudur.- Tüm sivrisinekleri beslemek için gereken öğün sayısını hesaplayın; her Glytube 2 mL'lik bir yemek tutar ve yaklaşık 25 sivrisinek besler Floresan ölçümleri için standart eğriyi kalibre etmek için bir ek yemek hazırlayın. Aksi belirtilmedikçe, bu bölümdeki tüm adımlar bir 2 mL yemek hazırlamak için gereken reaktif miktarlarını açıklar.
- Tuzlu su yemeğini hazırlamak için 400 mM NaHCO3stok çözeltisi yapın. Toplam 10 mL 400 mM NaHCO3 (MW = 84.006 g/mol) hacmi için, hacimsel bir şişeye336 mg NaHCO 3 ekleyin ve toplam 10 mL hacme ddH2O ile doldurun. Manyetik bir karıştırma çubuğu kullanarak, tüm NaHCO3 çözülene kadar çözeltiyi iyice karıştırın.
- Her 2 mL yemek için, 15 mL konik tüpte 600 μL 400 mM NaHCO3 ile 1,39 mL ddH2O. Yemek bir su banyosunda 45 °C'ye ısıtılana kadar 200 mM ATP stok çözeltisinin 10 μL'sini eklemeyi bekleyin.
- Daha sonra yemek boyutunun floresan bazlı nicelemesi yapılacaksa, %0,002'lik son konsantrasyona floresan çözeltisi ekleyin (toplam öğün hacminin 2 mL'sinde %2 floresan stoğunun 2 μL'si). Adım5.3'tekiddH 2 O'nun hacmini floresan eklenerek aynı miktarda azaltın. Referans standart eğriyi oluşturmak için %0,002 floresan içeren son öğün formülasyonunun en az 1 mL'sini koruyun. Tutulan hacmi sivrisineklere teslim edilen yemekle aynı şekilde tedavi edin; deney süresi boyunca aynı ışık ve sıcaklık koşullarına maruz kalmak ve daha sonra teslim edilen yemekle birlikte bunu dondurmak.
2. Sivrisineklere yemek teslimatı
- Beslenme için sivrisinek kaplarının kurulması
NOT: Sivrisinekler, aşağıdaki kriterler karşılandığı sürece çeşitli kaplarda beslenebilir. Kabın sivrisineklerin uçması için yeterince büyük olduğundan emin olun, ancak sivrisineklerin ağ yüzeyini bulması ve beslenmeye başlaması zor olacak kadar büyük değildir. Kabı örtmek için kullanılan ağ, malzeme ve delik boyutuna göre değişebilir. Delikler, dişi sivrisinek stilelerinin delinmesi için yeterince büyük olmalıdır, ancak sivrisinek kaçabilecek kadar büyük olmamalıdır. Ağı gergin olacak şekilde sıkıca sabitleyin ve Glytube besleme süresi boyunca yüzeyinde kararlı bir şekilde dinlenebilir.- Örnek bir kap (Şekil 1) modifiye edilmiş 946 mL (32 oz) yüksek yoğunluklu polietilen (HDPE) plastik kovadır. Bu kurulumu çoğaltmak için, kova kapağında ~10 cm çapında merkezi bir delik açmak için bir jilet kullanın. Sivrisinekler tarafından işgal için kabı monte etmek için, kovanın üzerine ~400 cm2 kare beyaz 0,8 mm polyester sivrisinek ağı sabitleyin, delikli kapağı sıkıca tutturmak için üzerine güvenli bir şekilde itin.
- Kanla beslenecek kadar olgun olduklarından emin olmak için eklozyondan en az 3 gün sonra olan dişi sivrisinekleri toplayın. Optimal beslenme oranları 7 gün sonra gözlenir33.
- Dişi sivrisinekleri kaba yerleştirin ve ağ ile örtün. Konteyner sivrisineklerle yoğun bir şekilde doldurulursa, kullanılan Glytube sayısını artırın. Optimal beslenme ~ 25 sivrisinek / Glytube ile elde edilir. Bu, besleme zarlarına erişim için rekabeti azaltır.
- Yemek sunulmayacak bir kontrol grubu unfed sivrisinekleri bir kenara bırakın. Ağırlık ölçüm protokolünde, beslenmemiş grubu ayrı ayrı tartın ve bu ağırlığı bir yemekle beslenen deneysel grupta kilo alımını tahmin etmek için kullanın. Floresan bazlı nicelik protokolünde, standart eğri hesaplamaları ve negatif kontroller için kuyulara bozulmamış sivrisinek grubunu ekleyin. Deneysel gruptaki temel sivrisinek dokusu otofluoresansını eşleştirmek için, standart eğrinin ve negatif kontrol kuyularının bozulmamış bir sivrisinek içerdiğiden emin olun.
- Glytube'un inşası ve kurulması (Costa-da-Silva ve ark. (2013)20'denuyarlanmıştır)
- Şekil 1'degösterildiği gibi, bir ısı kaynağı oluşturmak için, 50 mL konik bir tüpü% 100 gliserol 40 mL ile doldurun. Açık konik tüpü 5 cm × 5 cm'lik bir parafilm parçası ile kapatın ve sızıntı olasılığını en aza indirmek için 5 cm × 5 cm parafilm ilave bir parça ile tekrarlayın. İsteğe bağlı olarak, parafilm kauçuk bantlar kullanılarak yerinde tutulabilir. Delik veya boşluk olmadığından emin olmak için tüpü ters çevirin.
- Yemek dağıtım cihazını oluşturmak için, keskin bir jilet veya daha iyi kıvam için bir torna bıçağı kullanarak konik tüpün vida kapağında 2,5 cm çapında ortalanmış bir delik kesin. 5 cm × 5 cm'lik bir parafilm parçasını eşit şekilde uzatın, böylece kabaca iki katına çıkarın. Parafilm, sivrisineklerin kolayca delebileceği kadar ince olmalıdır, ancak sızıntı olmamalıdır. Deliği tamamen kapatmak ve kapağı bir kenara ayırmak için vida kapağının dış yüzeyine kapatın.
