Summary
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य चूहों के दिल और फेफड़ों को डीसेलुलराइज करना है। परिणामी बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स (ईसीएम) scaffolds immunostained किया जा सकता है और उनके घटकों के स्थान और टोपोलॉजी नक्शा करने के लिए imaged.
Abstract
हम यहां माउस दिल और फेफड़ों के लिए एक डीसेल्युलराइजेशन प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह संरचनात्मक ईसीएम scaffolds है कि ईसीएम टोपोलॉजी और संरचना का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है का उत्पादन करता है. यह एक माइक्रोसर्जिकल प्रक्रिया पर आधारित है जिसे एक euthanized माउस के श्वासनली और महाधमनी को कैथेटराइज़ करने के लिए डिज़ाइन किया गया है ताकि दिल और फेफड़ों को डीसेल्युलराइज़िंग एजेंटों के साथ परफ्यूज किया जा सके। Decellularized cardiopulmonary परिसर बाद में संरचनात्मक ईसीएम प्रोटीन के स्थान को प्रकट करने के लिए immunostained किया जा सकता है। पूरी प्रक्रिया को 4 दिनों में पूरा किया जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप ईसीएम scaffolds आयामी विकृतियों से मुक्त हैं. कोशिकाओं की अनुपस्थिति 3 डी में सबमाइक्रोन रिज़ॉल्यूशन के नीचे ईसीएम संरचनाओं की संरचनात्मक परीक्षा को सक्षम बनाती है। इस प्रोटोकॉल को 4 सप्ताह के रूप में छोटे चूहों से स्वस्थ और रोगग्रस्त ऊतक पर लागू किया जा सकता है, जिसमें फाइब्रोसिस और कैंसर के माउस मॉडल शामिल हैं, कार्डियोपल्मोनरी रोग से जुड़े ईसीएम रीमॉडलिंग को निर्धारित करने का रास्ता खोलते हैं।
Introduction
ईसीएम एक तीन आयामी नेटवर्क है जो प्रोटीन और ग्लाइकन से बना है जो एक बहुकोशिकीय जीव में सभी कोशिकाओं को समायोजित करता है, अंगों को उनका आकार देता है और पूरे जीवन में सेल व्यवहार को विनियमित करता है। अंडे के निषेचन के बाद से, कोशिकाएं ईसीएम का निर्माण और पुनर्निर्माण करती हैं, और बदले में इसके द्वारा सख्ती से नियंत्रित होती हैं। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य माउस ईसीएम का विश्लेषण और मानचित्र बनाने का एक तरीका खोलना है, क्योंकि चूहे स्तनधारी पैथोफिजियोलॉजी में सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले मॉडल जीव हैं।
इस विधि का विकास मेटास्टेसिस से जुड़े देशी ईसीएम 2 को चिह्नित करने और अलग करने की आवश्यकता से प्रेरित था। चूंकि ट्यूमर में उचित शारीरिक संवहन की कमी होती है और चूहे अपेक्षाकृत छोटे जीव होते हैं, इसलिए माइक्रोसर्जिकल प्रक्रियाओं को महाधमनी को प्रतिगामी रूप से कैथेटराइज़ करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, जबकि ट्यूमर (जैसे, फुफ्फुसीय नसों) के लिए अग्रणी प्रमुख पोत के परिसंचरण को अलग करना, इस प्रकार अभिकर्मक प्रवाह पर ध्यान केंद्रित करना और ट्यूमर डीसेल्युलराइजेशन की अनुमति देना। यह विधि एक संरक्षित संरचना 