Summary
Målet med denne protokollen er å levere dyreavledede og kunstige blodmåltider til Aedes aegypti mygg gjennom en kunstig membranmater og nøyaktig kvantifisere volumet av måltid innta.
Abstract
Kvinner av visse myggarter kan spre sykdommer mens biting virveldyr verter for å få proteinrike blodmåltider som kreves for eggutvikling. I laboratoriet kan forskere levere dyreavledede og kunstige blodmåltider til mygg via membranmatere, noe som tillater manipulering av måltidssammensetning. Her presenterer vi metoder for å mate blod og kunstige blodmåltider til Aedes aegypti mygg og kvantifisere volumet som forbrukes av individuelle kvinner.
Målrettet fôring og kvantifisering av kunstige/ blodmåltider har bred bruk, inkludert testing av effekten av måltidskomponenter på myggatferd og fysiologi, levering av farmakologiske forbindelser uten injeksjon, og infisere mygg med spesifikke patogener. Legge fluorescein fargestoff til måltidet før fôring gir etterfølgende måltid størrelse kvantifisering. Måltidsvolumet som forbrukes av mygg kan måles enten etter vekt, hvis hunnene skal brukes senere til atferdseksperimenter, eller ved å homogenisere individuelle kvinner i 96-brønnplater og måle fluorescensnivåer ved hjelp av en plateleser som en endepunktanalyse. Kvantifisering av måltidsstørrelse kan brukes til å avgjøre om endring av måltidskomponentene endrer måltidsvolumet, eller om måltidsforbruket varierer mellom myggstammer. Nøyaktig kvantifisering av måltidsstørrelse er også avgjørende for nedstrøms analyser, for eksempel de som måler effekter på vertattraksjon eller fecundity. Metodene som presenteres her kan tilpasses ytterligere for å spore måltidsfordøyelsen i løpet av dager eller for å inkludere flere skilleverdige markører lagt til forskjellige måltider (som nektar og blod) for å kvantifisere forbruket av hvert måltid med en enkelt mygg.
Disse metodene gjør det mulig for forskere å utføre målinger med høy gjennomstrømning for å sammenligne måltidsvolumet som forbrukes av hundrevis av individuelle mygg. Disse verktøyene vil derfor være bredt nyttige for myggforskere for å svare på ulike biologiske spørsmål.
Introduction
Vi presenterer en protokoll for fôring av modifiserte blodmåltider til Aedes aegypti mygg ved hjelp av en kunstig membranmater og nøyaktig måling av måltidsvolumet som forbrukes av hver enkelt mygg. Denne protokollen kan fleksibelt tilpasses for å endre innholdet i måltidet eller for å sammenligne måltidsvolumet som forbrukes av forskjellige eksperimentelle grupper av mygg.
Ae. aegypti mygg truer global helse ved å spre patogener som forårsaker sykdommer, inkludert gul feber, denguefeber, chikungunya og Zika1,2,3,4,5. Ae. aegypti kvinner er obligatoriske blodmatere; de må konsumere virveldyrblod for å oppnå det nødvendige proteinet for eggutvikling, og hver clutch av egg krever et fullt blodmåltid fra minst en vert6,7,8. Den kvinnelige myggen biter først verten ved å piercing huden med sin stylet og injisere spytt, som inneholder forbindelser som utløser vertens immunrespons9. Hun mater deretter ved å pumpe blod gjennom sin stylet inn i sin midgut. Mens hun bruker et blodmåltid fra en smittet vert, kan hun innta blodbårne patogener6,8, som deretter migrerer fra myggens midgut til spyttkjertlene10. Kvinnelige mygg smittet på denne måten kan spre sykdom ved å injisere patogener sammen med spytt når du biter etterfølgende verter11,12. Å forstå og kvantifisere mekanismene for blodfôringsatferd er avgjørende skritt for å kontrollere overføringen av myggbårne sykdommer.
Mange laboratorieprotokoller for myggoppdragelse og eksperimentering bruker levende dyr, inkludert mus, marsvin eller mennesker som en blodkilde13,14,15,16. Bruk av levende dyr stiller etiske bekymringer samt komplekse krav til personellopplæring, dyreboliger og omsorg, og overholdelse av IACUC-retningslinjene (Institutional Animal Care and Use Committee). Det begrenser også hvilke typer forbindelser som kan leveres til mygg, noe som begrenser studiene som kan utføres17.
Kunstige blodfôringsapparater, som vanligvis bruker et membransystem for å simulere vertshud, er nyttige verktøy for å studere blodfôringsatferd som omgår behovet for vedlikehold av levende verter. Fullblod kan kjøpes fra en rekke leverandører og mates til mygg ved hjelp av oppvarmede, vannjakkede kunstige membranmatere eller lignendeenheter 18,19. I denne protokollen demonstrerer vi bruken av små, engangsmembranmatere kalt "Glytubes". Denne membranmateren, tidligere utgitt av Costa-da-Silva et al. (2013)20,kan enkelt monteres fra standard laboratorieutstyr, noe som gjør den ideell for å levere blodmåltider til moderate antall mygg og grei å skalere opp for testing av større grupper eller flere måltidsformuleringer. Glytube er et billig og effektivt alternativ til andre kommersielle kunstige matere, noe som kan kreve større måltidsvolumer og er mer egnet for batchfôring av store grupper mygg på en enkelt måltidsformulering21.
Denne protokollen inneholder to seksjoner: tilberedning/levering av kunstige måltider og kvantifisering av forbruk. I den første delen brukes Glytubes som et effektivt middel for å levere manipulerte dietter. Fullblod kan erstattes med et helt kunstig måltid for å sammenligne effekten av bloderstatninger i stedet for et blodmåltid. En oppskrift tilpasset fra Kogan (1990)22 presenteres her, selv om flere kunstige måltidsformuleringer erutviklet 23,24. Videre er fôring en mindre invasiv og mindre arbeidskrevende metode for å introdusere farmakologiske forbindelser enn injeksjon. På grunn av det lave totale volumet som kreves for hvert måltid (1–2 ml), gir denne protokollen en attraktiv leveringsmetode for å redusere mengden dyre reagenser. Aegypti kvinner lett konsumere proteinfrie måltider av saltløsning med adenosin 5′-trifosfat (ATP)25,26, som gir en grunnlinje for måling av effekten av enkelt måltid komponenter. For eksempel er Neuropeptide Y-lignende reseptor 7 (NPYLR7) i Ae. aegypti kjent for å megle vertssøkende undertrykkelse etter et proteinrikt blodmåltid, og når NPYLR7-agonister legges til et proteinfritt saltvannsmåltid, viser kvinnelige mygg vertssøkende undertrykkelse som ligner på de som har konsumert fullblod7.
