Summary
Bu protokol farelerin kalbini ve akciğerlerini hücreden çıkarmayı amaçlamaktadır. Elde edilen hücre dışı matris (ECM) iskeleleri, bileşenlerinin konumunu ve topolojisini haritalamak için immünostain edilebilir ve görüntülenebilir.
Abstract
Burada fare kalbi ve akciğerleri için bir hücreden arındırma protokolü sunuyoruz. ECM topolojisini ve bileşimini analiz etmek için kullanılabilecek yapısal ECM iskeleleri üretir. Kalbi ve akciğerleri hücreden çıkarıcı ajanlarla boğmak için ötenazili bir farenin trakeasını ve aortlarını kateterize etmek için tasarlanmış mikrocerrahi bir prosedüre dayanmaktadır. Hücreden çıkarıcı kardiyopulmoner kompleks daha sonra yapısal ECM proteinlerinin yerini ortaya çıkarmak için immünositize edilebilir. Tüm prosedür 4 günde tamamlanabilir.
Bu protokolden kaynaklanan ECM iskeleleri boyutsal bozulmalardan arındırılmıştır. Hücrelerin yokluğu, ECM yapılarının 3D olarak mikrokron çözünürlüğe kadar yapısal olarak incelenmesini sağlar. Bu protokol, fibrozis ve kanserin fare modelleri de dahil olmak üzere 4 haftalık kadar genç farelerden sağlıklı ve hastalıklı dokulara uygulanabilir ve kardiyopulmoner hastalıkla ilişkili ECM tadilatını belirlemenin yolunu açar.
Introduction
ECM, çok hücreli bir organizmadaki tüm hücreleri barındıran, organlara şekil veren ve yaşam boyunca hücre davranışını düzenleyen protein ve glikanlardan oluşan üç boyutlu bir ağdır1. Yumurta döllenmesinden itibaren, hücreler ECM'yi oluşturur ve yeniden şekillendirir ve buna karşılık kesinlikle kontrol edilir. Bu protokolün amacı, fareler memeli patofizyolojisinde en çok kullanılan model organizma olduğu için fare ECM'yi analiz etmenin ve haritalamak için bir yol açmaktır.
Bu yöntemin gelişimi, metastaz ilişkili yerel ECM2'yi karakterize etme ve izole etme ihtiyacından kaynaklanmıştır. Tümörler uygun anatomik vaskülerizasyondan yoksun olduğundan ve fareler nispeten küçük organizmalar olduğundan, mikrocerrahi prosedürler aortu geriye dönük kateterize etmek için tasarlanmıştır, bu nedenle tümöre (örneğin pulmoner damarlara) giden ana damarın dolaşımını izole eder, böylece reaktif akışına odaklanır ve tümör desellülerizasyonuna izin verir. Bu yöntem, bağışıklık sistemi baskılanabilen ve görüntülenebilen korunmuş bir yapıya2 sahip ECM iskeleleri üreterek ecm yapısının altmikron detaylı olarak haritalandırılmasını sağlar. Bu protokolü gerçekleştirmek için, kullanımına potansiyel bir sınırlama oluşturabilecek cerrahi ve mikrocerrahi becerileri (diseksiyon, mikrosütür ve kateterizasyon) kazanmak gerekir. Bilgimize göre, bu yöntem yerel ECM yapı görüntüleme analizi için en son teknolojiyi temsil eder2,3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada yer alan tüm prosedürler Kopenhag Üniversitesi'nde deneysel tıbbı düzenleyen etik komite tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır ve Danimarka ve Avrupa mevzuatına uygundur. Bu protokolü göstermek için, 8-12 haftalık dişi BALB / cJ fareleri ve 11 haftalık bir MMTV-PyMT dişi fare kullandık.
NOT: Hücreden çıkarımlı ECM iskelesinin bakteriyel kirlenmesini önlemek en iyi görüntüleme sonucunu verir ve uzun süreli numune depolamaya izin verir. Bu nedenle tüm adımları steril tutmak önemlidir. Bu nedenle, dikiş, mikro dikiş, çözeltiler, boru, Luer konektörleri ve kateterler de dahil olmak üzere tüm aletler ve cerrahi malzemeler steril olmalıdır. Polistiren tepsi de dahil olmak üzere yüzeyler% 70 etanol ile dezenfekte edilmeli ve perfüzyon tercihen laminer akış başlığı altında yapılmalıdır. Aksi belirtilmedikçe tüm prosedürler oda sıcaklığında gerçekleşir.
