Summary
Este protocolo tiene como objetivo descelularizar el corazón y los pulmones de los ratones. Los andamios de matriz extracelular (ECM) resultantes pueden ser inmunoteñidos y fotografiados para mapear la ubicación y la topología de sus componentes.
Abstract
Presentamos aquí un protocolo de descelularización para corazón y pulmones de ratón. Produce andamios estructurales de ECM que se pueden usar para analizar la topología y composición de ECM. Se basa en un procedimiento microquirúrgico diseñado para cateterizar la tráquea y la aorta de un ratón sacrificado para perfundir el corazón y los pulmones con agentes descelularizantes. El complejo cardiopulmonar descelularizado puede ser posteriormente inmunoteñido para revelar la ubicación de las proteínas ECM estructurales. Todo el procedimiento se puede completar en 4 días.
Los andamios ECM resultantes de este protocolo están libres de distorsiones dimensionales. La ausencia de células permite el examen estructural de las estructuras de ECM hasta la resolución submicrónica en 3D. Este protocolo se puede aplicar a tejido sano y enfermo de ratones de tan solo 4 semanas de edad, incluidos modelos de ratón de fibrosis y cáncer, abriendo el camino para determinar la remodelación de ecm asociada con la enfermedad cardiopulmonar.
Introduction
La ECM es una red tridimensional formada por proteínas y glicanos que da cabida a todas las células de un organismo multicelular, dando a los órganos su forma y regulando el comportamiento celular a lo largo de la vida1. Desde la fertilización del óvulo en adelante, las células construyen y remodelan el ECM, y a su vez están estrictamente controlados por él. El propósito de este protocolo es abrir una forma de analizar y mapear la ECM de ratón, ya que los ratones son el organismo modelo más utilizado en la fisiopatología de mamíferos.
El desarrollo de este método fue impulsado por la necesidad de caracterizar y aislar ECM2 nativo asociado a metástasis. Como los tumores carecen de vascularización anatómica adecuada y los ratones son organismos relativamente pequeños, se diseñaron procedimientos microquirúrgicos para cateterizar retrógradamente la aorta, al tiempo que aíslan la circulación del vaso principal que conduce a un tumor (por ejemplo, las venas pulmonares), enfocando así el flujo de reactivos y permitiendo la descelularización del tumor. Este método produce andamios ecm con una estructura conservada2 que puede ser inmunoteñida y fotografiada, lo que permite el mapeo de la estructura ECM en detalle submicrónico. Para llevar a cabo este protocolo, es necesario adquirir habilidades quirúrgicas y microquirúrgicas (disección, microsutura y cateterismo) que pueden representar una potencial limitación a su uso. Hasta donde sabemos, este método representa el estado del arte para el análisis de imágenes de estructuras ECM nativas2,3.
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Protocol
Todos los procedimientos incluidos aquí han sido revisados y aprobados por el comité ético que regula la medicina experimental en la Universidad de Copenhague y están de acuerdo con la legislación danesa y europea. Para demostrar este protocolo, hemos utilizado ratones hembra BALB/cJ de 8-12 semanas de edad y un ratón hembra MMTV-PyMT de 11 semanas de edad.
NOTA: Evitar la contaminación bacteriana del andamio ECM descelularizado proporciona el mejor resultado de imagen y permite el almacenamiento de muestras a largo plazo. Por lo tanto, es importante mantener todos los pasos estériles. Como tal, todos los instrumentos y material quirúrgico, incluyendo sutura, microslutura, soluciones, tubos, conectores Luer y catéteres, deben ser estériles. Las superficies, incluida una bandeja de poliestireno, deben desinfectarse con etanol al 70%, y la perfusión debe llevarse a cabo preferiblemente bajo una campana de flujo laminar. Todos los procedimientos se llevan a cabo a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario.
1. Microcirugía post mortem
- Eutanasiar al ratón usando una cámara de CO2 .
- Coloque el ratón en una cámara de 4 L y comience a llenarse con 100% de CO2, comenzando a 0.2 L / min durante 2 min, aumentando hasta alcanzar un flujo de 0.8 L / min después de 3 min. El ratón debe caer inconsciente durante los primeros 2 minutos, y luego la respiración debe cesar (generalmente alrededor de 5 minutos, pero el flujo se puede mantener según sea necesario). Confirme la muerte antes de pasar al siguiente paso.
- Afeitar el tórax, el abdomen y la parte posterior del ratón con el cortapelos y desinfectar con etanol al 70%. El afeitado reduce en gran medida el número de artefactos debido a la presencia de vello, ya sea en muestras para imágenes o análisis bioquímicos.