I den andre delen presenteres trinn for å kvantifisere volumet av hvert måltid som forbrukes av en individuell kvinnelig mygg. Denne analysen er fluorescensbasert og fanger fôringsstatus i høyere oppløsning enn metoder der kvinner klassifiseres som "matet" eller "ufed" basert på visuell vurdering av abdominal distensjon alene. Ved å legge fluorescein til måltidet før fôring, kan måltidsvolumer innta av individer kvantifiseres ved å homogenisere hver mygg i en 96-brønns plate og måle fluorescensintensitet som en avlesning. Denne analysen kan måle forskjeller i fôringskraft som svar på variabler som måltidssammensetning eller myggenes genetiske bakgrunn. Presis kvantifisering er avgjørende for mellomliggende måltidsstørrelser, for eksempel når kvinner tilbys suboptimale måltider som inneholder fôring avskrekkende eller når de bruker sukrose måltider av varierende størrelser27. Hvis matet mygg er nødvendig for påfølgende atferdsanalyser etter måltidstørrelse kvantifisering, kan måltidsstørrelsen i stedet beregnes ved å veie bedøvede kvinner i grupper og estimere gjennomsnittlig økt masse per person. Selv om det er mindre presist enn fluoresceinmerking, gir veiing fortsatt et aggregert estimat av måltidsvolum og tillater undersøkelse av måltidets effekt på nedstrøms prosesser, for eksempel fecundity eller påfølgende vertattraksjon. Mens blod måltidsstørrelsen er variabel og kan påvirkes av en myriadeav faktorer 11,28,29, innta måltidsstørrelser målt med metodene som er beskrevet her, er i samsvar med tidligere kvantifiseringer7,30,31.
Protocol
Blodfôringsprosedyrer ble ikke utført ved hjelp av levende dyr eller menneskelige verter og overholdt retningslinjene fastsatt av The Rockefeller University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) og Institutional Review Board (IRB).
1. Matlaging av måltider
- Fremstilling av phagostimulant, adenosin 5′-trifosfat
- Forbered en 25 mM løsning av vandig NaHCO3 (molekylvekt, MW = 84.006 g/mol). For 100 ml 25 mM NaHCO3,tilsett 210 mg NaHCO3 i en volumetrisk kolbe og fyll med dobbeltdestillert vann (ddH2O) til et totalt volum på 100 ml. Bruk en magnetisk rørestang til å blande oppløsningen grundig til alle NaHCO3 er oppløst.
- Rekonstituer ATP-dekonsentrariumsalthydrat (MW = 551,14 g/mol) i vandig 25 mM NaHCO3 til en endelig konsentrasjon på 200 mM ATP. For et totalt volum på 10 ml 200 mM ATP i 25 mM NaHCO3-buffer, tilsett 1,1 g ATP-dinatriumsalthydrat til en volumetrisk kolbe og fyll med 25 mM NaHCO3-buffer til et totalt volum på 10 ml. Bruk en magnetisk rørestang til å blande oppløsningen grundig til alle ATP er oppløst.
MERK: For å minimere hydrolyse av ATP må den bufres av en saltløsning som NaHCO3. - Aliquot ATP-løsningen og oppbevares ved -20 °C.
MERK: Denne lagerløsningen av ATP er vanligvis laget ferskt hver sjette måned og brukes til alle måltider som er beskrevet nedenfor. For å forhindre nedbrytning, bør ATP aliquots ikke gjennomgå flere fryse-tine sykluser eller varmes opp sammen med andre måltidskomponenter.
- Fremstilling av fluorescerende tracer løsning, fluorescein
- Forbered en 2% (w / v) lagerløsning av vandig fluorescein. For et samlet lagerløsningsvolum på 10 ml, bland 0,2 g fluorescensdenatriumsalt med 10 ml ddH2O i et konisk rør på 15 ml innpakket i aluminiumsfolie ved romtemperatur. Denne lagerløsningen av fluorescein kan brukes til fortynning i alle måltider som er beskrevet nedenfor.
MERK: Siden fluorescein er lysfølsom, unngå eksponering for lys ved å pakke inn beholdere i aluminiumsfolie.
- Forbered en 2% (w / v) lagerløsning av vandig fluorescein. For et samlet lagerløsningsvolum på 10 ml, bland 0,2 g fluorescensdenatriumsalt med 10 ml ddH2O i et konisk rør på 15 ml innpakket i aluminiumsfolie ved romtemperatur. Denne lagerløsningen av fluorescein kan brukes til fortynning i alle måltider som er beskrevet nedenfor.
- Fremstilling av dyreavledede blodmåltider
- Beregn antall måltider som trengs for å mate alle mygg; hver Glytube har et 2 ml måltid og spiser ca. 25 mygg. Forbered et ekstra måltid for å kalibrere standardkurven for fluorescensavlesninger. Med mindre annet er oppgitt, beskriver alle trinnene i denne delen reagensmengder som kreves for å tilberede ett måltid med et endelig volum på 2 ml.
- For animalske blodmåltider overføres du 1,98–2 ml beruset saueblod til et konisk rør på 15 ml (se trinn 3.3 for ønsket blodvolum).
MERK: Kommersielt berusede kilder til virveldyrblod, inkludert fra sauer, marsvin og mennesker, kan brukes13. Før bruk må du sørge for at det kjøpte blodet ikke har passert utløpsdatoen og bland det godt ved å invertere flasken, spesielt hvis det er synlig separasjon av blodkomponenter. - For optimal fôring, tilsett ATP til en endelig konsentrasjon på 1–2 mM etter at saueblodet er varmet opp til 45 °C i et vannbad. For en endelig konsentrasjon på 1 mM ATP, tilsett 10 μL av 200 mM ATP-lagerløsningen til 1,99 ml forhåndsoppvarmet blod og bland. For en endelig konsentrasjon på 2 mM ATP, tilsett 20 μL av 200 mM ATP-lageret til 1,98 ml forhåndsoppvarmet blod og bland. Hvis ATP ikke skal tilsettes, varm 2 ml beruset saublod.
- Hvis fluorescensbasert kvantifisering av måltidsstørrelse senere skal utføres, tilsett fluoresceinløsning til en endelig konsentrasjon på 0,002 % (2 μL 2 % fluoresceinlager i 2 ml totalt måltidsvolum). Reduser volumet av blod med samme mengde som fluorescein tilsatt. Behold 1 ml av den endelige måltidsformuleringen som inneholder 0,002 % fluorescein for å generere referansestandardkurven. Behandle det beholdte volumet identisk med måltidet som leveres til mygg; utsettes for de samme lys- og temperaturforholdene gjennom hele eksperimentets varighet, og deretter fryse dette sammen med det leverte måltidet.
- Fremstilling av kunstige blodmåltider
- Beregn antall måltider som trengs for å mate alle mygg; hver Glytube har et 2 ml måltid og spiser ca. 25 mygg. Forbered et ekstra måltid for å kalibrere standardkurven for fluorescensavlesninger. Med mindre annet er oppgitt, beskriver alle trinnene i denne delen reagensbeløp som kreves for å tilberede ett 2 ml måltid.
- For å forberede kunstig blod (tilpasset fra Kogan (1990)22), som i tabell 1, først lage en lagerløsning på 400 mM NaHCO3. For et totalt volum på 10 ml på 400 mM NaHCO3 (MW = 84,006 g/mol), tilsett 336 mg NaHCO3 i en volumetrisk kolbe og fyll med dobbeltdestillert vann (ddH2O) til et totalt volum på 10 ml. Bruk en magnetisk rørestang til å blande oppløsningen grundig til alle NaHCO3 er oppløst.
- For proteinkomponentene i kunstig blod, klargjør lagerløsninger på 50 mg/ml γ-globuliner i 400 mM NaHCO3, 35 mg/ml hemoglobin i ddH2O og 300 mg/ml albumin i ddH2O. Protein lagerløsninger kan lagres ved 4 °C i opptil 2 måneder. Den endelige konsentrasjonen av totale humane proteiner i kunstig blod er 125 mg /ml. Dette inkluderer endelige konsentrasjoner på 15 mg/ml γ-globuliner, 8 mg/ml hemoglobin og 102 mg/ml albumin.