1. Ölüm sonrası mikrocerrahi
- Fareyi bir CO2 odası kullanarak ötenazi edin.
- Fareyi 4 L odaya yerleştirin ve 2 dakika boyunca 0,2 L / dk'dan başlayarak% 100 CO2 ile doldurmaya başlayın, 3 dakika sonra 0,8 L / dk'lık bir akışa ulaşana kadar artırın. Fare ilk 2 dakika boyunca bilinçsiz kalmalı ve daha sonra solunum sona ermelidir (genellikle yaklaşık 5 dakika, ancak akış gerektiği gibi korunabilir). Bir sonraki adıma geçmeden önce ölümü onaylayın.
- Toraksı, karnı ve farenin arkasını saç kesme makinesi ile tıraş edin ve% 70 etanol ile dezenfekte edin. Tıraş, görüntüleme veya biyokimyasal analiz için numunelerde saç varlığı nedeniyle eser sayısını büyük ölçüde azaltır.
- Fareyi bir polistiren tepsiye sabitleyin, ön ve arka ayaklarının yanı sıra başını ve kuyruğunu uzatın. Mikrocerrahi mikroskobun altına yerleştirin.
- Mayo düz desen makası kullanarak, alt menekbüler bölgeden alt karın bölgesine kadar uzanan bir kese kesisi ile cerrahi erişim kurun ve torasik duvarı ve peritonları ortaya çıkarmak için deri altından parçalara bölün.
- Mikrocerrahi makas kullanarak, göğüs duvarının her iki tarafındaki altıncı interkostal boşluk boyunca pektoralis majör ve pektoralis küçük kaslarını kesin.
- Düz desenli makas kullanarak, sternumu önceki kesiler boyunca kesin ve daha sonra sternumu uzun ekseni boyunca keserek bir sternotomiyi tamamlayın, ardından kardiyopulmoner kompleksi ortaya çıkarmak için torasik duvarın her iki tarafını yükseltin ve sabitlayın.
- Yuvarlak uçlu mikro-toparlamalar (veya Dumont mikro-toparlamaları) kullanarak, timus ve çevresindeki yağ dokusunu hassas bir şekilde ataşmanlarından çekerek çıkarır. Bu büyük gemileri ortaya çıkardı.
- Koter kullanarak, azalan kava damarını dağla ve düz desen makası kullanarak yemek borusunu kesin.
- Keskin mikro-tokaps kullanarak, brakiyofalik damarları ve brakiyofalik, sol ortak karotis ve sol subklaviyen arterleri alttaki dokudan ayırarak ligasyon ve koterizasyonu kolaylaştırın.
- Mikro iğne tutucu, keskin mikro-emişler ve 9-0 dikiş kullanılarak brakiyofalik, sol ortak karotid ve sol subklaviyen arterlerin ortaya çıkışının üzerine dikişler yerleştirilir.
- Braşiyofalik damarları dağla.
- Boyun kaslarını ve trakeayı açığa çıkarmak için orta hat boyunca submandibuler tükürük bezlerini ayırın. Krikotiroid ligamenti ortaya çıkarmak için kasları ayırın. Mikro makas kullanarak, bağı bölümlere alarak bir giriş açın.
- Trakeaya 27 G kateter takın ve trakea dalları bronşlara girene kadar hassas bir şekilde itin (yani katetere direnç karşılanana kadar, sonra 3 mm geri çekilin). Bronşları bozmamaya dikkat edin. 6-0 dikiş kullanarak, kateteri sabitlemek için nefes borusunun etrafına 3 dikiş yerleştirin.
- Fareyi 12. İnen aort omurgaya doğru ön olarak çalışır ve omurga ile birlikte burada bölümlenmelidir. Alt yarısını ayırın.
- Aortu retrograd katetere ve kateteri aort arkına ulaşana kadar itin. 9-0 dikiş kullanarak, kateter ucunun 5 mm altından başlayarak aortun etrafına 4 dikiş yerleştirin.