NOT: Glytube'a olan ilgiyi artırmak için, parafilimi germeden önce, hiçbir kozmetik uygulanmamış bir insan derisinin bir parçasına hafifçe sürerek, delik oluşturulmamasına dikkat ederek insan kokusuyla parfümleyin. Deney, sivrisineklerin yemeğe yaklaşması için gerekli duyusal ipuçlarını araştırmayı amaçlamamışsa tavsiye edilir. - Hem sızdırmaz gliserol tüpünü hem de yemeği (ATP hariç tüm bileşenlerle) 42-45 °C su banyosunda en az 15 dakika ısıtın. ATP'nin ön ısıtması yapmayın; denemeyi başlatmadan hemen önce ekleyin.
- Isıtılmış yemeğe ve girdaplara ATP'yi iyice ekleyin. Pipet 2 mL ısıtılmış yemeği vida kapağının iç haznesine yerleştirin ve ters, ısıtılmış, gliserol dolu 50 mL konik tüpü hafifçe içine yerleştirin. Yemeğin veya gliserol sızıntısını önleyecek kadar, yemekle birlikte kapağı gliserol dolu tüpe kısmen vidalayın.
NOT: Kullanılan yemek hacmi 1 mL ile 2,5 mL arasında değişebilir. Daha düşük hacimler, yemekler kıt veya pahalı bileşikler sunmak için kullanıldığında özellikle yararlı olabilir. Yemeğin ortam sıcaklığına soğumaması ve maksimum beslenme olasılığını azaltması için bu adımda hızlı bir şekilde çalışmak önemlidir. Soğutma oranı, bu adımların gerçekleştirildiği odanın ortam sıcaklığına bağlı olacaktır, ancak genellikle 25 ° C'de 5 dakika içinde tamamlanmalıdır. - Monte edilen Glytube'u sivrisinek kabının üzerine yerleştirin ve maksimum beslenme oranları elde etmek için sivrisineklerin en az 15 dakika beslenmesine izin verin.
- Optimum beslenme için, sivrisinek kaplarını CO2 ped ile donatılmış bir odanın içine yerleştirin ve yemeği teslim etmeden önce 25-28 ° C'de en az 15 dakika ve% 70-80 nemde alışmaya izin verin. Burada kullanılan tahlil odası, daha önce yayınlanan bir kurulumun basit ve düşük maliyetli bir modifikasyonudur16. Çıkarılabilir kapaklı 36 cm L × 31 cm W × 32 cm H boyutlarda yarı saydam bir polipropilen depolama kutusu kullanır. Oda duvarında yapılan 1,5 cm çapında bir delik, SILIKON borudan CO2'nin teslimini sağlar. CO2 difüzyon pedi, arıtılmış havanın teslimi için kapağın iç merkezine ve deneme sırasında oda atmosferini koşullandırmak için CO2'ye yapıştırılmıştır.
NOT: Sivrisineklerin membran besleyiciye çekilmesi için konak ipuçlarının (ısı ve CO2, isteğe bağlı konak kokusu16ile) mevcut olduğundan emin olun. Sivrisinekler Glytube'un altında kalabalık değilse, CO2'nin düzgün bir şekilde teslim edilip edilmediğini ve yemeğin ve Glytube'un yeterince sıcak olup olmadığını kontrol edin. Harici bir CO2 kaynağı mevcut değilse, CO2 nefesli insan nefesinin pufları ile teslim edilebilir. - Beslendikten sonra, Glytube kapağı biyolojik tehlike atığı olarak atılabilir veya düşük yüzdeli bir çamaşır suyu çözeltisine batırıldıktan ve suda iyice durulandıktan sonra tekrar kullanılabilir.
3. Tüketilen öğünlerin nicelleştirilmesi
- Daha fazla deney için kullanılacak tartım sivrisinekleri
NOT: Yemek boyutunu ölçmek için sivrisinekleri tartmak, daha fazla canlı deney için kullanılmalarını sağlar, ancak bu yöntem 5 sivrisinek grubundan ağırlık ölçümleri almayı gerektirir. Bireysel sivrisineklerin ağırlıklarının çoğu laboratuvar dengesini kullanarak hassas bir şekilde ölçülmesi zor olduğundan, bireysel yemek boyutundaki değişkenlik ağırlıklar ölçülerek kolayca ölçülemez. Tartım sadece kadınların yemeğe gözle görülür şekilde engorge yaptığı durumlar için önerilir.- Soğuk, kabını 4 °C soğuk bir odaya taşıyarak veya buza yerleştirerek sivrisinekleri uyuşturun.
- Beslenmemiş kohorttan (yani, hiç yemek teklif edilmeyen sivrisineklerden) 5 dişiden oluşan grupları tartın ve ortalama ağırlıklarını "ön besleme" ağırlığının tahmini olarak hesaplayın. Beslenmemiş bir sivrisinin ortalama ağırlığı genotip, cinsiyet ve yetiştirme koşullarına bağlıdır. Sükroz için ad libitum erişimi ile yetiştirilen unfed dişi Ae. aegypti sivrisinekleri tipik olarak her biri yaklaşık 2 mg ağırlığındadır.
- Deneysel kohorttan (yani, bir yemek sunulan sivrisinekler), dişileri gözle gözlemlenebilen karın distansiyonuna dayanarak "beslenen" ve "beslenmeyen" yığınlar halinde sıralayın7. Sırasıyla "beslenen" ve "beslenmeyen" yığınların her birini tartım için 5 sivrisinek grubuna bölün. 5'li her gruptaki sivrisinekler, grup ağırlık ölçümlerini almak için aynı deneysel kohorttan türetilmelidir. Deney grubunun "beslenen" ve "beslenmeyen" yığınlarının her birinden kadın başına ortalama ağırlığı hesaplayın.