- For hvert 2 ml måltid kombinerer du 600 μL γ-globuliner, 460 μL hemoglobin, 680 μL albumin og 250 μL ddH2O fra lagerløsninger oppført i tabell 1. Vent med å tilsette 10 μL på 200 mM ATP lagerløsning til etter at måltidet er varmet opp til 45 °C, umiddelbart før måltidet presenteres.
- Hvis fluorescensbasert kvantifisering av måltidsstørrelse senere skal utføres, tilsett fluoresceinløsning til en endelig konsentrasjon på 0,002 % (2 μL 2 % fluoresceinlager i 2 ml totalt måltidsvolum). Reduser volumet av ddH2O i trinn 4,4 med samme mengde som fluoresceinen tilsatt. Behold minst 1 ml av den endelige måltidsformuleringen som inneholder 0,002 % fluorescein for å generere referansestandardkurven. Behandle det beholdte volumet identisk med måltidet som leveres til mygg; utsettes for de samme lys- og temperaturforholdene gjennom hele eksperimentets varighet, og deretter fryse dette sammen med det leverte måltidet.
- Tilberedning av eksempel proteinfrie saltvannsmåltider (tilpasset fra Duvall et al. (2019)7)
MERK: Proteinfrie saltvannsmåltider kan tilberedes på fleremåter 7,27,32. Saltvannsmåltidet som presenteres her er en proteinfri versjon av den kunstige blodoppskriften beskrevet ovenfor.- Beregn antall måltider som trengs for å mate alle mygg; hver Glytube har et 2 ml måltid og mater ca 25 mygg Forbered ett ekstra måltid for å kalibrere standardkurven for fluorescensmålinger. Med mindre annet er oppgitt, beskriver alle trinnene i denne delen reagensbeløp som kreves for å tilberede ett 2 ml måltid.
- For å tilberede saltvannsmåltidet, lag en lagerløsning på 400 mM NaHCO3. For et totalt volum på 10 ml 400 mM NaHCO3 (MW = 84,006 g/mol), tilsett 336 mg NaHCO3 i en volumetrisk kolbe og fyll med ddH2O til et totalt volum på 10 ml. Bruk en magnetisk rørestang til å blande oppløsningen grundig til alle NaHCO3 er oppløst.
- For hvert 2 ml måltid, kombineres i et konisk rør på 15 ml 600 μL på 400 mM NaHCO3 med 1,39 ml ddH2O. Vent med å tilsette 10 μL av 200 mM ATP-lagerløsningen til etter måltidet er varmet opp til 45 °C i et vannbad.
- Hvis fluorescensbasert kvantifisering av måltidsstørrelse senere skal utføres, tilsett fluoresceinløsning til en endelig konsentrasjon på 0,002 % (2 μL 2 % fluoresceinlager i 2 ml totalt måltidsvolum). Reduser volumet av ddH2O i trinn 5.3 med samme mengde som fluoresceinen tilsatt. Behold minst 1 ml av den endelige måltidsformuleringen som inneholder 0,002 % fluorescein for å generere referansestandardkurven. Behandle det beholdte volumet identisk med måltidet som leveres til mygg; utsettes for de samme lys- og temperaturforholdene gjennom hele eksperimentets varighet, og deretter fryse dette sammen med det leverte måltidet.
2. Måltid levering til mygg
- Sette opp myggbeholdere for fôring
MERK: Mygg kan mates i en rekke beholdere så lenge følgende kriterier er oppfylt. Sørg for at beholderen er stor nok til at mygg kan fly rundt i, men ikke så stor at det vil være vanskelig for myggene å finne mesh-overflaten og begynne å mate. Nettet som brukes til å dekke beholderen kan variere i materiale og hullstørrelse. Hullene må være store nok til at den kvinnelige myggens stylet kan pierce gjennom, men ikke så stor at myggen kan unnslippe. Fest nettet godt slik at det er stramt, og Glytube kan hvile stabilt på overflaten gjennom hele fôringsperioden.- En eksempelbeholder (figur 1) er en modifisert 946 ml plastbøtte med høy tetthet . For å gjenskape dette oppsettet, bruk et barberblad til å kutte et sentralt hull på ~ 10 cm diameter i bøttelokket. For å montere beholderen for okkupasjon av mygg, fest et ~ 400 cm2 firkantet stykke hvitt 0, 8 mm polyester myggnetting på toppen av bøtten, og skyv det perforerte lokket trygt ned over det for å smekker tett.
- Samle kvinnelige mygg som er minst 3 dager etter eclosion for å sikre at de er modne nok til å blodfôr. Optimal fôringshastighet observeres etter 7 dager33.
- Legg kvinnelige mygg i beholderen og dekk med mesh. Hvis beholderen er tett befolket med mygg, øk antall Glytubes som brukes. Optimal fôring oppnås med ~ 25 mygg / Glytube. Dette reduserer konkurransen om tilgang til matemembranen.
- Sett til side en kontrollgruppe av ufede mygg som ikke vil bli tilbudt et måltid. I vektmålingsprotokollen, veie den umatede gruppen separat og bruk denne vekten til å estimere vektøkning i den eksperimentelle gruppen som matet på et måltid. I den fluorescensbaserte kvantifiseringsprotokollen legger du til den ufiserte mygggruppen til brønnene for standard kurveberegninger og for negative kontroller. For å matche baseline myggvev autofluorescens i eksperimentell gruppe, sørg for at standardkurve og negative kontrollbrønner inneholder en ufed mygg.
- Bygging og oppsett av Glytube (tilpasset fra Costa-da-Silva et al. (2013)20)
- Som avbildet i figur 1, for å generere en varmekilde, fyll et 50 ml konisk rør med 40 ml 100% glyserol. Forsegle det åpne koniske røret med en 5 cm × 5 cm parafilm og gjenta med et ekstra stykke 5 cm × 5 cm parafilm for å minimere sjansen for lekkasje. Parafilmen kan eventuelt holdes på plass ved hjelp av gummibånd. Inverter røret for å sikre at det ikke er hull eller hull.
- For å lage måltidsleveringsenheten, kutt et sentrert hull på 2,5 cm diameter i skrukorken på det koniske røret ved hjelp av et skarpt barberblad eller, for bedre konsistens, en omten. Strekk en 5 cm × 5 cm stykke parafilm jevnt slik at den omtrent dobles i størrelse. Parafilmen skal være tynn nok til at mygg lett kan pierce gjennom den, men det bør ikke være noen lekkasjer. Tett over den ytre overflaten av skrukorken for å dekke hullet helt og sett hetten til side.
MERK: For å øke tiltrekningen til Glytube, før du strekker parafilmen, parfymerer den med menneskelig lukt ved å forsiktig gni den på en flekk av menneskelig hud uten kosmetikk påført, og vær forsiktig med at ingen hull er opprettet. Dette anbefales hvis eksperimentet ikke er rettet mot å undersøke de sensoriske signaler som kreves for mygg å nærme seg måltidet. - Varm både det forseglede røret av glyserol og måltidet (med alle komponenter unntatt ATP) i et 42–45 °C vannbad i minst 15 min. IKKE forvarm ATP; legge den til umiddelbart før du starter eksperimentet.
- Tilsett ATP til det oppvarmede måltidet og virvelen grundig. Pipette 2 ml av det oppvarmede måltidet i det indre kammeret på skrukorken og legg forsiktig det inverterte, varme, glyserolfylte koniske røret i den. Skru luen delvis med måltidet på det glyserolfylte røret – akkurat nok til å forhindre lekkasje av måltidet eller glyserolen.