- Fije el ratón a una bandeja de poliestireno, extendiendo sus extremidades delanteras y traseras, así como su cabeza y cola. Colóquelo debajo del microscopio de microcirugía.
- Usando una tijera de patrón recto de Mayo establece el acceso quirúrgico con una incisión cutánea que va desde la región submandibular hasta la parte inferior del abdomen y disecciona por vía subcutánea para exponer la pared torácica y el peritoneo.
- Usando tijeras microquirúrgicas, corte los músculos pectoral mayor y pectoral menor a lo largo del sexto espacio intercostal a ambos lados de la pared torácica.
- Usando tijeras de patrón recto, corte el esternón a lo largo de las incisiones anteriores y luego complete una esternotomía cortando el esternón a lo largo de su eje largo, luego eleve y fije ambos lados de la pared torácica para exponer el complejo cardiopulmonar.
- Usando micro-fórceps de punta redonda (o micro-fórceps Dumont), extirpe el timo y el tejido adiposo circundante tirando delicadamente de sus accesorios. Esto revelará los principales buques.
- Usando el cauterizado, cauterice la vena cava descendente y, usando tijeras de patrón recto, corte el esófago.
- Usando microfórceps afilados, separe las venas braquiocefálicas y las arterias braquiocefálicas, carótidas comunes izquierdas y subclavias izquierdas del tejido subyacente para facilitar la ligadura y cauterización.
- Usando un soporte de microagujas, microcepas afiladas y sutura 9-0 colocan puntos de sutura por encima de la aparición de las arterias braquiocefálica, carótida común izquierda y subclavia izquierda.
- Cauterizar las venas braquiocefálicas.
- Separe las glándulas salivales submandibulares a lo largo de la línea media para exponer los músculos del cuello y la tráquea. Separe los músculos para exponer el ligamento cricotiroideo. Usando micro-tijeras, abra una entrada seccionando el ligamento.
- Introduzca un catéter de 27 G en la tráquea y empuje delicadamente hasta que la tráquea se ramifique en los bronquios (es decir, hasta que se encuentre la resistencia al catéter, luego retroceda 3 mm). Tenga cuidado de no interrumpir los bronquios. Usando una sutura 6-0, coloque 3 puntos alrededor de la tráquea para asegurar el catéter.
- Secciona el ratón a la altura de la 12ª vértebra torácica. La aorta descendente corre anteriormente a la columna vertebral y debe seccionarse aquí junto con la columna vertebral. Separe la mitad inferior.
- Cateterice retrógradamente la aorta y empuje el catéter hasta que llegue al arco aórtico. Usando sutura 9-0, coloque 4 puntos alrededor de la aorta, comenzando 5 mm por debajo de la punta del catéter.
2. Descelularización
- Conecte el ratón a un sistema de bomba mediante tubos de silicona y conectores Luer. Perfusión con agua desionizada a 200 μL/min durante 15 min. Mantenga este caudal durante la descelularización.
- Cambie el agente de perfusión a desoxicolato de sodio al 0,5% (DOC) diluido en agua desionizada y perfusa durante la noche.
- Cambie el agente de perfusión a 0.1% de dodecil sulfato de sodio (SDS) diluido en agua desionizada y perfusa durante 8 horas.
- Perfundir con agua desionizada durante la noche para lavar SDS y DOC durante 24 h.
- Reseque el corazón y los pulmones descelularizados seccionando sus uniones al tórax con una tijera curva y guárdelo en un criotubo estéril con agua desionizada con penicilina-estreptomicina al 1% (v/v) y 0,3 μM de azida de sodio a 4 °C. Los andamios de ECM se pueden almacenar durante al menos 12 semanas1. Si el andamio se utilizará para análisis bioquímicos (por ejemplo, espectrometría de masas), congele al instante el nitrógeno líquido.
3. Inmunotinción
- Planifique las imágenes: determine el anticuerpo primario (o anticuerpos) y la combinación de anticuerpos secundarios conjugados fluorescentemente para que coincidan entre sí y se ajusten a las líneas láser del microscopio de fluorescencia.
- Bloquee la muestra sumergiéndola en un criotubo que contenga 6% (v / v) de suero de burro - 3% (p / v) de albúmina sérica bovina (BSA) durante la noche.
- Incubar con anticuerpos primarios (o anticuerpos) en suero de burro al 3% en PBS durante 24 h.
- Lavar 5 veces durante 1 h cada vez en 0.05% tween 20 en PBS (PBST).