- Uç nokta analizi için floresan ölçümü7,27,34
NOT: Daha fazla canlı deney için artık gerekli olmayan bireysel sivrisineklerden kesin yemek boyutu ölçümleri elde etmek için, sivrisinekleri ve kalan 1 mL'lik öğünü beslendikten hemen sonra -20 °C'de %0,002 floresan içeren bir şekilde saklayın. Deney burada duraklatılabilir. Bu yöntem, Şekil 2.- Bir referans standart eğrisi oluşturmak için, deneysel sivrisinek grubuna sunulan% 0.002 floresan içeren aynı yemeğin seri seyreltilmesini hazırlayın. Toplam 8 standart eğri çözümü olacaktır. Bu çözümlerin her birinde% 0.002 floresan içeren son yemek hacmi 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125, 0.15625, 0.078125 veya 0 μL ve her biri toplam 100 μL hacim için 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde olacaktır (örneğin, 1x PBS'nin 95 μL'sinde% 0.002 floresan içeren 5 μL yemek).
- Standart eğrinin ilk çözümünü yapmak için, 950 μL 1x PBS ve girdap için % 0.002 floresan içeren 50 μL yemek ekleyin (son hacim: 1x PBS'nin 95 μL'sinde% 0.002 floresan içeren 5 μL yemek). Standart eğri çözümlerinin geri kalanını yapmak için, önceki tüpten 500 μL alarak ve 500 μL 1x PBS içeren yeni bir tüpe ekleyerek her adım için 2 kat seyreltme gerçekleştirin. Bir sonraki 2 kat seyreltme hazırlamadan önce girdap.
- Bir referans standart eğrisi oluşturmak için kullanılacak kuyuları hazırlamak için, standart eğri çözümlerinin her birinin pipet 100 μL'si, 96 kuyulu bir PCR plakasının ilk sütunundaki 8 kuyunun her birine. Plakanın ilk sütunundaki aynı 8 kuyunun her birine 1 bozulmamış kontrol sivrisinek ekleyin. Çoğaltma ölçümü için plakanın ikinci sütununda tekrarlayın.
NOT: Deney gruplarına farklı yemek çeşitleri sunuluyorsa, her öğün tipi için ayrı bir referans standart eğrisi hazırlanmalıdır. - Bozulmamış kontrol ve deneysel gruplar için kalan her kuyuya 100 μL 1x PBS ekleyin. Bir boncuk değirmeni homojenizatörü veya girdabı kullanılarak sonraki adımlarda doku bozulacaksa, her kuyuya bir adet 3 mm borosilikat katı cam boncuk ekleyin.
- Olumsuz bir kontrol olarak, plakanın sonraki 2 sütununa her kuyuya 1 bozulmamış sivrisinek ekleyin. Bu grupta ölçülen floresan, doku otoflüoresansını hesaba katmak için temel bir kesme ayarlar ve deneysel gruptaki bir sivrisineğin yemekten beslenip beslenmediğini belirlemek için kullanılacaktır.
- Yemek sunulan deney gruplarından kalan kuyulara kuyu başına 1 sivrisinek ekleyin.
- Plakayı dikkatlice kapatın ve manuel taşlama ile dokuyu bozun. Karın, yemeği serbest bırakmak için iyice homojenize edilmelidir. Dokuyu bozma yöntemleri arasında 3 mm borosilikat katı cam boncuklu bir boncuk değirmeni homojenizatörü (30 saniye için 30 Hz), 3 mm borosilikat katı cam boncuklu girdap karıştırıcı veya boncuksuz bir pestle öğütücü kullanılması yer alır.
- Lisat toplamak için plakayı 2000 rpm'de 1-2 dakika santrifüjleyin.
- Her kuyuda 180 μL 1x PBS'lik siyah bir 96 kuyu plakası hazırlayın.
- 180 μL 1x PBS ile her kuyuya 20 μL lysate aktarın ve karıştırın. Varsa, daha yüksek hız ve daha iyi tutarlılık için bu adımda çok kanallı bir pipet kullanın.
- 485/520 ekscitasyon/emisyon kanalında bir plaka okuyucu kullanarak her kuyunun floresan yoğunluğunu ölçün. Bilinen yemek hacmini ilgili floresan yoğunluğu ölçümüne göre çizerek referans standart eğrisini oluşturun.
- Oluşturulan referans standart eğrisini kullanarak, deneysel grup sivrisineklerinin her biri tarafından yutılan yemek hacmini tahmin edin. Temel doku otoflüoresansını düzeltmek için her bir deney grubunun floresan yoğunluğu okumasından negatif kontrolsüz sivrisineklerin ortalama floresan yoğunluğu okumasını çıkarın.
Representative Results
Şekil 1, Glytube'u monte etmek için bir şema sunarken, Şekil 2 burada açıklanan floresan bazlı tahlilleri kullanarak yemek boyutunu ölçmek için deneysel tasarıma genel bir bakış göstermektedir. Şekil 3, kan besleme deneyinden temsili floresan yemek boyutu ölçümleri sağlar. Şekil 4, Şekil 5ve Şekil 6, bu protokol kullanılarak ele alınabilecek biyolojik soruların bir örneğini göstermektedir. Protokolün uygulamaları geniş kapsamlıdır ve kan unu bileşimini değiştirmeyi, farmakolojik bileşikleri beslemeyi, en uygun alt kan yemeklerini veya daha küçük nektar öğünlerini hassas bir şekilde ölçmeyi ve sivrisinek genotipleri arasında beslenme davranışını karşılaştırmayı içerir.
Yemek hacmi hesaplamaları için standart bir eğri oluşturmak için, floresan okumaları, her biri beslenmemiş bir sivrisinek ve % 0.002 floresan içeren bilinen bir yemek hacmi içeren belirlenen referans kuyularından çizilir (Şekil 3A). Gıdasız sivrisineklerin negatif kontrol grubundan veya bir yemek sunan deneysel sivrisinek grubundan sivrisinekler içeren kalan kuyulardan gelen floresan okumaları, her sivrisinek tarafından tüketilen yemek hacmini (μL) ölçmek için bu standart eğri ile karşılaştırılır (Şekil 3B). Bu testteki temel okumaları doğrulamak için, kullanılmamış negatif kontrol grubundan sivrisineklere tüketilen μL pozitif bir değer atanmadığını teyit edilmelidir (Şekil 3B, sol). Deneysel gruptaki tüm kadınlara kan unu teklif edilse de, bazı sivrisinekler beslendi (Şekil 3B, orta) ve bazıları yapmadı (Şekil 3B, sağ). Bu sonuç, bu protokolden iki tür veri elde edilebileceğini göstermektedir: 1) belirli bir yemekle beslenen toplam dişilerin yüzdesi ve 2) belirli bir yemekle beslenen dişiler tarafından alınan hacim.