2. Hücreden Arındırma
- Silikon boru ve Luer konektörleri kullanarak fareyi bir pompa sistemine bağlayın. 15 dakika boyunca 200 μL / dak'ta deiyonize su ile perfuse. Hücreden arındırma sırasında bu akış hızını koruyun.
- Perfüzyon maddesini deiyonize suda seyreltilmiş% 0,5 sodyum deoksikolat (DOC) olarak değiştirin ve bir gecede perfüzyon.
- Perfüzyon maddesini deiyonize suda seyreltilmiş% 0.1 sodyum dodecyl sülfat (SDS) ile değiştirin ve 8 saat boyunca perfuse yapın.
- SDS ve DOC'u 24 saat boyunca yıkamak için bir gecede deiyonize su ile perfuse.
- Hücreden çıkarılan kalp ve akciğerleri kavisli bir makas kullanarak toraksa bağlayarak resect yapın ve %1 (v/v) penisilin-streptomisin ve 4 °C'de 0.3 μM sodyum azit ile deiyonize su içeren steril bir kriyo-tüpte saklayın. İskele biyokimyasal analiz için kullanılacaksa (örneğin, kütle spektrometresi), sıvı nitrometrede snap dondurun.
3. İmmünasyon
- Görüntülemeyi planlayın: birincil antikoru (veya antikorları) ve floresan konjuge sekonder antikorların kombinasyonunu birbirleriyle eşleşecek ve floresan mikroskobun lazer hatlarına uyacak şekilde belirleyin.
- Örneği% 6 (v / v) eşek serumu içeren bir kriyotüme batırarak engelleyin - bir gecede% 3 (w / v) sığır serumu albümin (BSA).
- PBS'de %3 eşek serumunda primer antikor (veya antikorlar) ile 24 saat kuluçkaya yatırın.
- PBS'de (PBST) 20% ara 0,05'te her seferinde 1 saat boyunca 5 kez yıkayın.
- PBS'de %3 eşek serumunda floresan konjuge sekonder antikor (veya antikorlar) ile numuneyi 24 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
- %0,05'te (PBST) 1 saat boyunca 5 kez yıkayın. Her yıkama arasında 1 saat bekleyin.
- İyonize su ekleyin ve doğrudan ışıktan 4 °C'de saklayın. Bu noktada, iskele görüntüye hazırdır.
4. Görüntüleme
- Numuneyi cam tabanlı bir tabağa yerleştirin ve iki damla saklama çözeltisi (PBS veya deiyonize su) ile nemlendirin.
- Hedefi hazırlayın. Suya daldırma hedefi kullanmanızı öneririz.
- Floresan ışığı kullanarak numuneyi inceleyin.
- Bilgisayar kontrolüne geçin. Lazerleri açın ve lazer yoğunluğunu, iğne deliği diyaframını, dedektör dalga boylarını, kazancı, çözünürlüğünü ve yakınlaştırmasını ayarlayın. z yığını için sayı ve adım boyutunu ayarlayın ve edinmeye başlayın. Doku penetrasyonunu artırmak ve ışık, ağartma ve doku hasarının saçılmasını en aza indirmek için multifotoğraf lazer ekscitasyon kullanmanızı öneririz.
5. Hematoksilin-eosin lekeleme
- Ötenazili bir fareden 1 akciğer lobundan alıntı.
- 10 mm x 10 mm x 5 mm kriyoold yerleştirin ve yaklaşık 500 μL OCT bileşiği ile örtün.
- Kuru buzda (-70 °C) dondurun ve numuneyi bu sıcaklıkta saklayın.
- 2.5. adıma göre işlenmiş bir fareden bir hücreden çıkarmış akciğer lobu çıkar.
- En büyük yüzey alanı aşağı olan bir kriyoold yerleştirin ve adım 5.2'de belirtildiği gibi OCT bileşiği ile örtün.
- Kuru buzda (-70°C) dondurun ve numuneyi başka türlü gerekli olana kadar bu sıcaklıkta saklayın. Örnek en az 12 hafta saklanabilir.
- Bölüm donmuş doku blokları -20 °C'de 5 μm kalınlığında bir kriyostatta ve yapışkan cam slaytlara bölümler yerleştirin ve -80 °C'de saklayın.