- Incubar la muestra con anticuerpos secundarios (o anticuerpos) conjugados fluorescentemente en suero de burro al 3% en PBS durante 24 h.
- Lavar 5 veces durante 1 hora en 0.05% (PBST). Espere 1 h entre cada lavado.
- Añadir agua desionizada y conservar a 4 °C lejos de la luz directa. En este punto, el andamio está listo para la imagen.
4. Imágenes
- Coloque la muestra en un plato con fondo de vidrio y humidifíquela con dos gotas de solución de almacenamiento (PBS o agua desionizada).
- Prepara el objetivo. Recomendamos utilizar un objetivo de inmersión en agua.
- Inspeccione la muestra con luz de fluorescencia.
- Cambie al control por computadora. Encienda los láseres y ajuste la intensidad del láser, la apertura estenopeica, las longitudes de onda de los detectores, la ganancia, la resolución y el zoom. Establezca el número y el tamaño del paso para z-stack y comience la adquisición. Recomendamos el uso de excitación láser multifotónica para aumentar la penetración en el tejido y minimizar la dispersión de la luz, el blanqueamiento y el daño tisular.
5. Tinción de hematoxilina-eosina
- Extirpación 1 lóbulo pulmonar de un ratón sacrificado.
- Coloque en un criomold de 10 mm x 10 mm x 5 mm y cúbralo con aproximadamente 500 μL de compuesto OCT.
- Congelar sobre hielo seco (-70 °C) y mantener la muestra a esa temperatura.
- Extirpar un lóbulo pulmonar descelularizado de un ratón procesado de acuerdo con el paso 2.5.
- Colóquelo en un criomold con la mayor superficie hacia abajo y cúbralo con el compuesto OCT como se especifica en el paso 5.2.
- Congele sobre hielo seco (-70 °C) y mantenga la muestra a esa temperatura hasta que se requiera lo contrario. La muestra se puede almacenar durante al menos 12 semanas.
- Seccione bloques de tejido congelado a -20 °C en un criostato con un espesor de 5 μm y coloque secciones en portaobjetos de vidrio adhesivo y guárdelo a -80 °C.
- Tome los portaobjetos a temperatura ambiente hasta que se seque al aire (aproximadamente 20 min).
- Sumergir brevemente en PBS y arreglar sumergiendo las diapositivas en paraformaldehído al 4% en PBS durante 15 min. Lavar una vez en PBS durante 5 min, luego dos veces en agua destilada durante 5 min.
- Sumergir en la solución de hematoxilina de Mayer durante 10 min. Este tiempo se puede optimizar de acuerdo con la fuente de tejido y la preparación de la mancha.
- Lavar en un frasco de Coplin con agua destilada corriente durante 10 min.
- Sumergir en solución de eosina durante 7 min. Este tiempo se puede optimizar de acuerdo con la fuente de tejido y la preparación de la mancha.
- Sumerja en etanol al 50% para eliminar el exceso de Eosina y deshidrate sumergiendo brevemente en etanol al 70%, y en 96% y 100% de etanol durante 30 segundos. Sumerja en xileno varias veces.
- Aplique unas gotas de medio de montaje DPX y coloque una funda de vidrio.
- Deje que los toboganes se sequen durante la noche bajo una capucha química.
- Escanear diapositivas en un escáner de diapositivas.
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Representative Results
Descelularización cardiopulmonar
Después de completar con éxito el protocolo, el corazón y los pulmones, así como el tejido anexo, como el arco aórtico, estarán libres de células. La descelularización puede ser validada por tinción de hematoxilina-eosina (Figura 1) de los andamios de ECM que muestran la eliminación de los núcleos en comparación con el tejido nativo. Estos andamios conservan las dimensiones de los órganos frescos y su estructura ECM insoluble está intacta2. La Figura 2 muestra una representación esquemática de los pasos quirúrgicos clave necesarios para perfundir con éxito el complejo cardiopulmonar de ratón.
Imágenes ecm
En un entorno estándar, los anticuerpos secundarios se pueden utilizar en canales de fluorescencia verdes, rojos y rojos lejanos (es decir, detección de longitud de onda de 488 nm, 555 nm/594 nm y 647 nm); la adición de imágenes de segunda generación de armónicos (SHG) utilizando excitación de 2 fotones revelará colágeno fibrilar. La excitación láser puede incitar a la autofluorescencia tisular y se debe tener precaución al usarlo con fluorescencia verde, ya que puede confundir los datos de imágenes. Una forma sencilla de validar la autofluorescencia es obtener imágenes de un tejido de control no teñido y establecer la intensidad del láser y la ganancia del detector en consecuencia y comparar esto con la tinción de anticuerpos. Sin embargo, esta autofluorescencia se puede utilizar como una ventaja, ya que puede exponer la elastina en los andamios de los pulmones.