Bu protokol, çeşitli protein bileşimleri ile öğünleri sunmak ve ölçmek için kullanılabilir. Şekil 4A,B, ilave floresan içeren yemekler kullanılarak toplanan verileri gösterir. Beslenen sivrisineklerin oranı ve yutmuş oldukları yemek hacmi sırasıyla floresan okumalarından hesaplanmıştır. Bu okumalar son derece hassastır ve μL'nin hassas bir şekilde ölçülmesine izin verir, ancak sivrisineklerin gelecekteki canlı deneyler için kullanılamayacağı sınırlamasına sahiptir. Şekil 4C,D, floresansız yemekler sunulduktan sonra gözle beslenmiş veya beslenmemiş olarak puanlanan sivrisineklerle yapılan bağımsız bir deneyden toplanan verileri göstermektedir. Yemek büyüklüğü 5 sivrisinek grubundan ortalama ağırlık / dişi olarak hesaplandı. Bu ağırlık ölçümleri floresan ölçümlerinden daha az hassas olmasına rağmen, kadınların daha fazla canlı deney için kurtarılmasına ve kullanılmasına izin verir. Beslenen sivrisineklerin oranı, Şekil 4A ve Şekil 4C'ye yansıdığı gibi farklı deneysel günlerde değişebilir.
Şekil 5, sivrisinek konakçısı arama davranışını düzenleyen ilaçlar içeren öğünlerin tüketilen hacmini göstermektedir. Bu deneylerde, dişilere insan NPY Y2 reseptör agonisti TM30338'in 100 μM'si ile kan, salin + ATP veya salin + ATP yemekleri önerildi. Bu ilaç, Ae. aegypti NPY benzeri reseptörü 7'nin aktivasyonu yoluyla konak arama davranışını değiştirir. Yemek boyutlarının ölçülmesi, bu ilacın kan besleme sonrası davranış üzerindeki etkisini değerlendirmek için deneylerin yorumlanması için kritik öneme sahiptir, çünkü araştırmacının her kadın tarafından tüketilen dozu hesaplamasına izin verir.
Önceki örneklerde, dişiler kan veya yedek kan yemekleriyle beslendi ve bunların hepsi 3-5 μL öğünle sonuçlandı(Şekil 3, Şekil 4, Şekil 5). Bu floresan bazlı test, ortalama grup ağırlığı ölçümlerinden doğru bir şekilde ayırt edilemeyen daha küçük ve/veya daha değişken yemek boyutlarını ölçmek için de kullanılabilir. Şekil 6'da,Glytube'u% 0.002 floresan içeren% 10 sakkaroz ile doymuş bir pamuk topu ile değiştirerek nektar besleme davranışını ölçmek için aynı floresan nicelleştirme protokolü kullanılmıştır. Nektar şekerleri Glytube testinde sunulamaz, çünkü dişiler nektar şekerlerinin varlığını stylet ile tespit edemez ve beslemeye başlamaz27. Bu veriler, araştırmacının şeker yemeklerinin önceki çalışma34 (Şekil 6)ile uyumlu olarak kan yemeklerinden sürekli olarak daha küçük olduğunu belirlemesine izin verir.
Şekil 1: Sivrisineklere yemek yedirmek için kullanılan Glytube yönteminin kurulumu. (A) Sivrisineklere kan ve diğer öğünleri beslemek için kullanılan yapısız bir Glytube şeması. (B) Bir Glytube şeması, ağ kapaklı bir sivrisinek kabının üzerine sunuldu. Dişi sivrisinekler beslenmek için ağ kapağını delebilir. (C) Glytube tarafından verilen bir yemekte beslenmeden önce, sırasında ve sonra (alttan sağa) Glytube (üstte) ve dişi Aedes aegypti sivrisineklerinin fotoğrafları. Sivrisinekler, membran besleyiciye erişmek için kabını kaplayan ağdan delici olarak gösterilir. (D) Dişi Ae. aegypti sivrisineklerinin görünümünü gösteren fotoğraflar, suni kan unu (sağ, üst) veya salin + ATP yemeği (sağ, alt). Glytube yöntemi daha önce Costa-da-Silva ve ark. (C) ve (D) fotoğraflarında Alex Wild'ın izniyle çekilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Glytube kan besleme protokolünden sonra yemek boyutunun nasıl ölçülecek şeması. (A) Sivrisineklere floresan (üst, deneysel grup) veya yemeksiz (alt, bozulmamış negatif kontrol grubu) bir yemek sunulmaktadır. (B) Besleme deneyi sonlandırıldıktan sonra 96 kuyulu bir tabağa tek tek sivrisinekler eklenir. (C) Standart eğri% 0.002 floresan içeren bilinen miktarda yemek kullanılarak oluşturulur. (D) Sivrisinekler tüketilen herhangi bir floresanı serbest bırakmak için homojenize edilir ve her kuyudaki floresan seviyeleri bir plaka okuyucu kullanılarak ölçülür. Bu floresan nicelleştirme yöntemi Liesch ve ark. (2013)34'ten değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Floresan bazlı niceleme ile glytube kan besleme deneyi. (A) %0,002 floresan (y ekseni ölçeği = keyfi birimler) içeren bilinen bir öğün miktarına, el değmemiş kontrol grubundan bir sivrisineğin eklendiği kuyulardan elde edilen standart eğri ölçümleri. (B) Beslenmemiş kontrol grubundaki (sol, siyah, n = 40), kanla beslenen deney grubu (orta, kırmızı, n = 37) ve kanla beslenmeyen deney grubu (sağ, kırmızı, n = 23) için floresan okumaları kullanılarak hesaplanan yemek hacmi. Her nokta, tek bir dişiden gelen bir ölçümü temsil eder. Veriler aralıklı ortanca olarak gösterilir. Harfler istatistiksel olarak farklı grupları gösterir, Kruskal-Wallis Dunn'ın çoklu karşılaştırması ile test eder, p<0.01. Bu veriler Jové ve ark. (2020)27. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Farklı protein bileşimine sahip öğünlerin nicelemesi. Dişilere koyun kanı (kırmızı), insan kanı proteinli yapay kan (Kogan (1990)22) (turuncu) veya proteinsiz salin + ATP yemeği (aqua)7yemekleri sunuldu. (A) Beslenen kadınların yüzdesi floresan okumaları kullanılarak puan aldı. Her puan 12-16 kadından oluşan bir grubu temsil eder. Veriler, aralıkları olan ortancalar olarak gösterilir, n = 12. (B) Floresan okumaları kullanılarak hesaplanan yemek hacmi. Her nokta, Şekil 4A'dantek bir denemede tek bir dişiden bir ölçümü temsil eder. Veriler, aralıkları olan ortancalar olarak gösterilir, n = 12. (C) Yapay membran beslemeden sonra tamamen saran kadınların yüzdesi, gözle puanlandı. Her nokta, 20-30 kadından oluşan gruplardan elde edilen kadınların yüzdesini temsil eder. Veriler, aralıkları olan ortancalar olarak gösterilir, n = 23. (D) Beslenme durumu göz göre göre puanlandıktan sonra kilo/kadın olarak puanlanan yemek ölçüleri. Ağırlıklar 5 sivrisinek grubunun ortalaması olarak hesaplandı. Veriler, aralıkları olan ortancalar olarak gösterilir, n = 23. A–D: Harfler istatistiksel olarak farklı grupları gösterir, Kruskal-Wallis Dunn'ın çoklu karşılaştırması ile test eder, p<0.05. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Farmakolojik bileşiklerle öğünlerin nicelemesi. Dişiler aynı büyüklükteki koyun kanı (kırmızı), salin + ATP (aqua) ve salin + ATP + 100 μM doz insan NPY Y2 reseptör agonist TM30338 (koyu mavi) tüketir. Floresan okumalar kullanılarak hesaplanan yemek hacmi. Her nokta, tek bir dişiden gelen bir ölçümü temsil eder. Veriler, aralıkları olan ortancalar olarak gösterilir, n = 12. Harfler istatistiksel olarak farklı grupları gösterir, Kruskal-Wallis Dunn'ın çoklu karşılaştırmasıyla test eder, p<0.05. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Daha küçük nektar yemeklerinin nicelemesi. (A) Nektar besleme tahlil şeması. (B) Vahşi tip kadınlar için floresan okumaları kullanılarak hesaplanan yemek hacmi, nektar besleme testinde her biri% 0.002 floresan içeren su (mavi, n = 36) veya% 10 sakkaroz (yeşil, n = 53) yemekleri sundu. Her nokta, tek bir dişiden gelen bir ölçümü temsil eder. Veriler aralıkları olan ortancalar olarak gösterilir. Harfler istatistiksel olarak farklı grupları gösterir, Mann-Whitney testi, p<0.05. Bu veriler Jové ve ark. (2020)27. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Yapay Kan Unu | |||
| Stok Çözeltisinin Konsantrasyonu (mg/mL) | Yemekte Stok Çözeltisinin Hacmi (μL/mL) | Son Öğün Konsantrasyonu (mg/mL) | |
| Protein Bileşenleri* | |||
| γ-Globulinler | 50 | 300 | 15 |
| Hemoglobin | 35 | 230 | 8 |
| Albümin | 300 | 340 | 102 |
| Toplam Protein | - | - | 125 |
| Protein Olmayan Bileşenler | |||
| Stok Çözeltisinin Konsantrasyonu (mM) | Yemekte Stok Çözeltisinin Hacmi (μL/mL) | Son Öğün Konsantrasyonu (mM) | |
| Nacl | γ-globulin stokunda | - | 5-10 |
| NaHCO3 | γ-globulin stokunda | - | 120 |
| Atp | 200 | 5 | 1 |
| Su | - | 125 | - |
| *Protein bileşenleri, 400 mM NaHCO3'te çözünen ve değişken miktarda NaCl (%2-4) içeren γ-Globulinler hariç, çift damıtılmış suyun stok çözeltisinde hazırlanır. üründe. | |||
Tablo 1: Yapay kan yemekleri hazırlama tarifi (Kogan'dan uyarlanmıştır (1990)22). Yapay kan, insan kanında düzenli olarak bulunan protein ve protein dışı bileşenlerden oluşur ve bu bileşenlerin oranlarını değiştirme seçeneği sunar. Sivrisinekler yapay kanla besledikten sonra yumurta üretebilir7,22.
| Tuzlu Su Yemeği | |||
| Bileşen | Stok Çözeltisinin Konsantrasyonu (mM) | Yemekte Stok Çözeltisinin Hacmi (μL/mL) | Son Öğün Konsantrasyonu (mM) |
| Nacl | - | - | - |
| NaHCO3 | 400 | 300 | 120 |
| Atp | 200 | 5 | 1 |
| Su | - | 695 | - |
Tablo 2: ATP ile tuzlu yemek tarifi (Duvall ve ark. (2019) 7'den uyarlanmıştır). Protein içermeyen tuzlu su yemekleri, kan beslemeden sonra meydana gelen karın distansiyonunu taklit ederken, ancak proteinler yutulduğunuzda ortaya çıkan yumurta gelişimini tetiklemeden sivrisineklere ilgi bileşikleri sunmak için kullanılabilir.