- Hava kuruyana kadar (yaklaşık 20 dk) kaymaları oda sıcaklığına alın.
- Kısa bir süre PBS'ye dalın ve slaytları PBS'de % 4 paraformaldehit içine 15 dakika daldırarak düzeltin. PBS'de bir kez 5 dakika, ardından iki kez damıtılmış suda 5 dakika yıkayın.
- Mayer'in hematoksilin çözeltisinin içine 10 dakika daldırın. Bu süre doku kaynağına ve leke hazırlamaya göre optimize edilebilir.
- Bir Coplin kavanozunda damıtılmış su altında 10 dakika yıkayın.
- 7 dakika boyunca eosin çözeltisinin içine dalın. Bu süre doku kaynağına ve leke hazırlamaya göre optimize edilebilir.
- %70 etanol ve %96 ve %100 etanol 30 saniye boyunca kısa bir süre daldırma ile fazla Eozin ve susuzluk gidermek için% 50 etanol daldırın. Xylene'e birkaç kez daldırın.
- Birkaç damla DPX montaj ortamı uygulayın ve bir cam kapak parçası yerleştirin.
- Slaytları kimyasal bir kaputun altında bir gecede kurumaya bırakın.
- Slayt tarayıcıdaki slaytları tarayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kardiyopulmoner desellülerizasyon
Protokolü başarıyla tamamladıktan sonra kalp ve akciğerlerin yanı sıra aort arkı gibi ek dokular hücrelerden arındırılmış olacaktır. Desellülerizasyon, ecm iskelelerinin hematoksilin-eozin lekelenmesi (Şekil 1) ile doğrulanabilir. Bu iskeleler taze organların boyutlarını korur ve çözünmeyen ECM yapısı bozulmadan kalır2. Şekil 2 , fare kardiyo-pulmoner kompleksini başarıyla kullanmak için gereken önemli cerrahi adımların şematik bir gösterimini göstermektedir.
ECM Görüntüleme
Standart bir ortamda, ikincil antikorlar yeşil, kırmızı ve uzak kırmızı floresan kanallarında kullanılabilir (yani, 488 nm, 555nm/ 594 nm ve 647 nm dalga boyu tespiti); 2 foton ekscitasyon kullanılarak ikinci harmonik üretimi (SHG) görüntüleme ilavesi fibriller kollajeni ortaya getirecektir. Lazer uyarma doku otofluoresansını teşvik edebilir ve görüntüleme verilerini karıştırabileceğinden yeşil floresan ile kullanırken dikkatli olunmalıdır. Otomatik floresan doğrulamanın basit bir yolu, ellenmemiş bir kontrol dokusunu görüntülemek ve lazer yoğunluğunu ve dedektör kazancını buna göre ayarlamak ve bunu antikor boyama ile karşılaştırmaktır. Bununla birlikte, bu otofluoresans, akciğer iskelelerinde elastin ortaya çıkarabileceğinden bir avantaj olarak kullanılabilir.
ECM iskeleleri geçirgenliğin ve hafif penetrabilliğin arttığını gösterdi2. Bu protokolün motorlu bir mikroskop aşaması ile kullanılması, altmikron çözünürlükte üç boyutlu, karolanmış numunelerin tüm montajlı olarak görüntülenmesini sağlar (Şekil 3). Dokunun bölümlemenin gerekli olması durumunda (örneğin, görüntü kardiyak duvarlara veya derin pulmoner parenkim) doku lekelenmeden önce keskin bir neşterle bölümlenmelidir.