Los andamios ECM mostraron una mayor permeabilidad y penetrabilidad de la luz2. El uso de este protocolo con una etapa de microscopio motorizado permite obtener imágenes tridimensionales en mosaico de muestras de montaje completo a resolución submicrónica (Figura 3). En caso de que sea necesario seccionar el tejido (por ejemplo, para obtener imágenes de las paredes cardíacas o el parénquima pulmonar profundo), el tejido debe seccionarse con un bisturí afilado antes de realizar la tinción.
Figura 1. Validación de la descelularización. Tinción de hematoxilina-eosina de muestras congeladas instantáneas de pulmones y corazón nativos y descelularizados. Observe la ausencia de núcleos en muestras descelularizadas. Todas las escalas en micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Esquema de microcirugía que muestra los pasos clave necesarios para descelularizar el complejo cardiopulmonar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Inmunotinción de proteínas múltiples representativas de pulmones de ratón PyMT descelularizados de un ratón hembra de 11 semanas de edad. Mosaico de mosaico que muestra la proyección máxima de una pila z. El recuadro 1 muestra la pleura. El recuadro 2 muestra ECM de parénquima normal. El recuadro 3 muestra un bronquiolo. Los colores se han hecho accesibles para los daltónicos. Todas las escalas en micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Las técnicas de descelularización basadas en la agitación tisular alteran la estructura de la ECM, haciéndolas inadecuadas para el análisis de la estructura de la ECM4. La descelularización por perfusión, mediante una vía anatómica como la aorta de la tráquea, permite llegar al lecho capilar, o alvéolos terminales, y facilita la entrega de agentes descelularizantes por todo el órgano. Se reporta el uso de detergentes zwitteriónicos, aniónicos y no iónicos para descelularizar el tejido4,5,6, sin embargo, el dodecil sulfato de sodio (SDS, aniónico) linealiza el colágeno fibrilar en la almohadilla grasa del ratón2 pero no en los pulmones; esto sugiere que la elección del detergente debe optimizarse, adaptándose al tejido objetivo para mantener la estructura de ECM. Es concebible que se utilicen métodos de limpieza de tejidos para el análisis de ECM, aunque requieren sustancias químicas que pueden cambiar la reticulación de ECM y dimensiones de tejidos7,8,9. Si bien la transparencia del tejido adquirida permite mejorar las imágenes microscópicas, la presencia de células empeora significativamente la penetración de anticuerpos y puede cubrir los epítopos / proteínas ECM. Aislar e obtener imágenes de ECM intacta permite el análisis cuantitativo de su estructura con herramientas analíticas2,10, mapeando su composición2 y abre el camino para un mayor examen bioquímico de ECM.
La disección y ligadura de los vasos principales y el consiguiente aislamiento de la circulación coronaria y pulmonar es necesario para lograr una presión uniforme de las soluciones perfundidas en todos los tejidos. Por lo tanto, este protocolo depende de la experiencia microquirúrgica del operador principal. Es fundamental operar con precisión, a fin de preservar los vasos, los pulmones y el corazón intactos. Ejecutar este protocolo repetidamente para comprender la anatomía tridimensional del tórax es primordial para obtener resultados consistentes.
El procedimiento quirúrgico que aquí se muestra resume los pasos básicos para acceder a la vasculatura del ratón1,2 y a los órganos de su territorio. Al cambiar el patrón de ligadura, es posible acceder a la cabeza y el cuello, las extremidades anteriores y las almohadillas de grasa. Usando las mismas habilidades, es posible descelularizar los órganos subdiafragmáticos.
Igualmente importante es el diseño cuidadoso de la configuración de inmunotinción. Previamente hemos elaborado un catálogo de anticuerpos validados frente a proteínas ECM estructurales3. La configuración estándar puede revelar hasta tres proteínas y colágeno fibrilar simultáneamente, lo que permite el contrainterrogatorio.