2 के साथ ईसीएम मचानों का उत्पादन करती है जिसे इम्यूनोस्टेन और इमेज किया जा सकता है, जिससे सबमाइक्रोन विस्तार में ईसीएम संरचना मैपिंग की अनुमति मिलती है। इस प्रोटोकॉल को पूरा करने के लिए, सर्जिकल और माइक्रोसर्जिकल कौशल (विच्छेदन, माइक्रोस्यूटरिंग और कैथीटेराइजेशन) प्राप्त करना आवश्यक है जो इसके उपयोग के लिए एक संभावित सीमा का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं। हमारे ज्ञान के लिए, यह विधि देशी ईसीएम संरचना इमेजिंग विश्लेषण 2,3 के लिए अत्याधुनिक का प्रतिनिधित्व करती है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
यहां शामिल सभी प्रक्रियाओं की समीक्षा की गई है और कोपेनहेगन विश्वविद्यालय में प्रयोगात्मक चिकित्सा को विनियमित करने वाली नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है और डेनिश और यूरोपीय कानून से सहमत हैं। इस प्रोटोकॉल को प्रदर्शित करने के लिए, हमने 8-12 सप्ताह की उम्र के मादा BALB / cJ चूहों और 11 सप्ताह की उम्र के MMTV-PyMT महिला माउस का उपयोग किया है।
नोट: decellularized ईसीएम पाड़ के जीवाणु संदूषण से बचने के लिए सबसे अच्छा इमेजिंग परिणाम देता है और दीर्घकालिक नमूना भंडारण की अनुमति देता है. इसलिए सभी चरणों को बाँझ रखना महत्वपूर्ण है। इस प्रकार, टांका, माइक्रो-सीवन, समाधान, टयूबिंग, ल्यूर कनेक्टर्स और कैथेटर सहित सभी उपकरणों और सर्जिकल सामग्री को बाँझ होना चाहिए। एक पॉलीस्टीरीन ट्रे सहित सतहों को 70% इथेनॉल के साथ कीटाणुरहित किया जाना चाहिए, और परफ्यूजन को अधिमानतः एक लैमिनर फ्लो हुड के तहत किया जाना चाहिए। सभी प्रक्रियाएं कमरे के तापमान पर होती हैं जब तक कि अन्यथा इंगित न किया जाए।
1. पोस्टमार्टम माइक्रोसर्जरी
- एक CO2 कक्ष का उपयोग कर माउस Euthanize.
- माउस को 4 एल कक्ष में रखें, और 100% CO2 के साथ भरना शुरू करें, 2 मिनट के लिए 0.2 एल / मिनट से शुरू करें, 3 मिनट के बाद 0.8 एल / मिनट के प्रवाह तक पहुंचने तक बढ़ते हैं। माउस को पहले 2 मिनट के दौरान बेहोश हो जाना चाहिए, और फिर श्वसन बंद हो जाना चाहिए (आमतौर पर लगभग 5 मिनट, लेकिन प्रवाह को आवश्यक रूप से बनाए रखा जा सकता है)। अगले चरण पर जाने से पहले मौत की पुष्टि करें।
- बाल क्लिपर के साथ माउस के वक्ष, पेट और पीछे शेव करें और 70% इथेनॉल के साथ कीटाणुरहित करें। शेविंग इमेजिंग या जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए नमूनों पर बालों की उपस्थिति के कारण कलाकृतियों की संख्या को बहुत कम कर देता है।
- माउस को पॉलीस्टीरीन ट्रे पर पिन करें, इसके अग्र-और हिंडलिंब्स के साथ-साथ इसके सिर और पूंछ का विस्तार करें। इसे माइक्रोसर्जरी माइक्रोस्कोप के नीचे रखें।
- मेयो सीधे पैटर्न कैंची का उपयोग करके एक त्वचीय चीरा के साथ सर्जिकल पहुंच स्थापित की जाती है जो चमड़े के नीचे के क्षेत्र से निचले पेट तक चलती है और वक्षीय दीवार और पेरिटोनियम को उजागर करने के लिए चमड़े के नीचे विच्छेदन करती है।