Discussion
Birçok laboratuvar uygulaması için yapay membran besleyiciler, araştırmacılara yemeğin içeriğini doğrudan manipüle etme olanağı sağlayarak canlı konakçılara kıyasla farklı faydalar sunar. Yapay membran besleme için birden fazla yöntem mevcut olsa da, burada açıklanan yöntem esneklik, maliyet ve verimde avantajlar sunar. Diğer ticari membran besleyicilere kıyasla, Glytube tahlili küçük bir yemek hacmi gerektirir, bu da onu 7,35gereken toplam hacmi en aza indirerek ilaçlar veya patojenler de dahil olmak üzere pahalı reaktifler için verimli bir teslimat mekanizmasıhalinegetirir. Hem protein içermeyen tuzlu su hem de yapay kan yemekleri engorgement'i teşvik ettiği için, bileşikler veya patojenler her iki öğüne de enjeksiyonlara yüksek verimli ve invaziv olmayan bir alternatif olarak eklenebilir. Ayrıca, Glytube'un her bileşeni, besleme cihazının çapraz kirlenmesi olmadan birden fazla yemek türünü teslim etmek ve ölçmek için kolayca yıkanabilir, değiştirilebilir veya ölçeklendirilebilir.
Sivrisinekler tarafından tüketilen yemek hacimlerini ölçmek için, floresan bazlı yöntem, sivrisinekleri beslenmeden önce ve sonra tartmaya göre daha hassas yemek boyutu nicelemesi sağlar. Bu yöntemin bir bitiş noktası tahlil olduğu unutulmamalıdır. Buna karşılık, tartım sivrisineklerin daha fazla deney için canlı tutulmasını sağlar. Bir plaka okuyucu kullanarak, floresan tabanlı yöntem, yüzlerce bireysel kadın tarafından tüketilen öğünlerin yüksek verimli nicelemesi için kolayca ölçeklendirilebilir.
Yüksek beslenme oranları elde etmek için, kadın konakçı arama davranışını etkinleştirmek ve dişileri besleyiciye çekmek için yeterli konak ipuçlarının bir kombinasyonu bulunmalıdır. Sivrisinekler Glytube'un altında kalabalık değilse, yemek düzgün ısıtılamayabilir veya CO2 teslimatı yeterli olmayabilir. Membran yüzeyine insan kokusu eklenmesi, yapay zarın çekiciliğini güvenilir bir şekilde arttırır. Sivrisinekler Glytube'un altında görülürse, ancak beslenemezse, yemek bileşimi hatalı olabilir. Dişiler, yemeğin kendisi sıcak değilse, kan çok eskiyse veya yemeğe katkı maddeleri özünde averatifse veya istenmeyen bir kimyasal reaksiyona neden olursa beslenmeyebilir36. Ek ATP ayrıca beslenme oranlarını güvenilir bir şekilde artırır ve sağlanan tariflerin her birinde 2 mM'lik son konsantrasyona kadar ölçeklendirilebilir. Parafilm Glytube kapağı boyunca gergin çekilmezse dişiler beslenmeyebilir; parafilm düzgün bir şekilde şeffaf olmalı ve tokalanmamalıdır, çünkü bu, dişinin parafilm'i tarzıyla etkili bir şekilde delebilmesini önler. Yemek Glytube'dan örgüye sızarsa, parafilm germe işlemi sırasında yırtılmış olabilir ve değiştirilmelidir.
Yemek bileşimini değiştirmek, araştırmacıların yemeği midgut'tan temizlemek için gereken süreyi ve sonraki konakçı arama davranışını manipüle etmelerine de izin verebilir. Burada sunulan yemekler, hayvansal türevi kana benzer 7 sindirim için24-36 saat gerektirir. Bu yemeklerden herhangi birini besledikten sonra, dişiler sindirim süresi boyunca konakçı arayışını bastıracaktır. Tuzlu yemek proteinden yoksun olduğundan, dişiler yemek temizlendikten sonra ev sahibi arayışına geri dönerler. Daha hızlı bir geri dönüş isteniyorsa, araştırmacılar yaklaşık 6 saat27içinde atılan alternatif "hızlı temizleme" tuzlu su öğünlerini seçebilirler. Burada sunulan tuzlu yemeğin bileşimi, sonuçları yapay kan unu ile doğrudan karşılaştırmak için eşleştirilirken, "hızlı temizleme" unu omurgalı kanda bulunan fizyolojik tuz seviyeleriyle daha yakından eşleşir.
Burada açıklanan yöntemler, araştırmacının deneysel hedeflerine en uygun tahlilleri seçmeden önce dikkate alınması gereken sınırlamalara sahiptir. Açıklanan floresan ölçümleri, sivrisineklerin ek deneyler için tekrar kullanılmasına izin vermez. Bununla birlikte, floresan tahlil kullanılarak öğün büyüklüğü ölçümü öncesinde ağırlık ölçümleri yapılabilir. Kilo ve yemek boyutu belirli bir yemek için birden fazla denemede tutarlıysa, ağırlık gelecekteki deneylerde proxy olarak kullanılabilir. Ayrıca, bu protokol konak aramadaki açıklarla kan besleme davranışı arasındaki ayrımı yapmaz; membran besleyicinin bulunmasında bozukluklar gösteren sivrisineklerin beslenme oranlarında ve/veya yemek boyutunda bir azalma olacaktır. Araştırmacılar, test boyunca davranışı kaydetmek için bir kamera ekleyerek, dişilerin Glytube'u bulup bulamadıklarını veya Glytube'u bulup bulamadıklarını, ancak beslenmediklerini belirleyebilirler.
Burada açıklanan test, sivrisineklerde beslenme davranışı ile ilgili birçok olağanüstü soruyu araştırmak için uyarlanabilir. Örneğin, belirli kan proteinlerinin katkısı, bileşen proteinlerin oranını veya yapay kan unundaki toplam protein konsantrasyonu değiştirilerek araştırılabilir. Birden fazla besleme etkinliğinden yemek boyutlarını değerlendirmek için, öğünleri benzersiz kaynaklardan ayırt etmek için farklı floresan spektrumlu boyalar eklenebilir37. Bu protokol ayrıca kanı algılayan ve yutulması için kullanılan iç ağız partilerini (yani stile) ve sivrisinek kan beslemeye başlamak için inerken cilde (yani labium, bacaklara) temas eden kemosentory ekleri ayrı ayrı uyarmak için de değiştirilebilir36. Örneğin, ligandlar doğrudan yemeğe eklenirse, membran sadece stylet tarafından delindiği için labium ve bacaklarla temas etmezler. Bunun yerine parafilm'in dış yüzeyine ligandlar eklenirse, yemekten ayrı kalırlar ve labium ve bacaklar ile temas edebilir36. Son olarak, kan besleme davranışının ayrıntılı kinetiği iyi anlaşılmamıştır ve burada sunulan yöntem, yüksek çözünürlüklü izlemeyi makine öğrenimi araçlarıyla birleştirerek hareket, duruş ve besleme dinamiklerinin davranışsal okumalarını çıkarmak içindeğiştirilebilir 38.