MERK: Måltidsvolumet som brukes kan variere mellom 1 ml og 2,5 ml. Lavere volumer kan være spesielt nyttig når måltider brukes til å levere forbindelser som er knappe eller dyre. Det er viktig å jobbe raskt på dette trinnet slik at måltidet ikke avkjøles til omgivelsestemperatur og reduserer sannsynligheten for maksimal fôring. Kjølehastigheten vil avhenge av omgivelsestemperaturen i rommet der disse trinnene utføres, men de bør vanligvis fullføres innen 5 min ved 25 °C. - Plasser den monterte Glytube på toppen av myggbeholderen og gi myggene tilgang til å mate i minst 15 min for å oppnå maksimale fôringshastigheter.
- For optimal fôring, plasser myggbeholdere inne iet kammer utstyrt med en CO 2-pute, og la minst 15 min akklimatisering ved 25–28 °C og 70–80 % fuktighet før måltidet leveres. Analysekammeret som brukes her er en enkel og rimelig modifikasjon av et tidligere publisert oppsett16. Den bruker en gjennomsiktig polypropylen oppbevaringsboks av størrelse 36 cm L × 31 cm W × 32 cm H med et avtagbart lokk. Et hull med diameter på 1,5 cm laget i kammerveggen gjør det mulig for CO2-levering gjennom silikonrør. CO 2-diffusjonsputen er festet til det indre midten av lokket for levering av renset luft og CO 2 for å balsamerekammeratmosfæren under studien.
MERK: Pass på at vertssignaler (varme og CO2, med valgfri vertslukt16) er til stede slik at myggene er tiltrukket av membranmateren. Hvis mygg ikke er overfylt under Glytube, sjekk at CO2 er riktig levert og at måltidet og Glytube er tilstrekkelig varmt. Hvis en ekstern CO2-kilde ikke er tilgjengelig, kan CO2 leveres via puffer av utåndet menneskepustethet. - Etter fôring kan Glytube-hetten kastes som biologisk farlig avfall eller gjenbrukes etter bløtlegging i en lav prosentandel blekemiddelløsning og grundig skylling i vann.
3. Kvantifisering av konsumerte måltider
- Veiing mygg som skal brukes til ytterligere eksperimenter
MERK: Veiing av mygg for å kvantifisere måltidsstørrelsen gjør at de kan brukes til videre levende eksperimentering, men denne metoden krever å ta vektmålinger fra en gruppe på 5 mygg. Siden vekter av individuelle mygg er vanskelig å nøyaktig måle ved hjelp av de fleste laboratoriebalanser, kan variasjon i individuell måltidsstørrelse ikke lett kvantifiseres ved å måle vekter. Veiing anbefales bare for situasjoner der kvinner synlig omslutter måltidet.- Kaldbedøvelse mygg ved å flytte beholderen til et 4 ° C kaldt rom eller plassere den på is.
- Veie grupper på 5 kvinner fra den ufôret kohorten (det vil si mygg som aldri ble tilbudt et måltid) og beregner sin gjennomsnittlige vekt som estimatet av "pre-fôring" vekt. Den gjennomsnittlige vekten av en ufed mygg avhenger av genotype, kjønn og oppfoveringsforhold. Unfed kvinnelige Ae. aegypti mygg oppdratt med ad libitum tilgang til sukrose vanligvis veier ca 2 mg hver.
- Fra den eksperimentelle kohorten (det vil si mygg som ble tilbudt et måltid), sorterer kvinner i "matet" og "ikke matet" hauger basert på abdominal distensjon observerbar av øye7. Del hver av de "matet" og "ikke matet" hauger, henholdsvis i grupper på 5 mygg for veiing. Mygg i hver gruppe på 5 bør utledes fra samme eksperimentelle kohort for å ta gruppevektmålinger. Beregn gjennomsnittsvekten per kvinne fra hver av de "matet" og "ikke matet" hauger av eksperimentell gruppe.
- Fluorescensmåling for sluttpunktanalyse7,27,34
MERK: For å oppnå nøyaktige mål for måltidsstørrelse fra individuelle mygg som ikke lenger er nødvendige for videre levende eksperimentering, lagre myggene og de resterende 1 ml måltid som inneholder 0,002% fluorescein ved -20 °C umiddelbart etter fôring. Eksperimentet kan settes på pause her. Denne metoden er beskrevet i Figur 2.- For å generere en referansestandardkurve, lag en seriell fortynning av samme måltid som inneholder 0,002% fluorescein som ble tilbudt til den eksperimentelle gruppen mygg. Det vil være totalt 8 standard kurveløsninger. I hver av disse løsningene vil det endelige måltidsvolumet som inneholder 0,002 % fluorescein være 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,3125, 0,15625, 0,078125 eller 0 μL, og hver vil være i 1x fosfatbufret saltvann (PBS) for et totalt volum på 100 μL (f.eks. 5 μL måltid som inneholder 0,002 % fluorescein i 95 μL av 1x PBS).
- For å gjøre den første løsningen av standardkurven, tilsett 50 μL måltid som inneholder 0,002% fluorescein til 950 μL av 1x PBS og virvel grundig (endelig volum: 5 μL måltid som inneholder 0,002% fluorescein i 95 μL av 1x PBS). For å lage resten av standardkurveløsningene, utfør en 2-fold fortynning for hvert trinn ved å ta 500 μL fra forrige rør og legge den til et nytt rør som inneholder 500 μL μL 1x PBS. Vortex godt før du forbereder neste 2-fold fortynning.
- For å forberede brønner som skal brukes til å generere en referansestandardkurve, pipette 100 μL av hver av standard kurveløsninger i hver av de 8 brønnene i den første kolonnen på en 96-brønns PCR-plate. Tilsett 1 ufed kontroll mygg til hver av de samme 8 brønnene i den første kolonnen av platen. Gjenta i den andre kolonnen på platen for en replikeringsmåling.
MERK: Hvis eksperimentelle grupper tilbys forskjellige måltidstyper, må en egen referansestandardkurve tilberedes for hver måltidstype. - Tilsett 100 μL 1x PBS i hver gjenværende brønn for ufed kontroll og eksperimentelle grupper. Hvis vev skal forstyrres i etterfølgende trinn ved hjelp av en perlemølle homogenisator eller vortex, legg til en 3 mm borosilikat solid glassperle til hver brønn.
- Som en negativ kontroll, legg til 1 ufed mygg til hver brønn i de neste 2 kolonnene på platen. Fluorescensen målt i denne gruppen setter en baseline cutoff for å ta hensyn til vev autofluorescens og vil bli brukt til å avgjøre om en mygg i eksperimentell gruppe matet på måltidet.
- Tilsett 1 mygg per brønn til de resterende brønnene fra de eksperimentelle gruppene som ble tilbudt et måltid.
- Forsegle platen nøye og forstyrre vevet ved manuell sliping. Magen skal være grundig homogenisert for å frigjøre måltidet. Metoder for å forstyrre vev inkluderer bruk av en perlemølle homogenisator med 3 mm borosilikat solid-glass perler (30 Hz i 30 sekunder), vortex mikser med 3 mm borosilikat solid-glass perler, eller en pestle jeksel uten perler.
- Sentrifuger platen ved 2000 rpm i 1–2 min for å samle lysatet.
- Forbered en svart 96-brønnsplate med 180 μL 1x PBS i hver brønn.
- Overfør 20 μL lysat til hver brønn med 180 μL 1x PBS og bland. Hvis tilgjengelig, bruk en flerkanals pipette på dette trinnet for økt hastighet og bedre konsistens.