- माइक्रोसर्जिकल कैंची का उपयोग करके, वक्ष यी दीवार के दोनों किनारों पर छठे इंटरकोस्टल स्पेस के साथ पेक्टोरलिस मेजर और पेक्टोरलिस मामूली मांसपेशियों को काटें।
- सीधे-पैटर्न कैंची का उपयोग करके, पिछले चीरों के साथ उरोस्थि को काटें, और फिर अपनी लंबी धुरी के साथ उरोस्थि को काटकर एक स्टेरनोटॉमी को पूरा करें, फिर कार्डियोपल्मोनरी कॉम्प्लेक्स को उजागर करने के लिए वक्ष यी दीवार के दोनों किनारों को ऊपर उठाएं और पिन करें।
- गोल-इत्तला वाले माइक्रो-संदंश (या ड्यूमोंट माइक्रो-संदंश) का उपयोग करके, थाइमस और आसपास के वसा ऊतक को नाजुक रूप से उनके अनुलग्नकों से खींचकर एक्साइज करें। इससे प्रमुख जहाजों का पता चल जाएगा।
- Cautery का उपयोग करके, अवरोही कावा नस cauterize और, सीधे पैटर्न कैंची का उपयोग करके, अन्नप्रणाली में कटौती।
- तेज माइक्रो-संदंश का उपयोग करते हुए, ब्रैकियोसेफेलिक नसों और ब्रैकियोसेफलिक को अलग करें, बंधाव और कैटराइजेशन की सुविधा के लिए अंतर्निहित ऊतक से आम कैरोटिड और बाएं सबक्लेवियन धमनियों को छोड़ दिया।
- माइक्रो-सुई धारक, तेज माइक्रो-संदंश और 9-0 टांके का उपयोग करके ब्रेकिओसेफलिक के उद्भव के ऊपर टांके लगाते हैं, आम कैरोटिड और बाएं सबक्लेवियन धमनियों को छोड़ दिया जाता है।
- ब्रैकियोसेफेलिक नसों को काउटराइज़ करें।
- गर्दन की मांसपेशियों और श्वासनली को उजागर करने के लिए मध्यरेखा के साथ सबमैंडिबुलर लार ग्रंथियों को अलग करें। क्रिकोथायराइड स्नायुबंधन को उजागर करने के लिए मांसपेशियों को अलग करें। माइक्रो-कैंची का उपयोग करके, स्नायुबंधन को विभाजित करके एक प्रवेश द्वार खोलें।
- श्वासनली में एक 27 जी कैथेटर का परिचय दें और श्वासनली की शाखाओं को ब्रांकाई में होने तक नाजुक रूप से धक्का दें (यानी, जब तक कैथेटर के प्रतिरोध से नहीं मिलता है, तब तक 3 मिमी पीछे हटना)। ब्रांकाई को बाधित न करने के लिए सावधान रहें। 6-0 टांके का उपयोग करके, कैथेटर को सुरक्षित करने के लिए श्वासनली के चारों ओर 3 टांके लगाएं।
- माउस को 12 वें वक्षीय कशेरुका की ऊंचाई पर अनुभाग करें। अवरोही महाधमनी रीढ़ की हड्डी के लिए पूर्वकाल में चलती है और रीढ़ की हड्डी के साथ यहां विभाजित की जानी चाहिए। निचले आधे हिस्से को अलग रखें।
- प्रतिगामी रूप से महाधमनी को कैथेटराइज़ करें और कैथेटर को तब तक धक्का दें जब तक कि यह महाधमनी चाप तक न पहुंच जाए। 9-0 टांके का उपयोग करते हुए, महाधमनी के चारों ओर 4 टांके लगाएं, कैथेटर टिप के नीचे 5 मिमी शुरू करें।
2. decellularization
- सिलिकॉन टयूबिंग और Luer connectors का उपयोग कर एक पंप प्रणाली के लिए माउस कनेक्ट करें। 15 मिनट के लिए 200 μL / मिनट पर विआयनीकृत पानी के साथ perfuse। decellularization के दौरान इस प्रवाह दर को बनाए रखें।
- परफ्यूजन एजेंट को 0.5% सोडियम डीऑक्सीकोलेट (डीओसी) में बदलें जो विआयनीकृत पानी में पतला हो जाता है और रात भर परफ्यूज होता है।