Şekil 1. Hücreden arındırma doğrulanarak. Hematoksilin-Eosin, doğal ve hücreden uzaklaştırılmış akciğerlerden ve kalpten alınan donmuş örneklerin lekelenmeleri. Hücreden sönmemiş örneklerde çekirdek yokluğuna dikkat edin. Tüm ölçekler mikron halinde. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. Kardiyo-pulmoner kompleksin hücrelerinin deselülarize etmek için gereken temel adımları gösteren mikro cerrahi şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. 11 haftalık bir kadın fareden hücreden çıkarımış PyMT fare akciğerlerinin temsili çoklu protein immünostainasyonu. Z yığınının maksimum projeksiyonu gösteren karo mozaiği. 1. ad plevrayı gösterir. Inset 2 normal parenchyma ECM gösterir. Inset 3 bir bronşiol gösterir. Renkler, renk körü için erişilebilir hale getirildi. Tüm ölçekler mikron halinde. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Doku ajitasyonuna dayalı desellülerizasyon teknikleri ECM yapısını değiştirerek ECM yapı analizi için uygun hale getirir4. Trakea aort gibi anatomik bir yol kullanarak perfüzyon desellülerizasyonu kılcal yatağa veya terminal alveollere ulaşmayı sağlar ve hücreden çıkarıcı ajanların organ boyunca teslimini kolaylaştırır. Dokuyu hücreden çıkarmak için zwitteriyonik, anionik ve iyonik olmayan deterjanların kullanımı4,5,6 bildirilmiştir, ancak sodyum dodecyl sülfat (SDS, anionik) fare yağ yastığında fibriller kollajeni doğrullaştırır2, ancak akciğerlerde değil; bu, ECM yapısını korumak için hedef dokuya uyum sağlayarak deterjan seçiminin optimize edilmesi gerektiğini göstermektedir. Doku temizleme yöntemleri, ECM çapraz bağlamayı değiştirebilecek kimyasallar ve doku boyutları7,8,9 gerektirmesine rağmen, ECM analizi için kullanılabilir. Edinilmiş doku şeffaflığı gelişmiş mikroskobik görüntülemeye izin verirken, hücrelerin varlığı antikor penetrasyonunu önemli ölçüde kötüleştirebilir ve ECM epitoplarını / proteinlerini kapsayabilir. Sağlam ECM'nin izole edilmesi ve görüntülenmesi, yapısının analitik araçlarla nicel analizine izin veriyor2,10, bileşimini haritalıyor2 ve daha fazla ECM biyokimyasal incelemenin yolunu açıyor.
Ana damarların diseksiyonu ve ligasyonu ve bunun sonucunda koroner ve pulmoner dolaşımın izolasyonu, dokular boyunca perfüzyonlu çözeltilerin düzgün basıncını elde etmek için gereklidir. Bu nedenle, bu protokol ana operatörün mikrocerrahi uzmanlığına bağlıdır. Damarları, akciğerleri ve kalbi sağlam korumak için hassas bir şekilde çalışmak önemlidir. Toraksın üç boyutlu anatomisini anlamak için bu protokolün tekrar tekrar yürütülmesi tutarlı sonuçlar elde etmek için çok önemlidir.
Burada gösterilen cerrahi prosedür, fare vaskülatürü1,2'ye ve bölgesindeki organlara erişmek için temel adımları toplar. Ligatür desenini değiştirerek baş ve boyuna, fore uzuvlara ve yağ pedlerine erişmek mümkündür. Aynı becerileri kullanarak, diyafram altı organları deselülarize etmek mümkündür.
Aynı derecede önemli olan, immün sistemi baskılayan kurulumun dikkatli tasarımıdır. Daha önce yapısal ECM proteinlerine karşı doğrulanmış antikorların bir kataloğunu derledik3. Standart kurulum aynı anda üç protein ve fibriller kollajen ortaya çıkabilir ve çapraz sorguya olanak tanır.