La importancia de este método radica en la posibilidad de obtener andamios ECM estructural y dimensionalmente intactos. La deconstrucción de un tejido complejo en componentes discretos es uno de los objetivos fundamentales de la bioingeniería; si bien es relativamente sencillo aislar células, o sangre, de un órgano, no había métodos para obtener su andamiaje ECM. Esto fue especialmente cierto para los tumores, pero el método presentado aquí abre el camino para el aislamiento de ECM en cualquier cepa de ratón para el análisis anatómico y bioquímico de la ECM.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a la Prof. Ivana Novak y a la Dra. Nynne Meyn Christensen (Centro de Bioimagen Avanzada (CAB), Universidad de Copenhague) por proporcionar acceso al microscopio. Este trabajo fue apoyado por el Consejo Europeo de Investigación (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN; AEM-G, OW, RR y JTE); una beca de doctorado de la Fundación Lundbeck (R286-2018-621; MR); el Consejo Sueco de Investigación (2017-03389; MDL); la Sociedad Sueca del Cáncer, Cancerfonden (CAN 2016/783, 19 0632 Pj y 190007; MDL); Ayuda alemana contra el cáncer (Deutsche Krebshilfe; RR); y la Sociedad Danesa del Cáncer (R204-A12454; RR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MICROSURGERY | |||
| 6-0 suture, triangular section needle (Vicryl) | Ethicon | 6301124 | |
| 9-0 micro-suture (Safil) | B Braun | G1048611 | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Adson forceps with teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Castroviejo microneedle holder | Fine Science Tools | no. 12061-01 | |
| CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia | |||
| Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Disposable polystyrene tray (~30 × 50 cm) | |||
| Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck) | Leica | S6 D | |
| Double-ended microspatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Dumont microforceps (two) | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Dumont microforceps with 45° tips (two) | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Hair clippers | Oster | 76998-320-051 | |
| Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws) | Fine Science Tools | 12500-12 | |
| Intravenous 24-gauge catheter (Insyte) | BD | 381512 | |
| Intravenous 26-gauge catheter (Terumo) | Surflo-W | SR+DM2619WX | |
| Mayo scissors (tough cut, straight) | Fine Science Tools | 14110-15 | |
| Microforceps with ringed tips (two) | Aesculap | FM571R | |
| Micro-spring scissors (Vannas, curved) | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Minicutter | KLS Martin | 80-008-03-04 | |
| Molt Periostotome | Aesculap | D0543R | |
| Needles (27 gauge; Microlance) | BD | 21018 | |
| Paper towel (sterile) or surgical napkin | |||
| Serrated scissors (CeramaCut, straight) | Fine Science Tools | 14958-09 | |
| Spatula (Freer-Yasargil) | Aesculap | OL166R | |
| Syringes (1 mL; Plastipak) | BD | 3021001 | |
| Syringes (10 mL; Plastipak) | BD | 3021110 | |
| Tendon scissors (Walton) | Fine Science Tools | 14077-09 | |
| IMMUNOSTAINING | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11037 | |
| BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized) | Serva | 11930.03 | |
| Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457) | Millipore | AB756P | Host: rabbit |
| PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | Host: goat |
| Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621) | Host: guinea pig | ||
| Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10) | VWR | 233-5364) | |
| Serum (normal donkey serum) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| IMAGING | |||
| Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; ) | Leica | ||
| Fluorescence light source | Leica | EL6000 | |
| Microscope (inverted multiphoton microscope) | Leica | SP5-X MP | |
| Objective (lambda blue, 20×, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV) | Leica | HCX PL APO | |
| Two-photon Ti–sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model) | |||
| White-light laser (WLL) | Leica | ||
| DECELLULARIZATION | |||
| 70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water | Plum | 1680766 | |
| Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch) | World Precision Instruments | 13158-100 | |
| PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Peristaltic pump (with 12 channels) | Ole Dich | 110AC(R)20G75 | |
| Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.) | Ole Dich | 31399 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 08591-1ML-F | |
| Sodium deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sodium Dodecyl Sulphate | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
| H&E STAINING | |||
| 4% PFA | Fisher Scientific | 15434389 | |
| 96% Ethanol | Plum | 201446-5L | |
| Absolute ethanol | Plum | 201152-1L | |
| Coverslips (24x50mm; 1000 pcs) | Hounisen | 422.245 | |
| Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs) | Tissue-Tek | 4566 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| DPX mounting medium | Hounisen | 1001.0025 | |
| Eosin Y solution alcoholic 0.5% | Sigma | 1024390500 | |
| Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs) | Pfm medical | 207500003 | |
Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs) |
Thermofisher | 6319483 | |
| Mayers hematoxylin | Sigma | MHS32-1L | |
| OCT compound | VWR | 361603E | |
| Slide scanner (Nanozoomer) | Hamamatsu Photonics | ||
| Xylene | Sigma | 534056-4L |
References
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