- परफ्यूजन एजेंट को 0.1% सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) में बदलें जो विआयनीकृत पानी में पतला हो जाता है और 8 घंटे के लिए परफ्यूज होता है।
- 24 घंटे के लिए एसडीएस और डीओसी को धोने के लिए रात भर विआयनीकृत पानी के साथ perfuse।
- एक घुमावदार कैंची का उपयोग करके वक्ष के लिए अपने अनुलग्नकों को विभाजित करके डीसेल्युलराइज्ड दिल और फेफड़ों को उच्छेदन करें और 1% (वी / वी) पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन और 0.3 μM सोडियम एजाइड के साथ विआयनीकृत पानी के साथ एक बाँझ क्रायो-ट्यूब में स्टोर करें। यदि पाड़ का उपयोग जैव रासायनिक विश्लेषण (जैसे, मास स्पेक्ट्रोमेट्री) के लिए किया जाएगा, तो तरल नाइट्रोजन में स्नैप फ्रीज।
3. Immunostaining
- इमेजिंग की योजना बनाएं: प्राथमिक एंटीबॉडी (या एंटीबॉडी) और फ्लोरोसेंटली संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के संयोजन को एक-दूसरे से मेल खाने और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप की लेजर लाइनों को फिट करने के लिए निर्धारित करें।
- 6% (v / v) गधा सीरम - 3% (डब्ल्यू / वी) गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) रात भर युक्त एक क्रायोट्यूब में विसर्जित करके नमूने को अवरुद्ध करें।
- पीबीएस में 3% गधे के सीरम में प्राथमिक एंटीबॉडी (या एंटीबॉडी) के साथ 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
- पीबीएस (पीबीएसटी) में 0.05% tween 20 में हर बार 1 घंटे के लिए 5 बार धोएं।
- 24 घंटे के लिए पीबीएस में 3% गधा सीरम में फ्लोरोसेंट रूप से संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (या एंटीबॉडी) के साथ नमूने को इनक्यूबेट करें।
- 0.05% (PBST) में 1 घंटे के लिए 5 बार धोएं। प्रत्येक धोने के बीच 1 घंटे प्रतीक्षा करें।
- विआयनीकृत पानी जोड़ें और सीधे प्रकाश से दूर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। इस बिंदु पर, पाड़ छवि के लिए तैयार है।
4. इमेजिंग
- नमूने को कांच के तल वाले पकवान में रखें और इसे भंडारण समाधान (पीबीएस या विआयनीकृत पानी) की दो बूंदों के साथ आर्द्र करें।
- उद्देश्य तैयार करें। हम एक जल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करने की सलाह देते हैं।
- प्रतिदीप्ति प्रकाश का उपयोग करके नमूने का निरीक्षण करें।
- कंप्यूटर नियंत्रण पर स्विच करें. लेजर चालू करें और लेजर तीव्रता, पिनहोल एपर्चर, डिटेक्टरों तरंग दैर्ध्य, लाभ, संकल्प और ज़ूम को समायोजित करें। z-स्टैक के लिए संख्या और चरण आकार सेट करें और अधिग्रहण शुरू करें। हम ऊतक प्रवेश को बढ़ाने और प्रकाश, ब्लीचिंग और ऊतक क्षति के प्रकीर्णन को कम करने के लिए मल्टीफोटॉन लेजर उत्तेजना का उपयोग करने की सलाह देते हैं।
5. Hematoxylin-eosin धुंधला
- एक euthanized माउस से 1 फेफड़े के लोब आबकारी.