Bu yöntemin önemi, yapısal ve boyutsal olarak sağlam ECM iskeleleri elde etme olasılığında yatmaktadır. Karmaşık bir dokunun gizli bileşenlere yapısızlaştırılması biyomühendislik temel hedeflerinden biridir; hücreleri veya kanı bir organdan izole etmek nispeten basit olsa da, ECM iskelesini elde etmek için hiçbir yöntem yoktu. Bu özellikle tümörler için geçerliydi, ancak burada sunulan yöntem, ECM'nin anatomik ve biyokimyasal analizi için herhangi bir fare zorlanmasında ECM izolasyonunun yolunu açar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Prof. Ivana Novak ve Dr. Nynne Meyn Christensen'e (Kopenhag Üniversitesi İleri Biyogörüntleme Merkezi)'ne mikroskop erişimi sağladıkları için teşekkür ederiz. Bu çalışma Avrupa Araştırma Konseyi (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN; AEM-G, OW, RR ve JTE); Lundbeck Vakfı'ndan doktora bursu (R286-2018-621; SN. ); İsveç Araştırma Konseyi (2017-03389; CDM); İsveç Kanser Derneği, Cancerfonden (CAN 2016/783, 19 0632 Pj ve 190007; CDM); Alman Kanser Yardımı (Deutsche Krebshilfe; RR); ve Danimarka Kanser Derneği (R204-A12454; RR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MICROSURGERY | |||
| 6-0 suture, triangular section needle (Vicryl) | Ethicon | 6301124 | |
| 9-0 micro-suture (Safil) | B Braun | G1048611 | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Adson forceps with teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Castroviejo microneedle holder | Fine Science Tools | no. 12061-01 | |
| CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia | |||
| Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Disposable polystyrene tray (~30 × 50 cm) | |||
| Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck) | Leica | S6 D | |
| Double-ended microspatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Dumont microforceps (two) | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Dumont microforceps with 45° tips (two) | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Hair clippers | Oster | 76998-320-051 | |
| Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws) | Fine Science Tools | 12500-12 | |
| Intravenous 24-gauge catheter (Insyte) | BD | 381512 | |
| Intravenous 26-gauge catheter (Terumo) | Surflo-W | SR+DM2619WX | |
| Mayo scissors (tough cut, straight) | Fine Science Tools | 14110-15 | |
| Microforceps with ringed tips (two) | Aesculap | FM571R | |
| Micro-spring scissors (Vannas, curved) | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Minicutter | KLS Martin | 80-008-03-04 | |
| Molt Periostotome | Aesculap | D0543R | |
| Needles (27 gauge; Microlance) | BD | 21018 | |
| Paper towel (sterile) or surgical napkin | |||
| Serrated scissors (CeramaCut, straight) | Fine Science Tools | 14958-09 | |
| Spatula (Freer-Yasargil) | Aesculap | OL166R | |
| Syringes (1 mL; Plastipak) | BD | 3021001 | |
| Syringes (10 mL; Plastipak) | BD | 3021110 | |
| Tendon scissors (Walton) | Fine Science Tools | 14077-09 | |
| IMMUNOSTAINING | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11037 | |
| BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized) | Serva | 11930.03 | |
| Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457) | Millipore | AB756P | Host: rabbit |
| PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | Host: goat |
| Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621) | Host: guinea pig | ||
| Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10) | VWR | 233-5364) | |
| Serum (normal donkey serum) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| IMAGING | |||
| Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; ) | Leica | ||
| Fluorescence light source | Leica | EL6000 | |
| Microscope (inverted multiphoton microscope) | Leica | SP5-X MP | |
| Objective (lambda blue, 20×, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV) | Leica | HCX PL APO | |
| Two-photon Ti–sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model) | |||
| White-light laser (WLL) | Leica | ||
| DECELLULARIZATION | |||
| 70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water | Plum | 1680766 | |
| Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch) | World Precision Instruments | 13158-100 | |
| PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Peristaltic pump (with 12 channels) | Ole Dich | 110AC(R)20G75 | |
| Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.) | Ole Dich | 31399 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 08591-1ML-F | |
| Sodium deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sodium Dodecyl Sulphate | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
| H&E STAINING | |||
| 4% PFA | Fisher Scientific | 15434389 | |
| 96% Ethanol | Plum | 201446-5L | |
| Absolute ethanol | Plum | 201152-1L | |
| Coverslips (24x50mm; 1000 pcs) | Hounisen | 422.245 | |
| Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs) | Tissue-Tek | 4566 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| DPX mounting medium | Hounisen | 1001.0025 | |
| Eosin Y solution alcoholic 0.5% | Sigma | 1024390500 | |
| Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs) | Pfm medical | 207500003 | |
Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs) |
Thermofisher | 6319483 | |
| Mayers hematoxylin | Sigma | MHS32-1L | |
| OCT compound | VWR | 361603E | |
| Slide scanner (Nanozoomer) | Hamamatsu Photonics | ||
| Xylene | Sigma | 534056-4L |
References
- Hynes, R. O. Extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326, 1216-1219 (2009).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix. Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D. Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).
- White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
- Uygun, B. E., et al. Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
- Wershof, E., et al. A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix. BioRxiv. , (2019).