Bu protokol, sivrisinek kanı besleme ve kan sonrası besleme davranışlarını incelemek için farmakolojik ve genetik manipülasyonlar kullanan araştırmacılara hizmet etme yeteneği ile kullanıcı dostu ve uygun maliyetli olmayı amaçlamaktadır.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
El yazmaları hakkındaki yorumları için Nipun Basrur, Adriana K. Rosas Villegas, Nadav Shai ve Trevor Sorrells'e ve teknik yardım için Zhongyan Gong ve Kyrollos Barsoum'a teşekkür ederiz. Şekil 1'dekullanılan fotoğraflar için Alex Wild'a teşekkür ederiz. K.V., Boehringer Ingelheim Fonds doktora bursu tarafından desteklendi. V.J. kısmen NIH T32-MH095246 tarafından desteklendi. Bu çalışma kısmen Howard Hughes Tıp Enstitüsü'nden The Rockefeller Üniversitesi'ne James H. Gilliam İleri Çalışma Bursları programı aracılığıyla V.J.'ye verilen bir hibe ile desteklendi. Bu materyal, Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Araştırma Burs Programı tarafından Hibe No. NSF DGE-1325261'den V.J.'ye Bu materyalde ifade edilen herhangi bir görüş, bulgu ve sonuç veya öneri yazar(lar)ın görüşleridir ve Ulusal Bilim Vakfı'nın görüşlerini yansıtmak zorunda değildir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 3 mm diameter borosilicate solid-glass bead | MilliporeSigma | Z143928 | For use for bead mill homogenizer; not required if using pellet pestle grinder |
| 32 oz. high-density polyethylene (HDPE) plastic cup | VWR | 89009-668 | Example mosquito container used for feeding assays shown; alternate options can be used |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 96-well black polystyrene plate | ThermoFisher | 12-566-09 | |
| 96-well PCR plate sealing film | Bio-Rad | MSB1001 | Alternate options can be used |
| 96-well PCR plates | Bio-Rad | HSP9621 | Alternate options can be used |
| Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | MilliporeSigma | A6419 | |
| Albumin (human serum) | MilliporeSigma | A9511 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213 | Alternate options can be used to block light entering fluorescein container |
| Balance | Fisher Scientific | 01-911 | Alternate options can be used |
| Bead mill homogenizer | Qiagen | 85300 | Not required if using pellet pestle grinder |
| Cotton ball | Fisher Scientific | 22456880 | For nectar-feeding; alternate options can be used |
| Defibrinated sheep blood | Hemostat Laboratories | DSB100 | Alternate options can be used |
| Drosophila CO2 fly pad | Tritech Research | MINJ-DROS-FP | Alternate options can be used |
| Fluorescein | MilliporeSigma | F6377 | |
| Fluorescence plate-reader | ThermoFisher | VL0000D0 | Alternate options can be used |
| Gamma-globulin (human blood) | MilliporeSigma | H7379 | |
| Glycerol | MilliporeSigma | G7893 | |
| Hemoglobin (human) | MilliporeSigma | G4386 | |
| Laboratory wrapping film - parafilm | Fisher Scientific | 13-374 | |
| Magnetic stirrer | Fisher Scientific | 90-691 | Alternate magnetic stirrers can be used |
| Microcentrifuge for 96-well plate | VWR | 80094-180 | Alternate options can be used |
| Microcentrifuge Tubes | MilliporeSigma | 2236412 | Alternate options can be used |
| Pellet pestle grinder | VWR | KT749521-1500 | Not required if using bead mill homogenizer |
| Phosphate buffered solution (PBS) | Fisher Scientific | BW17-516F | Optional |
| Razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | Alternate options can be used, such as a lathe for better consistency of cutting |
| Rubber bands | |||
| Silicone tubing | McMaster Carr | Needed if using a fly pad for CO2 delivery | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | S233 | |
| Sodium chloride (NaCl) | MilliporeSigma | S9888 | |
| Stir bars | Fisher Scientific | 14-512 | Alternate magnetic stir bars can be used |
| Translucent polypropylene storage box with removable lid | Example box used for feeding assays shown | ||
| Vortex mixer | |||
| Water bath | Alternate heating device may be used | ||
| White 0.8 mm polyester mosquito netting | American Home & Habit Inc. | F03A-PONO-MOSQ-M008-WT | Alternate options can be used |
References
- Bhatt, S., et al. The global distribution and burden of dengue. Nature. 496 (7446), 504-507 (2014).
- Rogers, D. J., Wilson, A. J., Hay, S. I., Graham, A. J. The global distribution of yellow fever and dengue. Advances in Parasitology. 62 (05), 181-220 (2006).
- Chouin-Carneiro, T., et al. Differential susceptibilities of Aedes aegypti and Aedes albopictus from the Americas to Zika virus. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (3), (2016).
- Guerbois, M., et al. Outbreak of Zika virus infection, Chiapas State, Mexico, 2015, and first confirmed transmission by Aedes aegypti mosquitoes in the Amercias. Journal of Infectious Diseases. 214 (9), 1349-1356 (2016).
- Weaver, S. C., et al. Zika virus: history, emergence, biology, and prospects for control. Antiviral Research. 130, 69-80 (2016).
- Attardo, G. M., Hansen, I. A., Raikhel, A. S. Nutritional regulation of vitellogenesis in mosquitoes: implications for anautogeny. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 35 (7), 661-675 (2005).