- एक 10 मिमी x 10 मिमी x 5 मिमी क्रायोमोल्ड में रखें और इसे OCT यौगिक के लगभग 500 μL के साथ कवर करें।
- सूखी बर्फ (-70 डिग्री सेल्सियस) पर फ्रीज करें और उस तापमान पर नमूने को बनाए रखें।
- चरण 2.5 के अनुसार एक संसाधित माउस से एक decellularized फेफड़े के लोब को एक्साइज करें।
- सबसे बड़े सतह क्षेत्र के साथ एक क्रायोमोल्ड में रखें और इसे OCT यौगिक के साथ कवर करें जैसा कि चरण 5.2 में निर्दिष्ट किया गया है।
- सूखी बर्फ (-70 डिग्री सेल्सियस) पर फ्रीज करें और अन्यथा आवश्यक होने तक उस तापमान पर नमूने को बनाए रखें। नमूने को कम से कम 12 सप्ताह के लिए संग्रहीत किया जा सकता है।
- अनुभाग जमे हुए ऊतक ब्लॉक -20 डिग्री सेल्सियस पर एक क्रायोस्टेट में 5 μm मोटाई के साथ और चिपकने वाला ग्लास स्लाइड पर अनुभागों को रखें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- स्लाइड को कमरे के तापमान पर ले जाएं जब तक कि हवा सूख न जाए (लगभग 20 मिनट)।
- जल्द ही पीबीएस में विसर्जित करें और 15 मिनट के लिए पीबीएस में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड में स्लाइड को विसर्जित करके ठीक करें। पीबीएस में एक बार 5 मिनट के लिए धोएं, फिर 5 मिनट के लिए आसुत पानी में दो बार धोएं।
- 10 मिनट के लिए मेयर के हेमेटोक्सिलिन समाधान में विसर्जित करें। इस समय को ऊतक स्रोत और दाग की तैयारी के अनुसार अनुकूलित किया जा सकता है।
- 10 मिनट के लिए आसुत पानी चलाने के तहत एक Coplin जार में धोएं।
- 7 मिनट के लिए eosin समाधान में विसर्जित करें। इस समय को ऊतक स्रोत और दाग की तैयारी के अनुसार अनुकूलित किया जा सकता है।
- अतिरिक्त ईोसिन को हटाने के लिए 50% इथेनॉल में डुबकी लगाएं और जल्द ही 70% इथेनॉल में डुबकी लगाकर निर्जलित करें, और 30 सेकंड के लिए 96% और 100% इथेनॉल में। जाइलीन में कई बार डुबकी लगाएं।
- DPX बढ़ते माध्यम की कुछ बूँदें लागू करें और एक ग्लास coverslip जगह.
- स्लाइड्स को एक रासायनिक हुड के नीचे रात भर सूखने के लिए छोड़ दें।
- स्लाइड स्कैनर में स्लाइड्स स्कैन करें.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
कार्डियोपल्मोनरी डिसेलुलराइजेशन
प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक पूरा करने के बाद, हृदय और फेफड़े, साथ ही साथ महाधमनी चाप जैसे अनुलग्नक ऊतक, कोशिकाओं से मुक्त हो जाएंगे। Decellularization हेमेटोक्सिलिन-eosin धुंधला (चित्रा 1) ईसीएम scaffolds के देशी ऊतक की तुलना में नाभिक को हटाने दिखा द्वारा मान्य किया जा सकता है. ये scaffolds ताजा अंगों के आयामों को बनाए रखने और इसकी अघुलनशील ईसीएम संरचना बरकरार है2. चित्रा 2 माउस कार्डियो-फुफ्फुसीय परिसर को सफलतापूर्वक पारफ्यूज करने के लिए आवश्यक प्रमुख सर्जिकल चरणों का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व दिखाता है।
ईसीएम इमेजिंग
एक मानक सेटिंग में, द्वितीयक एंटीबॉडी का उपयोग हरे, लाल और दूर-लाल प्रतिदीप्ति चैनलों (यानी, 488 एनएम, 555एनएम / 594 एनएम और 647 एनएम तरंग दैर्ध्य का पता लगाने) में किया जा सकता है; 2-फोटॉन उत्तेजना का उपयोग करके दूसरी हार्मोनिक्स पीढ़ी (एसएचजी) इमेजिंग के अलावा फाइब्रिलर कोलेजन को प्रकट करेगा। लेजर उत्तेजना ऊतक autofluorescence को उत्तेजित कर सकते हैं और सावधानी को हरी प्रतिदीप्ति के साथ इसका उपयोग करते समय लागू किया जाना चाहिए, क्योंकि यह इमेजिंग डेटा को भ्रमित कर सकता है। ऑटो-प्रतिदीप्ति को मान्य करने का एक सीधा तरीका एक अप्रकाशित नियंत्रण ऊतक की छवि बनाना है और तदनुसार लेजर तीव्रता और डिटेक्टर लाभ सेट करना है और एंटीबॉडी धुंधला के साथ इसकी तुलना करना है। हालांकि, इस autofluorescence एक लाभ के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, क्योंकि यह फेफड़ों scaffolds में elastin बेनकाब कर सकते हैं.