- Mål fluorescensintensiteten til hver brønn ved hjelp av en plateleser på 485/520-eksitasjons-/utslippskanalen. Generer referansestandardkurven ved å plotte det kjente måltidsvolumet mot den tilsvarende fluorescensintensitetsmålingen.
- Ved hjelp av referansestandardkurven som genereres, ekstrapolere måltidsvolumet innta av hver av de eksperimentelle gruppemyggene. Trekk den gjennomsnittlige fluorescensintensiteten lesing av den negative kontrollgruppen av ufed mygg fra fluorescensintensiteten lesing av hver eksperimentell gruppe individ for å korrigere for baseline vev autofluorescens.
Representative Results
Figur 1 presenterer en skjematisk for montering av Glytube, mens figur 2 viser en oversikt over den eksperimentelle designen for å måle måltidsstørrelsen ved hjelp av fluorescensbasert analyse som er beskrevet her. Figur 3 gir representative fluorescein måltid størrelse målinger fra en blod-fôring eksperiment. Figur 4, Figur 5og Figur 6 illustrerer et utvalg av biologiske spørsmål som kan tas opp ved hjelp av denne protokollen. Anvendelser av protokollen er omfattende og inkluderer endring av blodmåltidssammensetning, fôring av farmakologiske forbindelser, nøyaktig kvantifisere sub-optimale blodmåltider eller mindre nektarmåltider, og sammenligne fôringsatferd på tvers av mygggenotyper.
For å generere en standardkurve for måltidsvolumberegninger plottes fluorescensavlesninger fra de angitte referansebrønnene som hver inneholder en ufed mygg og et kjent volum av måltidet med 0,002% fluorescein (figur 3A). Fluorescensavlesninger fra de resterende brønnene, som inneholder mygg fra enten den negative kontrollgruppen av ufede mygg eller den eksperimentelle gruppen mygg som tilbys et måltid, sammenlignes med denne standardkurven for å kvantifisere måltidsvolumet (μL) som forbrukes av hver mygg (figur 3B). For å validere baseline avlesningene i denne analysen, bør det bekreftes at mygg fra den ufedde negative kontrollgruppen ikke er tildelt en positiv verdi på μL konsumert (figur 3B, venstre). Selv om alle kvinner i den eksperimentelle gruppen ble tilbudt blodmåltidet, noen mygg matet (Figur 3B, midten) og noen gjorde ikke (Figur 3B, ikke sant). Dette resultatet viser at to typer data kan hentes fra denne protokollen: 1) prosentandelen av totale kvinner som spiser på et gitt måltid, og 2) volumet innta av kvinner som spiser på et gitt måltid.
Denne protokollen kan brukes til å levere og kvantifisere måltider med ulike proteinsammensetninger. Figur 4A,B viser data samlet inn ved hjelp av måltider med ekstra fluorescein. Andelen mygg som matet og måltidsvolumet de innstvinget, ble beregnet ut fra fluorescensavlesningene. Disse målingene er svært følsomme og tillater presis kvantifisering av μL, men har begrensningen at mygg ikke kan brukes til fremtidige levende eksperimenter. Figur 4C,D viser data samlet inn fra et uavhengig eksperiment med mygg som ble scoret som matet eller ufed av øyet etter at de ble tilbudt måltider uten fluorescein. Måltidsstørrelsen ble beregnet som gjennomsnittlig vekt / kvinne fra grupper på 5 mygg. Selv om disse vektmålingene er mindre følsomme enn fluorescensmålinger, tillater de at hunnene gjenopprettes og brukes til videre levende eksperimentering. Andelen mygg som spiser kan variere over forskjellige eksperimentelle dager, som gjenspeiles i figur 4A og figur 4C.
Figur 5 viser volumet som forbrukes av måltider som inneholder legemidler som regulerer myggvertssøkende oppførsel. I disse eksperimentene ble kvinner tilbudt blod, saltvann + ATP, eller saltvann + ATP måltider med 100 μM av den menneskelige NPY Y2 reseptoragonist, TM30338. Dette stoffet endrer vertssøkende atferd gjennom aktivering av Ae. aegypti NPY-lignende reseptor 7. Måling av måltidsstørrelser er avgjørende for tolkningen av eksperimenter for å vurdere effekten av dette stoffet på post-blod-fôring atferd fordi det tillater forskeren å beregne dosen forbrukes av hver kvinne.
I de tidligere eksemplene ble kvinner matet enten blod eller erstatning av blodmåltider, som alle resulterte i 3–5 μL måltider (figur 3, figur 4, figur 5). Denne fluorescensbaserte analysen kan også brukes til å måle mindre og/eller mer variable måltidsstørrelser som ikke kan skilles nøyaktig fra gjennomsnittlige gruppevektmålinger. I figur 6ble den samme fluorescensekvantifiseringsprotokollen brukt til å måle nektarfôring ved å utveksle Glytube for en bomullsdott mettet med 10% sukrose som inneholder 0,002% fluorescein. Nektarsukker kan ikke presenteres i Glytube-analysen fordi kvinner ikke kan oppdage tilstedeværelsen av nektarsukker med styleten og ikke initierefôring 27. Disse dataene gjør det mulig for forskeren å fastslå at sukkermåltider er konsekvent mindre enn blodmåltider, i samsvar med tidligerearbeid 34 (figur 6).