- Duvall, L. B., Ramos-Espiritu, L., Barsoum, K. E., Glickman, J. F., Vosshall, L. B. Small-molecule agonists of Ae. aegypti neuropeptide Y receptor block mosquito biting. Cell. 176 (4), 687-701 (2019).
- Dimond, J. B., Lea, A. O., Hahnert, W. F., DeLong, D. M. The amino acids required for egg production in Aedes aegypti. The Canadian Entomologist. 88 (2), 57-62 (1956).
- Guerrero, D., Cantaert, T., Missé, D. Aedes mosquito salivary components and their effect on the immune response to arboviruses. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 1-11 (2020).
- Raquin, V., Lambrechts, L. Dengue virus replicates and accumulates in Aedes aegypti salivary glands. Virology. 507, 75-81 (2017).
- Farjana, T., Tuno, N. Multiple blood feeding and host-seeking behavior in Aedes aegypti and Aedes albopictus (diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 50 (4), 838-846 (2013).
- Scott, T. W., Takken, W. Feeding strategies of anthropophilic mosquitoes result in increased risk of pathogen transmission. Trends in Parasitology. 28 (3), 114-121 (2012).
- Ross, P. A., Lau, M. J., Hoffmann, A. A. Does membrane feeding compromise the quality of Aedes aegypti mosquitoes. PLoS ONE. 14 (11), 1-19 (2019).
- Ross, P. A., Axford, J. K., Richardson, K. M., Endersby-Harshman, N. M., Hoffmann, A. A. Maintaining Aedes aegypti mosquitoes infected with wolbachia. Journal of Visualized Experiments. 2017 (126), 1-8 (2017).
- Briegel, H., Hefti, M., DiMarco, E. Lipid metabolism during sequential gonotrophic cycles in large and small female Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 48 (5), 547-554 (2002).
- McMeniman, C. J., Corfas, R. A., Matthews, B. J., Ritchie, S. A. S., Vosshall, L. B. Multimodal integration of carbon dioxide and other sensory cues drives mosquito attraction to humans. Cell. 156 (5), 1060-1071 (2014).
- Pakes, S. P., et al. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , National Academic Press. Washington, DC, USA. (2011).
- Deng, L., Koou, S. Y., Png, A. B., Ng, L. C., Lam-Phua, S. G. A novel mosquito feeding system for routine blood-feeding of Aedes aegypti and Aedes albopictus. Tropical Biomedicine. 29 (1), 169-174 (2012).
- Gunathilaka, N., Ranathunge, T., Udayanga, L., Abeyewickreme, W. Efficacy of blood sources and artificial blood feeding methods in rearing of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) for sterile insect technique and incompatible insect technique approaches in Sri Lanka. BioMed Research International. 2017, 3196924 (2017).
- Costa-da-Silva, A. L., et al. Glytube: a conical tube and parafilm M-based method as a simplified device to artificially blood-feed the Dengue vector mosquito, Aedes aegypti. PLoS ONE. 8 (1), 53816 (2013).
- Carvalho, D. O., et al. Mass production of genetically modified Aedes aegypti for field releases in Brazil. Journal of Visualized Experiments. 83 (83), 1-10 (2014).
- Kogan, P. H. H. Substitute blood meal for investigating and maintaining Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 27 (4), 1-4 (1990).
- Gonzales, K. K., Hansen, I. A.
- Baughman, T., et al. A highly stable blood meal alternative for rearing Aedes and Anopheles mosquitoes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (12), 0006142 (2017).
- Galun, R. Feeding stimuli and artificial feeding. Bulletin of the World Health Organization. 36, 590-593 (1967).
- Galun, R. Feeding response in Aedes aegypti: stimulation by adenosine triphosphate. Science. 142, 1674-1675 (1963).
- Jové, V., et al. Sensory Discrimination of Blood and Floral Nectar by Aedes aegypti Mosquitoes. Neuron. 108, 1-18 (2020).
- Petersen, M. T., et al. The impact of the age of first blood meal and Zika virus infection on Aedes aegypti egg production and longevity. PLoS ONE. 13 (7), 1-15 (2018).
- Sissoko, F., et al. Frequent sugar feeding behavior by Aedes aegypti in Bamako, Mali makes them ideal candidates for control with Attractive Toxic Sugar Baits (ATSB). PLoS ONE. 14 (6), 0214170 (2019).
- Houseman, J. G., Downe, A. E. R. Methods of measuring blood meal size and proteinase activity for determining the effects of mated state of digestive processes of female Aedes aegypti (L.) (Diperta: Culicidae). The Canadian Entomologist. 18, 241-248 (1986).
- Redington, B. C., Hockmeyer, W. T. A method for estimating blood meal volume in Aedes aegypti using a radioisotope. Journal of Insect Physiology. 22 (7), 961-966 (1976).
- Gonzales, K. K., et al. The effect of SkitoSnack, an artificial blood meal replacement, on Aedes aegypti life history traits and gut microbiota. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
- Klowden, M. J. The endogenous regulation of mosquito reproductive behavior. Experientia. 46 (7), 660-670 (1990).
- Liesch, J., Bellani, L. L., Vosshall, L. B. Functional and genetic characterization of neuropeptide Y-like receptors in Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (10), 22486 (2013).
- Frances, S. P., Sithiprasasna, R., Linthicum, K. J. Laboratory evaluation of the response of Aedes aegypti and Aedes albopictus uninfected and infected with Dengue virus to Deet. Journal of Medical Entomology. 48 (2), (2011).
- Dennis, E. J., Goldman, O. V., Vosshall, L. B. Aedes aegypti mosquitoes use their legs to sense DEET on contact. Current Biology. 29 (9), 1551-1556 (2019).
- Harrington, L. C., et al. Heterogeneous feeding patterns of the Dengue vector, Aedes aegypti, on individual human hosts in rural Thailand. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (8), 3048 (2014).
- Hol, F. J., Lambrechts, L., Prakash, M. BiteOscope, an open platform to study mosquito biting behavior. eLife. 9, 1-24 (2020).