ईसीएम scaffolds पारगम्यता और प्रकाश penetrability2 में वृद्धि हुई से पता चला. एक motorized माइक्रोस्कोप चरण के साथ इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने से सबमाइक्रोन रिज़ॉल्यूशन (चित्रा 3) पर पूरे-माउंट के तीन आयामी, टाइल इमेजिंग के लिए अनुमति मिलती है। मामले में ऊतक को विभाजित करना आवश्यक है (उदाहरण के लिए, कार्डियक दीवारों या गहरे फुफ्फुसीय पैरेन्काइमा की छवि के लिए) ऊतक को धुंधला होने से पहले एक तेज स्केलपेल के साथ विभाजित किया जाना चाहिए।
चित्र 1. विकोशिकीयकरण को मान्य करना. Hematoxylin-Eosin देशी और decellularized फेफड़ों और दिल से स्नैप जमे हुए नमूनों के धुंधला. decellularized नमूनों में नाभिक की अनुपस्थिति पर ध्यान दें। माइक्रोन में सभी तराजू. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2. माइक्रो-सर्जरी योजनाबद्ध कार्डियो-फुफ्फुसीय परिसर को डीसेल्युलराइज़ करने के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण चरणों को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3. एक 11 सप्ताह पुरानी मादा माउस से decellularized PyMT माउस फेफड़ों के प्रतिनिधि एकाधिक प्रोटीन immunostaining. टाइल मोज़ेक एक z-स्टैक के अधिकतम प्रक्षेपण दिखा. इनसेट 1 फुस्फुस को दर्शाता है। इनसेट 2 सामान्य पैरेन्काइमा ईसीएम दिखाता है। इनसेट 3 एक ब्रोन्किओल दिखाता है। रंग अंधे रंग के लिए सुलभ बनाया गया है। माइक्रोन में सभी तराजू. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ऊतक आंदोलन के आधार पर डीसेल्युलराइजेशन तकनीकें ईसीएम संरचना को बदल देती हैं, जिससे उन्हें ईसीएम संरचना विश्लेषण के लिए अनुपयुक्त बना दिया जाता है। परफ्यूजन डीसेल्युलराइजेशन, ट्रेकिआ के महाधमनी जैसे एक शारीरिक मार्ग का उपयोग करके, केशिका बिस्तर, या टर्मिनल एल्वियोली तक पहुंचने की अनुमति देता है, और पूरे अंग में डीसेल्युलराइज़िंग एजेंटों के वितरण की सुविधा प्रदान करता है। ऊतक को डीसेल्युलराइज़ करने के लिए zwitterionic, anionic और गैर-आयनिक डिटर्जेंट का उपयोग 4,5,6 की सूचना दी गई है, हालांकि, सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस, एनिओनिक) माउस वसा पैड 2 में फाइब्रिलर कोलेजन को रैखिक करता है लेकिन फेफड़ों में नहीं; इससे पता चलता है कि डिटर्जेंट की पसंद को अनुकूलित किया जाना चाहिए, ईसीएम संरचना को बनाए रखने के लिए लक्ष्य ऊतक के अनुकूल होना चाहिए। ईसीएम विश्लेषण के लिए ऊतक समाशोधन विधियों का उपयोग किया जा सकता है, हालांकि उन्हें ऐसे रसायनों की आवश्यकता होती है जो ईसीएम क्रॉस लिंकिंग और ऊतक आयाम7,8,9 को बदल सकते हैं। जबकि अधिग्रहित ऊतक पारदर्शिता बढ़ी हुई माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग की अनुमति देती है, कोशिकाओं की उपस्थिति एंटीबॉडी प्रवेश को काफी खराब कर देती है और ईसीएम एपिटोप / प्रोटीन को कवर कर सकती है। अलग-थलग और इमेजिंग बरकरार ईसीएम विश्लेषणात्मक उपकरणों 2,10 के साथ अपनी संरचना के मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है, इसकी संरचना 2 का मानचित्रण करता है और आगे ईसीएम जैव रासायनिक परीक्षा के लिए रास्ता खोलता है।
प्रमुख वाहिकाओं का विच्छेदन और बंधाव और कोरोनरी और फुफ्फुसीय परिसंचरण के परिणामस्वरूप अलगाव पूरे ऊतकों में परफ्यूज्ड समाधानों के समान दबाव को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। इसलिए, यह प्रोटोकॉल मुख्य ऑपरेटर की माइक्रोसर्जिकल विशेषज्ञता पर निर्भर करता है। परिशुद्धता के साथ काम करना महत्वपूर्ण है, ताकि जहाजों, फेफड़ों और हृदय को बरकरार रखा जा सके। वक्ष की त्रि-आयामी शरीर रचना को समझने के लिए बार-बार इस प्रोटोकॉल को निष्पादित करना लगातार परिणाम प्राप्त करने के लिए सर्वोपरि है।