Figur 1: Oppsett av Glytube-metoden som brukes til å mate måltider til mygg. (A) Skjematisk av en dekonstruert Glytube brukes til å mate blod og andre måltider til mygg. (B) Skjematisk av en Glytube presentert på toppen av en beholder med mygg med et nettinglokk. Kvinnelige mygg kan pierce gjennom nettinglokket for å mate. (C) Fotografier av Glytube (øverst), og kvinnelige Aedes aegypti mygg før, under, og etter fôring (bunn, fra venstre til høyre) på et Glytube-levert måltid. Mygg vises piercing gjennom nettet som dekker beholderen for å få tilgang til membranmateren. (D) Fotografier som viser utseendet på kvinnelige Ae. aegypti mygg som er unfed (venstre) og som har engorged på enten en kunstig blod måltid (høyre, topp) eller en saltvann + ATP måltid (høyre, bunn). Glytube-metoden ble tidligere publisert i Costa-da-Silva et al. (2013)20. Fotografier i (C) og (D) er gjengitt med tillatelse fra Alex Wild. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Skjematisk for hvordan man kvantifiserer måltidsstørrelsen etter Glytube blodfôringsprotokoll. (A) Mygg tilbys et måltid med fluorescein (topp, eksperimentell gruppe) eller ingen måltid (bunn, ufed negativ kontrollgruppe). (B) Individuelle mygg legges til en 96-brønns plate etter avsluttet fôringseksperimentet. (C) Standardkurve genereres ved hjelp av kjente mengder måltid som inneholder 0,002% fluorescein. (D) Mygg er homogenisert for å frigjøre konsumert fluorescein, og fluorescensnivåer i hver brønn kvantifiseres ved hjelp av en plateleser. Denne fluorescens kvantifiseringsmetoden er endret fra Liesch et al. (2013)34. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Glytube blodfôring eksperiment med fluorescein-basert kvantifisering. (A) Standard kurvemålinger hentet fra brønnene hvor en mygg fra den ufede kontrollgruppen ble lagt til en kjent mengde måltid som inneholder 0,002% fluorescein (y-akseskala = vilkårlige enheter). (B) Måltidsvolum beregnet ved hjelp av fluorescensmålinger for kvinner i den ufôret kontrollgruppen (venstre, svart, n = 40), den eksperimentelle gruppen som matet på blod (midten, rød, n = 37), og den eksperimentelle gruppen som ikke matet på blod (høyre, rød, n = 23). Hvert punkt representerer en måling fra en individuell kvinne. Data vises som median med rekkevidde. Brev indikerer statistisk forskjellige grupper, Kruskal-Wallis test med Dunns flere sammenligning, p<0.01. Disse dataene ble publisert i Jové et al. (2020)27. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Kvantifisering av måltider med forskjellig proteinsammensetning. Hunnene ble tilbudt måltider av enten saueblod (rødt), kunstig blod med humant blodproteiner (Kogan (1990)22) (oransje) eller proteinfri saltvann + ATP-måltid (aqua)7. (A) Prosentandel av kvinner matet scoret ved hjelp av fluorescens målinger. Hvert punkt representerer en gruppe på 12-16 kvinner. Data vises som medianer med områder, n = 12. (B) Måltidsvolum beregnet ved hjelp av fluorescensavlesninger. Hvert punkt representerer en måling fra en individuell kvinne i en enkelt studie fra figur 4A. Data vises som medianer med områder, n = 12. (C) Prosentandel av kvinner fullt oppslukt etter kunstig membran fôring, scoret av øyet. Hvert punkt representerer prosentandelen av kvinner som er oppslukt av grupper på 20–30 kvinner. Data vises som medianer med områder, n = 23. (D) Måltidsstørrelser scoret som vekt / kvinne etter fôring status ble scoret av øyet. Vekter ble beregnet som gjennomsnittet av grupper på 5 mygg. Data vises som medianer med områder, n = 23. A–D: Bokstaver indikerer statistisk forskjellige grupper, Kruskal-Wallis test med Dunns flere sammenligning, p<0.05. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Kvantifisering av måltider med farmakologiske forbindelser. Hunnene spiser måltider av samme størrelse av saueblod (rød), saltvann + ATP (aqua) og saltvann + ATP + 100 μM dose human NPY Y2 reseptoragonist TM30338 (mørk blå). Måltidsvolum beregnet ved hjelp av fluorescensavlesninger. Hvert punkt representerer en måling fra en individuell kvinne. Data vises som medianer med områder, n = 12. Brev indikerer statistisk forskjellige grupper, Kruskal-Wallis test med Dunns flere sammenligning, p<0.05. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Kvantifisering av mindre nektarmåltider. (A)Skjematisk av nektar-fôring analyse. (B) Måltidsvolum beregnet ved hjelp av fluorescensmålinger for ville kvinner tilbød måltider av enten vann (blå, n = 36) eller 10% sukrose (grønn, n = 53), hver med 0,002% fluorescein, i nektarfôringsanalysen. Hvert punkt representerer en måling fra en individuell kvinne. Data vises som medianer med områder. Brev indikerer statistisk forskjellige grupper, Mann-Whitney test, p<0.05. Disse dataene ble publisert i Jové et al. (2020)27. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Kunstig blod måltid | |||
| Konsentrasjon av lagerløsning (mg/ml) | Volum av lagerløsning i måltid (μL/ml) | Endelig måltidskonsentrasjon (mg/ml) | |
| Proteinkomponenter* | |||
| γ-Globulins | 50 | 300 | 15 |
| Hemoglobin | 35 | 230 | 8 |
| Albumin | 300 | 340 | 102 |
| Totalt protein | - | - | 125 |
| Ikke-proteinkomponenter | |||
| Konsentrasjon av lagerløsning (mM) | Volum av lagerløsning i måltid (μL/ml) | Endelig måltidskonsentrasjon (mM) | |
| Nacl | På γ-globulin lager | - | 5-10 |
| NaHCO3 | På γ-globulin lager | - | 120 |
| Atp | 200 | 5 | 1 |
| Vann | - | 125 | - |
| *Proteinkomponenter fremstilles i lagerløsning av dobbeltdestillert vann, med unntak av γ-Globulins, som oppløses i 400 mM NaHCO3 og inkluderer en variabel mengde NaCl (2-4%) i produktet. | |||
Tabell 1: Oppskrift på tilberedning av kunstige blodmåltider (tilpasset fra Kogan (1990)22). Kunstig blod består av protein- og ikke-proteinkomponenter som regelmessig finnes i menneskelig blod og gir mulighet til å variere forholdene til disse komponentene. Mygg kan produsere egg etter fôring på kunstigblod 7,22.
| Saltvann måltid | |||
| Komponent | Konsentrasjon av lagerløsning (mM) | Volum av lagerløsning i måltid (μL/ml) | Endelig måltidskonsentrasjon (mM) |
| Nacl | - | - | - |
| NaHCO3 | 400 | 300 | 120 |
| Atp | 200 | 5 | 1 |
| Vann | - | 695 | - |
Tabell 2: Oppskrift på saltvannsmåltid med ATP (tilpasset fra Duvall et al. (2019)7). Proteinfrie saltvannsmåltider kan brukes til å levere forbindelser av interesse for mygg mens de fortsatt etterligner abdominal distensjon som oppstår etter blodfôring, men uten å utløse eggutviklingen som oppstår når proteiner inntar.
Discussion
For mange laboratorieapplikasjoner tilbyr kunstige membranmatere forskjellige fordeler sammenlignet med levende verter ved å tillate forskere muligheten til å manipulere innholdet i måltidet direkte. Selv om flere metoder er tilgjengelige for kunstig membranfôring, gir metoden som er beskrevet her fordeler i fleksibilitet, kostnad og gjennomstrømming. Sammenlignet med andre kommersielle membranmatere krever Glytube-analysen et lite måltidsvolum, noe som gjør det til en effektiv leveringsmekanisme for kostbare reagenser, inkludert stoffer eller patogener, ved å minimere det totale volumet som kreves7,35. Som både protein-fri saltvann og kunstige blod måltider fremme engorgement, forbindelser eller patogener kan legges til enten måltid som en høy gjennomstrømning og ikke-invasiv alternativ til injeksjoner. I tillegg kan hver komponent av Glytube enkelt vaskes, erstattes eller skaleres opp for å levere og kvantifisere flere måltidstyper uten krysskontaminering av fôringsapparatet.
For å kvantifisere måltidsvolumer som forbrukes av mygg, muliggjør fluorescensbasert metode mer presis måltidsstørrelse kvantifisering enn å veie myggene før og etter fôring. Det bør bemerkes at denne metoden er en sluttpunktanalyse. I motsetning gjør veiing at myggene kan holdes i live for videre eksperimentering. Ved å bruke en plateleser kan den fluorescensbaserte metoden enkelt skaleres opp for kvantifisering av måltider som forbrukes av hundrevis av individuelle kvinner.
For å oppnå høye fôringshastigheter må en kombinasjon av tilstrekkelige vertssignaler være til stede for å aktivere kvinnelig vertssøkende oppførsel og tiltrekke kvinner til materen. Hvis mygg ikke er overfylt under Glytube, kan måltidet ikke varmes riktig, eller CO2 levering kan ikke være tilstrekkelig. Tilsetning av menneskelig lukt til membranoverflaten øker pålitelig attraktiviteten til den kunstige membranen. Hvis mygg observeres under Glytube, men ikke klarer å mate, kan måltidssammensetningen være feil. Kvinner kan ikke mate hvis måltidet i seg selv ikke er varmt, blodet er for gammelt, eller hvis tilsetningsstoffene til måltidet er iboende aversive eller forårsaker en uønsket kjemisk reaksjon36. Ytterligere ATP øker også fôringshastighetene på en pålitelig måte og kan skaleres opp til en endelig konsentrasjon på 2 mM i hver av oppskriftene som tilbys. Kvinner kan ikke mate hvis parafilmen ikke trekkes stramt over Glytube-hetten; parafilmen skal være jevnt gjennomsiktig og bør ikke spenne, da dette hindrer kvinnen i å effektivt pierce parafilmen med sin stylet. Hvis måltidet lekker gjennom Glytube på nettet, kan parafilmen ha revet under strekkprosessen og bør byttes ut.
Endring av måltidssammensetningen kan også tillate forskere å manipulere hvor lang tid som trengs for å fjerne måltidet fra midtgut, samt den påfølgende vertssøkende oppførselen. Måltidene som presenteres her krever 24-36 timer forfordøyelsen 7 lik animalsk-avledet blod. Etter fôring på noen av disse måltidene, vil kvinner undertrykke vertssøkende under fordøyelsestidsvinduet. Siden saltvannsmåltidet mangler protein, går kvinner tilbake til vertssøkende etter at måltidet er ryddet. Hvis en raskere avkastning er ønskelig, kan forskerne velge alternative "rask rydding" saltvannsmåltider som utskilles i ca. 6 t27. Mens sammensetningen av saltvannsmåltidet som presenteres her, er matchet for å sammenligne resultatene direkte med det kunstige blodmåltidet, matcher det "raske clearing" måltidet nærmere fysiologiske saltnivåer som finnes i virveldyrblod.
Metodene som er beskrevet her har begrensninger som bør vurderes før du velger analysen som passer best til forskerens eksperimentelle mål. Fluoresceinmålingene som er beskrevet, tillater ikke mygg som brukes igjen til ytterligere eksperimentering. Vektmålinger kan imidlertid tas før kvantifisering av måltidsstørrelse ved hjelp av fluoresceinsanalysen. Hvis vekt og måltidsstørrelse er konsistent på tvers av flere forsøk for et gitt måltid, kan vekten brukes som proxy i fremtidige eksperimenter. Videre skiller denne protokollen ikke mellom underskudd i vertssøkende versus blodfôringsatferd; mygg som viser nedsatt funksjonsevne i å finne membranmateren vil ha en reduksjon i fôringshastigheter og / eller måltidsstørrelse. Ved å legge til et kamera for å registrere atferd gjennom hele analysen, kan forskerne avgjøre om hunnene ikke finner Glytube, eller om de finner Glytube, men ikke mater.
Analysen som er beskrevet her, kan tilpasses for å utforske mange fremragende spørsmål knyttet til fôringsatferd hos mygg. For eksempel kan bidraget fra spesifikke blodproteiner utforskes ved å endre forholdet mellom bestanddeler eller total proteinkonsentrasjon i det kunstige blodmåltidet. For å evaluere måltidsstørrelser fra flere fôringshendelser, kan fargestoffer med distinkt fluorescensspektra legges til for å skille måltider fra unikekilder 37. Denne protokollen kan også endres for å stimulere de indre munndelene som oppdager blod og som brukes til inntak (det vil si stylet), og de kjemosensoriske vedleggene som kontakter huden (det vil si labium, ben) som mygglander for å begynne blodfôring36. For eksempel, hvis ligandes legges direkte til måltidet, kontakter de ikke labium og ben, siden membranen bare gjennombores av styleten. Hvis ligandene legges til den ytre overflaten av parafilmen i stedet, forblir de atskilt fra måltidet og kan kontaktes av labium og ben36. Til slutt er de detaljerte kinetikkene til blodfôringsatferd ikke godt forstått, og metoden som presenteres her, kan endres for å kombinere høyoppløselig sporing med maskinlæringsverktøy for å trekke ut atferdsavlesninger av bevegelse, holdning og fôringsdynamikk38.
Denne protokollen er rettet mot å være brukervennlig og kostnadseffektiv, med evnen til å tjene forskere som bruker farmakologiske og genetiske manipulasjoner for å studere myggblodfôring og post-blod-fôringsatferd.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Nipun Basrur, Adriana K. Rosas Villegas, Nadav Shai og Trevor Sorrells for kommentarer til manuskriptene, og Zhongyan Gong og Kyrollos Barsoum for teknisk assistanse. Vi takker Alex Wild for fotografier som brukes i figur 1. K.V. ble støttet av Boehringer Ingelheim Fonds PhD-stipend. V.J. ble delvis støttet av NIH T32-MH095246. Dette arbeidet ble delvis støttet av et stipend til Rockefeller University fra Howard Hughes Medical Institute gjennom James H. Gilliam Fellowships for Advanced Study-programmet til V.J. Dette materialet er basert på arbeid støttet av National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program under Grant No. NSF DGE-1325261 til V.J. Eventuelle meninger, funn og konklusjoner eller anbefalinger uttrykt i dette materialet er de av forfatteren(e) og reflekterer ikke nødvendigvis synspunktene til National Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 3 mm diameter borosilicate solid-glass bead | MilliporeSigma | Z143928 | For use for bead mill homogenizer; not required if using pellet pestle grinder |
| 32 oz. high-density polyethylene (HDPE) plastic cup | VWR | 89009-668 | Example mosquito container used for feeding assays shown; alternate options can be used |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 96-well black polystyrene plate | ThermoFisher | 12-566-09 | |
| 96-well PCR plate sealing film | Bio-Rad | MSB1001 | Alternate options can be used |
| 96-well PCR plates | Bio-Rad | HSP9621 | Alternate options can be used |
| Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | MilliporeSigma | A6419 | |
| Albumin (human serum) | MilliporeSigma | A9511 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213 | Alternate options can be used to block light entering fluorescein container |
| Balance | Fisher Scientific | 01-911 | Alternate options can be used |
| Bead mill homogenizer | Qiagen | 85300 | Not required if using pellet pestle grinder |
| Cotton ball | Fisher Scientific | 22456880 | For nectar-feeding; alternate options can be used |
| Defibrinated sheep blood | Hemostat Laboratories | DSB100 | Alternate options can be used |
| Drosophila CO2 fly pad | Tritech Research | MINJ-DROS-FP | Alternate options can be used |
| Fluorescein | MilliporeSigma | F6377 | |
| Fluorescence plate-reader | ThermoFisher | VL0000D0 | Alternate options can be used |
| Gamma-globulin (human blood) | MilliporeSigma | H7379 | |
| Glycerol | MilliporeSigma | G7893 | |
| Hemoglobin (human) | MilliporeSigma | G4386 | |
| Laboratory wrapping film - parafilm | Fisher Scientific | 13-374 | |
| Magnetic stirrer | Fisher Scientific | 90-691 | Alternate magnetic stirrers can be used |
| Microcentrifuge for 96-well plate | VWR | 80094-180 | Alternate options can be used |
| Microcentrifuge Tubes | MilliporeSigma | 2236412 | Alternate options can be used |
| Pellet pestle grinder | VWR | KT749521-1500 | Not required if using bead mill homogenizer |
| Phosphate buffered solution (PBS) | Fisher Scientific | BW17-516F | Optional |
| Razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | Alternate options can be used, such as a lathe for better consistency of cutting |
| Rubber bands | |||
| Silicone tubing | McMaster Carr | Needed if using a fly pad for CO2 delivery | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | S233 | |
| Sodium chloride (NaCl) | MilliporeSigma | S9888 | |
| Stir bars | Fisher Scientific | 14-512 | Alternate magnetic stir bars can be used |
| Translucent polypropylene storage box with removable lid | Example box used for feeding assays shown | ||
| Vortex mixer | |||
| Water bath | Alternate heating device may be used | ||
| White 0.8 mm polyester mosquito netting | American Home & Habit Inc. | F03A-PONO-MOSQ-M008-WT | Alternate options can be used |
References
- Bhatt, S., et al. The global distribution and burden of dengue. Nature. 496 (7446), 504-507 (2014).