यहां दिखाई गई सर्जिकल प्रक्रिया माउस वास्कुलचर 1,2 और इसके क्षेत्र में अंगों तक पहुंचने के लिए बुनियादी चरणों को जोड़ती है। लिगचर पैटर्न को बदलकर, सिर और गर्दन, अग्र अंगों और वसा पैड तक पहुंचना संभव है। एक ही कौशल का उपयोग करते हुए, उप-डायाफ्रामिक अंगों को डीसेल्युलर बनाना संभव है।
समान रूप से महत्वपूर्ण के रूप में immunostaining सेटअप के सावधान डिजाइन है. हमने पहले संरचनात्मक ईसीएम प्रोटीन 3 के खिलाफ मान्य एंटीबॉडी की एक सूची संकलित की है। मानक सेटअप एक साथ तीन प्रोटीन और फाइब्रिलर कोलेजन तक प्रकट कर सकता है, जिससे क्रॉस-एग्जामिनेशन सक्षम हो सकता है।
इस विधि का महत्व संरचनात्मक और आयामी रूप से बरकरार ईसीएम मचान प्राप्त करने की संभावना में निहित है। विचारशील घटकों में एक जटिल ऊतक का विघटन बायोइंजीनियरिंग के मौलिक लक्ष्यों में से एक है; जबकि यह एक अंग से कोशिकाओं, या रक्त को अलग करने के लिए अपेक्षाकृत सीधा है, इसके ईसीएम मचान को प्राप्त करने के लिए कोई तरीका नहीं था। यह ट्यूमर के बारे में विशेष रूप से सच था, लेकिन यहां प्रस्तुत विधि ईसीएम के शारीरिक और जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए किसी भी माउस तनाव में ईसीएम अलगाव का रास्ता खोलती है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
हम प्रोफेसर इवाना नोवाक और डॉ Nynne Meyn Christensen (उन्नत Bioimaging (सीएबी), कोपेनहेगन विश्वविद्यालय के लिए केंद्र) माइक्रोस्कोप पहुँच प्रदान करने के लिए धन्यवाद. इस काम को यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN) द्वारा समर्थित किया गया था; एईएम-जी, ओडब्ल्यू, आरआर और जेटीई); लुंडबेक फाउंडेशन (R286-2018-621) से पीएचडी फैलोशिप; MR); स्वीडिश अनुसंधान परिषद (2017-03389; सीडीएम); स्वीडिश कैंसर सोसायटी, Cancerfonden (CAN 2016/783, 19 0632 Pj, और 190007; सीडीएम); जर्मन कैंसर सहायता (ड्यूश Krebshilfe; आरआर); और डेनिश कैंसर सोसायटी (R204-A12454; आरआर)।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MICROSURGERY | |||
| 6-0 suture, triangular section needle (Vicryl) | Ethicon | 6301124 | |
| 9-0 micro-suture (Safil) | B Braun | G1048611 | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Adson forceps with teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Castroviejo microneedle holder | Fine Science Tools | no. 12061-01 | |
| CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia | |||
| Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Disposable polystyrene tray (~30 × 50 cm) | |||
| Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck) | Leica | S6 D | |
| Double-ended microspatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Dumont microforceps (two) | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Dumont microforceps with 45° tips (two) | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Hair clippers | Oster | 76998-320-051 | |
| Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws) | Fine Science Tools | 12500-12 | |
| Intravenous 24-gauge catheter (Insyte) | BD | 381512 | |
| Intravenous 26-gauge catheter (Terumo) | Surflo-W | SR+DM2619WX | |
| Mayo scissors (tough cut, straight) | Fine Science Tools | 14110-15 | |
| Microforceps with ringed tips (two) | Aesculap | FM571R | |
| Micro-spring scissors (Vannas, curved) | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Minicutter | KLS Martin | 80-008-03-04 | |
| Molt Periostotome | Aesculap | D0543R | |
| Needles (27 gauge; Microlance) | BD | 21018 | |
| Paper towel (sterile) or surgical napkin | |||
| Serrated scissors (CeramaCut, straight) | Fine Science Tools | 14958-09 | |
| Spatula (Freer-Yasargil) | Aesculap | OL166R | |
| Syringes (1 mL; Plastipak) | BD | 3021001 | |
| Syringes (10 mL; Plastipak) | BD | 3021110 | |
| Tendon scissors (Walton) | Fine Science Tools | 14077-09 | |
| IMMUNOSTAINING | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11037 | |
| BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized) | Serva | 11930.03 | |
| Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457) | Millipore | AB756P | Host: rabbit |
| PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | Host: goat |
| Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621) | Host: guinea pig | ||
| Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10) | VWR | 233-5364) | |
| Serum (normal donkey serum) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| IMAGING | |||
| Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; ) | Leica | ||
| Fluorescence light source | Leica | EL6000 | |
| Microscope (inverted multiphoton microscope) | Leica | SP5-X MP | |
| Objective (lambda blue, 20×, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV) | Leica | HCX PL APO | |
| Two-photon Ti–sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model) | |||
| White-light laser (WLL) | Leica | ||
| DECELLULARIZATION | |||
| 70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water | Plum | 1680766 | |
| Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch) | World Precision Instruments | 13158-100 | |
| PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Peristaltic pump (with 12 channels) | Ole Dich | 110AC(R)20G75 | |
| Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.) | Ole Dich | 31399 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 08591-1ML-F | |
| Sodium deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sodium Dodecyl Sulphate | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
| H&E STAINING | |||
| 4% PFA | Fisher Scientific | 15434389 | |
| 96% Ethanol | Plum | 201446-5L | |
| Absolute ethanol | Plum | 201152-1L | |
| Coverslips (24x50mm; 1000 pcs) | Hounisen | 422.245 | |
| Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs) | Tissue-Tek | 4566 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| DPX mounting medium | Hounisen | 1001.0025 | |
| Eosin Y solution alcoholic 0.5% | Sigma | 1024390500 | |
| Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs) | Pfm medical | 207500003 | |
Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs) |
Thermofisher | 6319483 | |
| Mayers hematoxylin | Sigma | MHS32-1L | |
| OCT compound | VWR | 361603E | |
| Slide scanner (Nanozoomer) | Hamamatsu Photonics | ||
| Xylene | Sigma | 534056-4L |
References
- Hynes, R. O. Extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326, 1216-1219 (2009).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix. Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D. Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).
- White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
- Uygun, B. E., et al. Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
- Wershof, E., et al. A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix. BioRxiv. , (2019).