- Rogers, D. J., Wilson, A. J., Hay, S. I., Graham, A. J. The global distribution of yellow fever and dengue. Advances in Parasitology. 62 (05), 181-220 (2006).
- Chouin-Carneiro, T., et al. Differential susceptibilities of Aedes aegypti and Aedes albopictus from the Americas to Zika virus. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (3), (2016).
- Guerbois, M., et al. Outbreak of Zika virus infection, Chiapas State, Mexico, 2015, and first confirmed transmission by Aedes aegypti mosquitoes in the Amercias. Journal of Infectious Diseases. 214 (9), 1349-1356 (2016).
- Weaver, S. C., et al. Zika virus: history, emergence, biology, and prospects for control. Antiviral Research. 130, 69-80 (2016).
- Attardo, G. M., Hansen, I. A., Raikhel, A. S. Nutritional regulation of vitellogenesis in mosquitoes: implications for anautogeny. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 35 (7), 661-675 (2005).
- Duvall, L. B., Ramos-Espiritu, L., Barsoum, K. E., Glickman, J. F., Vosshall, L. B. Small-molecule agonists of Ae. aegypti neuropeptide Y receptor block mosquito biting. Cell. 176 (4), 687-701 (2019).
- Dimond, J. B., Lea, A. O., Hahnert, W. F., DeLong, D. M. The amino acids required for egg production in Aedes aegypti. The Canadian Entomologist. 88 (2), 57-62 (1956).
- Guerrero, D., Cantaert, T., Missé, D. Aedes mosquito salivary components and their effect on the immune response to arboviruses. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 1-11 (2020).
- Raquin, V., Lambrechts, L. Dengue virus replicates and accumulates in Aedes aegypti salivary glands. Virology. 507, 75-81 (2017).
- Farjana, T., Tuno, N. Multiple blood feeding and host-seeking behavior in Aedes aegypti and Aedes albopictus (diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 50 (4), 838-846 (2013).
- Scott, T. W., Takken, W. Feeding strategies of anthropophilic mosquitoes result in increased risk of pathogen transmission. Trends in Parasitology. 28 (3), 114-121 (2012).
- Ross, P. A., Lau, M. J., Hoffmann, A. A. Does membrane feeding compromise the quality of Aedes aegypti mosquitoes. PLoS ONE. 14 (11), 1-19 (2019).
- Ross, P. A., Axford, J. K., Richardson, K. M., Endersby-Harshman, N. M., Hoffmann, A. A. Maintaining Aedes aegypti mosquitoes infected with wolbachia. Journal of Visualized Experiments. 2017 (126), 1-8 (2017).
- Briegel, H., Hefti, M., DiMarco, E. Lipid metabolism during sequential gonotrophic cycles in large and small female Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 48 (5), 547-554 (2002).
- McMeniman, C. J., Corfas, R. A., Matthews, B. J., Ritchie, S. A. S., Vosshall, L. B. Multimodal integration of carbon dioxide and other sensory cues drives mosquito attraction to humans. Cell. 156 (5), 1060-1071 (2014).
- Pakes, S. P., et al. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , National Academic Press. Washington, DC, USA. (2011).
- Deng, L., Koou, S. Y., Png, A. B., Ng, L. C., Lam-Phua, S. G. A novel mosquito feeding system for routine blood-feeding of Aedes aegypti and Aedes albopictus. Tropical Biomedicine. 29 (1), 169-174 (2012).
- Gunathilaka, N., Ranathunge, T., Udayanga, L., Abeyewickreme, W. Efficacy of blood sources and artificial blood feeding methods in rearing of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) for sterile insect technique and incompatible insect technique approaches in Sri Lanka. BioMed Research International. 2017, 3196924 (2017).
- Costa-da-Silva, A. L., et al. Glytube: a conical tube and parafilm M-based method as a simplified device to artificially blood-feed the Dengue vector mosquito, Aedes aegypti. PLoS ONE. 8 (1), 53816 (2013).
- Carvalho, D. O., et al. Mass production of genetically modified Aedes aegypti for field releases in Brazil. Journal of Visualized Experiments. 83 (83), 1-10 (2014).
- Kogan, P. H. H. Substitute blood meal for investigating and maintaining Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 27 (4), 1-4 (1990).
- Gonzales, K. K., Hansen, I. A.
- Baughman, T., et al. A highly stable blood meal alternative for rearing Aedes and Anopheles mosquitoes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (12), 0006142 (2017).
- Galun, R. Feeding stimuli and artificial feeding. Bulletin of the World Health Organization. 36, 590-593 (1967).
- Galun, R. Feeding response in Aedes aegypti: stimulation by adenosine triphosphate. Science. 142, 1674-1675 (1963).
- Jové, V., et al. Sensory Discrimination of Blood and Floral Nectar by Aedes aegypti Mosquitoes. Neuron. 108, 1-18 (2020).
- Petersen, M. T., et al. The impact of the age of first blood meal and Zika virus infection on Aedes aegypti egg production and longevity. PLoS ONE. 13 (7), 1-15 (2018).
- Sissoko, F., et al. Frequent sugar feeding behavior by Aedes aegypti in Bamako, Mali makes them ideal candidates for control with Attractive Toxic Sugar Baits (ATSB). PLoS ONE. 14 (6), 0214170 (2019).
- Houseman, J. G., Downe, A. E. R. Methods of measuring blood meal size and proteinase activity for determining the effects of mated state of digestive processes of female Aedes aegypti (L.) (Diperta: Culicidae). The Canadian Entomologist. 18, 241-248 (1986).
- Redington, B. C., Hockmeyer, W. T. A method for estimating blood meal volume in Aedes aegypti using a radioisotope. Journal of Insect Physiology. 22 (7), 961-966 (1976).
- Gonzales, K. K., et al. The effect of SkitoSnack, an artificial blood meal replacement, on Aedes aegypti life history traits and gut microbiota. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
- Klowden, M. J. The endogenous regulation of mosquito reproductive behavior. Experientia. 46 (7), 660-670 (1990).
- Liesch, J., Bellani, L. L., Vosshall, L. B. Functional and genetic characterization of neuropeptide Y-like receptors in Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (10), 22486 (2013).
- Frances, S. P., Sithiprasasna, R., Linthicum, K. J. Laboratory evaluation of the response of Aedes aegypti and Aedes albopictus uninfected and infected with Dengue virus to Deet. Journal of Medical Entomology. 48 (2), (2011).
- Dennis, E. J., Goldman, O. V., Vosshall, L. B. Aedes aegypti mosquitoes use their legs to sense DEET on contact. Current Biology. 29 (9), 1551-1556 (2019).
- Harrington, L. C., et al. Heterogeneous feeding patterns of the Dengue vector, Aedes aegypti, on individual human hosts in rural Thailand. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (8), 3048 (2014).
- Hol, F. J., Lambrechts, L., Prakash, M. BiteOscope, an open platform to study mosquito biting behavior. eLife. 9, 1-24 (2020).
